專利名稱：用于子宮頸疾病檢測(cè)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)高度子宮頸疾病的方法和組合物。
背景技術(shù)：
宮頸癌是婦女中的第二大常見(jiàn)腫瘤，大約占所有女性癌癥的12％，每年導(dǎo)致大約250,000人死亡。Baldwin等人(2003)Nature ReviewsCancer 31-10。在許多不能進(jìn)行大規(guī)模篩查程序的發(fā)展中國(guó)家，臨床問(wèn)題更加嚴(yán)重。在這些國(guó)家，宮頸癌是婦女中癌癥死亡的頭號(hào)病因。
大部分宮頸癌的病例表現(xiàn)為鱗狀細(xì)胞癌，盡管也觀察到腺癌。可通過(guò)人群篩查來(lái)預(yù)防宮頸癌，因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)已完全明確的非浸潤(rùn)上皮內(nèi)階段演化而來(lái)，所述階段可通過(guò)形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行辨別。Williams等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514932-14937。盡管不知道正常細(xì)胞是如何開(kāi)始轉(zhuǎn)化的，但從正常的復(fù)層上皮通過(guò)子宮頸上皮內(nèi)贅瘤(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)至浸潤(rùn)性癌的組織病理學(xué)變化的連續(xù)譜的概念多年來(lái)已被廣泛接受。宮頸癌的前身是發(fā)育異常，在本領(lǐng)域也稱為CIN或鱗狀上皮內(nèi)病變(squamousintraepithelial lesions，SIL)。可使用三級(jí)(three-tiered)(CIN)或二級(jí)(two-tiered)(Bethesda)系統(tǒng)將鱗狀上皮內(nèi)異常分類。在Bethesda系統(tǒng)下，低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)，對(duì)應(yīng)于CINI和HPV感染，通常代表了有效果的HPV感染，其發(fā)展成浸潤(rùn)性疾病的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低。盡管LSIL和HSIL都被視為惡性腫瘤的潛在前身，但在三級(jí)系統(tǒng)中對(duì)應(yīng)于CINII和CINIII的高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)，和LSIL相比顯示更高的發(fā)展成宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。在該系統(tǒng)下，也可將患者的樣品分類為ASCUS(意義不明的非典型性鱗狀細(xì)胞，atypical squamouscells of unknown significance)或AGUS(意義不明的非典型性腺細(xì)胞，atypical glandular cells of unknown significance)。
已證實(shí)宮頸癌和通過(guò)高危型的人乳頭瘤病毒(HPV)例如16、18和31型的感染之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。事實(shí)上，大量流行病學(xué)和分子生物學(xué)證據(jù)已將HPV感染確定為宮頸癌的病因因素。此外，在85％或更多的高度子宮頸疾病的病例中發(fā)現(xiàn)了HPV。然而，HPV感染非常普遍，可能在5-15％超過(guò)30歲的婦女中發(fā)生，但很少有HPV陽(yáng)性的婦女會(huì)發(fā)展成高度子宮頸疾病或癌癥。單獨(dú)的HPV存在只是感染的指標(biāo)，而不是高度子宮頸疾病的指標(biāo)，因此，只對(duì)HPV感染進(jìn)行檢測(cè)導(dǎo)致許多假陽(yáng)性。參見(jiàn)，例如，Wright等人(2004) Obstet.Gyhecol.103304-309。
目前的文獻(xiàn)表明HPV感染宮頸的深部組織內(nèi)的基底干細(xì)胞。干細(xì)胞向成熟角質(zhì)形成細(xì)胞的分化(結(jié)果導(dǎo)致所述細(xì)胞遷移至復(fù)層子宮頸上皮)和HPV病毒復(fù)制以及細(xì)胞的再傳染有關(guān)聯(lián)。在該病毒復(fù)制過(guò)程中，發(fā)生許多細(xì)胞變化，包括細(xì)胞周期失控(de-regulation)、活躍的增殖、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄激活和基因組的不穩(wěn)定性(Crum(2000)ModeriiPatliology 13243-251；Middleton等人(2003)J.Virol.7710186-10201；Pett等人(2004)CaracerRes.641359-1368)。
大多數(shù)HPV感染實(shí)際上是短暫的，因?yàn)椴《靖腥緯?huì)在12個(gè)月內(nèi)將其自身消解。對(duì)于那些因?yàn)橐环N或多種HPV的致癌亞型而發(fā)生持久性感染的個(gè)體，和無(wú)HPV感染的患者相比，存在發(fā)展瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)。已知HPV在子宮頸瘤形成(cervical neoplasia)的發(fā)展上的重要性，在鑒定可能發(fā)生子宮頸瘤形成的患者上，HPV的臨床檢測(cè)已逐漸成為重要的診斷工具。基于HPV的子宮頸疾病的篩查的臨床功效在于其陰性預(yù)測(cè)價(jià)值。HPV陰性結(jié)果和正常的Pap抹片檢查史一起是無(wú)疾病狀況和在以后的1-3年期間較少可能發(fā)生子宮頸瘤形成的優(yōu)良指標(biāo)。然而，陽(yáng)性HPV結(jié)果不是子宮頸疾病的診斷，而只是感染的指征。盡管大多數(shù)HPV感染是短暫的并且會(huì)在12個(gè)月的時(shí)期內(nèi)自發(fā)清除，但具有高危HPV病毒亞型的持續(xù)性感染預(yù)示著發(fā)生子宮頸瘤形成的更大可能性。為補(bǔ)充HPV檢測(cè)，預(yù)期和子宮頸瘤形成關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)志物的鑒定可提高針對(duì)子宮頸疾病診斷的臨床特異性。
對(duì)經(jīng)帕帕尼古拉烏染色的子宮頸抹片(Pap抹片)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查目前是檢測(cè)子宮頸癌所選用的方法。Pap抹片檢查是種主觀的方法，60多年來(lái)其基本上保持未變。然而，關(guān)于其性能存在幾個(gè)顧慮。報(bào)道的單一Pap檢查的靈敏度(檢查呈陽(yáng)性的疾病陽(yáng)性的比例)較低，并且顯示較寬的變化范圍(30-87％)。對(duì)于潛在的高度疾病的確定，單一Pap抹片檢查的特異性(經(jīng)檢驗(yàn)呈陰性的疾病陰性的比例)在篩查人群中低達(dá)86％，在ASCUS PLUS人群中更要低得多。參見(jiàn)，Baldwin等人，同上。相當(dāng)比例的鑒定為L(zhǎng)SIL或CINI的Pap抹片檢查實(shí)際上是高度病變陽(yáng)性。此外，高達(dá)10％的Pap抹片檢查被分類為ASCUS(意義不明的非典型性鱗狀細(xì)胞)，即不太可能明確歸類為正常、中度或嚴(yán)重病變、或腫瘤。然而，經(jīng)驗(yàn)顯示高達(dá)10％的該ASCUS群體具有高度病變，所述病變因此而被忽略掉。參見(jiàn)，例如，Manos等人(1999) JAMA2811605-1610。
因此，需要這樣的用于診斷高度子宮頸疾病的方法，該方法不依賴于常規(guī)的Pap抹片檢查和針對(duì)高危HPV感染的分子檢測(cè)或者與其一起使用。該方法應(yīng)當(dāng)能夠特異性地鑒定存在于所有患者群體中的高度子宮頸疾病，包括通過(guò)Pap染色被分類為L(zhǎng)SIL或CINI、而實(shí)際上是高度病變陽(yáng)性(即，“假陰性”)的病例。因此，本領(lǐng)域需要這樣的特異的、可靠的診斷方法，該方法能夠檢測(cè)高度子宮頸疾病以及能夠區(qū)別高度疾病和不被當(dāng)作臨床疾病的病癥例如早期HPV感染和輕度發(fā)育異常。
