專利名稱：哲羅鮭微衛(wèi)星序列與多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的獲取方法和哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微衛(wèi)星序列與多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的獲取方法和多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。
背景技術(shù)：
哲羅鮭是我國(guó)土著的珍稀名貴的魚(yú)類，是鮭科魚(yú)類中體型最大的魚(yú)類。由于環(huán)境惡化及過(guò)度捕撈等因素，其目前的資源量已十分稀少、瀕臨滅絕；因此，1998年哲羅鮭被列入《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)(魚(yú)類)》，2004年被列入《中國(guó)物種紅色名錄》。哲羅鮭同時(shí)也是一種優(yōu)良的冷水性養(yǎng)殖魚(yú)類，其具有生長(zhǎng)快速、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，目前已成功進(jìn)行了野生哲羅鮭的人工馴養(yǎng)，并在此基礎(chǔ)上成功開(kāi)展了規(guī)模化繁殖和養(yǎng)殖。但由于其自殘嚴(yán)重、不耐高溫、不耐低氧及在北方地區(qū)低溫季節(jié)(如冬春季水溫在1(TC以下季節(jié))生長(zhǎng)緩慢等特性，限制了哲羅鮭的養(yǎng)殖區(qū)域及養(yǎng)殖產(chǎn)量，增加了養(yǎng)殖成本，因此有必要對(duì)目前人工馴養(yǎng)的哲羅鮭進(jìn)行進(jìn)一步選育。 隨著生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，分子標(biāo)記已在物種的保護(hù)遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)及魚(yú)類的選擇育種中得到充足的發(fā)展，尤其是在動(dòng)物的選擇育種上的應(yīng)用，大大促進(jìn)了分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的進(jìn)步，在魚(yú)類中成功的就有羅非魚(yú)催乳素基因?qū)δ望}性狀的選擇(專利號(hào)ZL 02821303. 3)。哲羅鮭作為瀕危物種及優(yōu)良的養(yǎng)殖種類，而可利用的分子標(biāo)記數(shù)量卻十分有限，目前Genbank中收錄的哲羅鮭的核酸序列僅270多條，其中有153條為本發(fā)明發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室提交的微衛(wèi)星序列，其余大部分為哲羅鮭的線粒體部分基因序列，可利用的微衛(wèi)星分子標(biāo)記僅十幾個(gè)，因此開(kāi)發(fā)哲羅鮭的微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)這一物種進(jìn)行保護(hù)遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)的研究是十分必要的，同時(shí)也為哲羅鮭的分子標(biāo)記輔助選擇提供充足的分子標(biāo)記。 微衛(wèi)星是基因組中由1 6個(gè)核苷酸組成的短串聯(lián)重復(fù)3 6次以上的DNA序列，利用重復(fù)序列兩側(cè)的保守序列設(shè)計(jì)引物，以此開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記(微衛(wèi)星標(biāo)記由微衛(wèi)星序列和微衛(wèi)星序列引物兩部分組成)。由于微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性程度高且共顯性遺傳，通過(guò)它計(jì)算雜合度可以較好地反映群體內(nèi)的變異，因此微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)于遺傳學(xué)研究是十分重要的。微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)可以分為3步一、從基因組中克隆或分離出含有短串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，即微衛(wèi)星序列；二、在微衛(wèi)星序列的兩側(cè)保守序列中設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的引物；三、采用合適的方法鑒定所設(shè)計(jì)引物的多態(tài)性。