專(zhuān)利名稱(chēng)：核酸提取方法及核酸提取裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及這樣一種核酸提取方法，該方法使用裝配有過(guò)濾材料 的核酸提取柱來(lái)自動(dòng)地提取樣品溶液中的核酸；本發(fā)明還涉及核酸提 取裝置。
背景技術(shù)：
關(guān)于提取核酸的相關(guān)方法，存在這樣一些方法，其中要施加離心 力、使用磁珠、使用過(guò)濾器等。例如有這樣一種方法使用固相(例 如二氧化硅、二氧化硅聚合物或硅酸鎂)來(lái)吸附核酸，然后通過(guò)隨后 的操作(例如洗滌和解吸附)來(lái)純化核酸(例如，參見(jiàn)日本專(zhuān)利公報(bào)
No. 07/051,065)。
發(fā)明內(nèi)容
然而，盡管上述提取核酸的相關(guān)方法在分離性能方面表現(xiàn)良好， 但是，它們?cè)诤?jiǎn)便性、快速性和自動(dòng)化適應(yīng)性方面還存在不足。還存
在的其它問(wèn)題是難以進(jìn)行具有相同性能的吸附介質(zhì)的工業(yè)化大規(guī)模
生產(chǎn)；不便于處理；并且難以模制成各種形狀；等等。
本發(fā)明是考慮到上述情況而完成的，并且本發(fā)明的目的是提供一 種核酸提取方法，其中在核酸分離純化過(guò)程中，通過(guò)使用核酸吸附性 固體載體來(lái)吸附含有核酸的樣品溶液中的核酸，隨后通過(guò)洗滌等使核 酸解吸附，從而以如下優(yōu)點(diǎn)來(lái)處理含核酸的樣品溶液高效、簡(jiǎn)便、 快速、良好的自動(dòng)化適應(yīng)性和良好的重復(fù)性；本發(fā)明的目的還在于提 供核酸提取裝置。
通過(guò)以下內(nèi)容可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。 (1). 一種提取核酸的方法，該方法包括
通過(guò)使含核酸的樣品溶液與核酸吸附性固體載體接觸，從而將核
酸吸附到所述的核酸吸附性固體載體上；
在所述核酸吸附在所述的核酸吸附性固體載體上時(shí)，通過(guò)使洗滌 液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而對(duì)所述的核酸吸附性固體 載體進(jìn)行洗滌；以及
通過(guò)將回收液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而使所述核 酸從所述的核酸吸附性固體載體上解吸附；
其中，在所述洗滌液的分注及允許停留的時(shí)間以及所述回收液的 分注及允許停留的時(shí)間這二者中，至少有一個(gè)所述時(shí)間被控制為預(yù)定 時(shí)間。
(2) .上述(l)中所述的方法，
其中將所述洗滌液的允許停留時(shí)間控制為50秒到1,000秒。
(3) .上述(l)中所述的方法，
其中將所述洗滌液的允許停留時(shí)間控制為100秒到300秒。
(4) .上述(1)到(3)中的任意一項(xiàng)所述的方法， 其中將所述回收液的允許停留時(shí)間控制為20秒到300秒。
(5) .上述(1)到(3)中的任意一項(xiàng)所述的方法， 其中將所述回收液的允許停留時(shí)間控制為25秒到60秒。
(6) .上述(1)到(5)中的任意一項(xiàng)所述的方法，
其中所述的核酸吸附性固體載體是通過(guò)基本不涉及離子鍵的相 互作用來(lái)吸附核酸的核酸吸附性固體載體。
(7) . (1)到(6)中的任意一項(xiàng)所述的方法， 其中用于制備含核酸的樣品溶液的方法包括 將含有選自離液鹽、表面活性劑、消泡劑、蛋白酶和核酸穩(wěn)定劑
中的化合物的預(yù)處理溶液與試驗(yàn)樣品混合，從而得到混合后的溶液； 以及
向所述的混合溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑。
(8) .上述(7)中所述的方法，
其中所述的核酸穩(wěn)定劑為巰基化合物。
(9) .上述(7)或(8)中所述的方法， 其中所述的離液鹽為胍鹽。
(10) .上述(7)到(9)中所述的方法，
其中所述的水溶性有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至 少一種。
(11) .上述(1)到(10)中的任意一項(xiàng)所述的方法，
其中所述的核酸吸附性固體載體被容納于核酸提取柱的、具有至 少兩個(gè)開(kāi)口的容器的內(nèi)部；以及
其中所述方法包括
在將所述的含核酸的樣品溶液分注到所述的核酸提取柱中之后， 通過(guò)壓力差使所述的樣品溶液中的所述核酸吸附到所述的核酸吸附 性固體載體上；
在將所述的洗滌液分注到所述的核酸提取柱中之后，通過(guò)壓力差 除去雜質(zhì)；以及
在將所述的回收液分注到所述的核酸提取柱中之后，通過(guò)壓力差 使吸附到所述的核酸吸附性固體載體上的所述核酸從該核酸吸附性 固體載體上分離出來(lái)，從而與所述回收液一起回收所述核酸。
(12) . —種用于實(shí)施上述(ll)中的所述方法的核酸提取裝置， 其中所述的核酸吸附性固體載體為過(guò)濾材料。
(13) .上述(12)中所述的核酸提取裝置，
其中所述的核酸提取裝置通過(guò)加壓自動(dòng)地實(shí)施提取操作；以及
其中所述的提取操作包括
在將所述的含核酸的樣品溶液分注到核酸提取柱中之后，樣品溶 液中的核酸被吸附到所述的過(guò)濾材料上；
在將洗滌液分注到所述的核酸提取柱中之后，除去雜質(zhì)；以及 在將回收液分注到所述的核酸提取柱中之后，使吸附到所述的過(guò)
濾材料上的所述核酸從該過(guò)濾材料上分離出來(lái)；從而與所述回收液一
起回收所述核酸。
(14) .上述(12)或(13)中所述的核酸提取裝置，該裝置包括 壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，其通過(guò)加壓嘴將壓縮空氣引入到所述的核酸
提取柱中；以及
分注機(jī)構(gòu)，該機(jī)構(gòu)包括第一分注嘴，用于將洗滌液分注到所述
的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用于將回收液分注到所述的核酸 提取柱中。
(15).上述(12)到(14)中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置，該裝 置包括
保持機(jī)構(gòu)，用于保持多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱和多個(gè)經(jīng)排布的回 收容器，所述回收容器用于接收所述的含核酸的回收液；
壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，用于將壓縮空氣由單個(gè)加壓嘴引入到所述的 多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱中；
分注機(jī)構(gòu)，該機(jī)構(gòu)包括第一分注嘴，用于將洗滌液分注到所述 的多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用于將回收液分注 到所述的多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱中；以及
移動(dòng)裝置，用于使所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)的所述的單個(gè)加壓嘴 和所述的保持機(jī)構(gòu)這兩者之一相對(duì)于另一者進(jìn)行相對(duì)移動(dòng)。
根據(jù)如此構(gòu)造，就能夠通過(guò)簡(jiǎn)單的裝置進(jìn)行核酸提取操作，其中 核酸提取柱和接收含核酸的回收液的回收容器分別被排布在多個(gè)位 置上，并由保持機(jī)構(gòu)保持；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)的單個(gè)加壓嘴和分注機(jī) 構(gòu)的分注嘴可相對(duì)移動(dòng)，從而將壓縮空氣引入核酸提取柱中，并且對(duì) 洗滌液和回收液進(jìn)行分注；并且，核酸提取柱中的過(guò)濾材料所吸附的 核酸被分離和回收。
(16) .上述(12)到(15)中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置， 其中，所述的多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱被支承在固定側(cè)；以及 其中，所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)的所述的單個(gè)加壓嘴以在所述的
多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱的排布方向上可移動(dòng)的方式受到支承。
根據(jù)如此構(gòu)造，當(dāng)加壓嘴沿核酸提取柱的排布方向進(jìn)行移動(dòng)時(shí)， 就可以依次向多個(gè)核酸提取柱中供入氣體。
(17) .上述(12)到(16)中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置，
其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴中的至少一者與所 述的單個(gè)加壓嘴被設(shè)置成一體化的可移動(dòng)件。
根據(jù)如此構(gòu)造，當(dāng)加壓嘴與分注嘴被設(shè)置成一體化的可移動(dòng)件 時(shí)，可以簡(jiǎn)單地設(shè)置壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)和分注機(jī)構(gòu)。
(18) .上述(12)到(17)中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置，
其中，所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)的所述的單個(gè)加壓嘴被支承在固
定側(cè)；以及
其中，所述的多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱以在該多個(gè)經(jīng)排布的核酸 提取柱的排布方向上可移動(dòng)的方式受到支承。
根據(jù)如此構(gòu)造，當(dāng)固定分注嘴而移動(dòng)核酸提取柱時(shí)，大量核酸提 取柱都能夠依次受到加壓、分注、洗滌、分注和回收這些處理中的每 一步處理，并且當(dāng)已處理的核酸提取柱和回收容器接著換成未處理的 核酸提取柱和回收容器時(shí)，就可以以連續(xù)的方式進(jìn)行大量處理。
(19) .上述(12)到(18)中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置， 其中，以相同的排布間距來(lái)設(shè)置所述的多個(gè)核酸提取柱；以及 其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴分別與所述的單個(gè)
加壓嘴的排布距離均為所述的多個(gè)核酸提取柱的所述的相同的排布 間距的整數(shù)倍。
根據(jù)如此構(gòu)造，以相同的排布間距來(lái)設(shè)置核酸提取柱，并且分注 嘴與加壓嘴之間的排布距離是核酸提取柱的排布間距的整數(shù)倍，因 此，在這種情況下，就可以同時(shí)對(duì)多個(gè)不同的核酸提取柱進(jìn)行分注處 理和加壓處理，從而使處理時(shí)間縮短。
圖1示出核酸提取裝置的一個(gè)實(shí)施方案，并且是示出移去蓋子 后的狀態(tài)的斜視圖。
圖2是核酸提取裝置的移動(dòng)頭的結(jié)構(gòu)輪廓圖。 圖3是核酸提取裝置的結(jié)構(gòu)輪廓框圖。
圖4A是提取柱的斜視圖，而圖4B是沿該提取柱的IVB-IVB截 取的剖面圖。
圖5A到5G是提取操作的步驟圖。
圖6A到6C是示出由移動(dòng)頭向提取柱供入壓縮空氣的方式的示意圖。
圖7A到7B是示出從移動(dòng)頭向提取柱分注洗滌液的方式的示意
10
圖。
圖8A到8B是示出從移動(dòng)頭向提取柱分注回收液的方式的示意圖。
圖9是示出核酸提取裝置的另一個(gè)實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)輪廓圖。 圖IO是示出本發(fā)明的核酸提取步驟的工藝流程圖。 圖11是示出核酸收率與洗滌液注入后的允許停留時(shí)間之間的關(guān) 系的圖。
圖12是示出核酸收率與回收液注入后的允許停留時(shí)間之間的關(guān) 系的圖。
2表示裝置主體，3表示保持機(jī)構(gòu)，4表示壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，5 表示分注機(jī)構(gòu)，6表示臺(tái)架，7表示移動(dòng)裝置，ll表示提取柱(核酸 提取柱)，lib表示核酸吸附性多孔膜，12表示廢液容器，13表示 回收容器，21表示柱支架，22表示容器保持立架，40表示移動(dòng)頭(可 移動(dòng)件)，41表示加壓嘴，43表示氣泵，45表示開(kāi)關(guān)閥，46表示壓 力傳感器，51w和51r分別表示分注嘴，52w和52r分別表示供給泵， 56w和56r分別表示瓶子，70表示控制部分，72表示存儲(chǔ)部分，100 表示核酸提取裝置，S表示樣品溶液，W表示洗滌液，R表示回收液。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方案
下文中，將給出本發(fā)明的核酸提取裝置的實(shí)施方式的詳細(xì)描述， 該提取裝置適用于實(shí)施本發(fā)明的核酸提取方法。
圖1示出核酸提取裝置的一個(gè)實(shí)施方案，并且是示出移去蓋子 后的狀態(tài)的斜視圖；圖2是核酸提取裝置的移動(dòng)頭的結(jié)構(gòu)輪廓圖；圖 3是核酸提取裝置的結(jié)構(gòu)輪廓框圖。
通過(guò)設(shè)置以下部分而構(gòu)成本發(fā)明的核酸提取裝置ioo，所述部分
為保持機(jī)構(gòu)3，其中，多個(gè)核酸提取柱(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為"提取柱") 以及回收容器13分別被保持并排布在容納部件中，所述的提取柱中 裝有過(guò)濾材料，所述的回收容器用于接收含核酸的回收液；壓縮空氣 供給機(jī)構(gòu)4，其中壓縮空氣由單個(gè)加壓嘴41引入提取柱11中；分注 機(jī)構(gòu)5，其具有將洗滌液和回收液分別注入到提取柱11中的分注嘴