發(fā)明概述提供了用于診斷高度子宮頸疾病的組合物和方法。本發(fā)明的方法包括檢測(cè)至少一種生物標(biāo)志物、特別是核生物標(biāo)記物在機(jī)體樣品中的過(guò)表達(dá)，其中所述所述生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)的檢測(cè)特異性地鑒定顯示高度子宮頸疾病的樣品。本方法可將顯示高度子宮頸疾病的樣品和顯示良性增殖、早期HPV感染或輕度發(fā)育異常的樣品區(qū)分開(kāi)。因此，該方法依賴于這樣的生物標(biāo)志物的檢測(cè)，該生物標(biāo)志物選擇性地在高度子宮頸疾病狀態(tài)中過(guò)表達(dá)，而不在正常細(xì)胞或不指示臨床疾病的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。
本發(fā)明的生物標(biāo)志物是選擇性地在高度子宮頸疾病中過(guò)表達(dá)的蛋白和/或基因，包括由于HPV誘導(dǎo)的細(xì)胞周期功能失調(diào)和負(fù)責(zé)S期誘導(dǎo)的某些基因的激活造成的蛋白和/或基因的過(guò)表達(dá)。特別吸引人的生物標(biāo)志物包括S期基因，其過(guò)表達(dá)是由于HPV誘導(dǎo)的細(xì)胞周期功能失調(diào)和隨后的轉(zhuǎn)錄因子SP-1和E2F的激活造成的。本發(fā)明的生物標(biāo)志物基因或蛋白的過(guò)表達(dá)的檢測(cè)可區(qū)分顯示高度疾病的樣品(例如中度至嚴(yán)重的發(fā)育異常和宮頸癌)和正常細(xì)胞或不指示臨床疾病(例如，無(wú)發(fā)育異常的早期HPV感染和輕度發(fā)育異常)的細(xì)胞。
可在蛋白或核酸水平上估計(jì)生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，提供了利用抗體在子宮頸細(xì)胞學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。在本發(fā)明的該方面，使用至少一種針對(duì)感興趣的特定生物標(biāo)志物的抗體。也可通過(guò)基于核酸的技術(shù)(包括，例如，雜交和RT-PCR)檢測(cè)過(guò)表達(dá)。此外還提供了包含用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑的試劑盒。
也可將本發(fā)明的方法和用于分析形態(tài)學(xué)特征或HPV感染狀況的常規(guī)婦科診斷技術(shù)結(jié)合使用。因此，例如，此處提供的免疫細(xì)胞化學(xué)方法可和Pap抹片檢查一起使用，這樣就保存了來(lái)自常規(guī)方法的所有形態(tài)學(xué)信息。通過(guò)這種方式，對(duì)在高度子宮頸疾病中選擇性地過(guò)表達(dá)的生物標(biāo)記物的檢測(cè)可減少Pap抹片檢查的高假陽(yáng)性率，從而有助于大規(guī)模自動(dòng)化篩查。
附圖概述

圖1提供了子宮頸結(jié)構(gòu)異常中的增殖和細(xì)胞周期失控的圖解概述。子宮頸瘤形成中的細(xì)胞周期變化和增殖控制缺陷。HPV感染和E6與E7癌蛋白(oncoproteins)的過(guò)表達(dá)引起了細(xì)胞周期和增殖控制中的一系列變化。HPV E6癌蛋白消除了G1/S和G2/M界線上的細(xì)胞周期關(guān)卡，結(jié)果DNA進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生體細(xì)胞突變。E7促進(jìn)了加速進(jìn)入S期，結(jié)果DNA復(fù)制所需的S期基因長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)(異常的S期誘導(dǎo))。同樣，E6提高了端粒酶的表達(dá)，在增殖和細(xì)胞永生化期間確保了連續(xù)的染色體端粒完整性。最后，E7消除了TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而消除了G1期阻滯的該控制機(jī)制和增殖的控制。
圖2提供了子宮頸瘤形成中的異常S期誘導(dǎo)的示意性圖解說(shuō)明。HPV蛋白對(duì)細(xì)胞周期控制和增殖的作用包括p53和Rb腫瘤抑制途徑的失活、E2F-1轉(zhuǎn)錄的激活、S期基因MCM-2、MCM-6、MCM-7、TOP2A和細(xì)胞周期蛋白E1等的誘導(dǎo)。此外，E2和Sp-1轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而激活p21-waf-1的基因表達(dá)。
圖3提供了細(xì)胞周期的異常S期中關(guān)于細(xì)胞增殖的反饋回路的示意圖。S期中細(xì)胞周期蛋白E和CDK2的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致允許誘導(dǎo)S期基因的獨(dú)立機(jī)制。
圖4提供了c-myc在異常S期誘導(dǎo)中的作用的示意圖。C-myc是細(xì)胞增殖中重要的轉(zhuǎn)錄激活物。編碼c-myc的基因位于染色體上。該位置與已證實(shí)了HPV18的整合以及該基因區(qū)域的相應(yīng)擴(kuò)增屬同一位置。c-myc基因的擴(kuò)增將導(dǎo)致被編碼的蛋白的過(guò)表達(dá)，c-myc的增加的水平將獨(dú)立地促進(jìn)S期基因轉(zhuǎn)錄，從而進(jìn)一步加速細(xì)胞增殖。
圖5提供了針對(duì)MCM7轉(zhuǎn)錄體變體的TaqMan引物的示意圖。
圖6舉例說(shuō)明了具有輕度發(fā)育異常的患者和患有鱗狀細(xì)胞癌的患者在IHC測(cè)定法中針對(duì)Claudin 1的抗體的差異染色模式。
圖7舉例說(shuō)明IHC和ICC形式中針對(duì)Claudin 1的抗體的差異染色模式。顯示了正常細(xì)胞和指示CINIII和HSIL的細(xì)胞。
圖8舉例說(shuō)明了用核生物標(biāo)志物(即，MCM2)獲得的細(xì)胞核染色模式和用細(xì)胞質(zhì)生物標(biāo)志物(p16)獲得的細(xì)胞質(zhì)染色模式。結(jié)果來(lái)自高度子宮頸疾病患者樣品的免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)測(cè)定。
圖9舉例說(shuō)明在使用兩種不同的針對(duì)MCM6的抗體對(duì)來(lái)自患有高度子宮頸疾病的患者的宮頸組織進(jìn)行的免疫組織化學(xué)(IHC)測(cè)定中期望的和不期望的抗體染色。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于鑒定或診斷高度子宮頸疾病的組合物和方法。該方法包括檢測(cè)選擇性地在高度子宮頸疾病(例如中度至嚴(yán)重的發(fā)育異常和宮頸癌)中過(guò)表達(dá)的特定生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)。即，本發(fā)明的生物標(biāo)志物能夠區(qū)別HPV感染的細(xì)胞和癌變前、惡性的、或顯露癌性的HPV感染的細(xì)胞。用于診斷高度子宮頸疾病的方法包括來(lái)自患者的組織或體液樣品中檢測(cè)至少一種指示高度子宮頸疾病的生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)。在特定的實(shí)施方案中，使用抗體和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)目的生物標(biāo)志物的表達(dá)。此外還提供了用于實(shí)施本發(fā)明的方法的試劑盒。
“診斷高度子宮頸疾病”包括，例如，診斷或檢測(cè)子宮頸疾病的存在、監(jiān)控疾病的進(jìn)程，和鑒定或檢測(cè)指示高度子宮頸疾病的細(xì)胞或樣品。術(shù)語(yǔ)診斷、檢測(cè)和鑒定高度子宮頸疾病在此處可交換使用?！案叨茸訉m頸疾病”是指通過(guò)陰道鏡被分類為癌前病理、惡性病理、中度至嚴(yán)重發(fā)育異常，和宮頸癌的病癥。潛在的高度子宮頸疾病包括CINII、CINIII、HSIL、原位癌、腺癌，和癌(FIGO I-IV期)的組織學(xué)鑒定。
如上所述，相當(dāng)比例的表現(xiàn)Pap抹片檢查分類為正常、CINI或ASCUS的患者實(shí)際上具有高度子宮頸疾病特征性的病變。因此，本發(fā)明的方法允許在所有患者(包括這些“假陰性”患者)群體中鑒定高度子宮頸疾病，并且便于檢查患者樣品中的稀有異常細(xì)胞。盡管本發(fā)明的方法也可和常規(guī)診斷技術(shù)例如Pap抹片檢查、針對(duì)高危型HPV的分子檢測(cè)等一起使用，但其可不依賴于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和HPV感染狀態(tài)進(jìn)行診斷。
