專利名稱：無飼養(yǎng)細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞的長期培養(yǎng)物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2004年5月21日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/573,545的優(yōu)先權(quán)。
關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究或開發(fā)的聲明待定。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞被定義為能夠分化成許多其它分化細(xì)胞類型的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是來自胚胎的干細(xì)胞，能夠分化成大多數(shù)，如果不是全部，成熟機(jī)體的分化細(xì)胞類型。干細(xì)胞被稱為是多能的，這是指它能夠分化成許多細(xì)胞類型。一類受到研究機(jī)構(gòu)高度關(guān)注的多能干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞，這里簡(jiǎn)稱為hES細(xì)胞，這是一種來自人胚胎來源的胚胎干細(xì)胞。人胚胎干細(xì)胞由于能夠在培養(yǎng)基中無限增殖并由此而能夠(至少原則上能夠)提供細(xì)胞和組織以替代缺陷或受損的人組織而受到極大科學(xué)關(guān)注。培養(yǎng)物中存在人胚胎干細(xì)胞有可能提供無限量的人細(xì)胞和組織以用于各種有助于人體健康的治療方案?？梢韵胂?，在未來，將能夠增殖人胚胎干細(xì)胞并使其定向分化成特定譜系以產(chǎn)生出于治療目的可移植入人體的分化的細(xì)胞或組織。
人胚胎干細(xì)胞一個(gè)最重要的特征是能夠自我更新。這就意味著hES細(xì)胞能夠增殖成多種后代干細(xì)胞，其中每種似乎都具有其祖先細(xì)胞的全部潛能。換句話說，后代被更新而具有親本細(xì)胞的所有發(fā)育和增殖能力。這種特性以及多能性使得hES細(xì)胞可用于多種潛在用途，因?yàn)?，從理論上說，hES細(xì)胞能夠無限大量復(fù)制且然后可誘導(dǎo)成為人體內(nèi)的任何細(xì)胞類型。根據(jù)已有知識(shí)而言，只有未分化的hES細(xì)胞才能夠無限自我更新，一旦細(xì)胞分化就喪失了自我更新的能力，至少從這一角度看，能夠自我更新的特性似乎與保持未分化的特性密切相關(guān)。由于人胚胎干細(xì)胞將自發(fā)分化，因此培養(yǎng)時(shí)必需小心以維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。
已經(jīng)描述了產(chǎn)生和培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞以維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)的基礎(chǔ)技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)的確有效，但一些目前用來培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法有限制和缺點(diǎn)。一種限制意義特別重大。大多數(shù)現(xiàn)有人胚胎干細(xì)胞系在一定程度上或在其它程度上已經(jīng)直接暴露于小鼠細(xì)胞或暴露于其中已經(jīng)培養(yǎng)過小鼠細(xì)胞的培養(yǎng)基。最初的產(chǎn)生和培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的技術(shù)要使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，在該飼養(yǎng)層上可培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞。成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層通過一些仍不十分清除的機(jī)制使得干細(xì)胞能夠保持在未分化狀態(tài)。隨后發(fā)現(xiàn)，如果使干細(xì)胞接觸“調(diào)理培養(yǎng)基(conditioned medium)”也能獲得相同的現(xiàn)象。調(diào)理培養(yǎng)基無非就是已經(jīng)培養(yǎng)過MEF等飼養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞培養(yǎng)基。無論飼養(yǎng)細(xì)胞是能賦予培養(yǎng)基某些因子還是能從培養(yǎng)基中除去某些因子，其結(jié)果都是調(diào)理培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)干細(xì)胞使其不發(fā)生分化。無論是培養(yǎng)條件、直接在飼養(yǎng)細(xì)胞上生長還是使用調(diào)理培養(yǎng)基都涉及一種或多種能從小鼠細(xì)胞傳遞到人ES細(xì)胞的試劑，如病毒。如果培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的一個(gè)目的是產(chǎn)生最終可植入人體的組織，就高度需要干細(xì)胞從而暴露于其它種類的細(xì)胞或者暴露于曾用來培養(yǎng)其它種類細(xì)胞的培養(yǎng)基。同時(shí)，使用任何種類的飼養(yǎng)細(xì)胞會(huì)在培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)帶來不需要的生物變異，而這是要盡可能避免的。因此，在利用人胚胎干細(xì)胞技術(shù)的持續(xù)發(fā)展中最感興趣的是找到能增殖和培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞但不含成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層且不含調(diào)理培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件。