51;移動(dòng)裝置7，其可以使保持機(jī)構(gòu)3和壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4的加壓 嘴41相對(duì)移動(dòng)。關(guān)于過(guò)濾材料，可以使用核酸吸附性固體載體，例 如核酸吸附性多孔物質(zhì)(本文中為核酸吸附性多孔膜)。
在其中實(shí)施本發(fā)明的核酸提取方法的核酸提取裝置100中，相
繼實(shí)施以下步驟步驟(l)，使含核酸的樣品溶液通過(guò)核酸吸附性多 孔膜，從而用所述的多孔膜吸附核酸；步驟(2)，在核酸被吸附的狀 態(tài)下來(lái)洗滌所述的核酸吸附性多孔膜；以及步驟(3)，使回收液通過(guò) 所述的核酸吸附性多孔膜，從而使核酸從所述的多孔膜上分離。
在說(shuō)明本實(shí)施方案的核酸提取裝置100的機(jī)構(gòu)組成之前，先說(shuō) 明使用這種核酸提取裝置來(lái)提取核酸的步驟。
圖4A是提取柱的斜視圖，圖4B是沿該提取柱的IVB-IVB截取 的剖面圖；而圖5A到5G包括了示出提取操作的各個(gè)步驟的圖。
核酸提取裝置100使用圖4A所示的提取柱11來(lái)提取樣品溶液 中的核酸。提取柱ll的構(gòu)成方式為使得核酸吸附性多孔膜llb被 保持在圓柱形主體lla (其頂端是開(kāi)放的)的底部，圓柱形主體lla 在核酸吸附性多孔膜lib以下的部分被成形為漏斗狀的形狀，細(xì)管口 形狀的出口 lie以預(yù)定的長(zhǎng)度從底端的中心突出來(lái)，并且在圓柱形主 體lla的兩側(cè)形成縱向突出體lld。在從提取柱11的頂端開(kāi)口 lie 分注樣品溶液之后、分注洗滌液之后以及分注回收液之后(這些溶液 將在下文中提到)，均從頂端開(kāi)口 lle引入壓縮空氣，而各種溶液則 通過(guò)核酸吸附性多孔膜llb，向下流動(dòng)，并由開(kāi)口 llc排放到廢液容 器12或回收容器13 (各種容器將在下文中提到)中。順便提及，在 圖中所示的情況下，圓柱形主體lla具有這樣的結(jié)構(gòu)圓柱形主體 lla被分為上部和下部，并通過(guò)將上部和下部接合而使之連接在一 起。如圖4B所示的沿IVB-IVB截取的剖面圖，頂端開(kāi)口 lle具有斜 面llf，其中內(nèi)表面被切削成錐形，并且斜面llf的形成方式為使 得其與加壓嘴41 (將在下文提到)的前端的傾斜的外表面基本吻合。
基本上來(lái)說(shuō)，核酸提取裝置100通過(guò)圖5A到5G所示的提取步 驟來(lái)進(jìn)行核酸的提取。首先，在圖5A步驟中，將含核酸(經(jīng)溶解處 理)的樣品溶液S倒入位于廢液容器12之上的提取柱11中。然后，
在圖5B所示的步驟中，壓縮空氣被引入提取柱11中，以施加壓力 并通過(guò)核酸吸附性多孔膜lib,從而使得樣品溶液S通過(guò)核酸吸附性 多孔膜llb，而核酸被吸附在該多孔膜上，通過(guò)多孔膜的液體成分則 被排放到廢液容器12中。
接著，在圖5C所示的步驟中，洗滌液W被自動(dòng)地分注到提取 柱11中，在圖5D所示的步驟中，壓縮空氣被引入到提取柱11中， 在核酸仍保留在核酸吸附性多孔膜llb上時(shí)，進(jìn)行洗滌和除去其它雜 質(zhì)的操作，而通過(guò)多孔膜的洗滌液W則被排放到廢液容器12中。圖 5C所示的步驟和圖5D所示的步驟可以重復(fù)幾次。
接著，在圖5E所示的步驟中，將提取柱11下部的廢液容器12 換為回收容器13，之后，在圖5F所示的步驟中，將回收液R自動(dòng)地 分注到提取柱11中，在圖5G所示的步驟中，壓縮空氣被引入到提 取柱11中以便進(jìn)行加壓，從而使得核酸吸附性多孔膜Ub與核酸之 間的結(jié)合力變?nèi)?，以釋放被吸附的核酸，而含核酸的回收液R則被 排放到回收容器13中以實(shí)現(xiàn)回收。
基本上來(lái)說(shuō)，位于上述提取柱11中的核酸吸附性多孔膜lib是 多孔物質(zhì)，液體能夠通過(guò)其中，并且該多孔物質(zhì)的表面具有通過(guò)化學(xué) 鍵作用力的方式來(lái)吸附樣品溶液中的核酸的性質(zhì)。所述的核酸吸附性 多孔膜被構(gòu)造成這樣的方式在使用洗滌液進(jìn)行洗滌時(shí)，核酸保持吸 附，而在使用回收液進(jìn)行回收時(shí)，核酸的吸附力變?nèi)鯊亩蛊浔会尫拧?詳細(xì)情況將在下文中提到。
如圖1到圖3所示，在核酸吸附性裝置100的主體2中，該裝 置設(shè)置有以下部分柱支架21，用于保持多個(gè)提取柱ll;容器保持 立架22，用于保持廢液容器12和回收容器13;壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4， 通過(guò)該機(jī)構(gòu)將壓縮空氣引入提取柱11中；分注機(jī)構(gòu)5，通過(guò)該機(jī)構(gòu) 將洗滌液W和回收液R分注提取柱11中；等等。柱支架21和容器 保持立架22構(gòu)成了保持機(jī)構(gòu)3。以下，將詳細(xì)說(shuō)明機(jī)構(gòu)3到機(jī)構(gòu)5 中的各個(gè)機(jī)構(gòu)。
保持機(jī)構(gòu)
保持機(jī)構(gòu)3包括柱支架21和容器保持立架22。容器保持立架 22中具有位于裝置主體2的前側(cè)下部的臺(tái)架6，用于保持廢液容器 12和回收容器13。隨著容器交換用電動(dòng)機(jī)32(直流電動(dòng)機(jī))的驅(qū)動(dòng)， 運(yùn)作部件31 (參見(jiàn)圖3)發(fā)生移動(dòng)，由此來(lái)進(jìn)行臺(tái)架6中的容器的交 換移動(dòng)(向前移動(dòng)和向后移動(dòng))操作，所述運(yùn)作部件31設(shè)置于容器 保持立架22的底部。這種向前和向后移動(dòng)的結(jié)果是將回收容器13 定位于柱支架21的下方或?qū)U液容器12定位于柱支架21的下方。 根據(jù)定位傳感器33a和33b的檢測(cè)結(jié)果，來(lái)控制上述容器交換用電動(dòng) 機(jī)32的運(yùn)轉(zhuǎn)。
柱支架21是通過(guò)將前、后板件粘合而構(gòu)成的分體式(two divided)結(jié)構(gòu)，所以柱支架21設(shè)有在橫向方向上延伸的保持件21a 和21b。在保持件21a和21b上形成了多個(gè)保持孔21c，提取柱U從 上方插入，而在圓柱形主體lla的兩側(cè)形成的突出體lld(參見(jiàn)圖4A 和4B)的下端與柱支架21中的連接件(圖中未示出)連接，并由該 連接件保持。該連接件能夠被移動(dòng)，并且在移動(dòng)時(shí)，其與所述突出體 lld的連接被解除，使所有的提取柱11同時(shí)下落并被扔掉。
在臺(tái)架6位于圖1所示的下降的位置時(shí)，提取柱ll (由柱支架 21所保持)的出口 llc的底端定位于臺(tái)架6中所設(shè)置的廢液容器12 和回收容器13的上方。當(dāng)隨著諸如脈沖電動(dòng)機(jī)之類(lèi)的升降用電動(dòng)機(jī) 47 (參見(jiàn)圖3)的驅(qū)動(dòng)而使容器保持立架22升起和下降、同時(shí)通過(guò) 光傳感器48a到48c的檢測(cè)結(jié)果來(lái)控制臺(tái)架6升起和下降的時(shí)候，在 臺(tái)架6升起時(shí)，提取柱11的出口 llc就會(huì)以預(yù)定的量插入廢液容器 12或回收容器13中。
臺(tái)架6的上表面上設(shè)有廢液容器保持孔和回收容器保持孔，這 兩種保持孔在橫向方向上延伸為平行的兩列，并且多個(gè)廢液容器12 中的每一個(gè)廢液容器和多個(gè)回收容器13中的每一個(gè)回收容器分別被 位于后側(cè)的廢液容器保持孔和位于前側(cè)的回收容器保持孔保持成列。 將廢液容器保持孔和回收容器保持孔排布成與柱支架21的保持孔 21c的位置相同并且間距(距離)相同的方式，并且進(jìn)行這樣的設(shè)定， 使得廢液容器12和回收容器13分別位于相應(yīng)的被保持的提取柱11
的下方。關(guān)于廢液容器12和回收容器13，優(yōu)選使用具有不同尺寸和 形狀等的容器，以免混淆。
壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)
如圖1到3所示，壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4設(shè)有以下部分作為可
移動(dòng)件的移動(dòng)頭40，其與上述保持機(jī)構(gòu)3中的臺(tái)架6相反地升起和 下降；單個(gè)加壓嘴41，被固定在移動(dòng)頭40上；氣泵43，可產(chǎn)生壓縮 空氣；安全閥44,該閥用于打開(kāi)和關(guān)閉設(shè)定在加壓嘴41這一側(cè)的氣 體供應(yīng)通路；壓力傳感器46，被設(shè)定在加壓嘴41這一側(cè)；以及加壓 嘴升降裝置，其可以使加壓嘴41升起和下降。關(guān)于加壓嘴升降裝置， 通過(guò)加壓嘴升/降用電動(dòng)機(jī)81 (例如脈沖電動(dòng)機(jī))和與之相連的螺柱 -螺母式(bold-nut)機(jī)構(gòu)來(lái)完成升起和下降的操作。如此構(gòu)造的結(jié)果 是壓縮空氣被依次供入到提取柱11中。氣泵43、安全閥44和加 壓嘴41各自的操作都是根據(jù)控制部分70的控制命令來(lái)實(shí)施的。
上述移動(dòng)頭40設(shè)有以下部分移動(dòng)頭移動(dòng)用電動(dòng)機(jī)26 (參見(jiàn)圖 3)(例如脈沖電動(dòng)機(jī))，其作為移動(dòng)裝置被定位于裝置主體2的中 間框架23與上框架24之間；位于驅(qū)動(dòng)側(cè)的皮帶輪27，是由移動(dòng)頭 移動(dòng)用電動(dòng)機(jī)26驅(qū)動(dòng)而旋轉(zhuǎn)的；位于空轉(zhuǎn)側(cè)的皮帶輪28，其自由旋 轉(zhuǎn)并進(jìn)行張力調(diào)節(jié)；以及同步皮帶29，其懸掛在驅(qū)動(dòng)側(cè)的皮帶輪27 和空轉(zhuǎn)側(cè)的皮帶輪28之間。順便提及，移動(dòng)頭移動(dòng)用電動(dòng)機(jī)26是根 據(jù)光傳感器25a到25c的檢測(cè)結(jié)果來(lái)控制而被驅(qū)動(dòng)的，并且移動(dòng)頭移 動(dòng)用電動(dòng)機(jī)26沿提取柱11的排布方向來(lái)移動(dòng)移動(dòng)頭40。
以可上、下移動(dòng)的方式將加壓嘴41安裝在移動(dòng)頭40中，并使 其可以更多地向下移動(dòng)，此外，位于加壓嘴41的下部前端的外邊緣 被制成圓錐形。如此構(gòu)造的結(jié)果是當(dāng)加壓嘴41向下移動(dòng)、并使加 壓嘴41的前端與提取柱11 (設(shè)置在柱支架21中)的頂端開(kāi)口接觸 時(shí)，提取柱的被切削成錐形的斜面llf緊緊地貼附在加壓嘴41的前 端的圓錐形表面上，因此提取柱11的內(nèi)部被緊緊地密封。在這種緊 密密封的狀態(tài)下，就可以將壓縮空氣供入提取柱11中，而不會(huì)泄露。
當(dāng)要排放位于氣泵43和開(kāi)關(guān)閥45之間的通路中的空氣時(shí)，將
安全閥44打開(kāi)通向大氣，并進(jìn)行排放。空氣環(huán)路這樣構(gòu)建使得開(kāi)
關(guān)閥45選擇性地開(kāi)啟，并使壓縮空氣從氣泵43通過(guò)加壓嘴41而引
入到提取柱II中。如此構(gòu)造的結(jié)果是形成了從氣泵43到提取柱
11的氣流供應(yīng)通路。 分注機(jī)構(gòu)
分注機(jī)構(gòu)5設(shè)有以下部分洗滌液分注嘴51w和回收液分注嘴 51r，并且分注嘴51w和分注嘴51r—起被設(shè)置于上述的可移動(dòng)的移 動(dòng)頭40中，所述移動(dòng)頭40能夠在柱支架21上沿橫向方向移動(dòng)；洗 滌液供給泵52w (參見(jiàn)圖3)，其中洗滌液瓶56w所容納的洗滌液W 被提供并輸送到洗滌液分注嘴51w中；回收液供給泵52r(參見(jiàn)圖3)， 其中回收液瓶56r所容納的回收液R被提供并輸送到回收液分注嘴 51r中；廢液器皿57，被安裝在中間框架23上；等等。
通過(guò)移動(dòng)頭移動(dòng)用電動(dòng)機(jī)26 (參見(jiàn)圖3)的驅(qū)動(dòng)，使移動(dòng)頭40 在各個(gè)提取柱U處停下，而在復(fù)位狀態(tài)下，使移動(dòng)頭40停在廢液器 皿57上；以這樣的方式對(duì)驅(qū)動(dòng)加以控制，以便使每個(gè)提取柱上方的 空間不受遮攔。當(dāng)每個(gè)提取柱上方的空間不受遮攔時(shí)，工作性能會(huì)大 大提高。
洗滌液分注嘴51w和回收液分注嘴5Ir的前端向下彎曲，洗滌 液分注嘴51w通過(guò)閥55w與洗滌液供給泵52w連接，洗滌液供給泵 52w與洗滌液瓶56w連接，回收液分注嘴51r通過(guò)閥55r與回收液供 給泵52r連接，回收液供給泵52r與回收液瓶56r連接。洗滌液瓶56w 和回收液瓶56r分別被設(shè)置在裝置主體2的前面，由此使操作性能提 高。洗滌液供給泵52w和回收液供給泵52r都由管式泵構(gòu)成，并且 它們各自的驅(qū)動(dòng)都是受控的，從而可以由泵用電動(dòng)機(jī)53w和53r (脈 沖電動(dòng)機(jī))根據(jù)傳感器54w和54r的位置檢測(cè)結(jié)果而分別注入預(yù)定 量的洗漆液W和回收液R。這些泵用電動(dòng)機(jī)53w、 53r和閥55w、 55r 都是根據(jù)控制部分70的指令來(lái)工作的。
當(dāng)要分注洗滌液W或回收液R時(shí)，開(kāi)啟閥55w或55r，并開(kāi)動(dòng) 泵用電動(dòng)機(jī)53w或53r，使得洗漆液供給泵52w的轉(zhuǎn)動(dòng)部件或回收液
供給泵52r的轉(zhuǎn)動(dòng)部件轉(zhuǎn)動(dòng)并工作。如此構(gòu)造的結(jié)果是通過(guò)洗滌液
供給泵52w或回收液供給泵52r吸入洗滌液W或回收液R，并經(jīng)過(guò) 閥55w或55r從洗滌液分注嘴51w或回收液分注嘴51r排出洗滌液 W和回收液R。在進(jìn)行這種排放操作時(shí)，將洗漆液分注嘴51w或回 收液分注嘴51r移動(dòng)到提取柱11的上方。結(jié)果，將預(yù)定量的洗滌液 W或回收液R分注到提取柱11中。
洗滌液瓶56w和回收液瓶56r各自具有容器主體56wb或56rb 以及蓋56wu或56m;蓋56wu和56m中分別設(shè)有細(xì)管狀的吸管58w 和58r，所述吸管58w和58r的下端開(kāi)口分別接近容器瓶主體56wb 和56rb的底部，從而隨著洗滌液供給泵52w或回收液供給泵52r的 操作，分別抽吸洗滌液W或回收液R。