基于HPV型和宮頸癌以及癌前病變的相關(guān)性已將其分為高危型和低危型類別。低危HPV型包括6、11、42、43、44型，并且和增加的宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。相反地，高危HPV型，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型，和宮頸癌以及鱗狀上皮內(nèi)病變強(qiáng)烈相關(guān)。參見(jiàn)，例如，Wright等人(2004)Obstet.Gynecol.103304-309。事實(shí)上，超過(guò)99％的宮頸癌和高危HPV感染相關(guān)。持久的高危HPV感染通過(guò)HPV基因E2、E6和E7的作用導(dǎo)致子宮頸細(xì)胞中細(xì)胞周期和有絲分裂關(guān)卡的破壞。具體地說(shuō)，HPV E7導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白E的增加和隨后轉(zhuǎn)錄因子E2f從視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)蛋白(Rb)的釋放。然后釋放的E2f轉(zhuǎn)錄因子觸發(fā)各種S期基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞周期控制的喪失，所述S期基因包括拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα(Topo2A)、MCM蛋白、細(xì)胞周期蛋白E1和E2以及p14α。HPV E2通過(guò)激活Sp-1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步刺激S期基因例如p21Waf-1的過(guò)表達(dá)。由持久HPV感染引起的細(xì)胞周期的破壞可導(dǎo)致輕度宮頸結(jié)構(gòu)異常，然后該疾病可發(fā)展為中度或嚴(yán)重發(fā)育異常，最終在一些情況下導(dǎo)致宮頸癌?！皩m頸癌”指和宮頸組織或子宮頸細(xì)胞相關(guān)的任何癌癥或癌癥病變。
宮頸角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的HPV感染導(dǎo)致破壞細(xì)胞周期內(nèi)的活動(dòng)的多種變化。高危HPV亞型的E6和E7癌蛋白參與許多這樣的細(xì)胞過(guò)程，所述細(xì)胞過(guò)程和被感染的角質(zhì)形成細(xì)胞的增加的增殖和致瘤性轉(zhuǎn)化相關(guān)。E6蛋白參與兩個(gè)至關(guān)重要的過(guò)程。第一個(gè)過(guò)程是通過(guò)遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白水解進(jìn)行的P53腫瘤抑制蛋白的降解。功能性p53的除去消除了在進(jìn)入DNA修復(fù)和有絲分裂前負(fù)責(zé)DNA修復(fù)的主要細(xì)胞周期關(guān)卡(Duensing和Munger(2003)Prog Cell Cycle Res.5383-391)。此外，已顯示E6和c-myc蛋白相互作用，負(fù)責(zé)hTERT基因的直接轉(zhuǎn)錄激活，隨后表達(dá)端粒酶(McMurray和McCance(2003)J Virol.779852-9861；Veldman等人(2003)Proc Natl Acad Sci U.S.A.1008211-8216)。端粒酶的活化是癌癥生物學(xué)中負(fù)責(zé)在復(fù)制染色體時(shí)保持端粒長(zhǎng)度的關(guān)鍵步驟，該酶在細(xì)胞永生化期間可確保功能完整的染色體。
已知HPV癌蛋白E7通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖。第一機(jī)制是通過(guò)E7和Smad蛋白(Smad2、3和4)的直接相互作用，從而抑制其結(jié)合DNA的能力(Lee等人(2002)J Biol Chem 27738557-38564)，由此使負(fù)責(zé)將細(xì)胞周期阻滯在G1期的TGF-β腫瘤抑制途徑失活。同樣，已知E7特異性地和Rb腫瘤抑制蛋白相互作用。在細(xì)胞周期的G1期內(nèi)，Rb和E2F轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合，從而防止E2F激活基因轉(zhuǎn)錄。在G1/S邊界上，Rb蛋白被磷酸化，釋放出E2F轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動(dòng)E2F基因轉(zhuǎn)錄和進(jìn)入細(xì)胞周期的S期。HPV E7癌蛋白通過(guò)直接結(jié)合Rb并從復(fù)合物中置換出E2F來(lái)消除該控制機(jī)制。這導(dǎo)致受E2F基因驅(qū)動(dòng)的基因轉(zhuǎn)錄不依賴于正常的細(xì)胞周期控制(Duensing和Munger(2003)Prog Cell Cycle Res.5383-391；Duensing和Munger(2004)Int J Cancer 109157-162；Clarke和Chetty(2001)GynecolOncol.82238-246)。該E2F的釋放使基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞周期控制解偶聯(lián)，從而導(dǎo)致負(fù)責(zé)DNA合成和細(xì)胞增殖的S期基因的長(zhǎng)時(shí)間和異常轉(zhuǎn)錄。此外，已顯示E6和E7兩者的組合作用導(dǎo)致子宮頸瘤形成中的中心體異常和后來(lái)的基因組不穩(wěn)定性(Duensing和Munger(2004)Int JCancer 109157-162)。
盡管不想限制于特定的機(jī)制，但在一些實(shí)施方案中，作為HPV的致癌株系感染的結(jié)果，可將高度子宮頸疾病的分子行為表征為通常只在細(xì)胞周期的S期期間表達(dá)的離散基因的過(guò)表達(dá)。隨后不受控制的基因轉(zhuǎn)錄的激活和異常的S期誘導(dǎo)通過(guò)E2F-1轉(zhuǎn)錄因子途徑來(lái)介導(dǎo)。該行為似乎標(biāo)示了高度子宮頸疾病并提供了致癌HPV感染和子宮頸瘤形成的分子行為之間的聯(lián)系。在分子診斷測(cè)定形式中使用這些子宮頸瘤形成的分子標(biāo)志物可改進(jìn)子宮頸疾病的檢測(cè)，使之具有比現(xiàn)有方法更高的靈敏度和特異性。一般參見(jiàn)圖1-4和Malinowski(2005)BioTechniques 381-8(即將出版)，在此以其全文引用作為參考。因此，在特定的實(shí)施方案中，用于診斷高度子宮頸疾病的方法包括檢測(cè)生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)，其中如此處描述的，該生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)標(biāo)示了異常的S期誘導(dǎo)。在其他實(shí)施方案中，所述方法包括檢測(cè)生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)，其中該生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)標(biāo)示了HPV E6和HPV E7基因的活躍轉(zhuǎn)錄或過(guò)表達(dá)。
以形態(tài)學(xué)術(shù)語(yǔ)常規(guī)地定義發(fā)育異常，表現(xiàn)在上皮細(xì)胞的正常定位的喪失、伴隨細(xì)胞和細(xì)胞核大小、形狀和染色特征上的改變。如通過(guò)癌前發(fā)育異常病癥例如CIN的鑒定所顯示的，根據(jù)細(xì)胞異常的程度對(duì)發(fā)育異常分級(jí)(即，輕度、中度、嚴(yán)重)，發(fā)育異常被廣泛視作從正常組織到子宮頸瘤形成的進(jìn)程中的中間階段?；趯?duì)于高度子宮頸疾病特異的生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)，本發(fā)明的方法允許鑒定高度子宮頸疾病，包括中度至嚴(yán)重發(fā)育異常以及宮頸癌(即，CINII病癥和以上病癥)。