目前微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，主要困難集中在微衛(wèi)星序列的獲得、引物設(shè)計(jì)及引物PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化上。微衛(wèi)星序列的分離或克隆現(xiàn)有多種方法，如小片段基因組文庫(kù)的雜交篩選、FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences)、磁珠富集法等，由于磁珠富集法具有陽(yáng)性克隆率及微衛(wèi)星序列的得率較高的特點(diǎn)，所以目前被廣為應(yīng)用，但該方法需采用同位素(缺點(diǎn)具有放射性)或生物素二次雜交(缺點(diǎn)毒性較大)技術(shù)，增加了微衛(wèi)星序列分離的風(fēng)險(xiǎn)和成本，所以在使用中具有局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前采用磁珠富集法分離或克隆微衛(wèi)星序列存在放射性或毒性較大，增加了微衛(wèi)星序列分離的風(fēng)險(xiǎn)和成本的問(wèn)題，而提供的一種哲羅鮭微衛(wèi)星序列與多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的獲取方法和哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。 本發(fā)明哲羅鮭微衛(wèi)星序列按以下步驟獲得一、提取哲羅鮭基因組DNA;二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建；三、菌落PCR擴(kuò)增并進(jìn)行陽(yáng)性克隆檢測(cè)和測(cè)序，即獲得哲羅鮭微衛(wèi)星序列。 本發(fā)明哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記按以下步驟獲得一、提取哲羅鮭基因組DNA;二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建；三、菌落PCR擴(kuò)增并進(jìn)行陽(yáng)性克隆檢測(cè)和測(cè)序，獲得哲羅鮭微衛(wèi)星序列；四、對(duì)哲羅鮭微衛(wèi)星序列進(jìn)行分析和引物設(shè)計(jì)；五、微衛(wèi)星序列引物多態(tài)性鑒定，獲得具有哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星序列及其引物。
本發(fā)明哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記共7對(duì)； 微衛(wèi)星標(biāo)記HtaCa69的序列如SEQ ID NO : 1所示，其正向引物序列為
5' -GCAGGCTCTCGCACTAACA-3'，反向引物序列為5' -CTGTCCCATTTGATGTCTGATAA-3'; 微衛(wèi)星標(biāo)記HtaCalOl的序列如SEQ ID NO :2所示，其正向引物序列為
5' -GTCGTTTGCCTCACCTCATA-3'，反向引物序列為5' -CGTTACAGCCACATTCCTACAA-3'; 微衛(wèi)星標(biāo)記HtaCal09的序列如SEQ ID NO :7所示，其正向引物序列為
5' -AGGGGATTCGGCTATTTCAC-3'，反向引物序列為5' -CCTCTCATTGTGTTGGAGCA-3'; 微衛(wèi)星標(biāo)記HtaCal72的序列如SEQ ID NO :3所示，其正向引物序列為
5' -AACCGTCCCCTAACCCAAT-3'，反向引物序列為5' -TGCTTACCTCTCCCCAAAGT-3'; 微衛(wèi)星標(biāo)記HtaCal83的序列如SEQ ID NO :4所示，其正向引物序列為
5' -TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3'，反向引物序列為5' -GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3'; 微衛(wèi)星標(biāo)記HtaCal85的序列如SEQ ID NO :5所示，其正向引物序列為
5' -GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3'，反向引物序列為5' -TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3'; 微衛(wèi)星標(biāo)記HtaCa203的序列如SEQ ID NO :6所示，其正向引物序列為