上述機(jī)構(gòu)3到5分別是由其各自連接的控制部分70根據(jù)控制板 (圖中未示出)的輸入操作來(lái)控制的，該控制板設(shè)置于裝置主體2 的上部。換言之，驅(qū)動(dòng)和控制是根據(jù)存儲(chǔ)部分72 (與控制部分70連 接)中預(yù)先存儲(chǔ)的程序來(lái)實(shí)施的。
以下將詳細(xì)說(shuō)明使用上述核酸提取裝置100進(jìn)行的提取操作。 首先，將提取柱11設(shè)置在位于保持機(jī)構(gòu)3的臺(tái)架6中的柱支架21 中，將廢液容器12和回收容器13分別設(shè)置在臺(tái)架6中，并將臺(tái)架6 安裝在裝置主體2的容器保持立架22中，由此做好準(zhǔn)備。然后，使 用移液管等將經(jīng)過(guò)溶解處理的樣品溶液S依次注入到每一個(gè)提取柱 11中。在注入樣品溶液S的時(shí)候，將移動(dòng)頭40放置于廢液器皿57 的正上方，從而使提取柱上方的空間不受遮攔。順便提及，還可以在 把提取柱11設(shè)置到尚未安裝到核酸提取裝置100上的臺(tái)架6中之前 或之后，將樣品溶液S預(yù)先注入到提取柱11中。
然后，通過(guò)對(duì)操作控制板進(jìn)行操作使該裝置工作，其中，如圖 6A所示，移動(dòng)頭40被轉(zhuǎn)移到提取柱11正上方的位置。將加壓嘴41 放置在該圖左端的提取柱Cl (示作實(shí)例)的正上方，并通過(guò)開(kāi)動(dòng)壓 縮空氣供給機(jī)構(gòu)4的加壓嘴升/降用電動(dòng)機(jī)81，使移動(dòng)頭40的加壓 嘴41向下移動(dòng)(圖6B)。結(jié)果，加壓嘴41的前端外表面緊緊地貼 附在提取柱11的斜面llf上。同時(shí)，升降用電動(dòng)機(jī)47驅(qū)動(dòng)容器保持
立架22向上移動(dòng)，使提取柱11的底端出口 lie以預(yù)定的量插入到廢 液容器12中，從而防止了排出的溶液因滴濺等泄露到外部而造成的 污染。
然后，進(jìn)行壓縮空氣的供入操作?？刂撇糠?0發(fā)出指令，結(jié)果， 在開(kāi)關(guān)閥45處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)驅(qū)動(dòng)氣泵43，再將開(kāi)關(guān)閥45打開(kāi)。壓 縮空氣立即從氣泵43經(jīng)加壓嘴41以預(yù)定的量供入到第一提取柱11 (Cl)中。
然后，在關(guān)閉開(kāi)關(guān)閥45后，通過(guò)加壓嘴升/降用電動(dòng)機(jī)81使加 壓嘴41升起，再開(kāi)動(dòng)移動(dòng)頭移動(dòng)用電動(dòng)機(jī)26，使移動(dòng)頭40移動(dòng)與 柱11的排布間距相等的距離。而后，將預(yù)定量的壓縮空氣以相同的 方式供入到相鄰的第二提取柱11 (C2)(圖6C)中。
在施加壓力使樣品溶液S通過(guò)核酸吸附性多孔膜Ub后，樣品 溶液S中的核酸被吸附和保留在多孔膜lib上，同時(shí)，其它液體成 分由底部的出口 llc排放到廢液容器12中。當(dāng)所有的樣品溶液S都 通過(guò)核酸吸附性多孔膜llb之后，壓力降低到液體排放結(jié)束時(shí)的壓力 以下，因此通過(guò)壓力傳感器46來(lái)檢測(cè)提取柱11己完成提取。所述步 驟重復(fù)進(jìn)行的次數(shù)為提取柱11的個(gè)數(shù)。
接著進(jìn)行洗滌處理。在上述的壓縮空氣供入操作之后，將移動(dòng) 頭40升起，并返回到第一提取柱(Cl)的上方。然后將移動(dòng)頭40 的洗滌液分注嘴51w停在第一提取柱(Cl)的上方，并注入預(yù)定量 的洗滌液W，再將移動(dòng)頭40移動(dòng)到下一個(gè)提取柱(C2)的上方，并 相繼注入洗漆液W。當(dāng)將洗滌液W分注到所有的提取柱11中的操 作已完成后，將移動(dòng)頭40返回到第一提取柱(Cl)的上方。
然后，如圖6A到6C所示，使移動(dòng)頭40的加壓嘴41下降，并 且，在將加壓嘴41的底端部分壓附于提取柱11的頂端開(kāi)口上以將其 封閉之后，按照上述相同的方式打開(kāi)開(kāi)關(guān)閥45，使壓縮空氣供入到 提取柱11中。受壓力作用的洗滌液W進(jìn)行洗滌，并在通過(guò)核酸吸附 性多孔膜lib的同時(shí)除去除核酸以外的雜質(zhì)；洗滌液W由底端開(kāi)口 lie排放到廢液容器12中。當(dāng)所有提取柱11中的所有洗滌液W都 已通過(guò)核酸吸附性多孔膜llb而排出時(shí)，將移動(dòng)頭40返回到起始位
置。順便提及，當(dāng)洗漆處理被重復(fù)進(jìn)行兩次或多次時(shí)，上述操作均被 重復(fù)。
接著進(jìn)行回收處理。首先，在洗滌處理之后，在移動(dòng)頭40進(jìn)行 上述的返回操作的同時(shí)，通過(guò)升降用電動(dòng)機(jī)47使臺(tái)架6下降，從而 使提取柱ll底端的出口 llc與廢液容器12分離，在此之后，通過(guò)容 器交換用電動(dòng)機(jī)32的驅(qū)動(dòng)使得保持機(jī)構(gòu)3的運(yùn)作部件31移動(dòng)，從而 使臺(tái)架向后移動(dòng)。由此，通過(guò)把回收容器13定位于提取柱11之下， 而使容器發(fā)生交換。
在此之后，使用升降用電動(dòng)機(jī)47將臺(tái)架6升高，并保持使提取 柱11的底端插入到回收容器13中的狀態(tài)。然后，如圖8A所示，移 動(dòng)移動(dòng)頭40，由此使回收液分注嘴51r停在第一提取柱(Cl)的上 方，以便注入預(yù)定量的回收液R，隨后將移動(dòng)頭40移動(dòng)到下一個(gè)提 取柱(C2)，并相繼進(jìn)行回收液R的注入操作(圖8B)。當(dāng)將回收 液R分注到所有的提取柱11中的操作已完成后，按照上述相同的方 式將壓縮空氣供入每一個(gè)提取柱11中，如圖6A到6C所示。
在按照上述相同的方式供入壓縮空氣后，在壓力的作用下，回 收液R通過(guò)核酸吸附性多孔膜llb、釋放出被多孔膜吸附的核酸，然 后核酸與回收液R—起由底端出口 Uc排放到回收容器13中。在所 有提取柱11中的所有回收液R都被排放到回收容器13中之后，將 移動(dòng)頭40移動(dòng)到廢液器皿57正上方的最初的空位處，至此完成--系 列操作。
開(kāi)動(dòng)升降用電動(dòng)機(jī)47，使完成了提取操作的臺(tái)架6下降，將提 取柱11和廢液容器12各自從柱支架21和臺(tái)架6中取出并扔掉，而 從臺(tái)架6中取出回收容器13，如果需要可將其蓋上并進(jìn)行隨后的核 酸分析處理。
在本實(shí)施方案中，示出了這樣的結(jié)構(gòu)，其中多個(gè)提取柱ll被支 承在固定側(cè)，而壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4的加壓嘴41則以可沿提取柱11 的排布方向自由移動(dòng)的方式受到支承。然而，本發(fā)明并不限于這一種 實(shí)施方案，如圖9的核酸提取裝置的結(jié)構(gòu)輪廓中所示的結(jié)構(gòu)也是合乎 需要的，其中壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4的加壓嘴41被支承在固定側(cè)，而
多個(gè)提取柱11、廢液容器12和回收容器13分別以可沿各自的排布 方向自由移動(dòng)的方式受到支承。根據(jù)圖9所示的結(jié)構(gòu)，可以按這樣一 種方式連續(xù)地進(jìn)行大量核酸的處理，所述方式為..將各提取柱11、 廢液容器12和回收容器13連續(xù)提供給固定加壓嘴41、洗滌液分注 嘴51w和回收液分注嘴51r，并且回收完成核酸提取操作后得到的物 質(zhì)。
由氣泵43供給提取柱11的空氣可以是任何其它氣體，只要它 不會(huì)影響樣品溶液、洗滌液和回收液的性質(zhì)等即可。
與其中多個(gè)提取柱11被一起抽吸的結(jié)構(gòu)相比而言，核酸提取裝 置100可以控制氣體的供入時(shí)間和氣體的供入量等，使這些條件針對(duì) 每個(gè)提取柱11都達(dá)到最佳。此外，即使在樣品溶液的液體量和粘度 等不均衡時(shí)，也很難受其影響，并且本發(fā)明的裝置可以加快核酸提取 處理的節(jié)奏，核酸的目標(biāo)提取物可更為廣泛，并且裝置的適用性可以 得到增強(qiáng)。例如，在向多個(gè)提取柱同時(shí)供入氣體的結(jié)構(gòu)中，即使向其 中部分提取柱供入壓縮空氣的操作已經(jīng)完成，在向其它提取柱供入壓 縮空氣的操作沒(méi)有完成的情況下，也不可以結(jié)束壓縮空氣的供入。因 此，只有在多個(gè)提取柱11都結(jié)束同一操作后，才可以進(jìn)入下一步操 作。然而，在根據(jù)本實(shí)施方案的核酸提取裝置100中，各個(gè)提取柱相 繼受到處理，因此不會(huì)受其它提取柱的任何影響，從而可以在最短的 時(shí)間內(nèi)進(jìn)行最佳的處理。
此外，因?yàn)閮H向一個(gè)提取柱11供入氣體，所以與向多個(gè)提取柱 11同時(shí)供入氣體的情況相比，前者就可以降低氣泵43的供給量。因 此，甚至可以使用小尺寸的氣泵43，其安裝所需的空間小，并且可 實(shí)現(xiàn)緊湊的結(jié)構(gòu)。
此外，將提取柱11以均勻的排布間距進(jìn)行排布，并且分注嘴51r 和51w與加壓嘴41之間的排布距離分別為提取柱11的排布間距的 整數(shù)倍，以上事實(shí)的結(jié)果是可以同時(shí)對(duì)多個(gè)不同的提取柱11進(jìn)行 分注處理和加壓處理，因此可以使處理時(shí)間縮短。順便提及，提取柱 11、廢液容器12和回收容器13除了排布成直線(xiàn)狀以外，還可以排布 成曲線(xiàn)狀(例如圓弧形)。當(dāng)它們排布成(例如)圓弧形時(shí)，可以使
用其支承軸為該圓弧的圓心的臂狀物，將壓縮空氣供給并充入位于圓 弧上的各個(gè)位置處的提取柱中。
在本發(fā)明的核酸提取方法和核酸提取裝置中，洗滌液的分注及 允許停留的時(shí)間以及回收液的分注及允許停留的時(shí)間這二者中，至少 一者被控制為預(yù)定的時(shí)間。
圖io是示出本發(fā)明的核酸提取步驟的工藝流程圖。在核酸提取
步驟(將在下文中提到)中，將使用上述的核酸提取裝置100。
如圖IO所示，首先將含梭酸的樣品溶液S注入到提取柱11中
(步驟S101)。將壓縮空氣引入到其中容納有樣品溶液s的提取柱
11中(步驟S102)，并且將洗滌液W注入其中(步驟S103)。在 分注洗滌液W之后，使洗滌液照原樣停留然后再將壓縮空氣引入到 提取柱中，從而使洗滌液W停留預(yù)定的時(shí)間，其中，核酸被浸泡在 所述的洗滌液中(步驟S104)。在所述的預(yù)定時(shí)間結(jié)束后，洗滌液 W被排放到廢液容器12中(步驟S105)。
優(yōu)選的是，將洗滌液W的允許停留時(shí)間控制為50秒到l,OOO秒， 更優(yōu)選的是，控制為IOO秒到300秒。
在分注洗滌液W之后，在將壓縮空氣引入到提取柱中之前，使洗 滌液W (核酸被浸泡在所述的洗滌液中)停留預(yù)定的時(shí)間，由此可以 使回收處理后的核酸提取量增加。
在此之后，分注回收液R (步驟S106)。在分注回收液R之后， 在將壓縮空氣引入到提取柱11中之前，使回收液R停留預(yù)定的時(shí)間， 其中，核酸被浸泡在所述的回收液中(步驟S107)。在所述的預(yù)定 時(shí)間結(jié)束后，回收液R被排放到回收容器13中(步驟S108)。
優(yōu)選的是，將回收液R的允許停留時(shí)間控制為20秒到300秒， 更優(yōu)選的是，控制為25秒到60秒。
在分注回收液R之后，在將壓縮空氣引入到提取柱中之前，使回 收液R (核酸被浸泡在所述的回收液中)停留預(yù)定的時(shí)間，由此可以 使回收處理后的核酸提取量增加。
將洗滌液W的注入及允許停留的時(shí)間或回收液R的注入及允許停 留的時(shí)間控制為預(yù)定的時(shí)間，會(huì)得到這樣的效果可提取的核酸的量
增加。在洗滌液W的注入及允許停留的時(shí)間以及回收液R的注入及允 許停留的時(shí)間分別被控制為各自的預(yù)定時(shí)間的情況下，就可以進(jìn)一步 增加可提取的核酸的量。
例如，在僅僅使洗滌液W停留預(yù)定時(shí)間的情況下，就省略使回收
液R停留的步驟(如圖10中步驟S107所示)。另一方面，在僅僅使 回收液R停留預(yù)定時(shí)間的情況下，就省略使洗滌液W停留的步驟(如 圖10中步驟S104所示)。
參照?qǐng)D3來(lái)說(shuō)明這樣一種機(jī)構(gòu)，該機(jī)構(gòu)用于將洗滌液的注入及允 許停留的時(shí)間以及回收液的注入及允許停留的時(shí)間分別控制為預(yù)定的 時(shí)間。
如圖3所示，控制部分70控制氣泵43、安全閥44和加壓嘴41， 使得在洗滌處理過(guò)程中分注洗滌液W之后，不向提取柱11供入壓縮 空氣。然后，使核酸在提取柱11內(nèi)的洗滌液W中浸泡預(yù)定的時(shí)間， 通過(guò)控制部分70控制氣泵43、安全閥44和加壓嘴41，使壓縮空氣再 次輸入，由此使洗滌液W從提取柱11中排出。順便提及，在回收處 理過(guò)程中，在分注回收液R之后，控制部分70控制氣泵43、安全閥 44和加壓嘴41，使得壓縮空氣不被輸送到提取柱11中。核酸在提取 柱內(nèi)的回收液R中浸泡預(yù)定的時(shí)間，通過(guò)控制部分70控制氣泵43、 安全閥44和加壓嘴41，使壓縮空氣再次輸入，由此使回收液R從提 取柱中排出。在這種實(shí)施方案中，控制部分70起到了用于控制允許停 留時(shí)間的裝置的作用。
在這種實(shí)施方案中，使用了一種機(jī)構(gòu)，該機(jī)構(gòu)通過(guò)控制部分70將 洗滌液W的分注及允許停留的時(shí)間以及回收液R的分注及允許停留的 時(shí)間分別控制為預(yù)定的時(shí)間，但對(duì)這種機(jī)構(gòu)沒(méi)有限制。例如，可以安 裝進(jìn)氣制動(dòng)器，該制動(dòng)器與氣泵43、安全閥44和加壓嘴41協(xié)作來(lái)終 止壓縮空氣的供入，從而在洗滌液W和回收液R被分注后，使它們分 別能在提取柱中停留預(yù)定的時(shí)間。
下面，將詳細(xì)說(shuō)明上述提取柱11中所安裝的核酸吸附性多孔膜 (核酸吸附性多孔材料)llb。
上述提取柱11所容納的核酸吸附性多孔膜llb基本為核酸能夠通
過(guò)的多孔物質(zhì)。其表面的特征在于樣品溶液中的核酸可通過(guò)化學(xué)鍵 作用力的方式被吸附，并且其被構(gòu)造成這樣的方式在使用洗滌液進(jìn) 行洗滌時(shí)，仍保持吸附狀態(tài)，而在使用回收液進(jìn)行回收時(shí)，核酸的吸 附力變?nèi)醵会尫拧?br>