和Pap抹片檢查和/或HPV感染檢測(cè)法相比，此處公開(kāi)的方法提供了更優(yōu)越的高度子宮頸疾病檢測(cè)法。在本發(fā)明的特定方面，本方法的靈敏度和特異性等于或高于常規(guī)的Pap抹片檢查法。如此處所用的“特異性”是指本發(fā)明的方法可準(zhǔn)確鑒定已通過(guò)陰道鏡被確定為NIL(即真陰性)的樣品的水平。即，特異性是試驗(yàn)呈陰性的疾病陰性的比例。在臨床研究中，通過(guò)將真陰性的數(shù)目除以真陰性和假陽(yáng)性之和來(lái)計(jì)算特異性?！办`敏度”是指本發(fā)明的方法可精確地鑒定已通過(guò)陰道鏡確定為高度子宮頸疾病陽(yáng)性(即真陽(yáng)性)的樣品的水平。因此，靈敏度是試驗(yàn)呈陽(yáng)性的疾病陽(yáng)性的比例。在臨床研究中，通過(guò)將真實(shí)陽(yáng)性的數(shù)目除以真陽(yáng)性和假陰性之和來(lái)計(jì)算靈敏度。參見(jiàn)下面的實(shí)施例1-3。在一些實(shí)施方案中，用于高度子宮頸疾病檢測(cè)的所公開(kāi)方法的靈敏度優(yōu)選地是至少大約70％，更優(yōu)選地至少大約80％，最優(yōu)選地至少大約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多。此外，本方法的特異性優(yōu)選地為至少大約70％，更優(yōu)選地至少大約80％、最優(yōu)選地至少大約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多。
術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)性預(yù)測(cè)值”或“PPV”是指當(dāng)患者限定于通過(guò)使用本發(fā)明方法分類為陽(yáng)性的患者時(shí)，該患者患有高度子宮頸疾病的概率。在臨床研究中，通過(guò)將真陽(yáng)性的數(shù)目除以真陽(yáng)性和假陽(yáng)性之和來(lái)計(jì)算PPV。在一些實(shí)施方案中，用于診斷高度子宮頸疾病的本發(fā)明方法的PPV至少為約40％，同時(shí)保持至少大約90％，更優(yōu)選地至少大約95％的靈敏度。試驗(yàn)的“陰性預(yù)測(cè)值”或“NPV”是當(dāng)患者限定于所有試驗(yàn)呈陰性的患者時(shí)，該患者不患有該疾病的概率。在臨床研究中通過(guò)將真陰性的數(shù)目除以真陰性和假陰性之和來(lái)計(jì)算NPV。
本發(fā)明的生物標(biāo)志物包括基因和蛋白，以及其變體和片段。這些生物標(biāo)志物包括這樣的DNA，該DNA包含編碼該生物標(biāo)志物的核酸序列的完整或部分序列、或該序列的互補(bǔ)序列。生物標(biāo)志物核酸也包括這樣的RNA，該RNA包含任何目的核酸序列的完整或部分序列。生物標(biāo)志物蛋白是由本發(fā)明DNA標(biāo)志物編碼的蛋白或?qū)?yīng)于本發(fā)明DNA標(biāo)志物的蛋白。生物標(biāo)志物蛋白包含任何生物標(biāo)記蛋白或多肽的完整的或部分氨基酸序列。
“生物標(biāo)志物”是任何這樣的基因或蛋白，所述基因或蛋白在組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平與正常的或健康的細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平相比發(fā)生了改變。本發(fā)明的生物標(biāo)志物是針對(duì)潛在的高度子宮頸疾病而言具有選擇性的?！霸诟叨茸訉m頸疾病中選擇性過(guò)表達(dá)”是指目的生物標(biāo)記物在高度子宮頸疾病中過(guò)表達(dá)，但不在被分類為L(zhǎng)SIL、CINI的病癥、無(wú)任何發(fā)育異常存在的HPV-感染樣品、不成熟的完全發(fā)育細(xì)胞和不被當(dāng)作臨床疾病的其他病癥中過(guò)表達(dá)。因此，本發(fā)明的生物標(biāo)志物的檢測(cè)能夠區(qū)別指示潛在的高度子宮頸疾病的樣品和指示良性增殖、早期HPV感染或輕度發(fā)育異常的樣品?！霸缙贖PV感染”是指未發(fā)展成宮頸結(jié)構(gòu)異常的HPV感染。如此處所用的，“輕度發(fā)育異常”是指其中無(wú)高度病變存在的LSIL和CINI。本發(fā)明的方法也可將指示高度疾病的細(xì)胞與正常細(xì)胞、不成熟的完全發(fā)育細(xì)胞和不指示臨床疾病的其他細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。這樣，本發(fā)明的方法允許準(zhǔn)確地鑒定高度子宮頸疾病，即使在被常規(guī)的Pap抹片檢查錯(cuò)誤地分類為正常、CINI、LSIL或ASCUS情況(即，“假陰性”)下亦如此。在一些實(shí)施方案中，作為對(duì)異常的或非典型的Pap抹片檢查的反映，進(jìn)行診斷高度子宮頸疾病的方法。即，可進(jìn)行本發(fā)明的方法以響應(yīng)具有異?；蚍堑湫托訮ap抹片檢查結(jié)果的患者。在本發(fā)明的其他方面，將所述方法作為在一般的婦女人群中進(jìn)行的高度子宮頸疾病的初步篩查來(lái)進(jìn)行，就如同目前進(jìn)行常規(guī)的Pap抹片檢查一樣。
本發(fā)明的生物標(biāo)志物包括選擇性在上面定義的高度子宮頸疾病中過(guò)表達(dá)的任何基因或蛋白。這些生物標(biāo)記物能夠在細(xì)胞學(xué)細(xì)胞懸浮物中鑒定癌前、惡性或顯現(xiàn)癌性的細(xì)胞。本發(fā)明的生物標(biāo)志物檢測(cè)CINII病癥和以上病癥中的細(xì)胞，但不檢測(cè)CINI和其中不存在潛在的高度疾病的HPV感染細(xì)胞。特別感興趣的生物標(biāo)志物包括參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞周期的HPV干擾、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因和蛋白。在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物是S期基因，包括其表達(dá)受E2f轉(zhuǎn)錄因子或Sp-1轉(zhuǎn)錄因子刺激的基因。細(xì)胞核生物標(biāo)志物可用于實(shí)施本發(fā)明的某些方面?！凹?xì)胞核生物標(biāo)志物”是指主要在細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)的生物標(biāo)志物。細(xì)胞核生物標(biāo)志物可在細(xì)胞的其他部分以較低的程度表達(dá)。盡管標(biāo)示高度子宮頸疾病的任何生物標(biāo)志物可用于本發(fā)明，但在某些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物，特別是細(xì)胞核生物標(biāo)志物，選自MCM2、MCM6、MCM7、p21Waf1、拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα(Topo2A)、p14arf和細(xì)胞周期蛋白E。更具體地，生物標(biāo)志物可以包含MCM蛋白。
微小染色體維持(MCM)蛋白在真核細(xì)胞DNA復(fù)制中起著非常重要的作用。微小染色體維持(MCM)蛋白通過(guò)在雙DNA鏈的從頭合成期間將復(fù)制前復(fù)合物(prereplication complex)加載至DNA上和充當(dāng)解旋酶以幫助雙鏈DNA解鏈而在DNA復(fù)制的早期階段發(fā)揮作用。MCM蛋白中的每一個(gè)蛋白在其高度保守的中心結(jié)構(gòu)域具有DNA依賴性ATP酶基元。當(dāng)正常細(xì)胞從細(xì)胞周期的G0期進(jìn)行至G1/S期時(shí)，MCM蛋白的水平通常以可變的方式增加。在G0期，MCM2和MCM5蛋白遠(yuǎn)不如MCM7和MCM3蛋白豐富。MCM6和MCM2、MCM4以及MCM7形成結(jié)合組蛋白H3的復(fù)合物。此外，MCM4、MCM6和MCM7的亞復(fù)合物具有解旋酶活性，該活性是通過(guò)MCM6的ATP結(jié)合活性和MCM4的DNA結(jié)合活性介導(dǎo)的。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)reeman等人(1999)Clin.Cancer Res.52121-2132；Lei等人(2001)J Cell Sci.1141447-1454；Ishimi等人(2003)Eur.J.Biochem.2701089-1101，所有文獻(xiàn)在此以其全文引用作為參考。