一些培養(yǎng)基配方能夠在一段時(shí)間內(nèi)使人ES細(xì)胞維持未分化狀態(tài)，但長期培養(yǎng)時(shí)將不能維持這種狀態(tài)。具體地說，我們定義來自最初的種子培養(yǎng)物的人ES細(xì)胞在培養(yǎng)板上生長至細(xì)胞鋪滿一個(gè)“傳代”。我們發(fā)現(xiàn)一些培養(yǎng)基配方允許培養(yǎng)人ES細(xì)胞一或兩個(gè)傳代不發(fā)生嚴(yán)重分化，但在隨后的傳代中細(xì)胞逐漸或迅速分化。我們已經(jīng)開始相信，為得到確實(shí)能夠支持人ES細(xì)胞無限增殖而不分化且不含飼養(yǎng)細(xì)胞或飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)理的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基必需支持培養(yǎng)人ES細(xì)胞處于基本均勻且未分化狀態(tài)至少5代。
發(fā)明概述本發(fā)明可概述為一種不需任何類型的飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基的培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括在含有足以維持干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)量的鹽、維生素、氨基酸、葡萄糖、成纖維細(xì)胞生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明還涉及培養(yǎng)在含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑、因此無需成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基就可無限培養(yǎng)干細(xì)胞使其處于未分化狀態(tài)的培養(yǎng)基中的人胚胎干細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明的一個(gè)目的是定義一種不使用飼養(yǎng)細(xì)胞的人胚胎干細(xì)胞的長期培養(yǎng)條件，包括不在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)和不在飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)理過的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是定義一種盡可能確定的(defined)的同時(shí)完全不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件。
通過以下描述將了解本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖
簡(jiǎn)述無。
發(fā)明詳述對(duì)先前人胚胎干(ES)細(xì)胞培養(yǎng)物只有在存在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)或在調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)才能維持在未分化狀態(tài)的觀察，引起了成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)基中釋放了能夠抑制ES細(xì)胞分化的因子的推測(cè)。這種推測(cè)還基于對(duì)鼠ES細(xì)胞系的平行觀察，當(dāng)鼠ES細(xì)胞系與成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)會(huì)對(duì)成纖維細(xì)胞分泌的白血病抑制因子(LIF)響應(yīng)而維持未分化。LIF能夠激活鼠ES細(xì)胞中引發(fā)自我更新的信號(hào)途徑。然而，人ES細(xì)胞不對(duì)LIF產(chǎn)生響應(yīng)，其細(xì)胞表面實(shí)際上似乎不具有LIF受體。由于未從調(diào)理培養(yǎng)基中分離出似乎能阻止人ES細(xì)胞分化的單個(gè)因子，我們建立了一種新的假說。我們假設(shè)，成纖維細(xì)胞使非調(diào)理培養(yǎng)基中存在的分化因子失活。
各研究小組已經(jīng)研究了啟動(dòng)人ES細(xì)胞分化成富含一種或多種特定譜系細(xì)胞的后代細(xì)胞培養(yǎng)物的因子。這些分化因子之一是已知為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的蛋白質(zhì)因子類別。BMP是分泌型信號(hào)分子轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)超家族的成員。它們?cè)谂咛グl(fā)育的幾乎所有方面都發(fā)揮廣泛作用。BMP 4和BMP家族其它成員如BMP2、-5和-7結(jié)合II型BMP受體BRII，該受體能召集(recruit)I型受體BR1A(ALK3)或BR1B。配體激活后，I型受體的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化Smad1、-5和-8，它們?nèi)缓笤赟mad的保護(hù)下進(jìn)入細(xì)胞核并活化靶基因。細(xì)胞內(nèi)BMP、受體和Smad的相對(duì)表達(dá)水平是BMP誘導(dǎo)的應(yīng)答的重要決定因素。其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共刺激也能改變BMP效應(yīng)的特性。一個(gè)典型的例子是共激活小鼠ES細(xì)胞中的LIF信號(hào)引起的BMP的作用的變化單獨(dú)的BMP信號(hào)能誘導(dǎo)非神經(jīng)上皮分化，而BMP和LIF信號(hào)一起能抑制分化成任何譜系。