上述提取柱11所容納的核酸吸附性多孔膜lib優(yōu)選為以基本不 涉及離子鍵的相互作用來(lái)吸附核酸的多孔膜。這意味著在使用多孔膜 的條件下，沒(méi)有發(fā)生"離子化"，并且可以推測(cè)由于周?chē)鷺O性改變， 核酸和多孔膜相互吸引。因此，可以以?xún)?yōu)異的分離性能和優(yōu)良的洗滌 效率來(lái)分離和純化核酸。優(yōu)選的是，核酸吸附性多孔膜是具有親水性 基團(tuán)的多孔膜，并且可以推測(cè)當(dāng)周?chē)鷺O性改變時(shí)，核酸的親水性基 團(tuán)和多孔膜的親水性基團(tuán)相互吸引。
本文中，術(shù)語(yǔ)"具有親水性基團(tuán)的多孔膜"是指這樣的多孔膜， 其中構(gòu)成多孔膜的材料其本身具有親水性基團(tuán)，或者是這樣的多孔 膜，為了在多孔膜中引入親水性基團(tuán)，通過(guò)對(duì)多孔膜構(gòu)成材料進(jìn)行處 理或涂敷而得到該多孔膜。多孔膜構(gòu)成材料可以是有機(jī)或無(wú)機(jī)材料。 例如，可以使用這樣的多孔膜，其中多孔膜構(gòu)成材料本身是具有親水 性基團(tuán)的有機(jī)材料；可以使用這樣的多孔膜，為了將親水性基團(tuán)引入 其中，通過(guò)處理由不含親水性基團(tuán)的有機(jī)材料所制成的多孔膜而得到 該多孔膜；可以使用這樣的多孔膜，其中通過(guò)用具有親水性基團(tuán)的材 料涂敷由不含親水性基團(tuán)的有機(jī)材料所制成的多孔膜，由此引入親水 性基團(tuán)而得到該多孔膜；可以使用這樣的多孔膜，其中多孔膜構(gòu)成材 料本身是具有親水性基團(tuán)的無(wú)機(jī)材料；可以使用這樣的多孔膜，其中 為了將親水性基團(tuán)引入其中，通過(guò)處理由不含親水性基團(tuán)的無(wú)機(jī)材料 所制成的多孔膜而得到該多孔膜；并且可以使用這樣的多孔膜，其中 通過(guò)用具有親水性基團(tuán)的材料涂敷由不含親水性基團(tuán)的無(wú)機(jī)材料所 制成的多孔膜，由此引入親水性基團(tuán)而得到該多孔膜。為了處理方便， 優(yōu)選使用有機(jī)材料(例如有機(jī)聚合物)作為構(gòu)成多孔膜的材料。
親水性基團(tuán)是指能與水發(fā)生相互作用的極性基團(tuán)(原子)，包 括所有參與吸附核酸的基團(tuán)(原子)。作為親水性基團(tuán)，優(yōu)選那些 與水表現(xiàn)出約為中等水平的相互作用的親水性基團(tuán)(參見(jiàn)由共立出
版株式會(huì)社出版的《化學(xué)大詞典》中所述的關(guān)于"親水性基團(tuán)"中 的"親水性不太強(qiáng)的基團(tuán)")，其實(shí)例包括羥基、羧基、氰基和羥 乙基，優(yōu)選羥基。
關(guān)于能夠在本發(fā)明中使用的具有親水性基團(tuán)的多孔膜，可以舉出 含有酰氨基的有機(jī)材料的多孔膜。聚酰胺可優(yōu)選用作含有酰氨基的有 機(jī)材料。聚酰胺的實(shí)例為纖維蛋白、聚氨基酸、多肽、聚丙烯酰胺、
尼龍46、尼龍66、尼龍610、尼龍612、尼龍6、尼龍7、尼龍ll和 尼龍12，但是對(duì)此沒(méi)有限定。還可以使用改性尼龍，例如，N-甲基改 性尼龍、N-垸氧基甲基改性尼龍和N-烷硫基甲基改性尼龍。關(guān)于聚酰 胺多孔膜，可以為通過(guò)用(例如)美國(guó)專(zhuān)利No. 2,783,894、 3,408,315、 4,340,479、 4,340,480、 4,450,126和德國(guó)專(zhuān)利No. 3,138,525以及日本專(zhuān) 利申請(qǐng)公開(kāi)No. 58/037,842中所述的材料及所述的方法制成的那些，但 是對(duì)此沒(méi)有限制。
關(guān)于能夠在本發(fā)明中使用的含有羥基的有機(jī)材料的多孔膜，其實(shí)
例包括由以下物質(zhì)形成的多孔膜聚羥乙基丙烯酸、聚羥乙基甲基丙 烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和多糖 (例如聚氧化亞乙基和具有不同乙酰值的醋酸纖維素的混合物)，并 且特別優(yōu)選使用具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)材料的多孔膜。
關(guān)于用于多孔膜的有機(jī)材料，還可以使用乙烯基?；锏木酆?物的皂化產(chǎn)物；以及兩種或多種單體的皂化共聚物，該皂化共聚物優(yōu) 選含有至少為乙烯基酰化物的單體單元。所述的乙烯基?；锏木酆?物的皂化產(chǎn)物的皂化率、以及所述的兩種或多種單體的皂化共聚物(該 皂化共聚物含有至少為乙烯基?；锏膯误w單元)的皂化率均優(yōu)選為 1%或更高。還優(yōu)選的是，上述乙烯基?；锏孽；x自乙?；?、丙酰 基、丁?；?、戊酰基、庚酰基、辛?；⒐秕；⑹；?、十三酰 基、十六酰基和十八?；械闹辽僖环N。
可優(yōu)選使用纖維素、半纖維素、葡聚糖、淀粉酶、淀粉精、淀 粉、糖原、支鏈淀粉、甘露聚糖、葡甘露聚糖、地衣淀粉、異地衣淀 粉、昆布糖、角叉菜膠、木聚糖、果聚糖、褐藻酸、透明質(zhì)酸、軟骨 素、甲殼素和殼聚糖作為具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)材料。但是，對(duì)此沒(méi)有
限制，并可以使用任何具有多糖結(jié)構(gòu)或其衍生物的有機(jī)材料。此外， 可優(yōu)選使用任何上述多糖的酯衍生物。此外，可優(yōu)選使用任何上述多 糖的酯衍生物的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用選自羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦 酸酯和焦磷酸酯中的一種或多種作為任何上述多糖的酯衍生物的酯。 此外，更優(yōu)選使用羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸 酯和焦磷酸酯的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用選自垸基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳垸 基羰基酯中的一種或多種作為任何上述多糖的羧酸酯。此外，更優(yōu) 選使用任何上述多糖的烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和 芳烷基羰基酯的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用選自乙?；?、丙?；?、丁?；?、戊?；?、庚酰基、辛 ?；⒐秕；?、十二烷酰基、十三烷?；⑹轷；褪僳；?中的一種或多種作為任何上述多糖的垸基羰基酯的酯基。此外，更優(yōu) 選使用具有一個(gè)或多個(gè)選自乙?；⒈；⒍□；⑽祯；?、庚酰 基、辛?；?、癸?；?、十二烷?；⑹轷；⑹；褪?烷?；械孽セ娜魏紊鲜龆嗵堑脑砘a(chǎn)物。
優(yōu)選使用一種或多種丙烯?；图谆；鳛槿魏紊鲜龆?糖的烯基羰基酯的酯基。此外，更優(yōu)選使用具有一個(gè)或多個(gè)選自丙烯 ?；图谆；械孽セ娜魏紊鲜龆嗵堑脑砘a(chǎn)物。
優(yōu)選使用一種或多種苯酰基和萘?；?n叩hthaloyl)作為任何上 述多糖的芳香基羰基酯的酯基。此外，更優(yōu)選使用具有一個(gè)或多個(gè)含 苯酰基和萘?；孽セ娜魏紊鲜龆嗵堑脑砘a(chǎn)物。
優(yōu)選使用硝酸纖維素、硝酸半纖維素、硝酸葡聚糖、硝酸瓊脂 糖、硝酸糊精、硝酸淀粉酶、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支鏈淀粉、 硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸異地衣淀粉、 硝酸昆布糖、硝酸角叉菜膠、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、 硝酸透明質(zhì)酸、硝酸軟骨素、硝酸甲殼素和硝酸殼聚糖作為任何上述 多糖的硝酸酯。
此外，更優(yōu)選使用硝酸纖維素、硝酸半纖維素、硝酸葡聚糖、
硝酸瓊脂糖、硝酸糊精、硝酸淀粉酶、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸 支鏈淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸異 地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜膠、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、 硝酸褐藻酸、硝酸透明質(zhì)酸、硝酸軟骨素、硝酸甲殼素和硝酸殼聚糖 的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用硫酸纖維素、硫酸半纖維素、硫酸葡聚糖、硫酸瓊脂 糖、硫酸糊精、硫酸淀粉酶、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支鏈淀粉、 硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸異地衣淀粉、 硫酸昆布糖、硫酸角叉菜膠、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、 硫酸透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸甲殼素和硫酸殼聚糖作為任何上述 多糖的硫酸酯。
此外，更優(yōu)選使用硫酸纖維素、硫酸半纖維素、硫酸葡聚糖、 硫酸瓊脂糖、硫酸糊精、硫酸淀粉酶、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸 支鏈淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸異 地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜膠、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、 硫酸褐藻酸、硫酸透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸甲殼素和硫酸殼聚糖 的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選選自烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳垸基磺 酸酯中的一種或多種作為任何上述多糖的磺酸酯。此外，更優(yōu)選使用 任何上述多糖的烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺 酸酯的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用磷酸纖維素、磷酸半纖維素、磷酸葡聚糖、磷酸瓊脂 糖、磷酸糊精、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支鏈淀粉、 磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸異地衣淀粉、 磷酸昆布糖、磷酸角叉菜膠、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、 磷酸透明質(zhì)酸、磷酸軟骨素、磷酸甲殼素和磷酸殼聚糖作為任何上述 多糖的磷酸酯。
此外，更優(yōu)選使用磷酸纖維素、磷酸半纖維素、磷酸葡聚糖、 磷酸瓊脂糖、磷酸糊精、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸 支鏈淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸異
地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜膠、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、 磷酸褐藻酸、磷酸透明質(zhì)酸、磷酸軟骨素、磷酸甲殼素和磷酸殼聚糖 的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用膦酸纖維素、膦酸半纖維素、膦酸葡聚糖、膦酸瓊脂 糖、膦酸糊精、膦酸淀粉酶、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支鏈淀粉、 膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸異地衣淀粉、 膦酸昆布糖、膦酸角叉菜膠、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、 膦酸透明質(zhì)酸、膦酸軟骨素、膦酸甲殼素和膦酸殼聚糖作為任何上述 多糖的膦酸酯。
此外，更優(yōu)選使用膦酸纖維素、膦酸半纖維素、膦酸葡聚糖、 膦酸瓊脂糖、膦酸糊精、膦酸淀粉酶、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸 支鏈淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸異 地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜膠、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、 膦酸褐藻酸、膦酸透明質(zhì)酸、膦酸軟骨素、膦酸甲殼素和膦酸殼聚糖 的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用焦磷酸纖維素、焦磷酸半纖維素、焦磷酸葡聚糖、焦 磷酸瓊脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸淀粉酶、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖 原、焦磷酸支鏈淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸 地衣淀粉、焦磷酸異地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜膠、焦 磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明質(zhì)酸、焦磷 酸軟骨素、焦磷酸甲殼素和焦磷酸殼聚糖作為任何上述多糖的焦磷酸 酯。