早期的出版物已顯示MCM蛋白，特別是MCM-5，可用于檢測(cè)子宮頸疾病(Williams等人(1998)Proc Natl Acad Sci U.S.A.9514932-14937)以及其他癌癥(Freeman等人(1999)Clin Cancer Res.52121-2132)。已出版的文獻(xiàn)表明針對(duì)MCM-5的抗體能夠檢測(cè)子宮頸瘤形成細(xì)胞。MCM-5用于檢測(cè)高度子宮頸疾病的特異性未得到證實(shí)(Williams等人(1998)Proc Natl Acad Sci U.S.A.9514932-14937)。MCM-5表達(dá)的檢測(cè)不限于高度子宮頸疾病，其還在經(jīng)鑒定的低度發(fā)育異常和在用高危HPV感染后已進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞中被檢測(cè)到。使用針對(duì)MCM-5的抗體對(duì)子宮頸瘤形成的檢測(cè)顯示于圖4。除了MCM-5外，已顯示來(lái)自MCM家族的其他成員，包括MCM-2和MCM-7，是用于在組織樣品中檢測(cè)子宮頸瘤形成的可能有用的生物標(biāo)志物(Freeman等人(1999)Clin Cancer Res.52121-2132；Brake等人(2003)Cancer Res.638173-8180)。近年來(lái)的結(jié)果已顯示MCM-7似乎是用于使用免疫化學(xué)形式檢測(cè)高度子宮頸疾病的特異性標(biāo)志物(Brake等人(2003)Cancer Res.638173-8180；Malinowski等人(2004)Acta Cytol.43696)。
拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα(Topo2a)是參與DNA復(fù)制的基本的細(xì)胞核酶，其是許多用于癌癥治療的抗癌藥物的靶。Topo2a的減少的表達(dá)是對(duì)幾種化療劑的耐受性的最主要機(jī)制。在許多不同的腫瘤中已注意到該蛋白的表達(dá)范圍的重大變化。Topo2a主要存在于正在增殖的細(xì)胞中，其在M期在特定的位點(diǎn)被磷酸化修飾，這對(duì)有絲分裂染色體凝集和分離至關(guān)重要。
p21是由染色體6p上的WAFl/Cip1編碼的蛋白。經(jīng)顯示該基因抑制幾種細(xì)胞周期蛋白/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的活性，從而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。p21Waf1的表達(dá)介導(dǎo)p53的細(xì)胞周期阻滯功能。因?yàn)閜21似乎介導(dǎo)p53的幾種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)功能，其表達(dá)可能比p53的積累更準(zhǔn)確地反映p53的功能狀態(tài)。此外，p21Waf1可通過(guò)阻斷增殖細(xì)胞中的細(xì)胞核抗原(PCNA)的作用來(lái)抑制DNA復(fù)制。
細(xì)胞周期蛋白E是cdk-2的調(diào)控亞基，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中控制G1/S的轉(zhuǎn)變。細(xì)胞周期蛋白E的多種同種型只在腫瘤中表達(dá)而不在正常的組織中表達(dá)，這暗示著細(xì)胞周期蛋白E的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。體外分析表明，細(xì)胞周期蛋白E的這些截短的變體同種型能夠磷酸化組蛋白H1。細(xì)胞周期蛋白E上的變化已被認(rèn)為是各種癌癥中預(yù)后差的指標(biāo)。
盡管已詳細(xì)地討論了上述生物標(biāo)志物，但可將在高度子宮頸疾病狀態(tài)(例如，CINII、CINIII和宮頸癌)中過(guò)表達(dá)的任何生物標(biāo)志物用于實(shí)施本發(fā)明。其它感興趣的生物標(biāo)志物包括對(duì)于G1/S期邊界點(diǎn)或S期特異的受細(xì)胞周期調(diào)控的基因。這些基因包括但不限于解旋酶(DDX11)、尿嘧啶DNA乙二醇酯酶(uracil DNA glycolase，UNG)、E2F5、細(xì)胞周期蛋白E1(CCNE1)、細(xì)胞周期蛋白E2(CCNE2)、CDC25A、CDC45L、CDC6、p21WAF-1(CDKN1A)、CDKN3、E2F1、MCM2、MCM6、NPAT、PCNA、莖環(huán)BP(SLBP)、BRCA1、BRCA2、CCNG2、CDKN2C、二氫葉酸還原酶(DHFR)、組蛋白H1、組蛋白H2A、組蛋白H2B、組蛋白H3、組蛋白H4、MSH2、NASP、核糖核苷酸還原酶M1(RRM1)、核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)、胸苷合成酶(TYMS)、復(fù)制因子C4(RFC4)、RAD51、染色質(zhì)因子1A(CHAF1A)、染色質(zhì)因子1B(CHAF1B)、拓?fù)洚悩?gòu)酶III(TOP3A)、ORC1、引發(fā)酶2A(PRIM2A)、CDC27、引發(fā)酶1(PRIM1)、瓣結(jié)構(gòu)內(nèi)切核酸酶(flap structure endonuclease，F(xiàn)EN1)、fanconi anemia comp.grp A(FNACA)、PKMYT1和復(fù)制蛋白A2(RPA2)。參見(jiàn)，例如，Whitfield等人(2002)Mol.Biol.Cell 131977-2000，以其全文在此引用作為參考。其他感興趣的S期基因包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、MCM3、MCM4、MCM5、DNA聚合酶Iα(DNA POL1)、DNA連接酶1、B-Myb、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA MET)、中心粒周圍蛋白(pericentrin，PER)、KIF4、DP-1、ID-3、RAN結(jié)合蛋白(RANBP1)、間隙連接α6(GJA6)、氨基乙酰丙酸脫水酶(amino levulinatedehydratase，ALDH)、組蛋白2A Z(H2A.Z)、精胺合酶(SpmS)、增殖蛋白2、T淋巴細(xì)胞激活蛋白、磷脂酶A2(PLA2)和L6抗原(L6)。參見(jiàn)，例如，Neyins等人(2001)Mol.Cell.Biol.214689-4699，此處引用作為參考。
在本發(fā)明的一些方面，生物標(biāo)志物包含由E2f轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的基因。這些基因包括但不限于胸苷酸合酶(thymidylate synthase)、胸苷激酶1、核糖核苷酸還原酶M1、核糖核苷酸還原酶M2、CDK2、細(xì)胞周期蛋白E、MCM3、MCM7、PCNA、DNA引發(fā)酶小亞基、拓?fù)洚悩?gòu)酶IIA(Topo2A)、DNA連接酶1、flap endonuclease 1、RAD51、CDC2、細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白B2、KI-67、KIFC1、FIN16、BUB1、輸入蛋白α-2、HMG2、zeste增強(qiáng)子、STK-1、組蛋白莖環(huán)BP、Rb、P18-INK4C、膜聯(lián)蛋白VIII、c-Myb、CDC25A、細(xì)胞周期蛋白D3、細(xì)胞周期蛋白E1、脫氧胞嘧啶激酶、DP-1、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶(endothelin converting enzyme)、烯醇化酶2、P18 INK4C、核糖核苷酸還原酶和尿嘧啶DAN乙二醇酯酶2。參見(jiàn)，例如Nevins等人，同上；Muller等人(2000)Genes and Dev.15267-285。在特定的實(shí)施方案中，感興趣的生物標(biāo)志物是由參與細(xì)胞周期調(diào)控和DNA復(fù)制的E2f轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的基因，例如，細(xì)胞周期蛋白E2、Ki-67、p57KIP2、RANBPM和復(fù)制蛋白A1。一些E2f誘導(dǎo)的感興趣基因參與凋亡，其包括APAF1、Bc1-2、caspase 3、MAP3激酶5和TNF受體相關(guān)因子。其他E2f誘導(dǎo)的基因參與轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，其包括例如ash2樣、polyhomeotic2、embryonic ectoderm protein、Zeste基因增強(qiáng)子、hairy/enhancerof split、同源異形盒A10、同源異形盒A7、同源異形盒A9、同源結(jié)構(gòu)域TF1、早期前B細(xì)胞白血病FT3、YY1 TF、POU結(jié)構(gòu)域TF、TAFII130、TBP因子172、堿性TF3、溴區(qū)結(jié)構(gòu)(bromodomain)/鋅指、SWI/SNF、ID4、TEA-4、NFATC1、NFATC3、BT、CNC-1、MAF、MAFF、MAFG、核心結(jié)合蛋白、E74樣因子4、c-FOS、JUNB、鋅指DNA BP和Cbp/p300轉(zhuǎn)錄激活物。參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的E2f誘導(dǎo)的基因也是潛在的目的生物標(biāo)志物，其包括TGFβ、卵泡抑素(follistatin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bonemorphogenetic protein 2)、BMP受體類型1A、曲蛋白同源物1(frizzled homolog1)、WNT10B、鞘氨醇激酶1、雙特異性磷酸酶7、雙特異性(Y)磷酸酶、FGF受體3、蛋白酪氨酸磷酸酶、雙特異性(Y)磷酸酶D6655、胰島素受體、成熟T細(xì)胞增殖蛋白1、FGF受體2、TGFα、CDC42效應(yīng)蛋白3、Met、CD58、CD83、TACC1和TEAD4。