胞外BMP拮抗劑如頭蛋白、gremlin、脊索發(fā)生素、抑制素、促濾泡素抑制素、扭型原腸胚形成(twisted gastrulation)和DAN家族的成員等可修飾、減弱BMP活性或使其完全無效。另一方面，一些信號(hào)傳導(dǎo)途徑可打斷胞內(nèi)BMP信號(hào)傳導(dǎo)。例如，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)激活的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)可通過磷酸化Smad的接頭結(jié)構(gòu)域而阻止Smad發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)從而抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)、Nodal或活化素(Activin)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化可通過胞內(nèi)通訊如與Smad4競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入細(xì)胞核而拮抗BMP信號(hào)傳導(dǎo)。預(yù)計(jì)所有這些分子都可用來拮抗BMP信號(hào)傳導(dǎo)以獲得這里所述的效應(yīng)。
還觀察到骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)刺激的胞內(nèi)信號(hào)的水平在生長在調(diào)理培養(yǎng)基中的人ES細(xì)胞中較低，而同種信號(hào)的水平在生長在非調(diào)理培養(yǎng)基(且不含成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞)中的人ES細(xì)胞中較高。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基產(chǎn)生的效應(yīng)可能是由于抑制了非調(diào)理培養(yǎng)基中存在的BMP誘導(dǎo)信號(hào)的作用的緣故。因此，我們研究了在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基時(shí)用BMP活性拮抗劑培養(yǎng)人ES細(xì)胞并使其處于未分化狀態(tài)的可能性。我們發(fā)現(xiàn)，并在此報(bào)告，這種可能性是正確的。通過拮抗BMP活性可以無限培養(yǎng)人ES細(xì)胞，同時(shí)使細(xì)胞保留胚胎干細(xì)胞的所有已知特性。
許多BMP拮抗劑都可用于本發(fā)明。已知最有效的這種拮抗劑是頭蛋白。已知具有BMP拮抗劑功能的其它蛋白質(zhì)包括gremlin、脊索發(fā)生素、抑制素、促濾泡素抑制素、扭型原腸胚形成和DAN家族的成員。如上所述，其它蛋白質(zhì)包括TFGβ和活化素以及能激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的其它分子。不要求拮抗劑蛋白是蛋白質(zhì)的人形式。只要求它能使非調(diào)理培養(yǎng)基維持ES細(xì)胞不分化即可。還可以使用特異于所有BMP或特定BMP的拮抗劑抗體。選擇何種蛋白質(zhì)作為BMP拮抗劑并不比所要實(shí)現(xiàn)的結(jié)果重要，該結(jié)果是BMP信號(hào)傳導(dǎo)活性被加入培養(yǎng)基的分子所抑制。最簡(jiǎn)單且最直接的實(shí)現(xiàn)此目的的方法是在培養(yǎng)人ES細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入BMP拮抗劑。
迄今為止鑒定出的最有效的BMP抑制劑是頭蛋白，它最初是根據(jù)其在非洲爪蟾(Xenopus)胚胎中的背側(cè)化(dorsalizing)活性克隆的。小鼠頭蛋白cDNA編碼有232個(gè)氨基酸(aa)殘基的前體蛋白，被假定為信號(hào)肽的19個(gè)氨基酸的殘基被剪切從而產(chǎn)生有213個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)，該成熟的蛋白質(zhì)被作為均二聚糖蛋白分泌。頭蛋白是一種高度保守的分子。成熟的小鼠頭蛋白與人和非洲爪蟾(Xenopus)頭蛋白分別有99％和83％的氨基酸序列相同。在胚胎發(fā)生期間頭蛋白有復(fù)雜的表達(dá)模式。在成人中，頭蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在一些成人中也在肺、骨骼肌和皮膚等外周組織中表達(dá)。頭蛋白顯示是一種拮抗幾乎所有BMP生物活性的高親和性BMP結(jié)合蛋白。
還發(fā)現(xiàn)高水平的成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)也可和或不和調(diào)理培養(yǎng)基一起用于培養(yǎng)干細(xì)胞。雖然已經(jīng)報(bào)道說FGF是干細(xì)胞培養(yǎng)條件的有益添加劑，如WO 01/66697，該文獻(xiàn)中，加入培養(yǎng)基的FGF是濃度為4ng/ml的堿性FGF(bFGF或FGF2)，但是本文報(bào)道說，以濃度高出約10倍的FGF進(jìn)行培養(yǎng)可得到更好結(jié)果。本文中，bFGF的優(yōu)選濃度為40ng/ml。雖然其它各種FGF變體也可用于此目的，但需要調(diào)節(jié)FGF的濃度以與這種水平bFGF的功效相一致，我們已顯示這種水平的bFGF也可抑制胞內(nèi)BMP活性。
培養(yǎng)基中，BMP拮抗劑產(chǎn)生的功效和高水平FGF產(chǎn)生的功效之間似乎有協(xié)同關(guān)系。換句話說，使用高水平bFGF(如100ng/ml)有助于在無飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基時(shí)培養(yǎng)hES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，但同時(shí)使用較低水平的bFGF(如40ng/ml)和BMP拮抗劑如頭蛋白也能達(dá)到這種效果。任何一種組合能使培養(yǎng)不僅“不含飼養(yǎng)細(xì)胞”而且完全“不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞”，術(shù)語“不含飼養(yǎng)細(xì)胞”用于使用調(diào)理培養(yǎng)基(用飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)節(jié))的培養(yǎng)，“不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞”是指完全不依賴于所有類型的飼養(yǎng)細(xì)胞。