5' -AGCGGAAATAGCAGGAGGTT-3'，反向引物序列為5' -GAATACCACAGCCCAGCATT-3'。 本發(fā)明哲羅鮭微衛(wèi)星序列的獲取方法可以快速、方便的獲得哲羅鮭微衛(wèi)星序列；
本發(fā)明哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的獲取方法可以快速、方便的獲得哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。 本發(fā)明方法中結(jié)合了 FIASCO和磁珠富集法的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)避免了磁珠富集法中放射性同位素或生物素二次雜交鑒定陽(yáng)性克隆所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，具有成本低、安全性高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明方法所獲的生物材料可用于哲羅鮭的保護(hù)遺傳學(xué)、親緣關(guān)系分析、連鎖圖譜構(gòu)建及養(yǎng)殖群體的遺傳管理。


圖1是具體實(shí)施方式
十二中選用限制性內(nèi)切酶Tru9I和Tsp509I進(jìn)行酶切，酶切片段連接后步驟二 c回收的長(zhǎng)度為500 900bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2是具體實(shí)施方式
十二中限制性內(nèi)切酶Sau3AI的酶切片段和生物素標(biāo)記的(CA)w寡核苷酸探針構(gòu)建的微衛(wèi)星富集文庫(kù)的菌落PCR電泳圖。圖3是具體實(shí)施方式
十二中限制性內(nèi)切酶Tsp5091的酶切片段和生物素標(biāo)記的(CA)w寡核苷酸探針構(gòu)建的微衛(wèi)星富集文庫(kù)的菌落 PCR電泳圖。圖4是具體實(shí)施方式
十二中限制性內(nèi)切酶Tru9I的酶切片段和生物素標(biāo)記的 (CA)16寡核苷酸探針構(gòu)建的微衛(wèi)星富集文庫(kù)的菌落PCR電泳圖。圖5是具體實(shí)施方式
十二 中限制性內(nèi)切酶CviQI的酶切片段和生物素標(biāo)記的(CA)w寡核苷酸探針構(gòu)建的微衛(wèi)星富集 文庫(kù)的菌落PCR電泳圖。圖6是具體實(shí)施方式
十二中限制性內(nèi)切酶Bfal的酶切片段和生 物素標(biāo)記的(CA)w寡核苷酸探針構(gòu)建的微衛(wèi)星富集文庫(kù)的菌落PCR電泳圖。圖7是具體實(shí) 施方式十二中限制性內(nèi)切酶TaqI的酶切片段和生物素標(biāo)記的(CA)w寡核苷酸探針構(gòu)建的 微衛(wèi)星富集文庫(kù)的菌落PCR電泳圖。圖8是具體實(shí)施方式
十二中限制性內(nèi)切酶Sau3AI的 酶切片段和生物素標(biāo)記的(CAG)w寡核苷酸探針構(gòu)建的微衛(wèi)星富集文庫(kù)的菌落PCR電泳圖。 圖9是具體實(shí)施方式
十三中微衛(wèi)星標(biāo)記為HtaCalOl的檢測(cè)結(jié)果圖。圖10是具體實(shí)施方式
十三中微衛(wèi)星標(biāo)記為HtaCa69的檢測(cè)結(jié)果圖。圖11是具體實(shí)施方式
十三中微衛(wèi)星標(biāo)記為 HtaCal72的檢測(cè)結(jié)果圖。圖12是具體實(shí)施方式
十三中微衛(wèi)星標(biāo)記為HtaCal83的檢測(cè)結(jié)果 圖。圖13是具體實(shí)施方式
十三中微衛(wèi)星標(biāo)記為HtaCal85的檢測(cè)結(jié)果圖。圖14是具體實(shí) 施方式十三中微衛(wèi)星標(biāo)記為HtaCa203的檢測(cè)結(jié)果圖。圖15是具體實(shí)施方式
十三中微衛(wèi)星 標(biāo)記為HtaCal09的檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的 任意組合。
具體實(shí)施方式
一 本實(shí)施方式哲羅鮭微衛(wèi)星序列按以下步驟獲得一、提取哲羅 鮭基因組DNA;二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建；三、菌落PCR擴(kuò)增并 進(jìn)行陽(yáng)性克隆檢測(cè)和測(cè)序，即獲得哲羅鮭微衛(wèi)星序列。 具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟二中采用限制 性內(nèi)切酶單酶切或雙酶切哲羅鮭基因組DNA。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二的不同點(diǎn)是步驟二分以下步驟 實(shí)現(xiàn) a、哲羅鮭基因組DNA的酶切 哲羅鮭基因組DNA酶切體系為20iiL，由2iiL 10 X酶切buffer、0. 2 ii L濃度為 10ng/ ii L的BSA、2. 5U限制性內(nèi)切酶、5 y L濃度為100ng/ y L的哲羅鮭基因組DNA和余量 的滅菌去離子水組成；酶切孵育時(shí)間為4h ;