盡管本發(fā)明的方法要求在患者樣品中檢測(cè)至少一個(gè)生物標(biāo)志物以檢測(cè)高度子宮頸疾病，但可使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)生物標(biāo)志物來(lái)實(shí)施本發(fā)明。已認(rèn)識(shí)到對(duì)機(jī)體樣品中的超過(guò)一個(gè)生物標(biāo)志物的檢測(cè)可用于鑒定高度子宮頸疾病的事件。因此，在一些實(shí)施方案中，使用兩種或更多種生物標(biāo)志物，更優(yōu)選地，使用兩種或更多種互補(bǔ)生物標(biāo)志物。“互補(bǔ)”是指機(jī)體樣品中生物標(biāo)志物的組合的檢測(cè)導(dǎo)致比只使用其中一個(gè)生物標(biāo)志物時(shí)以更大比例成功鑒定高度子宮頸疾病。因此，在一些情況下，可通過(guò)使用至少兩種生物標(biāo)志物進(jìn)行高度子宮頸疾病的更準(zhǔn)確的確定。因此，當(dāng)使用至少兩種生物標(biāo)志物時(shí)，使用至少兩種針對(duì)不同生物標(biāo)志物蛋白的抗體來(lái)實(shí)施此處公開(kāi)的免疫細(xì)胞化學(xué)方法?？赏瑫r(shí)或共同地將抗體和機(jī)體樣品接觸。在本發(fā)明的某些方面，使用3種抗體檢測(cè)MCM2和Topo2A的過(guò)表達(dá)，其中抗體中的兩種抗體對(duì)于MCM2是特異性的，第三種抗體對(duì)于Topo2A是特異性的。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法包括從患者收集子宮頸樣品，將樣品和至少一種對(duì)于目的生物標(biāo)志物特異的抗體接觸，檢測(cè)抗體結(jié)合。表現(xiàn)本發(fā)明生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)的樣品，如通過(guò)抗體結(jié)合的檢測(cè)所確定的，被認(rèn)為是高度子宮頸疾病陽(yáng)性的。在特定的實(shí)施方案中，機(jī)體樣品是單層子宮頸細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面，在玻璃載片上提供單層子宮頸細(xì)胞。
“機(jī)體樣品”是指可檢測(cè)到生物標(biāo)志物表達(dá)的細(xì)胞、組織或體液的任何取樣。這些機(jī)體樣品的示例包括但不限于血液、淋巴、尿、婦科流體(gynecological fluids)、活組織檢查和涂片?？赏ㄟ^(guò)各種技術(shù)，包括例如，通過(guò)刮取或擦拭表面或通過(guò)使用針頭抽取體液來(lái)從患者獲得機(jī)體樣品。用于收集各種機(jī)體樣品的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。在特定的實(shí)施方案中，機(jī)體樣品包括子宮頸細(xì)胞，作為宮頸組織樣品或如懸浮物中的子宮頸細(xì)胞，特別是基于液體的制備物。在一個(gè)實(shí)施方案中，按照基于液體的細(xì)胞學(xué)樣品制備指南，例如SurePath(TriPath Imaging，Inc.)或ThinPrep preparation(CYTYC，Inc.)所述收集宮頸樣品?？蓪C(jī)體樣品轉(zhuǎn)移至玻璃載片上以進(jìn)行放大觀察?？蓪?duì)載片上的細(xì)胞使用固定液和染色液以保存樣品和幫助檢查。在一個(gè)實(shí)施方案中，收集宮頸樣品，對(duì)其進(jìn)行處理以提供單層樣品，如美國(guó)專利號(hào)5,346,831(此處引用作為參考)中所示。
單層方法涉及在帶陽(yáng)離子電荷的基底上制備單層細(xì)胞學(xué)材料的方法。該方法包括這樣的步驟，即在密度梯度上通過(guò)離心分離細(xì)胞學(xué)材料，產(chǎn)生該細(xì)胞學(xué)材料的緊密聚集的沉淀，混合該細(xì)胞學(xué)材料的沉淀，從混合的沉淀中取出預(yù)先確定體積的等分，將該等分和預(yù)先確定體積的水沉積在沉降容器中，該容器可移動(dòng)地裝在帶陽(yáng)離子電荷的基底上，從而可使細(xì)胞學(xué)材料在重力作用下沉淀在該基底上，在細(xì)胞學(xué)材料沉淀后，從沉降容器中除去水分。為了進(jìn)行自動(dòng)化分析，可將沉淀容器和基底分開(kāi)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，例如吹吸法(syringing)、胰蛋白酶法(trypsinizing)、超聲處理、震蕩、渦旋或通過(guò)使用美國(guó)專利5,316,814(其內(nèi)容在此引用作為參考)中描述的裝置進(jìn)行分離。在一些實(shí)施方案中，使用PrepStainTM載片處理器(TriPath Imaging，Inc.)從SurePathTM(TriPath Imaging，Inc.)制備包含單層子宮頸細(xì)胞的載片。
此處包括本領(lǐng)域可獲得的用于鑒定或檢測(cè)生物標(biāo)志物的任何方法?？稍诤怂崴交虻鞍姿缴蠙z測(cè)本發(fā)明的生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)。為了確定過(guò)表達(dá)，可將要檢查的機(jī)體樣品和來(lái)源于健康人的對(duì)應(yīng)的機(jī)體樣品進(jìn)行比較。即，表達(dá)的“正常”水平是未遭受高度子宮頸疾病的人受試者或患者的子宮頸細(xì)胞中該生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，特別是當(dāng)機(jī)體樣品包含單層子宮頸細(xì)胞時(shí)，生物標(biāo)志物過(guò)表達(dá)的確定不需要機(jī)體樣品和來(lái)源于健康人的對(duì)應(yīng)機(jī)體樣品之間的比較。在該情況下，來(lái)自單一患者的單層子宮頸細(xì)胞可以每50,000個(gè)正常細(xì)胞包含少至1-2個(gè)異常細(xì)胞。這些異常細(xì)胞(通過(guò)本發(fā)明標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)鑒定的)的檢測(cè)，排除了和來(lái)源于健康人的對(duì)應(yīng)機(jī)體樣品相比較的需要。
用于檢測(cè)本發(fā)明標(biāo)志物的方法包括在核酸或蛋白水平上確定生物標(biāo)志物的量或存在的任何方法。這些方法在本領(lǐng)域是熟知，包括但不限于western印跡法、Northern印跡法、southern印跡法、ELISA、免疫沉淀法、免疫熒光法、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)法、核酸雜交技術(shù)、核酸逆轉(zhuǎn)錄法以及核酸擴(kuò)增法。在特定的實(shí)施方案中，使用例如針對(duì)特定生物標(biāo)志物蛋白的抗體在蛋白水平上檢測(cè)生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá)。這些抗體可用于各種方法，例如western印跡法、ELISA、免疫沉淀法或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。同樣，可將Pap抹片檢查的免疫染色和常規(guī)Pap染色結(jié)合，這樣可獲得形態(tài)學(xué)信息和免疫細(xì)胞化學(xué)信息。這樣，生物標(biāo)志物的檢測(cè)可減少Pap抹片檢查的高假陰性率，從而可促進(jìn)大規(guī)模自動(dòng)化篩查。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用對(duì)于生物標(biāo)志物蛋白特異的抗體檢測(cè)機(jī)體樣品中生物標(biāo)志物蛋白的過(guò)表達(dá)。該方法包括從患者獲得機(jī)體樣品，將該機(jī)體樣品和至少一種針對(duì)于選擇性地在高度子宮頸疾病中過(guò)表達(dá)的生物標(biāo)志物的抗體相接觸，和檢測(cè)抗體結(jié)合以確定該生物標(biāo)志物在患者樣品中是否過(guò)表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)選的方面提供了用于診斷高度子宮頸疾病的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。具體地，該方法包括患者樣品中的生物標(biāo)志物的抗體染色，該生物標(biāo)志物對(duì)于高度子宮頸疾病是特異性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，可人工地或以自動(dòng)化的方式(使用例如Autostainer Universal Staining System(Dako)或Biocare NemesisAutostainer(Biocare))進(jìn)行本文下面描述的免疫細(xì)胞化學(xué)法。實(shí)施例1中提供了一個(gè)用于宮頸樣品的抗體染色(即免疫細(xì)胞化學(xué))的方案。