下面的數(shù)據(jù)將證明這種假說是正確的。加入頭蛋白或其它BMP信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑并刺激成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)信號(hào)，人ES細(xì)胞可在無飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基時(shí)在未分化狀態(tài)無限生長。這使得無需接觸飼養(yǎng)細(xì)胞或接觸暴露于飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基就能啟動(dòng)并維持人ES細(xì)胞的培養(yǎng)，因此能夠在無動(dòng)物細(xì)胞的情況下在很好定義的培養(yǎng)基中增殖人ES細(xì)胞系。
培養(yǎng)人ES細(xì)胞一個(gè)相關(guān)問題是盡可能地除去ES細(xì)胞培養(yǎng)條件中未定義的組分和動(dòng)物源的組分。這么做有兩個(gè)原因。其一是要標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件以盡可能地將生物材料的正常變異(normal variation)最小化。另一個(gè)目的是要避免使用動(dòng)物來源的材料、細(xì)胞、滲出物或組分以避免任何可能的通過培養(yǎng)系統(tǒng)造成的交叉物種病毒傳遞。因此，定義培養(yǎng)條件的一個(gè)目的是避免使用動(dòng)物源產(chǎn)品。
因此，所定義的人ES細(xì)胞培養(yǎng)基從含有鹽、維生素、葡萄糖和氨基酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基開始。基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是大量的市售培養(yǎng)基中的任何一種。我們推薦以組合形式出售的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基和Hams F12培養(yǎng)基的組合(DMEM/F12)。在此基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入谷氨酰胺、β-巰基乙醇和非必需氨基酸。其它可能的添加劑包括抗氧化劑和脂質(zhì)。培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)成分是替代血清?？墒褂冒椎鞍谆蚣兓陌椎鞍桩a(chǎn)品如市售產(chǎn)品AlbuMaxTM，但我們推薦由白蛋白、胰島素和運(yùn)鐵蛋白構(gòu)成的定義的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。優(yōu)選人類蛋白質(zhì)，但這不是必須的，只要排除未表征的動(dòng)物產(chǎn)品即可。
值得一提的是，這里的觀察指出了哺乳動(dòng)物種類干細(xì)胞自我更新機(jī)制之間的基本差別。包括在培養(yǎng)基中加入LIF和BMP在內(nèi)的支持維持鼠干細(xì)胞的條件并不足以維持hES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。我們無法在添加有LIF和BMP4的無血清培養(yǎng)基中維持未分化的hES細(xì)胞。BMP使人ES細(xì)胞分化成滋養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)際上，這里顯示的數(shù)據(jù)指出，BMP信號(hào)傳導(dǎo)必須被拮抗以促進(jìn)人干細(xì)胞自我更新。因此顯然，在最低程度上，小鼠和人類細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞自我更新機(jī)制至少非常不同。
實(shí)施例方法和材料培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)物。非調(diào)理培養(yǎng)基(UM)含有80％DMEM/F12和20％KNOCKOUT替代血清，并添加有1mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸(都來自Invitrogen)和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)。制備調(diào)理培養(yǎng)基(CM)時(shí)將非調(diào)理培養(yǎng)基與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培育過夜然后收集培養(yǎng)基，再在其中添加4ng/ml bFGF并冷凍，在2周內(nèi)使用。hESC在涂有Matrigel(BD Scientific)的平板上用添加有或未添加0.5μg/ml小鼠頭蛋白(R&D Systems)或40ng/ml人bFGF(Invitrogen)或這兩者的CM或UM培育，并用2mg/ml Dispase(Invitrogen)繁殖以分散細(xì)胞集落。為評(píng)估Oct4+細(xì)胞數(shù)，在諸孔的各培養(yǎng)基中加入含有35000個(gè)細(xì)胞細(xì)胞的懸浮集落并培育7天。在第1和7天收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)，通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS，見下文)檢測(cè)第7天的Oct4+細(xì)胞。為形成胚狀體(Eb)將已在CM或UM/bFGF/頭蛋白(UMFN)中培養(yǎng)的hESC作為細(xì)胞叢(cell clump)懸浮于未涂布平板上的UM中，并在搖床上培養(yǎng)7天。然后將EB細(xì)胞重鋪于明膠涂布平板上的添加有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基上，培育5天，然后收獲并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)分析。試驗(yàn)重復(fù)多次并對(duì)整個(gè)研究進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)分析。