b、連接 連接體系為40 ii L，由20 ii L步驟a酶切片段、2 ii L粘末端雙鏈接頭、 4 ii L10Xbuffer、6weiss單位T4DNA連接酶和余量的滅菌去離子水組成，并于4。C水浴中過(guò) 夜連接；其中雙鏈接頭按以下步驟制備等體積混合濃度均為10pmol/L的單鏈寡核苷酸連 接頭A和單鏈寡核苷酸連接頭B， 95t:變性10min，然后經(jīng)過(guò)4h勻速冷卻至l(TC ，即得到雙 鏈接頭； c、目的片段獲取 用單鏈寡核苷酸連接頭A做擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 ii L，由3 ii L步 驟b連接產(chǎn)物、1. 5ii L引物、2. 5ii L 10XBuffer、1. 5ii L濃度為25mmol/L的MgCl2、2 ii L濃度為2. 5mmol/L的dNTP、0. 3 y L濃度為5U/ y L的Taq酶和余量的無(wú)菌超純水組成；擴(kuò)增反 應(yīng)程序?yàn)?2°C 2min，94t:預(yù)變性5min，循環(huán)設(shè)置為94t:變性30s、53t:退火30s、72。C延伸 lmin，共14 20個(gè)循環(huán)，72t:延伸10min ;擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 用Promega PCR產(chǎn)物回收試劑盒切膠回收長(zhǎng)度為500 900bp的DNA片段；
d、微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建
1、雜交取12iiL步驟c回收的DNA片段置于95t:環(huán)境中變性10min，然后立即加入到 68°C 、體積為38 ii L的雜交液中雜交lh后得到雜交DNA ;其中38 y L的雜交液由1. 5 y L濃 度為10 ii mol/L的生物素標(biāo)記的含有重復(fù)序列的探針、5 ii L濃度為10pmol/L的單鏈寡核苷 酸連接頭A，15iiL 20XSSC，0. 5ii L質(zhì)量濃度為10X的SDS和16 y L ddH20組成；
n、平衡磁珠 在1. OmL離心管中加入100 y L鏈霉親和素磁珠和200 y L洗液C洗滌2次，然后將 離心管放在磁力架上使磁珠吸附在管壁上，棄除上清液，再用200 y L洗液D洗滌磁珠3 5次，之后加入150 y L洗液D室溫放置，即得到平衡磁珠；洗液C中pH值為8. 0的EDTA的 濃度為lmmol/L、pH值為8. 0的Tris-Cl的濃度為10mmol/L、NaCl的濃度為2mmol/L ;洗液 D是用6 X SSC液稀釋的質(zhì)量濃度為0. 1 %的SDS溶液；
ni、親和捕捉 將步驟I得到的雜交DNA加入步驟II平衡磁珠中25t:溫浴20min，然后去除上清 液，再用洗液D 25t:洗滌磁珠2次，每次10min，之后用洗液E 68。C洗滌磁珠2次，再用洗液 F洗滌磁珠2次，而后用200 ii L 0. 1 X TE洗滌磁珠2次，再加入30 y L 0. 1 X TE在95。C變 性10min，然后收集上清液，即得到含有重復(fù)序列的單鏈DNA片段；其中洗液E是用3XSSC 液稀釋的質(zhì)量濃度為0. 1 %的SDS溶液，洗液F為6 X SSC液；
IV、 PCR擴(kuò)增含有微衛(wèi)星序列的DNA片段 PCR反應(yīng)體系為25ii L，由內(nèi)含4種dNTP的混合PCR緩沖液18ii L、單鏈寡核苷酸連 接頭A為引物0. 5 ii L、T叫DNA聚合酶0. 5 y L，步驟III收集的上清液4 y L和余量的無(wú)菌 水組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4t:預(yù)變性5min，循環(huán)設(shè)置為94。C變性30s、53。C退火30s、 72t:延伸lmin，共20 30個(gè)循環(huán)，72t:延伸10min，用Promega PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化 回收，去除多余的引物、dNTP和接頭；