在優(yōu)選的免疫細(xì)胞化學(xué)法中，將患者的宮頸樣品收集入液體培養(yǎng)基中，例如，在SurePathTM收集小瓶(TriPath Imaging，Inc.)中。使用自動(dòng)化處理器，例如.PrepStainTM系統(tǒng)(TriPath Imaging，Inc.)，從液體培養(yǎng)基中收集細(xì)胞和將其沉淀在載玻片上的薄層內(nèi)以待進(jìn)一步分析。可固定或不固定載片樣品，并可在制備后立即對(duì)其進(jìn)行分析或可將其保存以待以后分析。在一些實(shí)施方案中，將制備的玻片貯存在95％的乙醇中最少24小時(shí)?？蛇x擇地，在其他實(shí)施方案中，如下所述將載片貯存在預(yù)處理緩沖液中。
為制備易于抗體結(jié)合的生物標(biāo)志物抗原，可能需要對(duì)樣品進(jìn)行修飾。在免疫細(xì)胞化學(xué)法的特定方面，將載片轉(zhuǎn)移至預(yù)處理緩沖液例如SureSlide制備緩沖液(TriPath Imaging，Inc.)和任選地將其加熱以增加抗原的易接近性。樣品在預(yù)處理緩沖液中的加熱快速地破壞了細(xì)胞的脂雙層，使得抗原(即，生物標(biāo)志物蛋白)更容易進(jìn)行抗體結(jié)合。預(yù)處理緩沖液可包含聚合物、去垢劑、或者非離子或陰離子表面活性劑例如乙氧基化的陰離子或非離子表面活性劑、鏈烷酸酯或烷氧基化物或甚至這些表面活性劑的混合物，或甚至使用膽鹽。在特定的實(shí)施方案中，預(yù)處理緩沖液包含非離子或陰離子去垢劑，例如和具有大約370kD分子量的烷氧基化物混合的具有大約183kD分子量的鏈烷酸鈉(在下文中稱作RAM)。在特定的實(shí)施方案中，預(yù)處理緩沖液包含1％RAM。在一些實(shí)施方案中，預(yù)處理緩沖液也可用作上面指出的載片貯存緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將0.1％至1％的脫氧膽酸、鈉鹽、一水合物的溶液用作貯存緩沖液和預(yù)處理緩沖液。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可將月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸鈉(例如，Sandopan LS)或/和乙氧基化的陰離子復(fù)合物或甚至烷基芳基乙氧化羧酸的溶液用于貯存和預(yù)處理緩沖液。在本發(fā)明的特定方面，載片預(yù)處理緩沖液包含0.05％至5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸鈉，優(yōu)選地0.1％至1％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸鈉、更優(yōu)選地0.5％月桂基(聚氧乙烯)醚-13-羧酸鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，載玻片可在預(yù)處理和染色處理前在緩沖液中貯存長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)?？蓪⒈景l(fā)明的預(yù)處理緩沖液用于制備在免疫測(cè)定法(例如，免疫細(xì)胞化學(xué)法和免疫組織化學(xué)法)中更容易進(jìn)行抗體結(jié)合的抗原的方法。參見(jiàn)實(shí)施例14。術(shù)語(yǔ)“預(yù)處理緩沖液”和“制備緩沖液”在此處可交換使用，其是指這樣的緩沖液，該緩沖液用于制備，特別是通過(guò)增加抗原的對(duì)抗體結(jié)合的易接近性來(lái)制備用于免疫染色的細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)樣品。
可將制備更容易進(jìn)行抗體結(jié)合的抗原的任何方法用于本發(fā)明的實(shí)施，所述方法包括本領(lǐng)域已知的抗原修復(fù)法(antigen retrievalmethods)。參見(jiàn)，例如，Bibbo等人(2002)Acta.Cytol.4625-29；Saqi等人(2003)Diagn.CutopatlioL 27365-370；Bibbo等人(2003)Anal.Quant.Cytol.Histol.258-11，此處以其全文引用作為參考。在一些實(shí)施方案中，抗原修復(fù)包括將載片貯在95％的乙醇中至少24小時(shí)，將載玻片浸沒(méi)在預(yù)熱至95℃的1X Target RetrievalSolution pH 6.0(DAKOS1699)/dH2O浴中，將載玻片置于蒸器中25分鐘。參見(jiàn)下面的實(shí)施例2。
在進(jìn)行增加抗原的易接近性的預(yù)處理或抗原修復(fù)后，使用合適的封閉試劑(例如，過(guò)氧化物酶封閉試劑例如過(guò)氧化氫)封閉樣品。在一些實(shí)施方案中，使用蛋白封閉劑封閉樣品以防止抗體的非特異性結(jié)合。所述蛋白封閉劑可包含，例如，純化的酪蛋白。然后將針對(duì)目的生物標(biāo)志物的抗體，特別是單克隆抗體，和樣品一起溫育。如上面所指出的，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，在一些情況下，通過(guò)在患者樣品中檢測(cè)超過(guò)一種生物標(biāo)志物可獲得高度子宮頸疾病的更準(zhǔn)確的診斷。因此，在特定的實(shí)施方案中，使用至少兩種針對(duì)兩種不同生物標(biāo)志物的抗體檢測(cè)高度子宮頸疾病。當(dāng)使用超過(guò)一種抗體時(shí)，可將這些抗體作為單個(gè)抗體試劑順次加入至單一樣品中或作為抗體混合物同時(shí)加入。參見(jiàn)下面實(shí)施例3?？蛇x擇地，可將各單一抗體加入至來(lái)自相同患者的分開(kāi)的樣品，再將所得的數(shù)據(jù)合并。在特定的實(shí)施方案中，抗體混合物包含至少3種抗體，其中兩種抗體特異性地結(jié)合MCM2，第三種抗體特異性地結(jié)合Topo2A。
檢測(cè)抗體結(jié)合的技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的?？墒褂卯a(chǎn)生對(duì)應(yīng)于抗體結(jié)合水平、因此對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平的可檢測(cè)信號(hào)的化學(xué)試劑來(lái)檢測(cè)針對(duì)目的生物標(biāo)志物的抗體結(jié)合。在本發(fā)明的其中一個(gè)免疫細(xì)胞化學(xué)法中，通過(guò)使用綴合了被標(biāo)記的聚合物的第二抗體來(lái)檢測(cè)抗體結(jié)合。經(jīng)標(biāo)記的聚合物的示例包括但不限于聚合物-酶綴合物。一般將這些復(fù)合物中的酶用于催化色原在抗原-抗體結(jié)合位點(diǎn)的沉積，從而引起對(duì)應(yīng)于目的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的細(xì)胞染色。特別有吸引力的酶包括辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)?？墒褂蒙藤?gòu)獲得的抗體檢測(cè)系統(tǒng)，例如，Dako Envision+系統(tǒng)和Biocare Medical′sMach 3系統(tǒng)實(shí)施本發(fā)明。