免疫沉淀和western印跡。在T75燒瓶中用2.12×105/ml照射過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)15ml DMEM/F12培養(yǎng)基過夜。收集培養(yǎng)基，用截止分子量為5kD的濾膜(Millipore)濃縮至約0.7ml，并用山羊抗小鼠頭蛋白和gremlin抗體(R&DSystems)(各5μg)或10μg作為陰性對(duì)照的山羊IgG進(jìn)行免疫沉淀。沉淀的蛋白質(zhì)或細(xì)胞溶解產(chǎn)物在4％-20％線性梯度聚丙烯酰胺凝膠Tris-HCl預(yù)制膠(BioRad)上電泳以進(jìn)行western印跡(圖2A)?？剐∈箢^蛋白和gremlin的抗體用于免疫沉淀的蛋白質(zhì)，抗人Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8(Cell Signaling Technology)、BMP2/4(R&D Systems)和β-肌動(dòng)蛋白(Abcam)的抗體用于細(xì)胞溶解產(chǎn)物。印跡用ECL替代溶液1和2(Amersham Biosciences)處理并暴露于Fuji成像儀以分析化學(xué)熒光。
BMP/Smad-螢光素酶報(bào)道分子試驗(yàn)。用BMP/Smad-反應(yīng)性螢火蟲螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pID120-Lux以及痕量表達(dá)花蟲螢光素酶作為內(nèi)部對(duì)照的pRL-tk質(zhì)粒(Promega)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在CM中的hESC。轉(zhuǎn)染后1天用不同方法處理細(xì)胞24小時(shí)。提取細(xì)胞溶解產(chǎn)物并在3010發(fā)光計(jì)(BD Biosciences)上用雙螢光素酶報(bào)道分子測(cè)定系統(tǒng)(Promega)檢測(cè)螢火蟲和花蟲螢光素酶的活性。結(jié)果表示為用花蟲螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲螢光素酶活性。
定量-PCR和RT-PCR。細(xì)胞總RNA用RNeasy試劑盒(Qiagen)提取，并用無RNA酶的DNA酶按照制造商的說明處理。用Improm-II逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega)將1μgRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在AB 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上用SYBR greenQ-PCR Mastermix(Stratagene)進(jìn)行定量-PCR，定量-PCR條件如下95℃10分鐘，40輪的95℃30秒、60℃1分鐘、72℃1分鐘，并在72℃延伸3分鐘。按照AppliedBiosystems的說明，檢測(cè)作為內(nèi)源參照的GAPDH轉(zhuǎn)錄物以計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。RT-PCR條件如下94℃3分鐘，循環(huán)不同輪數(shù)(見下文)的94℃20秒、55℃30秒、72℃1分鐘。通過電泳在凝膠上分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并在紫外光下拍攝DNA條帶。引物序列和PCR輪數(shù)如下。
表1.Q-PCR和RT-PCR的引物和輪數(shù)PCR
FACS和免疫細(xì)胞化學(xué)。對(duì)培養(yǎng)在各種培養(yǎng)基中的hESC進(jìn)行FACS分析以檢測(cè)Oct4+細(xì)胞。使用2μg/ml的小鼠抗人Oct4抗體(Santa Cruz Biotechnology)和1∶1000稀釋的熒光異硫氰酸(fluorescent isothiocyanate)標(biāo)記的兔抗小鼠第二抗體(MolecularProbes)。對(duì)Oct4+細(xì)胞百分比轉(zhuǎn)化得到的反正弦數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。為進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)，使用小鼠抗Oct4抗體(0.2μg/ml)和1∶1000稀釋的Alexa Fluor488-標(biāo)記的抗小鼠IgG第二抗體(Molecular Probes)。
培養(yǎng)基中HCG的免疫測(cè)定。使在UMFN(有bFGF和頭蛋白的非調(diào)理培養(yǎng)基)中培養(yǎng)多次傳代的hESC在添加有100ng/ml BMP4的CM中最多培養(yǎng)7天，每天更新培養(yǎng)基和BMP4。在第3、5和7天收集用過的培養(yǎng)基并按所述測(cè)定HCG。
G顯帶和熒光原位雜交。處理在UMFN中培養(yǎng)多個(gè)傳代的hESC，以進(jìn)行G顯帶和熒光原位雜交。在所有分散并固定的細(xì)胞在選擇20個(gè)中期細(xì)胞進(jìn)行G顯帶分析，并用探針對(duì)100-200個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行熒光原位雜交試驗(yàn)以檢測(cè)感興趣的染色體內(nèi)的標(biāo)記基因。觀察通過CytoVysion數(shù)字成像系統(tǒng)(Applied Imaging)捕獲的各個(gè)圖象。