V、T-載體連接及克隆 T-載體連接反應(yīng)體系為10 ii L，由5 ii L T-載體商業(yè)包裝中2 X連接緩沖液、1 y L 載體pMD18-T vector和4 y L步驟IV純化回收的DNA片段組成；同時(shí)以T載體自身連接作 為對(duì)照，4t:連接過(guò)夜；再用CaCl2制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5a進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到基因組微衛(wèi) 星富集文庫(kù)，并將文庫(kù)中的單菌落轉(zhuǎn)移培養(yǎng)平板中按順序排列。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方 式二相同。 本實(shí)施方式內(nèi)切酶從NEB公司購(gòu)買。酶切孵育溫度參見(jiàn)限制性內(nèi)切酶使用說(shuō)明。
T4DNA連接酶購(gòu)自于美國(guó)Promega公司。pMD18-T vector購(gòu)自于寶生物工程(大 連)有限公司(大連TaKaRa公司)。感受態(tài)大腸桿菌DH5 a購(gòu)自于蓋寧生物科技(北京) 有限公司。 本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購(gòu)得，若無(wú)特殊
9要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實(shí)施方式中未注明的操作步驟參見(jiàn)試劑使用說(shuō)明。
本實(shí)施方式步驟dill中25t:溫浴使生物素和鏈霉親和素結(jié)合。
本實(shí)施方式步驟dV中連接緩沖液中包含連接酶。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟二 d I中生 物素標(biāo)記的含有重復(fù)序列的探針為生物素標(biāo)記的(CA)w寡核苷酸探針或生物素標(biāo)記的 (CAG)16寡核苷酸探針。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四的不同點(diǎn)是步驟二 a中限制性 內(nèi)切酶為限制性內(nèi)切酶Tsp509I、限制性內(nèi)切酶Tru9I、限制性內(nèi)切酶CviQI、限制性內(nèi)切酶 Bfal、限制性內(nèi)切酶Sau3AI或限制性內(nèi)切酶TaqI ;步驟二中使用限制性內(nèi)切酶Tsp509I其 單鏈寡核苷酸連接頭A的堿基序列為5' -CTCGTAGACTGCGTACC-3'，單鏈寡核苷酸連接頭 B的堿基序列為5' -AATTGGTACGCAGTCTAC-3';使用限制性內(nèi)切酶Tru9I、 CviQI或Bfal 其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿基序列為5' -GACGATGAGTCCTGAG-3 '，單鏈寡核苷酸連接 頭B的堿基序列為5' -TACTCAGGACTCAT-3';使用限制性內(nèi)切酶Sau3AI其單鏈寡核苷酸 連接頭A的堿基序列為5' -GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3'，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿 基序列為5 ' -CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG-3';使用限制性內(nèi)切酶Taql其單鏈寡核苷酸 連接頭A的堿基序列為5' -GACGATGAGTCCTGAG-3'，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列為 5' -CGCTCAGGACTCAT-3'。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式四相同。 本實(shí)施方式中限制性內(nèi)切酶Tsp5091的粘末端序列為5' -AATT、酶切溫度孵育為 65°C，限制性內(nèi)切酶Tru9I的粘末端序列為5' -TA,酶切溫度孵育為65°C，限制性內(nèi)切酶 CviQI的粘末端序列為5' -TA、酶切溫度孵育為37°C，限制性內(nèi)切酶BfaI的粘末端序列為 5' -TA、酶切溫度孵育為37°C，限制性內(nèi)切酶Sau3AI的粘末端序列為5' -GATC、酶切溫度 孵育為37°C，限制性內(nèi)切酶TaqIGATC的粘末端序列為5' -CG.酶切溫度孵育為65°C。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五的不同點(diǎn)是步驟三中用通用引 物M13+或M13—與含有重復(fù)序列的探針為引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為15yL， 由濃度為10ymol/L的正向引物、0. 