在本發(fā)明的一個(gè)具體的免疫細(xì)胞化學(xué)法中，通過(guò)使用HRP標(biāo)記的綴合了二抗的聚合物來(lái)檢測(cè)針對(duì)生物標(biāo)志物的抗體結(jié)合。也可使用結(jié)合小鼠單克隆抗體的小鼠探針試劑和結(jié)合小鼠探針試劑的綴合HRP的聚合物來(lái)檢測(cè)抗體結(jié)合。使用色原3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)就抗體結(jié)合對(duì)載玻片進(jìn)行染色，然后用蘇木精和任選地著色劑例如氫氧化銨或TBS/Tween-20進(jìn)行復(fù)染。在本發(fā)明的一些方面，由細(xì)胞檢驗(yàn)技術(shù)員和/或病理學(xué)家在顯微鏡下檢查載片以評(píng)估細(xì)胞染色(即，生物標(biāo)志物的過(guò)表達(dá))和確定是否存在高度子宮頸疾病?？蛇x擇地，可通過(guò)自動(dòng)化的顯微鏡方法或通過(guò)人工借助有助于鑒定陽(yáng)性染色細(xì)胞的計(jì)算機(jī)軟件檢查樣品。
術(shù)語(yǔ)“抗體”廣義上包括天然發(fā)生的抗體形式和重組抗體例如單鏈抗體、嵌合抗體和人源化抗體和多特異性抗體以及所有前述抗體的片段和衍生物，所述片段和衍生物至少具有抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w衍生物可包含綴合至所述抗體的蛋白或化學(xué)部分。
“抗體”和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。盡管抗體表現(xiàn)對(duì)抗原的結(jié)合特異性，但免疫球蛋白包括抗體和缺乏抗原特異性的其他抗體樣分子。后一種的多肽通過(guò)例如淋巴系統(tǒng)以較低的水平產(chǎn)生，在骨髓瘤中以增加的水平產(chǎn)生。
術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣的意義使用，其包括完全地組裝的抗體、可結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab′、F′(ab)2、Fv、單鏈抗體、二價(jià)抗體(diabodies))和包含前述抗體的重組肽。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上均一的抗體的群體中獲得的抗體，即，構(gòu)成該群體的各抗體是完全相同的，除了可能天然發(fā)生的可以少量存在的突變?！翱贵w片段”包含完整抗體的部分，優(yōu)選地完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)部分?？贵w片段的示例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二價(jià)抗體；線性抗體(Zapata等人(1995)Protein Eng 8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w的木瓜蛋白酶降解產(chǎn)生兩個(gè)完全相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各片段具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，剩余的“Fc”片段，其名稱反應(yīng)其容易地結(jié)晶35的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并能夠交聯(lián)抗原的F(ab′)2片段。
“Fv”是包含完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，該區(qū)域由一條重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通過(guò)緊密的、非共價(jià)締合形成的二聚體構(gòu)成。在單鏈Fv種類中，可通過(guò)柔性肽連接體將一條重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接，從而可使輕鏈和重鏈以類似于雙鏈Fv種類中的形式以“二聚”結(jié)構(gòu)結(jié)合。正是處于該構(gòu)型，各可變區(qū)的3個(gè)CDRs相互作用，從而在VH-VL二聚體的表面上確定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。總之，6個(gè)CDRs為抗體提供了抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或只包含3個(gè)特異于抗原的CDRs的Fv一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，但以比完整結(jié)合位點(diǎn)更低的親合力結(jié)合。
Fab片段也包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab片段和Fab′片段的不同在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端加入了少數(shù)殘基，包括一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab′-SH在此處是Fab′的名稱，在所述Fab’中，恒定區(qū)的半胱氨酸殘基具有游離巰基。F(ab′)2抗體片段最初作為成對(duì)的Fab′片段(在其之間具有鉸鏈半胱氨酸)產(chǎn)生。
可通過(guò)用生物標(biāo)志物蛋白免疫原免疫合適的受試者(例如，兔子、山羊、小鼠或其他哺乳動(dòng)物)來(lái)制備多克隆抗體。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如采用使用固定的生物標(biāo)志物蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)控被免疫的受試者中的抗體滴度。在免疫后的合適時(shí)間點(diǎn)，例如當(dāng)抗體滴度最高時(shí)，可從受試者獲得抗體生產(chǎn)細(xì)胞，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其用于制備單克隆抗體，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是例如最先由Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497描述的雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人(1983)Immunol.Today 472)、EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人(1985)in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，ed.Reisfeld和Sell(Alan R.Liss，Inc.，New York，NY)，pp.77-96)或trioma技術(shù)。用于生產(chǎn)雜交瘤的技術(shù)是熟知的(一般參見(jiàn)Coligan等人，編著(1994)Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)；Galfre等人(1977)Nature 266550-52；Kenneth(1980)in Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses(Plenum Publishing Corp.，NY)；和Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54387-402)。
作為制備單克降抗體分泌性雜交瘤的另一選擇，可通過(guò)用生物標(biāo)志物蛋白篩選重組組合免疫球蛋白文庫(kù)(例如，抗體噬菌體展示文庫(kù))從而分離結(jié)合該生物標(biāo)志物蛋白的免疫球蛋白文庫(kù)成員來(lái)鑒定和分離單克隆抗體?？缮藤?gòu)(例如，the Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，Catalog No.27-9400-01；和the StratageneSurfZAP 9 Phage Display Kit，Catalog No.240612)獲得產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒。此外，特別適合用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的示例可見(jiàn)于例如美國(guó)專利號(hào)5,223,409；PCT
發(fā)明者T·J·費(fèi)希爾, D·P·馬利諾夫斯基, A·J·泰勒, M·R·帕克 申請(qǐng)人:三路影像公司