結(jié)果UM具有BMP樣分化誘導(dǎo)活性。UM含有20％KNOCKOUTTM替代血清(Invitrogen)，后者包括一種富含脂質(zhì)的專有牛白蛋白組分ALBUMAXTM。UM用成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)過夜，然后添加4ng/ml人bFGF以得到CM。我們將hESC(H1)培養(yǎng)在CM、UM、CM和UM的1∶1混合物或CM和DMEM/F12的1∶1混合物中。CM或CM-DMEM/F121∶1混合物中的細(xì)胞保持未分化，并具有典型的hESC形態(tài)特征。然而，UM或CM-UM 1∶1混合物中細(xì)胞都在48小時(shí)內(nèi)迅速分化。我們?nèi)缓笥眉兓奶ヅＱ灏椎鞍?16.6g/L，F(xiàn)isher Scientific)代替替代血清以確定是否是白蛋白造成了分化。這種培養(yǎng)基能夠維持hESC處于未分化形態(tài)約7天；但是，細(xì)胞的增殖速度減慢并逐漸分化成混合細(xì)胞群。這些結(jié)果說明，替代血清中除白蛋白之外的組分導(dǎo)致UM培養(yǎng)的細(xì)胞迅速分化。CM降低了這種分化誘導(dǎo)活性，但也提供維持hESC自我更新的有利因子。除白蛋白外，替代血清還含有培養(yǎng)hESC所需的其它組分，因此隨后的所有研究使用替代血清而不是白蛋白。
為檢測(cè)UM的分化誘導(dǎo)活性是否刺激hESC中的BMP信號(hào)傳導(dǎo)，我們用western印跡來評(píng)估BMP受體的直接下游效應(yīng)物磷酸化Smad1的水平。Smad1磷酸化(這里所用的抗體也能檢測(cè)BMP的其它效應(yīng)物Smad5和Smad8的磷酸化)在CM中培養(yǎng)的H1細(xì)胞內(nèi)較低，但在UM或CM+BMP4中培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞內(nèi)較高。在UM中加入頭蛋白減低了Smad1的磷酸化水平，但在UM中加入40ng/ml bFGF未改變Smad1的磷酸化水平。BMP信號(hào)傳導(dǎo)可誘導(dǎo)BMP配體表達(dá)，在包括hESC在內(nèi)的各種種類的細(xì)胞內(nèi)形成正反饋環(huán)。實(shí)際上，相比培養(yǎng)在CM或加有頭蛋白的UM中的細(xì)胞，UM培養(yǎng)的hESC的BMP2/4蛋白水平升高。現(xiàn)在還不清楚是否是UM中的BMP直接刺激hESC中的BMP信號(hào)傳導(dǎo)，或者是否有其它分化誘導(dǎo)分子通過誘導(dǎo)BMP分泌而間接刺激BMP信號(hào)傳導(dǎo)。在用成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中都檢測(cè)出頭蛋白和另一種BMP拮抗劑gremlin。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，UM培養(yǎng)的hESC中存在升高但可抑制的BMP信號(hào)傳導(dǎo)活性，且在hESC的成纖維支持的培養(yǎng)基中同時(shí)存在BMP激動(dòng)劑和拮抗劑。
我們還用特異性應(yīng)答B(yǎng)MP/Smad的螢光素酶報(bào)道分子質(zhì)粒評(píng)估了在存在或不存在蛋白質(zhì)因子時(shí)培養(yǎng)在不同培養(yǎng)基中的hESC(H14)的BMP信號(hào)傳導(dǎo)。報(bào)道分子活性隨替代血清或BMP4濃度增加而增加，并隨頭蛋白或bFGF濃度增加而降低。500ng/ml頭蛋白和40ng/ml bFGF對(duì)于將報(bào)道分子活性降低到類似于CM獲得的水平具有協(xié)同效應(yīng)。有點(diǎn)奇怪的是，不添加頭蛋白時(shí)，更高濃度的bFGF(100ng/ml)將BMP信號(hào)傳導(dǎo)降至與CM獲得的水平相當(dāng)?shù)乃?。這些結(jié)果提示，替代血清實(shí)際上具有BMP樣活性，頭蛋白和/或bFGF可降低這種活性。
Id1啟動(dòng)子含有BMP反應(yīng)性元件，已顯示Id1是人和小鼠ESC中BMP信號(hào)傳導(dǎo)的靶點(diǎn)。因此我們檢測(cè)了培養(yǎng)在各種培養(yǎng)基中的hESC的Id基因表達(dá)，Id基因是BMP信號(hào)傳導(dǎo)活性的第二指示物。在UM或CM+BMP4中培養(yǎng)24小時(shí)的hESC(H9)中的Id1-4轉(zhuǎn)錄物高于培養(yǎng)在CM中的細(xì)胞，在UM中加入頭蛋白能降低Id基因的表達(dá)。
UM/bFGF/頭蛋白維持hESC的未分化增殖。添加有0.5μg/ml頭蛋白和40ng/mlbFGF的UM能維持hESC的未分化增殖。等數(shù)目涂布H1細(xì)胞并在CM、UM、UM+bFGF、UM+頭蛋白或UM+bFGF+頭蛋白中培育7天。7天后，CM和UM/bFGF/頭蛋白中的Oct4+細(xì)胞數(shù)明顯高于UM、UM/bFGF或UM/頭蛋白。測(cè)得UM/bFGF和UM/頭蛋白中的Oct4+細(xì)胞數(shù)居中，說明頭蛋白和bFGF有協(xié)同效應(yīng)。培養(yǎng)在UM/bFGF或UM/頭蛋白中的hESC能繁殖多代，但分化的細(xì)胞聚集在hESC集落中間(UM/bFGF)或邊緣(UM/頭蛋白)。如果白蛋白濃度降至0.1μg/ml同時(shí)bFGF濃度降至10ng/ml，培養(yǎng)在UM/bFGF/頭蛋白中的細(xì)胞還會(huì)出現(xiàn)分化加劇。UM/bFGF/頭蛋白中的頭蛋白可用gremlin(5μg/ml)或可溶性BMP受體IA(0.5μg/ml)代替(未顯示數(shù)據(jù))，從而支持了頭蛋白的作用實(shí)際上是通過用BMP中斷BMP受體的活性。