6ii L濃度為1Oiimol/L的反向引物、1. 5ii L Taq DNA 聚合酶商業(yè)包裝中10XBuffer、0. 9ii L濃度為25,1/L的MgCl2、 1. 2 ii L濃度為2. 5,1/ L的dNTP、0. 12 ii L濃度為5U/ y L的T叫DNA聚合酶和余量的無(wú)菌去離子水組成；用無(wú)菌 牙簽按順序?qū)尉涮羧敕磻?yīng)管中進(jìn)行菌落PCR，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4t:預(yù)變性5min，94t:變 性30s、60。C退火30s、72。C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，72。C延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用濃度為 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為200 750bp的具有明顯條帶的陽(yáng)性克隆 進(jìn)行測(cè)序。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式五相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
六的不同點(diǎn)是步驟二 d I中選用 生物素標(biāo)記的(CA)w寡核苷酸探針，則步驟三PCR擴(kuò)增引物為M13+和(CA、。，或者M(jìn)13-和 (CA、。；步驟二d I中選用生物素標(biāo)記的(CAG)w寡核苷酸探針則步驟三PCR擴(kuò)增引物為 M13+和(CAG)e，或者M(jìn)13-和(CAG)e。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式六相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記按以下步驟獲得一、提 取哲羅鮭基因組DNA ;二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建；三、菌落PCR 擴(kuò)增并進(jìn)行陽(yáng)性克隆檢測(cè)和測(cè)序，獲得哲羅鮭微衛(wèi)星序列；四、對(duì)哲羅鮭微衛(wèi)星序列進(jìn)行分 析和引物設(shè)計(jì)；五、微衛(wèi)星序列引物多態(tài)性鑒定，獲得哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。
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具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
八的不同點(diǎn)是步驟二分以下步驟 實(shí)現(xiàn) a、哲羅鮭基因組DNA的酶切 哲羅鮭基因組DNA酶切體系為20iiL，由2iiL 10 X酶切buffer、0. 2 ii L濃度為 10ng/ ii L的BSA、2. 5U限制性內(nèi)切酶、5 y L濃度為100ng/ y L的哲羅鮭基因組DNA和余量 的滅菌去離子水組成；酶切孵育時(shí)間為4h ;
b、連接 連接體系為40 ii L，由20 ii L步驟a酶切片段、2 ii L粘末端雙鏈接頭、 4 ii L10Xbuffer、6weiss單位T4DNA連接酶和余量的滅菌去離子水組成，并于4。C水浴中過(guò) 夜連接；其中雙鏈接頭按以下步驟制備等體積混合濃度均為1Opmol/L的單鏈寡核苷酸連 接頭A和單鏈寡核苷酸連接頭B，95t:變性10min，然后經(jīng)過(guò)4h勻速冷卻至l(TC，即得到雙 鏈接頭； c、目的片段獲取 用單鏈寡核苷酸連接頭A做擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 ii L，由3 ii L步 驟b連接產(chǎn)物、1. 5ii L引物、2. 5ii L 10XBuffer、1. 5ii L濃度為25mmol/L的MgCl2、2 ii L濃 度為2. 5mmol/L的dNTP、0. 3 y L濃度為5U/ y L的Taq酶和余量的無(wú)菌超純水組成；擴(kuò)增反 應(yīng)程序?yàn)?2°C 2min，94t:預(yù)變性5min，循環(huán)設(shè)置為94t:變性30s，53t:退火30s，72。C延伸 lmin，共14 20個(gè)循環(huán)，72t:延伸10min ;擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 用Promega PCR產(chǎn)物回收試劑盒切膠回收長(zhǎng)度為500 900bp的DNA片段；