此外，更優(yōu)選使用焦磷酸纖維素、焦磷酸半纖維素、焦磷酸葡 聚糖、焦磷酸瓊脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸淀粉酶、焦磷酸淀粉精、 焦磷酸糖原、焦磷酸支鏈淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、 焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸異地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磯酸角叉菜 膠、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明質(zhì)酸、 焦磷酸軟骨素、焦磷酸甲殼素和焦磷酸殼聚糖的各自的皂化產(chǎn)物。
可以使用甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧乙基纖 維素、羧乙基-氨基甲酰乙基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、
羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基甲基纖維素、氰乙基纖 維素和氨基甲酰乙基纖維素作為任何上述多糖的醚類(lèi)衍生物，但是 其醚類(lèi)衍生物并不限定于此。優(yōu)選使用羥甲基纖維素或羥乙基纖維 素。
還可以?xún)?yōu)選使用其中的羥基被以任意程度卣化取代的任何上 述多糖。
以下將說(shuō)明上文中所述的纖維素酯衍生物。纖維素(為上述纖 維素酯衍生物的原料)的實(shí)例為天然纖維素(例如棉籽絨和木漿(闊 葉樹(shù)木漿和針葉樹(shù)木漿)、大麻、以及乙酸菌培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的纖維 素)；以及上述纖維素經(jīng)酸水解、機(jī)械破碎、爆破處理或高溫?cái)D出處 理來(lái)調(diào)節(jié)聚合度而得到的那些纖維素?？梢允褂糜扇魏卧侠w維素制 成的任何纖維素酯衍生物，并且在某些情況下，可將這些纖維素酯衍 生物混合后使用。這種纖維素原料的詳細(xì)描述可以在(例如)文獻(xiàn)
"Plastic Materials(17)， Cellulose-Type Resins" (Marusawa禾口 Uda著， 由Nikkan Kogyo Shimbunsha株式會(huì)社在1970年出版)中找到。
如上所述，纖維素的分子量范圍很寬。例如，天然纖維素的分 子量為600,000到1,500,000 (聚合度:約3,500到10,000)，純棉絨 的分子量為80,000至ij 500,000 (聚合度約500到3,000)，木漿的 分子量為80,000至lj 1 ，340,000 (聚合度約500至U 2,100)。在本發(fā) 明中，分子量在很大程度上影響著纖維素或其衍生物的機(jī)械強(qiáng)度，并 且當(dāng)分子量變小時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度會(huì)從一個(gè)特定的聚合度開(kāi)始突然下降， 但是這樣的纖維素仍可用作本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜的材料，而不 會(huì)產(chǎn)生任何問(wèn)題。
作為上述核酸吸附性多孔膜的實(shí)例，可以使用通過(guò)纖維素的酯 化反應(yīng)而制成的纖維素酯衍生物的多孔膜。然而，上述特別優(yōu)選的纖 維素不能以原樣使用，而是以棉絨或木槳通過(guò)純化作用而制成的純棉 絨或純的高級(jí)木漿的形式來(lái)使用。棉絨是棉籽的棉纖維中纖維長(zhǎng)度較 短的短纖維，其含有高含量(例如88重量％到92重量％)的oc-纖維 素，并且其純度很高，幾乎不含雜質(zhì)。天然棉絨經(jīng)過(guò)除塵、堿蒸煮、 漂白、酸處理、脫水和干燥處理后可制成純棉絨。詳細(xì)情況在文獻(xiàn)"Plastic Materials(17), Cellulose-Type Resins"(第25頁(yè)到第28頁(yè)) (Marusawa禾口 Uda著，由Nikkan Kogyo Shimb畫(huà)ha株式會(huì)社在1970 年出版)中有所描述，其中的表2到表3提到了純棉絨的性質(zhì)。更優(yōu) 選的純棉絨是由本發(fā)明制成的。
在上述同一本書(shū)的第28頁(yè)到第32頁(yè)，還提到了純木漿，其中 的表2到表4還提到了純木漿的性質(zhì)，并且由所述方法純化的木漿還 可以?xún)?yōu)選地作為纖維素酯衍生物的原料。在本發(fā)明中，將經(jīng)純化的棉 花絨與木漿混合使用也是優(yōu)選的，雖然對(duì)它們的混合比沒(méi)有特別限 定，但是優(yōu)選為5/95到95/5，更優(yōu)選為10/卯到90/10?；旌系慕Y(jié)果 是溶解性增強(qiáng)，由此可改善纖維素酯衍生物多孔膜的表面性質(zhì)和動(dòng) 力特性。
其中，可以對(duì)作為槳粕純度指標(biāo)的a-纖維素的含量加以選擇， 例如，a-纖維素的含量為80重量％到100重量％，在漿粕為木漿的 情況下，a-纖維素的含量通常為約85%到98%。在本發(fā)明中，還可 以使用(例如)其中a-纖維素的含量為80%到96% (特別是92%到 96%)這樣的低純度漿粕。在這樣的漿粕中，通常使用木漿。
此外，在本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜中，雖然葡萄糖是漿粕或 棉花中的中性的構(gòu)成糖(constituting saccharide)成分中的主要成分， 但是還可含有甘露糖和木糖。雖然對(duì)甘露糖/木糖的比例沒(méi)有特別限 定，但是甘露糖/木糖的摩爾比為0.35/1到3.0/1，優(yōu)選為0.35/1到 2.5/1，更優(yōu)選為0.35/1到2/1。在生產(chǎn)三醋酸纖維素時(shí)，甘露糖和木 糖的總量為0.01摩爾％到5摩爾％，優(yōu)選為0.1摩爾％到4摩爾％。 順便提及，"甘露糖"和"木糖"是漿粕中所含的半纖維素(木聚糖、 葡甘露聚糖等)的主要構(gòu)成糖。原料漿粕的構(gòu)成糖成分和所得的纖維 素酯衍生物(三醋酸纖維素)可以通過(guò)日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 1 1/130,301中所述的方法來(lái)進(jìn)行具體分析。
關(guān)于纖維素多孔膜，可優(yōu)選使用再生纖維素的多孔膜。再生纖 維素的實(shí)例為將醋酸纖維素固體的表面或其全部通過(guò)皂化處理而形 成纖維素的產(chǎn)物；由纖維素的銅氨溶液制成的產(chǎn)物；由纖維素的粘膠 溶液制成的產(chǎn)物；以及由纖維素的堿溶液制成的產(chǎn)物。這些纖維素在
晶態(tài)等方面與天然纖維素不同。纖維素中存在著晶型i、 ii、 ni和iv, 本發(fā)明中可優(yōu)選使用任何晶型，或者所包含的晶型i、 ii、 iii和iv
可分別為任意比例。關(guān)于由醋酸纖維素多孔膜制成的再生纖維素多孔
膜，可以使用由日本專(zhuān)利公報(bào)No. 45/4,633、日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 56/100,604等中所述的材料和方法而制成的那些，但是對(duì)此沒(méi)有限 定。關(guān)于由纖維素的銅氨溶液制成的再生纖維素多孔膜，可以使用由 (例如)日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 58/089,625、 58/089,626、 58/089,627、 58/089,628 、 59/045,333 、 59/045,334 、 59/199,728 、 61/274,707 、 62/001,403、 63/161,927禾H 07/330,945中所述的材料和方法而制成的 那些，但對(duì)此沒(méi)有限定。還可以以相同的方式由粘膠溶液制成再生纖 維素多孔膜，所述的粘膠溶液由纖維素與堿和二硫化碳發(fā)生反應(yīng)而生 成(其中，改變了原料成分和凝聚方法)，其產(chǎn)物可用在本發(fā)明中。 關(guān)于由纖維素的堿溶液制成的再生纖維素多孔膜，也可以使用由(例 如)日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 62/240,328、 62/240,329和01/188,539中 所述的材料和方法制成的再生纖維素多孔膜，但是對(duì)此沒(méi)有限定。
在本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜中，上述纖維素酯衍生物的粘均 聚合度優(yōu)選為200到3，000。上述纖維素酯衍生物的重均分子量與上 述纖維素酯衍生物的數(shù)均分子量之比優(yōu)選為0.8到2。上述纖維素酯 衍生物含有酸解離指數(shù)為1.93到4.5的酸或其鹽是優(yōu)選的。
在上述的纖維素酯衍生物中，乙酸的殘留量或Cm脂肪酸優(yōu)選 為0.5重量％或更少。所述的纖維素酯衍生物優(yōu)選含有l(wèi)ppb到 lO,OOOppm的堿金屬和/或堿土金屬中的至少一種。所述的纖維素酰 化物優(yōu)選含有l(wèi)ppb到l,OOOppm的下列物質(zhì)中的至少一種，所述物質(zhì) 為鋁、鉍、硅和重金屬(例如鉻、鎂、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、砷、 銀、鎘、錫、銻、金、鉑、汞和鉛)。
關(guān)于特別優(yōu)選的纖維素酯衍生物的多孔膜，可舉出含有多種乙 酰值不同的醋酸纖維素的有機(jī)大分子物質(zhì)的多孔膜。關(guān)于具有不同乙 酰值的醋酸纖維素的混合物，可優(yōu)選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維 素的混合物、三醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物、三醋酸纖維素 和二醋酸纖維素的混合物以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合
物。特別優(yōu)選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物。優(yōu)選的是， 由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素構(gòu)成的混合物中二者的混合比(重量 比)為99:1到1:99，更優(yōu)選為卯10到50:50。
關(guān)于上述纖維素酯衍生物，還優(yōu)選使用在日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 10/045,803 、 11/269,304 、 08/231,761 、 08/231,761 、 10/060,170 、 09/040,792 、 11/005,851 、 11/269,304 、 09/090,101 、 57/182,737 、 04/277,530、 11/292,989、 12/131,524、 12/137，115等中所提到的纖維 素酯衍生物。對(duì)與本發(fā)明中的核酸吸附性多孔膜相關(guān)的這些材料沒(méi)有 特別限定。
關(guān)于評(píng)價(jià)纖維素結(jié)構(gòu)的方法，還可以使用X射線(xiàn)分析法。根據(jù) 該方法，有這樣描述纖維素分子排布在與纖維軸向平行的方向上， 其通過(guò)氫鍵相互吸弓l，并形成了由5個(gè)纖維素分子的纖維二糖單元構(gòu) 成的晶胞。根據(jù)X射線(xiàn)方法，天然纖維素的結(jié)晶度為約70%，并且 這樣的纖維素可用于制備本發(fā)明中的纖維素酯衍生物。
關(guān)于其它可以在本發(fā)明中使用的纖維素，人們已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了 各種分析，并且ASTM Standard Part 15、 TAPPI Standard (Technical Association of the Pulp and Paper Industry) 、 JIS P 8101等中詳細(xì)提 到了這些分析方法。待測(cè)項(xiàng)目的實(shí)例為灰分、氧化鈣和氧化鎂的含量、 oc-纖維素值、P-纖維素值和銅值。
在本文中，皂化處理是指使醋酸纖維素與皂化處理液(例如氫 氧化鈉溶液)接觸。結(jié)果，與皂化處理液接觸的醋酸纖維素酯衍生物 的酯基被水解，并且引入羥基，從而形成再生纖維素。由此制備的再 生纖維素與初始纖維素在晶型方面是不同的。為了改變表面皂化率， 通過(guò)改變氫氧化鈉的濃度或氫氧化鈉的處理時(shí)間來(lái)實(shí)施皂化處理。通 過(guò)NMR、 IR或XPS (例如檢測(cè)羰基峰減弱的程度)來(lái)確定表面皂化 率。
具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)材料多孔膜的實(shí)例為日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) No. 2003/128,691中所述的醋酸纖維素的表面皂化產(chǎn)物。醋酸纖維素 的表面皂化產(chǎn)物是這樣的產(chǎn)物其中，對(duì)具有不同乙酰值的醋酸纖維 素的混合物進(jìn)行皂化處理，并且優(yōu)選使用的是三醋酸纖維素和二醋酸
纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物、三醋酸纖維素和二醋酸纖維素和單醋酸 纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物、以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混
合物的皂化產(chǎn)物。優(yōu)選的是，由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素構(gòu)成的 混合物中二者的混合比(重量比)為99:1到1:99。更優(yōu)選的是，由 三醋酸纖維素和二醋酸纖維素構(gòu)成的混合物中二者的混合比為 90:10到50:50。在這種情況下，可以通過(guò)氧化處理的程度(皂化率) 來(lái)控制固相表面上的羥基的量(密度)。為了提高核酸的分離效率， 則羥基的量(密度)越高越好。例如，在醋酸纖維素(例如三醋酸纖 維素)的情況下，皂化率(表面皂化率)優(yōu)選為約5%或更高，更優(yōu) 選為10%或更高。為了使具有羥基的有機(jī)大分子物質(zhì)的表面積更大， 優(yōu)選的是，對(duì)醋酸纖維素多孔膜進(jìn)行皂化處理。在這種情況下，當(dāng)使 用其表面和背面對(duì)稱(chēng)的多孔膜時(shí)，優(yōu)點(diǎn)是在所述膜的表面和背面上