在UM/bFGF/頭蛋白中擴(kuò)展了40天以上(分別7、6和6代)的三種不同的hESC細(xì)胞系(H1、H9和H14)仍為Oct4陽性，但如果換成缺乏bFGF和頭蛋白的UM后隨后發(fā)生分化。UM/bFGF/頭蛋白培養(yǎng)的hESC繼續(xù)表達(dá)其它ES細(xì)胞標(biāo)記(包括Nanog和Rexl)和細(xì)胞表面標(biāo)記SSEA4和TRA-1-60(未顯示數(shù)據(jù))。即便在最佳培養(yǎng)物中hESC也混有少量自發(fā)分化的細(xì)胞。例如，在CM培養(yǎng)的ES細(xì)胞中可檢測(cè)到低水平的滋養(yǎng)層標(biāo)記絨毛膜促性腺激素β-亞單位(CGβ)，這說明存在少許滋養(yǎng)層群體。然而在UM/bFGF/頭蛋白培養(yǎng)的細(xì)胞中未檢測(cè)到這種標(biāo)記。在CM和UM/bFGF/頭蛋白培養(yǎng)的hESC中神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記Pax6和NeuroDl、中胚層標(biāo)記brachyury和內(nèi)胚層標(biāo)記HNF3a均呈陰性。因此，UM/bFGF/頭蛋白中繁殖的ES細(xì)胞在長期培養(yǎng)后維持了特有的ES細(xì)胞標(biāo)記。
我們還檢測(cè)了在UM/bFGF/頭蛋白中長期培養(yǎng)后的hESC。H9細(xì)胞在UM/bFGF/頭蛋白中連續(xù)培養(yǎng)32代。H1和H14細(xì)胞在UM/bFGF/頭蛋白中分別培養(yǎng)20和16代后冷凍。H14細(xì)胞隨后直接解凍到UM/bFGF/頭蛋白中并培養(yǎng)到第18代。在UM/bFGF/頭蛋白中分別培養(yǎng)27和18代的H9和H14細(xì)胞的Oct4+細(xì)胞的倍增時(shí)間和比例類似于CM培養(yǎng)的對(duì)照hESC。
UM/bFGF/頭蛋白維持了hESC的發(fā)育潛能。當(dāng)在CM中用BMP4處理3-7天時(shí)，在UM/bFGF/頭蛋白中已經(jīng)培養(yǎng)10代的hESC分化成扁平上皮并在培養(yǎng)基中分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)，這標(biāo)志著滋養(yǎng)層分化。來自在UM/bFGF/頭蛋白中培養(yǎng)5代的H1細(xì)胞及來自CM培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞的胚狀體(EB)表達(dá)滋養(yǎng)層標(biāo)記CGβ和三個(gè)胚層的標(biāo)記，包括Pax6、NeuroDl、brachyury和HNF3a。EB細(xì)胞還具有降低的ES細(xì)胞標(biāo)記Oct4、Nanog和Rexl的表達(dá)。在UM/bFGF/頭蛋白中分別培養(yǎng)7和6代的H1和H9細(xì)胞被注射入SCID-米色鼠。接種5-6周后小鼠出現(xiàn)了顯示復(fù)雜分化的畸胎瘤。
UM/bFGF/頭蛋白培養(yǎng)的ES細(xì)胞核型正常。通過標(biāo)準(zhǔn)G顯帶分析在UM/bFGF/頭蛋白中培養(yǎng)5代的H1細(xì)胞、培養(yǎng)33代的H9和培養(yǎng)19代的H14的核型，并通過熒光原位雜交檢測(cè)染色體12和17。細(xì)胞保持了正常的核型。
培養(yǎng)在定義的人源化系統(tǒng)內(nèi)的ES細(xì)胞保持未分化。盡管用UMFN代替CM可以不使用小鼠衍生的飼養(yǎng)細(xì)胞，但UM仍含有胎牛血清衍生的白蛋白提取物(這是一種不完全定義的組分)，且涂布平板的材料Matrigel是一種提取白小鼠腫瘤的可溶性基底膜基質(zhì)。因此，進(jìn)一步除去這些動(dòng)物材料以定義人ES細(xì)胞的人源化培養(yǎng)系統(tǒng)是適當(dāng)?shù)?。我們首先尋找代替以前使用的KNOCKOUT SR產(chǎn)品的定義的人源化替代血清，考慮了由三種人蛋白白蛋白、胰島素和運(yùn)鐵蛋白構(gòu)成的Sigma的50x SeralReplacement3(SR3)。已知可用層粘連蛋白代替Matrigel涂布平板，以便用CM培養(yǎng)人ES細(xì)胞。然后我們建立了一個(gè)系統(tǒng)，其中在層粘連蛋白涂布的平板上用含有5XSR3代替KNOCKOUT SR并添加有40ng/ml FGF2和0.5μg/ml頭蛋白的UM培養(yǎng)人ES細(xì)胞。該系統(tǒng)中的ES細(xì)胞在數(shù)周傳代后也保持了ES細(xì)胞的一致性。因此，這種由定義的人源化培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)成的組合適合人ES細(xì)胞。
這些數(shù)據(jù)組一起證實(shí)，通過使用包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑如頭蛋白以及FGF的培養(yǎng)條件可避免使用飼養(yǎng)細(xì)胞和調(diào)理培養(yǎng)基。然后可選擇培養(yǎng)基的其它組分以避免使用動(dòng)物產(chǎn)品。得到的高度定義的培養(yǎng)基能夠長期培養(yǎng)和增殖人胚胎干細(xì)胞同時(shí)保留那些細(xì)胞的全部潛能。
權(quán)利要求
1.一種在不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有足以維持干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)量的鹽、維生素、氨基酸、葡萄糖、成纖維細(xì)胞生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有濃度至少為4ng/ml的成纖維細(xì)胞生長因子。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑是頭蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞生長因子是bFGF，其濃度為40ng/ml。
5.一種在含有鹽、維生素、氨基酸和成纖維細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征在于，在該培養(yǎng)基中加入一定量的骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)拮抗劑，加入量足以維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，且無需使干細(xì)胞或培養(yǎng)基接觸飼養(yǎng)細(xì)胞。