d、微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建
1、雜交 取12iiL步驟c回收的DNA片段置于95t:環(huán)境中變性10min，然后立即加入到 68t:、體積為38 ii L的雜交液中雜交lh后得到雜交DNA ;其中38 y L的雜交液由1. 5 y L濃 度為10 ii mol/L的生物素標(biāo)記的含有重復(fù)序列的探針、5 ii L濃度為10pmol/L的單鏈寡核苷 酸連接頭A，15iiL 20XSSC，0. 5ii L質(zhì)量濃度為10X的SDS和16 y L ddH20組成；
n、平衡磁珠 在1. OmL離心管中加入100 y L鏈霉親和素磁珠和200 y L洗液C洗滌2次，然后將 離心管放在磁力架上使磁珠吸附在管壁上，棄除上清液，再用200 y L洗液D洗滌磁珠3 5次，之后加入150 y L洗液D室溫放置，即得到平衡磁珠；洗液C中pH值為8. 0的EDTA的 濃度為lmmol/L、pH值為8. 0的Tris-Cl的濃度為10mmol/L、NaCl的濃度為2mmol/L ;洗液 D是用6 X SSC液稀釋的質(zhì)量濃度為0. 1 %的SDS溶液；
ni、親和捕捉 將步驟I得到的雜交DNA加入步驟II平衡磁珠中25t:溫浴20min，然后去除上清 液，再用洗液D 25t:洗滌磁珠2次，每次10min，之后用洗液E 68。C洗滌磁珠2次，再用洗液 F洗滌磁珠2次，而后用200 ii L 0. 1 X TE洗滌磁珠2次，再加入30 y L 0. 1 X TE在95。C變 性10min，然后收集上清液，即得到含有重復(fù)序列的單鏈DNA片段；其中洗液E是用3XSSC 液稀釋的質(zhì)量濃度為0. 1 %的SDS溶液，洗液F為6 X SSC液；
IV、 PCR擴(kuò)增含有微衛(wèi)星序列的DNA片段 PCR反應(yīng)體系為25ii L，由內(nèi)含4種dNTP的混合PCR緩沖液18ii L、單鏈寡核苷酸連接頭A為引物0. 5 L、T叫DNA聚合酶0. 5 y L，步驟III收集的上清液4 y L和余量的無(wú)菌 水組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4t:預(yù)變性5min，循環(huán)設(shè)置為94。C變性30s，53。C退火30s， 72t:延伸lmin，共20 30個(gè)循環(huán)，72t:延伸10min，用Promega PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化 回收，去除多余的引物、dNTP和接頭；
V、T-載體連接及克隆 T-載體連接反應(yīng)體系為10 ii L，由5 ii L T-載體商業(yè)包裝中2 X連接緩沖液、1 y L 載體pMD18-T vector和4 y L步驟IV純化回收的DNA片段組成；同時(shí)以T載體自身連接作 為對(duì)照，4t:連接過(guò)夜；再用CaCl2制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5a進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到基因組微衛(wèi) 星富集文庫(kù)，并將文庫(kù)中的單菌落轉(zhuǎn)移培養(yǎng)平板中按順序排列； 步驟二d I中生物素標(biāo)記的含有重復(fù)序列的探針為生物素標(biāo)記的(CA)w寡核苷酸 探針或生物素標(biāo)記的(CAG)w寡核苷酸探針； 步驟二 a中限制性內(nèi)切酶為限制性內(nèi)切酶Tsp5091 、限制性內(nèi)切酶Tru91 、 限制性內(nèi)切酶CviQI、限制性內(nèi)切酶Bfal、限制性內(nèi)切酶Sau3AI或限制性內(nèi)切 酶T叫I ;步驟二中使用限制性內(nèi)切酶Tsp5091其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿 基序列為5 ' -CTCGTAGACTGCGTACC-3 '，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列為 5 ' -AATTGGTACGCAGTCTAC-3 ';使用限制性內(nèi)切酶Tru91、 CviQI或Bfal其單鏈寡核苷 酸連接頭A的堿基序列為5 ' -GACGATGAGTCCTGAG-3 '，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基 序列為5' -TACTCAGGACTCAT-3 ';使用限制性內(nèi)切酶Sau3AI其單鏈寡核苷酸連接頭A 的堿基序列為5 ' -GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3 '，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列 