皂化產(chǎn)物可能沒(méi)有差別；而當(dāng)使用其表面和背面不對(duì)稱(chēng)的多孔膜時(shí)， 優(yōu)點(diǎn)是可以減少多孔膜被堵塞的不利情況；由此優(yōu)選使用不對(duì)稱(chēng)的 多孔膜。
向含有有機(jī)材料(不含羥基)的多孔膜引入羥基的方法是把
在聚合物主鏈或側(cè)鏈上具有羥基的接枝聚合物鏈連接到多孔膜上。 用于使接枝聚合物鏈與有機(jī)材料多孔膜連接的方法有(例如)
以下兩種使多孔膜和接枝聚合物鏈化學(xué)連接的方法；以及用多孔膜 作為起始物使具有雙鍵(能發(fā)生聚合反應(yīng))的化合物進(jìn)行聚合，從而 形成接枝聚合物鏈的方法。
首先，在使多孔膜和接枝聚合物鏈化學(xué)連接的方法中，使用在 聚合物的末端或側(cè)鏈上具有能夠與多孔膜發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)這樣的 聚合物，所述聚合物通過(guò)該官能團(tuán)與多孔膜的官能團(tuán)之間的化學(xué)反應(yīng) 而被接枝。對(duì)能與多孔膜發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)沒(méi)有特別限定，只要其能 與多孔膜的官能團(tuán)反應(yīng)即可，并且其實(shí)例包括硅烷偶聯(lián)基(例如烷氧 基硅烷)、異氰酸基、氨基、羥基、羧基、磺酸基、磷酸基、環(huán)氧基、 烯丙基、甲基丙烯酰基和丙烯?；?。
特別有用的在聚合物末端或側(cè)鏈上具有反應(yīng)性官能團(tuán)的化合物 的實(shí)例包括在其末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在其末端具
有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有環(huán)氧基 的聚合物以及在其末端具有異氰酸基的聚合物。對(duì)在此使用的聚合物 沒(méi)有特別限定，只要其具有參與吸附核酸的親水性基團(tuán)即可，其示例 性實(shí)例包括聚羥乙基丙烯酸、聚羥乙基甲基丙烯酸和它們的鹽、聚乙 烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其鹽、聚氧化亞 乙基以及類(lèi)似物。
通過(guò)使用多孔膜作為起始點(diǎn)、使具有可聚合雙鍵的化合物進(jìn)行 聚合而形成接枝聚合物鏈的方法通常被稱(chēng)為表面接枝聚合法。表面接 枝聚合法是指這樣一種方法其中通過(guò)等離子體輻射、光輻射、加熱 或類(lèi)似的方法，在基材表面上形成活性部位，并且使得與多孔膜接觸 設(shè)置的、具有雙鍵的可聚合化合物通過(guò)聚合反應(yīng)而連接到所述的多孔 膜上。
用于形成與基材相連的接枝聚合物鏈的化合物必須具有可聚合 的雙鍵和參與核酸吸附的親水性基團(tuán)這兩種特征。作為這種化合物， 具有親水性基團(tuán)的聚合物、具有親水性基團(tuán)的低聚物和具有親水性基 團(tuán)的單體中的任何 一 種都可以使用，只要在其分子內(nèi)具有雙鍵即可。 特別有用的化合物是具有親水性基團(tuán)的單體。
作為特別有用的具有親水性基團(tuán)的單體的示例性實(shí)例，可以舉 出以下單體。例如，丙烯酸2-羥乙酯、甲基丙烯酸2-羥乙酯、單甲基 丙烯酸甘油酯以及類(lèi)似的含羥基的單體是特別適用的。此外，丙烯酸、 甲基丙烯酸以及類(lèi)似的含羧基的單體、或者它們的堿金屬鹽和胺鹽也 是適用的。
作為另一種用于把親水性基團(tuán)引入到不具有親水性基團(tuán)的有機(jī) 材料多孔膜中的方法，可以用具有親水性基團(tuán)的材料進(jìn)行涂敷。對(duì)用 于涂敷的材料沒(méi)有特別限定，只要其具有參與核酸吸附的親水性基團(tuán) 即可，但是為了使操作簡(jiǎn)單，優(yōu)選為有機(jī)材料聚合物。這類(lèi)聚合物的 實(shí)例包括聚丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯及其鹽、聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其鹽、聚氧化亞乙基、 醋酸纖維素以及具有不同乙酰值的醋酸纖維素的混合物等，但是具有 多糖結(jié)構(gòu)的聚合物是合乎需要的。 可供選用的另一種方式是可將醋酸纖維素或具有不同乙酰值 的醋酸纖維素的混合物涂敷到不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜 上，然后對(duì)經(jīng)涂敷的醋酸纖維素或具有不同乙酰值的醋酸纖維素的混 合物進(jìn)行皂化處理。在這種情況下，皂化率優(yōu)選為約5%或更髙。皂 化率更優(yōu)選為10%或更高。
作為具有親水性基團(tuán)的無(wú)機(jī)材料的多孔膜，可舉例為含有二氧
化硅化合物的多孔膜。作為含有二氧化硅化合物的多孔膜，可舉例為 玻璃濾膜。還可舉出的是日本專(zhuān)利No. 3,058,3442所述的二氧化硅多 孔薄膜。這種二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制備把能夠形成雙分 子層的陽(yáng)離子兩性物質(zhì)的展開(kāi)液鋪在基材上，通過(guò)除去液體膜中的溶 劑，而在基材上制成兩性物質(zhì)的多層雙分子層薄膜，使多層雙分子層 薄膜與含有二氧化硅化合物的溶液接觸，然后取出并移走所述的多層 雙分子層薄膜。
關(guān)于向不具有親水性基團(tuán)的無(wú)機(jī)材料多孔膜中引入親水性基團(tuán)
的方法，存在著如下方法 一種方法是使多孔膜和接枝聚合物鏈化學(xué)
連接；以及另一種方法是使用多孔膜作為起始點(diǎn)，使用分子內(nèi)具有雙 鍵的并含有親水性基團(tuán)的單體進(jìn)行聚合而形成接枝聚合物鏈。
在通過(guò)化學(xué)鍵合作用使多孔膜和接枝聚合物鏈連接起來(lái)時(shí)，可 向無(wú)機(jī)材料中引入能夠與接枝聚合物鏈的末端官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的官 能團(tuán)，并且使接枝聚合物鏈被化學(xué)連接到該官能團(tuán)上。此外，當(dāng)接枝 聚合物鏈?zhǔn)鞘褂枚嗫啄ぷ鳛槠鹗键c(diǎn)、并且使用分子內(nèi)具有雙鍵的并含 有親水性基團(tuán)的單體而聚合形成的時(shí)候，在含有雙鍵的化合物進(jìn)行聚 合時(shí)作為起始點(diǎn)的官能團(tuán)被引入到無(wú)機(jī)材料中。
作為具有親水性基團(tuán)的接枝聚合物以及分子內(nèi)具有雙鍵并含有親 水性基團(tuán)的單體，適合使用的是在上述關(guān)于向不具有親水性基團(tuán)的有 機(jī)材料多孔膜中引入親水性基團(tuán)的方法中所述的具有親水性基團(tuán)的接 枝聚合物以及分子內(nèi)具有雙鍵并含有親水性基團(tuán)的單體。
向不含親水性基團(tuán)的無(wú)機(jī)材料的多孔膜中引入親水性基團(tuán)的另 一種方法是在其上涂敷具有親水性基團(tuán)的材料。涂敷所用的材料不受
限制，只要其具有參與核酸吸附的羥基即可；但為了易于操作，優(yōu)選
為有機(jī)材料的聚合物。該聚合物的實(shí)例包括聚丙烯酸羥乙酯和聚甲基 丙烯酸羥乙酯及其鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚 甲基丙烯酸酯及其鹽、聚氧化亞乙基、醋酸纖維素以及乙酰值各不相 同的醋酸纖維素的混合物。
不含親水性基團(tuán)的無(wú)機(jī)材料的多孔膜的實(shí)例包括由鋁和類(lèi)似 的金屬、玻璃、水泥、陶和類(lèi)似的陶瓷制成的多孔膜，或者由新型陶 瓷、硅和活性炭等經(jīng)逐步加工(stepping)而制成的多孔膜。
對(duì)于不含親水性基團(tuán)的無(wú)機(jī)材料的多孔膜，將醋酸纖維素或乙酰 值互不相同的醋酸纖維素的混合物涂敷于其上，并且可以將經(jīng)涂敷的 醋酸纖維素和乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物皂化。在這種情
況下，表面皂化率優(yōu)選為5%或更高。表面皂化率更優(yōu)選為10%或更 咼°
在上述制備核酸吸附性固體載體的步驟中，根據(jù)用途的不同， 可以加入各種添加劑(例如，增塑劑、抗靜電劑、防劣化劑、防紫外 線(xiàn)劑、表面活性劑、剝離劑、著色劑、增強(qiáng)劑和交聯(lián)劑)。關(guān)于添加 劑的加入時(shí)間，雖然添加劑可以在漿液制備步驟中的任何時(shí)間加入， 但是還可以在漿液制備步驟中的最后制備步驟中增加用于向制劑中 加入添加劑的歩驟。
如果需要，上述核酸吸附性固體載體可以含有增塑劑，并且可 優(yōu)選使用以下增塑劑例如，日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2002/265,636所 述的磷酸酯和羧酸酯；日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)02/006,826所述的多元醇； 日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 05/194,788 、 60/250,053 、 04/227,941 、 06/016,869 、 05/271,471、 07/286,068 、 05/005,047 、 11/080,381、 07/020,317、 08/057,879、 10/152,568、 10/120,824禾Q 11/124,445所述 的(二)季戊四醇酯；日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 11/246,704所述的甘油酉旨； 日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2000/063,560所述的雙甘油酯；日本專(zhuān)利申請(qǐng) 公幵No. 11/092,574所述的檸檬酸酯；日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 11/0卯，946所述的被取代的苯基磷酸酯；和日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 56/100,604所述的增塑劑。在這些專(zhuān)利文獻(xiàn)的描述中，不僅存在著很 多針對(duì)增塑劑的優(yōu)選的說(shuō)明，還存在著很多針對(duì)其使用方法或其特性
的優(yōu)選的說(shuō)明，并且這些說(shuō)明也可優(yōu)選地適用于本發(fā)明中的核酸吸附 性固體載體中。
為了防止多孔膜在處理過(guò)程中帶電，可以向上述核酸吸附性固 體載體中加入抗靜電劑。關(guān)于抗靜電劑，可優(yōu)選使用離子導(dǎo)電物質(zhì)和 導(dǎo)電性細(xì)顆粒。本文中，離子導(dǎo)電物質(zhì)是指這樣一種物質(zhì)，該物質(zhì)表 現(xiàn)出導(dǎo)電性，并且含有用作攜帶電荷的載體的離子；其實(shí)例為離子型 大分子化合物。離子導(dǎo)電物質(zhì)的實(shí)例為日本專(zhuān)利公報(bào)No.49/23，826、 49/23,827和47/28,937中所述的陰離子大分子物質(zhì)；日本專(zhuān)利公報(bào) No. 55/734、日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 50/054,672以及日本專(zhuān)利公報(bào)No. 59/14,735、 57/18,175、 57/18,176禾口 57/56,059中所述的在其主鏈中具 有解離基團(tuán)的紫羅烯型聚合物；以及日本專(zhuān)利公報(bào)No. 53/13,223、 57/15,376、 53/45,231、 55/145,783、 55/65,950、 55/67,746、 57/1 1,342、 57/19,735和58/56,858、日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 61/027,853以及日本 專(zhuān)利公報(bào)No. 62/9,346中所述的在其側(cè)鏈中具有陽(yáng)離子解離基團(tuán)的 陽(yáng)離子側(cè)基型聚合物。在這些物質(zhì)中，優(yōu)選的是這樣一種物質(zhì)其中 導(dǎo)電物質(zhì)是細(xì)顆粒，并且被充分分散并加入到上述的核酸吸附性固體 載體中；關(guān)于優(yōu)選使用的導(dǎo)電物質(zhì)，優(yōu)選為包括以下物質(zhì)含有金屬 氧化物或其復(fù)合氧化物的導(dǎo)電細(xì)顆粒、日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 09/203,810所述的紫羅烯類(lèi)導(dǎo)電聚合物或具有分子間交聯(lián)結(jié)構(gòu)的季 銨類(lèi)陽(yáng)離子導(dǎo)電聚合物顆粒。優(yōu)選的粒徑為5nm到l(^m，而更優(yōu)選 的粒徑則取決于所用的細(xì)顆粒的類(lèi)型。關(guān)于構(gòu)成導(dǎo)電細(xì)顆粒的金屬氧 化物的實(shí)例，優(yōu)選為ZnO、 Ti02、 Sn02、 A1203、 ln203、 Si02、 MgO、 Mo02、 V205等及其復(fù)合氧化物，并且特別優(yōu)選的是ZnO、 Ti02和 Sn02。關(guān)于其中含有雜原子的實(shí)例，有效的是向ZnO中加入Al 和In等，向Ti02中加入Nb禾口 Ta等，或向Sn02中加入Sb、 Nb和 鹵素等。這種雜原子的加入量?jī)?yōu)選為0.01摩爾％到25摩爾％，并且 特別優(yōu)選為0.1摩爾％到15摩爾％。優(yōu)選的是，核酸吸附性固體載體 含有0.01體積％到20體積％的這種具有特定結(jié)構(gòu)的金屬氧化物導(dǎo)電 粉末，其中，所述導(dǎo)電粉末的體積粘度不高于107Qcm，或者，特別 是不高于105Dcm，其原生粒徑為100A到0.2wm，并且其高次結(jié)構(gòu)