6.一種在含有鹽、維生素、氨基酸和成纖維細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征在于，抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)作用，從而可維持干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，且無需接觸飼養(yǎng)細(xì)胞或接觸暴露于飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
7.一種體外細(xì)胞培養(yǎng)物，其在培養(yǎng)瓶中含有人胚胎干細(xì)胞，和培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有鹽、維生素、氨基酸、葡萄糖、成纖維細(xì)胞生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)拮抗劑，其含量足以在不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)維持干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，所述培養(yǎng)基不含飼養(yǎng)細(xì)胞且從未接觸飼養(yǎng)細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑選自通過物理相互作用而胞外抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的因子，包括頭蛋白、gremlin、脊索發(fā)生素、抑制素、促濾泡素抑制素、扭型原腸胚形成和DAN家族的成員。
9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)拮抗劑是頭蛋白。
10.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑選自胞內(nèi)抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的因子，包括FGF、TGFβ、Nodal和活化素。
11.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有濃度至少為4ng/ml bFGF的成纖維細(xì)胞生長因于。
12.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有選自白蛋白、胰島素和運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是人蛋白。
14.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是重組蛋白。
15.一種在不依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有鹽、維生素、氨基酸、葡萄糖、成纖維細(xì)胞生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑，其含量足以維持生長在培養(yǎng)基中的干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，且該培養(yǎng)基未接觸飼養(yǎng)細(xì)胞或接觸暴露于飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
16.如權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑選自通過物理相互作用而胞外抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的因子，包括頭蛋白、gremlin、脊索發(fā)生素、抑制素、促濾泡素抑制素、扭型原腸胚形成和DAN家族的成員。
17.如權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑選自胞內(nèi)抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的因子，包括FGF、TGFβ、Nodal和活化素。
18.如權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述骨蛋白拮抗劑是頭蛋白。
19.如權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有選自白蛋白、胰島素和運(yùn)鐵蛋白的蛋白質(zhì)。
20.如權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞生長因子是bFGF，其在培養(yǎng)基中的存在濃度至少為4ng/ml。
全文摘要
以前培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法需要成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞或曾經(jīng)接觸成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基以將干細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，如果在培養(yǎng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白拮抗劑和成纖維細(xì)胞生長因子，即便沒有飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基，干細(xì)胞也將無限期地維持未分化。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK101018857SQ200580016446
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月21日
發(fā)明者徐仁和, J·A·湯姆森 申請(qǐng)人:威塞爾研究所股份有限公司