為5 ' -CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG-3 ';使用限制性內(nèi)切酶Taql其單鏈寡核苷酸連接 頭A的堿基序列為5 ' -GACGATGAGTCCTGAG-3 '，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列為 5' -CGCTCAGGACTCAT-3'; 步驟三中用通用引物M13+或M13—與含有重復(fù)序列的探針為引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò) 增，PCR反應(yīng)體系為15iiL，由0. 6iiL正向引物、0. 6iiL反向引物、1.5iiL Taq DNA聚合酶商 業(yè)包裝中10XBuffer、0. 9ii L濃度為25mmol/L的MgCl2、1. 2ii L濃度為2. 5mmol/L的dNTP、 0. 12 ii L濃度為5U/ ii L的Taq DNA聚合酶和余量的無(wú)菌去離子水組成；用無(wú)菌牙簽按順序 將單菌落挑入反應(yīng)管中進(jìn)行菌落PCR，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4t:預(yù)變性5min，94t:變性30s、6(rC 退火30s、72t:延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，72t:延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用濃度為1%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)，挑取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為200 750bp的具有明顯條帶的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；
步驟二 d I中選用生物素標(biāo)記的(CA) 16寡核苷酸探針，則步驟三PCR擴(kuò)增引物為 M13+和(CA、。，或者M(jìn)13-和(CA)1Q ;步驟二 d I中選用生物素標(biāo)記的(CAG) 16寡核苷酸探針 則步驟三PCR擴(kuò)增引物為M13+和(CAG)e，或者M(jìn)13-和(CAG)6。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方 式八相同。 本實(shí)施方式內(nèi)切酶從NEB公司購(gòu)買。 T4DNA連接酶購(gòu)自于美國(guó)Promega公司。pMD18-T vector購(gòu)自于寶生物工程(大 連)有限公司(大連TaKaRa公司)。感受態(tài)大腸桿菌DH5 a購(gòu)自于蓋寧生物科技(北京) 有限公司。 本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購(gòu)得，若無(wú)特殊 要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實(shí)施方式中未注明的操作步驟參見(jiàn)試劑使用說(shuō)明。
本實(shí)施方式步驟dill中25t:溫浴使生物素和鏈霉親和素結(jié)合。
本實(shí)施方式步驟dV中連接緩沖液中包含連接酶。 本實(shí)施方式中限制性內(nèi)切酶Tsp5091的粘末端序列為5' 4八17、酶切溫度孵育為 65°C，限制性內(nèi)切酶Tru91的粘末端序列為5' -TA,酶切溫度孵育為65°C，限制性內(nèi)切酶 CviQI的粘末端序列為5' -TA、酶切溫度孵育為37°C，限制性內(nèi)切酶BfaI的粘末端序列為 5' -TA、酶切溫度孵育為37°C，限制性內(nèi)切酶Sau3AI的粘末端序列為5' -GATC、酶切溫度 孵育為37°C，限制性內(nèi)切酶TaqIGATC的粘末端序列為5' -CG.酶切溫度孵育為65°C。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
八或九的不同點(diǎn)是步驟四對(duì)哲羅 鮭微衛(wèi)星序列進(jìn)行分析和引物設(shè)計(jì)按以下步驟實(shí)現(xiàn)
①根據(jù)步驟二限制性內(nèi)切酶和粘末端雙鏈接頭序列分組； ②根據(jù)分組采用相對(duì)應(yīng)的粘末端連接接頭序列進(jìn)行載體和接頭去除，所用程序?yàn)?DNA測(cè)序污染序列批量處理工具(專利申請(qǐng)
發(fā)明者佟廣香, 匡友誼, 孫效文, 尹家勝 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所