的長(zhǎng)軸直徑為30nm到6pm。作為可分散的顆粒聚合物交聯(lián)型陽(yáng)離子 導(dǎo)電聚合物的特征在于因?yàn)轭w粒中的陽(yáng)離子部分能夠保持高濃度和 高密度，所以該交聯(lián)型陽(yáng)離子導(dǎo)電聚合物具有優(yōu)異的導(dǎo)電性，此外， 即使在相對(duì)濕度較低的情況下，也不會(huì)表現(xiàn)出導(dǎo)電性下降，并且，雖 然所述顆粒被充分分散成分散狀態(tài)，但是在成膜情況下，在流動(dòng)之后 的成膜過(guò)程中，顆粒間的粘附力仍然很強(qiáng)，從而使膜具有髙強(qiáng)度和優(yōu) 異的耐化學(xué)性。交聯(lián)型陽(yáng)離子導(dǎo)電聚合物類(lèi)的可分散的顆粒聚合物， 其粒徑通常為約10nm到1,000nm,并且優(yōu)選使用的粒徑為20nm到 300nm。本發(fā)明使用的可分散的顆粒聚合物通過(guò)裸眼觀(guān)察，其外觀(guān)為 透明或稍微渾濁的溶液，但是在電子顯微鏡下則表現(xiàn)為顆粒分散體。 還可以利用有機(jī)電子導(dǎo)電類(lèi)的有機(jī)化合物。其實(shí)例為聚噻吩、聚吡咯、 聚苯胺、聚乙炔和聚磷嗪。它們與聚苯乙烯磺酸和高氯酸等形成復(fù)合 物而被優(yōu)選用作酸供體。
可以向上述核酸吸附性固體載體中加入防劣化劑(例如，抗氧化 劑、過(guò)氧化物降解劑、自由基抑制劑、金屬失活劑、除酸劑和胺)和 防紫外線(xiàn)劑。關(guān)于這種防劣化劑和防紫外線(xiàn)劑，可優(yōu)選使用在日本專(zhuān) 利申請(qǐng)公開(kāi)No. 60/235,852、 03/199,201 、 05/190,707、 05/194,789、 05/271,471 、06/107,854、06/118，233、06/148,430、07/011，056、 07/01 1,055 、 07/011,056 、 08/029,619 、 08/239,509 、 07/011,056 、 2000/204,173 、 05/197,073、 05/194,789、 06/107,854、 60/235,852、 12/193,821 、08/029,619、 06/118,233、 06/148,430、 2002/265,636、 05/197,073等。特別優(yōu)選的防 劣化劑的實(shí)例為二丁基羥基甲苯(BHT)。
防劣化劑的加入量?jī)?yōu)選為所要制備的溶液(漿液)重量的0.01% 到1%，更優(yōu)選為0.01%到0.08%。當(dāng)防劣化劑的加入量少于0.01重量 %時(shí)，則其效果不明顯。當(dāng)防劣化劑的加入量髙于1重量％時(shí)，可能會(huì) 發(fā)生這樣一些情況防劣化劑明顯擴(kuò)散(滲出)到固體載體的表面上。 本發(fā)明優(yōu)選的防劣化劑為在25'C時(shí)為液體并且沸點(diǎn)為20(TC的防劣 化劑，或者是熔點(diǎn)為25'C到25(TC的固體防劣化劑。更優(yōu)選的防劣化 劑為在25'C時(shí)為液體并且沸點(diǎn)為25(TC或更高的防劣化劑，或者是 熔點(diǎn)為25t:到20(TC的固體防劣化劑。當(dāng)防劣化劑為液體時(shí)，其通常通過(guò)真空蒸餾來(lái)進(jìn)行純化，并且真空度越高，純化效果越好。例如，
真空度優(yōu)選為100Pa或更低。此外，特別優(yōu)選的是，使用真空蒸餾裝 置進(jìn)行純化。當(dāng)增塑劑為固體時(shí)，通常通過(guò)重結(jié)晶(使用溶劑溶解、 過(guò)濾、洗滌和干燥)來(lái)進(jìn)行純化。
還可以向上述核酸吸附性固體載體中加入表面活性劑。關(guān)于表面 活性劑，可優(yōu)選使用日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2002/265,636、日本專(zhuān)利公 報(bào)No. 55/031,418、以及文獻(xiàn)"Tables of Surfactants, etc." (2001年)
(Japan Surfactant Industry Association出版)、以及文獻(xiàn)"Applications of Surfactants" (Takao Kariyone著，1980年9月1日由Saiwai Shobo 出版)等中所述的那些，但是對(duì)此沒(méi)有限定。對(duì)本發(fā)明中優(yōu)選的表面 活性劑的類(lèi)型和用量沒(méi)有特別限定，可以使用任何量，只要能得到目 標(biāo)表面活性劑即可。
如果需要，核酸吸附性固體載體可以含有剝離劑，從而使得生產(chǎn) 時(shí)剝離力變小。關(guān)于這種剝離劑，表面活性劑就合乎需要，并且可以 使用磷酸酯類(lèi)、磺酸酯類(lèi)、羧酸酯類(lèi)、非離子型、陽(yáng)離子型等，但是 沒(méi)有特別限定。這些剝離劑在(例如)日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 61/243,837 和2000/099,847中被提及。酸解離系數(shù)pKa為1.93到4.50 [優(yōu)選為2.0 到4.4，更優(yōu)選為2.2到4.3 (例如，2.5到4.0)，特別優(yōu)選為2.6到4.3
(例如，2.6到4.0)]的酸或其鹽是優(yōu)選的剝離劑。所述的酸可以是任 何無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸。酸的pKa可以參見(jiàn)"《。g幽腸簡(jiǎn)(Handbook of Chemistry) ， Fundamental Part II"(第三次修訂版，由日本化學(xué)學(xué)會(huì) 編著，由丸善株式會(huì)社出版)。也可以?xún)?yōu)選使用日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2002/265,636中所述的剝離劑。在這些文獻(xiàn)的描述中，不僅存在著很 多針對(duì)剝離劑的優(yōu)選的說(shuō)明，還存在著很多針對(duì)其使用方法或其特性 的優(yōu)選的說(shuō)明，并且這些說(shuō)明也可優(yōu)選地適用于本發(fā)明中的核酸吸附 性固體載體中。
可以向上述核酸吸附性固體載體中加入著色劑。關(guān)于著色劑， 可以將已知的有機(jī)、無(wú)機(jī)以及有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合著色劑以所需的濃度單 獨(dú)或聯(lián)合使用，或者以所需的濃度與分散劑(例如表面活性劑或保護(hù) 性聚合物)一起使用，但對(duì)此沒(méi)有限定，已知的著色劑可為例如色
料、染料、顏料、氧化著色顏料、還原著色顏料、pH指示劑、熒光 顏料、偶合顏料、紫外線(xiàn)吸收顏料、紅外線(xiàn)吸收顏料、近紅外線(xiàn)吸收 顏料、壓敏顏料、光變色顏料、熱變色顏料、電變色顏料、有機(jī)著色 顏料、食品顏料、有機(jī)非線(xiàn)性光學(xué)顏料、化學(xué)發(fā)光顏料、藥物顏料、 醫(yī)療診斷用顏料、化妝品顏料、半導(dǎo)體激光用顏料、升華轉(zhuǎn)印顏料、 熔融轉(zhuǎn)印顏料、熱敏顏料、隱色顏料、電磁吸附性顏料、光導(dǎo)電性顏 料和可帶電的顏料。
為了增強(qiáng)膜的強(qiáng)度，可向上述核酸吸附性固體載體中加入增強(qiáng) 劑。關(guān)于增強(qiáng)劑，可優(yōu)選使用的實(shí)例為玻璃纖維、碳纖維、硅纖維、 纖維素纖維、漿粕纖維、鈦酸鉀纖維、碳化硅晶須、氮化硅晶須、氧
化鋅晶須、硼酸鋁晶須、堿性硫酸鎂、纖維狀的硬硅鈣石、鈦酸鈣晶 須、碳化硅(SiC)晶須和晶須狀的碳酸鈣，但對(duì)此沒(méi)有限定，只要 其是纖維狀的或者是針狀的晶體，則任何增強(qiáng)劑都可以使用。還可以 加入用于增強(qiáng)抗彎曲性能的合成聚合物，盡管可優(yōu)選使用日本專(zhuān)利申 請(qǐng)公開(kāi)No. 54/01 1,081中所述的聚氨酯，但對(duì)其沒(méi)有限定。
可以向上述的核酸吸附性固體載體中加入交聯(lián)劑。關(guān)于交聯(lián)劑， 可以使用己知的那些，并且優(yōu)選的是，根據(jù)固體載體材料的官能團(tuán)來(lái) 選擇合適的類(lèi)型。當(dāng)所述的官能團(tuán)是羥基時(shí)，可優(yōu)選使用日本專(zhuān)利申 請(qǐng)公開(kāi)No. 07/256,066、 03/058,431等中所述的交聯(lián)劑，但對(duì)其沒(méi)有 限定。
可以向核酸吸附性固體載體中加入濕潤(rùn)劑。關(guān)于濕潤(rùn)劑，可優(yōu) 選使用日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 63/256,066 、日本專(zhuān)利公報(bào)No. 03/068,431等中所述的濕潤(rùn)劑，但對(duì)其沒(méi)有限定。
溶液可從其內(nèi)部通過(guò)、并且其厚度為10 (im到500 pm的核酸 吸附性多孔膜是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是，核酸吸附性多孔膜的厚度為 50nm到250(im。為了容易洗滌，核酸吸附性多孔膜的厚度優(yōu)選為 較薄。
溶液可從其內(nèi)部通過(guò)、并且最小孔徑為0.22 (im或更大的核酸 吸附性多孔膜是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是，核酸吸附性多孔膜的最小孔徑 為0.5 pm或更大。此外，優(yōu)選使用最大孔徑與最小孔徑之比為2或
更大的多孔膜。結(jié)果，可得到足夠的用于吸附核酸的表面積，并且孔 不容易被堵。最大孔徑與最小孔徑之比更優(yōu)選為5或更大。
溶液可從其內(nèi)部通過(guò)、并且孔隙率為50%到95%的核酸吸附性 多孔膜是優(yōu)選的。孔隙率更優(yōu)選為65%到80%。此外，泡點(diǎn)為0.1 kgf/ci^到10 kgf/ct^的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的。泡點(diǎn)更優(yōu)選為 0.2 kgf/cm2至lj 4 kgf/cm2。
溶液可從其內(nèi)部通過(guò)、并且壓力損失為0.1 kPa到100kPa的核 酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的。結(jié)果，核酸吸附性多孔膜在加壓狀態(tài)下， 可獲得均勻的壓力。壓力損失更優(yōu)選為0.5 kPa到50kPa。在本文中， 術(shù)語(yǔ)"壓力損失"是指水每通過(guò)100 pm的膜厚所需的最小壓力。
溶液可從其內(nèi)部通過(guò)、并且水的滲濾量(水在1kg/cn一的壓力、 25'C下通過(guò)時(shí)的滲濾量)為每1分鐘每1 cm"的膜lmL到5000 mL 的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的。水的滲濾量(水在1 kg/crr^的壓力、 25。C下通過(guò)時(shí)的滲濾量)更優(yōu)選為每1分鐘每1 cm4勺膜5 mL至U 1000 mL。
溶液可從其內(nèi)部通過(guò)、并且核酸吸附量為每1 mg的多孔膜O.l 叫或更多的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的。核酸吸附量更優(yōu)選為每1 mg的多孔膜0.9嗎或更多。
溶液可從其內(nèi)部通過(guò)、并且其所含的纖維素衍生物具有下述特 征的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的，所述纖維素衍生物的特征為在將 邊長(zhǎng)為5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙酸中時(shí)，該纖維素衍 生物在l小時(shí)以?xún)?nèi)(不含l小時(shí))不溶解，但是在48小時(shí)以?xún)?nèi)(不 含48小時(shí))溶解。此外，具有下述特征的纖維素衍生物是優(yōu)選的， 所述特征為在將邊長(zhǎng)為5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙酸 中時(shí)，該纖維素衍生物在1小時(shí)以?xún)?nèi)(不含1小時(shí))溶解，但是在將 所述膜浸在5 mL 二氯甲烷中時(shí)，該纖維素衍生物在24小時(shí)以?xún)?nèi)(不 含24小時(shí))不溶解。其中更優(yōu)選的是這樣的纖維素衍生物在將邊 長(zhǎng)為5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙酸中時(shí)，該纖維素衍生 物在l小時(shí)以?xún)?nèi)(不含l小時(shí))溶解，但是在將所述膜浸在5mL二 氯甲烷中時(shí)，該纖維素衍生物在24小時(shí)以?xún)?nèi)(不含24小時(shí))不溶解。200580016159.1
說(shuō)明書(shū)第36/52頁(yè)
在核酸混合物溶液通過(guò)核酸吸附性多孔膜時(shí)，優(yōu)選的是，使核 酸混合物溶液從多孔膜的一側(cè)流到另一側(cè)，從而使溶液與多孔膜均勻 接觸。在核酸混合物溶液通過(guò)核酸吸附性多孔膜時(shí)，為了使孔不容易 被堵，優(yōu)選的是，使核酸混合物溶液以從較大孔徑向較小孔徑的方式 通過(guò)核酸吸附性多孔膜。
當(dāng)核酸混合物溶液通過(guò)核酸吸附性多孔膜時(shí)，流速優(yōu)選為每
單位膜面積(cm2) 2)iL/秒到1500 pL/秒，從而使溶液與多孔膜達(dá)到 合適的接觸時(shí)間。如果溶液與多孔膜的接觸時(shí)間太短，則不能得到充 分的分離和純化的效果；而如果時(shí)間太長(zhǎng)，則從可操作性來(lái)說(shuō)不是優(yōu) 選的。流速優(yōu)選為每單位膜面積(cm2) 5 ^L/秒到700 一L/秒。
此外，溶液可從其內(nèi)部通過(guò)的核酸吸附性多孔膜可以以一層的 方式使用，但也可以以多層的方式使用。核酸吸附性多孔膜的多層可 以彼此相同或互不相同。
優(yōu)選使用這樣的核酸分離柱該核酸分離柱在具有至少兩個(gè)開(kāi) 口的容器內(nèi)容納有核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可通過(guò)該多孔
膜。此外，優(yōu)選使用這樣的核酸分離柱該核酸分離柱在具有至少兩 個(gè)開(kāi)口的容器內(nèi)容納有多層核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可通
過(guò)該多孔膜。在這種情況下，具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器所容納的多層 核酸吸附性多孔膜可相同或不同。 .
多層核酸吸附性多孔膜可以是無(wú)機(jī)材料核酸吸附性多孔膜和有機(jī) 材料核酸吸附性多孔膜的組合。其實(shí)例是玻璃濾膜與再生纖維素多孔 膜的組合。多層核酸吸附性多孔膜還可以是無(wú)機(jī)材料核酸吸附性多孔 膜和有機(jī)材料核酸非吸附性多孔膜的組合。其實(shí)例是玻璃濾膜和尼龍 (或聚砜)多孔膜的組合。
根據(jù)柱的形狀的不同，可以將上述核酸吸附性多孔膜制成除膜 以外的其它形式。例如，可將其制成片狀或塊狀。
核酸分離純化柱除了在具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器內(nèi)容納有核酸 吸附性多孔膜(如上所述，溶液能夠通過(guò)該膜)以外，不應(yīng)該包含其 它組件。可使用的容器材料的實(shí)例包括塑料，例如，聚丙烯、聚苯乙 烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯。此外，優(yōu)選使用可生物降解的材料。此外，
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容器可以是透明的或有顏色的。
可使用這樣一種核酸分離純化柱，該柱具有用于區(qū)分各個(gè)核酸 分離純化柱的裝置。用于區(qū)分各個(gè)核酸分離純化柱的裝置可包括條形 碼、二維條形碼、磁條和IC卡。
還可使用具有這樣一種結(jié)構(gòu)的核酸分離純化柱，所述結(jié)構(gòu)使得 可以很容易地從所述具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器中取出核酸吸附性多 孔膜。
本發(fā)明所使用的試驗(yàn)樣品不受限制，只要試驗(yàn)樣品中含有核酸 即可，例如，其在診斷領(lǐng)域中包括作為試驗(yàn)樣品收集的體液(例如 全血、血漿、血清、尿、排泄物、精液和唾液)，或者植物(或其一 部分)、動(dòng)物(或其一部分)、細(xì)菌、病毒、培養(yǎng)的細(xì)胞以及由生物 材料(例如上述樣品的裂解產(chǎn)物和勻漿)制成的溶液。
使用含有試劑的水溶液處理這些試驗(yàn)樣品，所述試劑能分解細(xì) 胞膜和核膜，并溶解核酸，所以被稱(chēng)為核酸溶解試劑。由此可以使細(xì) 胞膜和核膜分解，并且使核酸分散到水溶液中，從而得到核酸混合物 溶液。
含有核酸的樣品可以是含有單獨(dú) 一 種核酸的樣品，或者可以是 含有多種不同核酸的樣品。待回收的核酸不受種類(lèi)的限制，其可以是
DNA或RNA，可以是單鏈的或雙鏈的，以及直鏈的或環(huán)狀的。樣品 數(shù)可以為一個(gè)或多個(gè)(使用多個(gè)容器平行處理多個(gè)樣品)。對(duì)待回收 的核酸的長(zhǎng)度也沒(méi)有特別的限定，可以使用(例如)從幾bp到幾 Mbp之間的任何長(zhǎng)度的核酸。為了使操作方便，待回收的核酸的長(zhǎng) 度通常為約幾bp到約幾百kbp。本發(fā)明用于分離和純化核酸的方法 能夠使試驗(yàn)人員迅速回收到比使用常規(guī)的用于分離和純化核酸的簡(jiǎn) 單方法得到的核酸相對(duì)更長(zhǎng)的核酸，并且可以用來(lái)回收長(zhǎng)度優(yōu)選為 50kbp或更長(zhǎng)、更優(yōu)選為70kbp或更長(zhǎng)、進(jìn)一步優(yōu)選為100kbp或更 長(zhǎng)的核酸。為了回收較長(zhǎng)的DNA，優(yōu)選進(jìn)行溫和的攪拌和吸液。
通過(guò)裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核 酸的樣品溶液的步驟將在下文描述。在本發(fā)明中，核酸溶解試劑通過(guò) 使細(xì)胞膜和核膜裂解，而用來(lái)使核酸溶解，核酸溶解試劑的實(shí)例包括
含有選自離液鹽、表面活性劑、消泡劑、蛋白酶和核酸穩(wěn)定劑這類(lèi)化 合物的溶液。
作為通過(guò)裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含 有核酸的樣品溶液的方法，以下說(shuō)明一種方法，該方法包括以下步驟
(I) 向容器中加入含細(xì)胞或病毒的樣品；
(II) 向容器中加入含離液鹽或表面活性劑的核酸溶解試劑，并 將樣品與核酸溶解試劑的溶液混合；
(III) 溫育所得到的混合溶液；
(IV) 向經(jīng)溫育的混合溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑。 在通過(guò)裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有
核酸的樣品溶液的步驟中，通過(guò)均質(zhì)處理樣品可提高其對(duì)自動(dòng)化處 理的適應(yīng)性。例如，這種均質(zhì)處理可通過(guò)超聲波處理、使用尖銳突 出物處理、高速攪拌處理、通過(guò)細(xì)孔擠出處理或使用玻璃珠處理來(lái) 實(shí)施。
此外，在通過(guò)裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得 到含有核酸的樣品溶液的歩驟中，通過(guò)使用含有蛋白酶的核酸溶解 試劑，可提高核酸的回收量和回收率，從而可使含有核酸的樣品的 用量減少并使分析加速成為可能。
可優(yōu)選使用至少一種選自絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金 屬蛋白酶等中的蛋白酶作為這種蛋白酶。此外，可優(yōu)選使用多種蛋 白酶的混合物。
沒(méi)有特別限定絲氨酸蛋白酶，例如，可優(yōu)選使用蛋白酶K。沒(méi) 有特別限定半胱氨酸蛋白酶，例如，可優(yōu)選使用木瓜蛋白酶和組織 蛋白酶。
沒(méi)有特別限定金屬蛋白酶，例如，可優(yōu)選使用羧肽酶。 蛋白酶的使用量可以?xún)?yōu)選為在添加后達(dá)到每毫升全部反應(yīng)體
系有0.001IU到IOIU、更優(yōu)選為0.01IU到IIU的蛋白酶。
此外，可優(yōu)選使用不含核酸酶的蛋白酶作為這種蛋白酶。此外， 可優(yōu)選使用含有穩(wěn)定劑的蛋白酶?？蓛?yōu)選使用金屬離子作為穩(wěn)定劑。 具體地說(shuō)，優(yōu)選鎂離子，例如，可以以氯化鎂的形式添加。在蛋白酶中加入穩(wěn)定劑可以使回收核酸所需的蛋白酶的量降至微量，從而 減少核酸回收所需的費(fèi)用。基于反應(yīng)體系的總量，蛋白酶所用穩(wěn)定
劑的量?jī)?yōu)選為1毫摩爾/L到1000毫摩爾/L、更優(yōu)選為10毫摩爾/L 到100毫摩爾/L。
蛋白酶通過(guò)預(yù)先與其它試劑(例如離液鹽和表面活性劑)混合， 可以作為一種試劑使用，而用于回收核酸。
作為可供選擇的另一種方式，蛋白酶可以與其它試劑(例如離 液鹽和表面活性劑)分開(kāi)使用。
在后一情況下，樣品首先與含有蛋白酶的試劑混合，然后把混 合物與含有離液鹽和表面活性劑的試劑混合。或者，在首先把樣品 與含有離液酸(chaotr叩ic acid)和表面活性劑的試劑混合后，再混 入蛋白酶。
此外，可以從容納蛋白酶的容器逐滴直接加入到樣品或樣品與 含有離液鹽和表面活性劑的試劑形成的混合物中，就像滴眼藥水一 樣。在此情況下，可簡(jiǎn)化操作。
核酸溶解試劑還可以?xún)?yōu)選為以千燥態(tài)供給。此外，例如，可以 使用含有預(yù)先通過(guò)冷凍-干燥而得到的干燥態(tài)蛋白酶的容器。還可以 通過(guò)同時(shí)使用以干燥態(tài)供給的核酸溶解試劑和預(yù)先含有干燥蛋白酶 的容器，得到一種含有核酸的樣品溶液。
核酸溶解試劑中離液鹽的濃度優(yōu)選為0.5摩爾/L或更高，更優(yōu) 選為0.5摩爾/L到4摩爾/L，甚至更優(yōu)選為1摩爾/L到3摩爾/L。關(guān) 于離液鹽，己知的離液鹽都可以使用，而沒(méi)有特別限定。例如，可以 使用胍鹽、異硫氰酸鈉、碘化鈉和碘化鉀。特別優(yōu)選為胍鹽。胍鹽的 實(shí)例包括鹽酸胍、異硫氰酸胍和胍的硫氰酸鹽(硫氰酸胍)，并且特 別優(yōu)選的是鹽酸胍或胍的硫氰酸鹽。這些鹽可單獨(dú)使用，或者將其中 的兩種或多種組合使用。
可以使用諸如脲之類(lèi)的離液物質(zhì)來(lái)代替離液鹽。
表面活性劑(例如)包括非離子型表面活性劑、陽(yáng)離子表面活 性劑、陰離子表面活性劑和兩性表面活性劑。
在本發(fā)明中，可優(yōu)選使用非離子型表面活性劑和陽(yáng)離子表面活
性劑。
非離子型表面活性劑包括聚氧亞乙基烷基苯基醚類(lèi)表面活性 劑、聚氧亞乙基烴基醚類(lèi)表面活性劑和脂肪酸烷醇酰胺，并且優(yōu)選為 聚氧亞乙基烴基醚類(lèi)表面活性劑。在聚氧亞乙基(POE)烴基醚類(lèi)表 面活性劑中，更優(yōu)選的是，POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷 基醚、POE亞烷基癸醚、POE脫水山梨糖醇單月桂酸酯、POE脫水 山梨糖醇單油酸酯、POE脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、四油酸聚氧化 亞乙基山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇。
陽(yáng)離子表面活性劑包括溴化十六烷基三甲基銨、氯化十二烷基 三甲基銨、氯化十四烷基三甲基銨和氯化十六垸基吡啶錙。
這些表面活性劑可以單獨(dú)使用，或者將其中的兩種或多種組合 使用。在核酸溶解試劑中，表面活性劑的濃度優(yōu)選為0.1重量％到20 重量o/。。
當(dāng)回收除RNA以外的核酸(例如DNA)時(shí)，優(yōu)選的是，在使 核酸溶解、從而由試驗(yàn)品制成含核酸的樣品溶液的步驟中，向核酸溶 解試劑溶液中加入RNA降解酶。在這種情況下，能夠減少與待回收 核酸共存的RNA的干擾。還優(yōu)選加入DNA降解酶抑制劑。反之， 在回收除DNA之外的核酸(例如RNA)的情況下，優(yōu)選的是向核酸 溶解試劑溶液中加入DN A降解酶。在這種情況下，能夠減少與待回 收核酸共存的DNA的干擾。還優(yōu)選加入RNA降解酶抑制劑。能夠 特異性地抑制RNA降解酶的那些RNA降解酶抑制劑是優(yōu)選的。對(duì) RNA降解酶沒(méi)有特別限定，并且可優(yōu)選使用能夠特異性地降解RNA 的酶(例如核糖核酸酶H) (RNase H)。對(duì)DNA降解酶沒(méi)有特別 限定，并且可優(yōu)選使用能夠特異性地降解DNA的酶(例如DNaseI)。 可以按常規(guī)使用的濃度來(lái)使用核酸降解酶和核酸降解酶抑制劑。還可 以對(duì)它們進(jìn)行常規(guī)的溫?zé)崽幚?。?yōu)選的是將溫?zé)崽幚砼c蛋白降解酶處 理一起進(jìn)行。
作為核酸穩(wěn)定劑，可舉出這樣的試劑其可以發(fā)生反應(yīng)使核酸 酶的活性失活。根據(jù)試驗(yàn)樣品的不同，存在這樣的情況其中含有核 酸酶(能夠使核酸降解)，結(jié)果當(dāng)核酸被均化時(shí)，核酸酶與核酸發(fā)生
反應(yīng)，從而導(dǎo)致回收量顯著降低。為了達(dá)到避免這種情況發(fā)生的目的， 可以使具有使核酸酶失活的功能的穩(wěn)定劑與核酸溶解溶液共存。結(jié) 果，核酸的回收率和回收效率提高，而使得試驗(yàn)樣品的用量最少化并 使操作加速。
作為具有使核酸酶活性失活的功能的核酸穩(wěn)定劑，可使用通常 被用作還原劑的化合物。還原劑的實(shí)例包括氫化化合物，例如，氫 原子、碘化氫、硫化氫、氫化鋁鋰和硼氫化鈉；髙正電性金屬，例如， 堿金屬、鎂、鈣、鋁和鋅，或它們的汞合金；有機(jī)氧化物，例如，醛 類(lèi)、糖類(lèi)、甲酸和草酸；以及巰基化合物。在這些物質(zhì)當(dāng)中，巰基化 合物是優(yōu)選的。巰基化合物的實(shí)例包括N-乙酰半胱氨酸、巰基乙醇 和烷基硫醇或類(lèi)似的化合物。巰基化合物可以單獨(dú)使用，或者將其中 的兩種或多種組合使用。
在核酸溶解試劑中，核酸穩(wěn)定劑的濃度優(yōu)選為0.1重量％到20 重量％，并且更優(yōu)選為0.3重量％到15重量％。在核酸溶解試劑中，
巰基化合物的濃度優(yōu)選為0.1重量％到10重量％，并且更優(yōu)選為0.5 重量％到5重量％。
在細(xì)胞膜和核膜被分解并且使核酸溶解、從而由試驗(yàn)品制成含 核酸的樣品溶液的上述步驟中，優(yōu)選的是，含核酸的樣品溶液中含有 防沫劑(消泡劑)。
作為消泡劑，可舉出如下試劑硅類(lèi)消泡劑(例如，硅油、二 甲基聚硅氧垸、有機(jī)硅乳液、改性聚硅氧烷和有機(jī)硅復(fù)合物等)、醇 類(lèi)消泡劑(例如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇和聚氧化亞烷基
二醇等)、醚類(lèi)消泡劑(例如，庚基溶纖劑和壬基溶纖劑-3-庚基山
梨糖醇等)、脂肪油類(lèi)消泡劑(例如，動(dòng)物油和植物油等)、脂肪酸 類(lèi)消泡劑(例如，硬脂酸、油酸和棕櫚酸等)、金屬皂類(lèi)消泡劑(例 如，硬脂酸鋁和硬脂酸鈣等)、脂肪酸酯類(lèi)消泡劑(例如，天然蠟和 磷酸三丁酯等)、磷酸鹽酯類(lèi)消泡劑(例如，辛基磷酸鈉等)、胺類(lèi) 消泡劑(例如，二戊基胺等)、酰胺類(lèi)消泡劑(例如，硬脂酸酰胺等) 和其它消泡劑(例如，硫酸鐵和礬土等)。這些消泡劑可以單獨(dú)使用 或者將其中的兩種或多種組合使用。特別優(yōu)選的是，將硅類(lèi)消泡劑和
醇類(lèi)消泡劑這兩種化合物組合在一起使用。
在核酸溶解試劑中，消泡劑的濃度優(yōu)選為0.1重量％到10重量%。
核酸穩(wěn)定劑優(yōu)選為以干燥態(tài)供給。此外，還可以使用預(yù)先裝有 干燥態(tài)(例如通過(guò)冷凍干燥)的蛋白酶的容器。也可以通過(guò)同時(shí)使用 上述干燥態(tài)的核酸溶解試劑和預(yù)先裝有干燥態(tài)的蛋白酶的容器，而得 到含核酸的試驗(yàn)樣品。在通過(guò)上述方法獲得含核酸的試驗(yàn)樣品時(shí)，核 酸溶解試劑和蛋白酶具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，并且可以在不改變經(jīng)分 離和純化的核酸的收率的情況下使操作簡(jiǎn)化。
對(duì)混合樣品和核酸溶解試劑溶液的方法沒(méi)有特別限定。
混合時(shí)，優(yōu)選使用攪拌器在30到3000卬m下混合3分鐘，由
此可以提高所分離和純化的核酸的收率。此外，還優(yōu)選用上下翻轉(zhuǎn) (end-over-end)的混合操作方式混合5到30分鐘。此外，還可以 通過(guò)反復(fù)吸液操作10到50次來(lái)實(shí)施混合。在此情況下，通過(guò)簡(jiǎn)單 操作可以提高經(jīng)分離和純化的核酸的收率。
通過(guò)在蛋白酶的最佳溫度下以最佳反應(yīng)時(shí)間來(lái)溫育樣品和核 酸溶解試劑溶液的混合物，可以提高經(jīng)分離和純化的核酸的收率。 溫育溫度通常為20°C到70°C，這優(yōu)選為蛋白酶的最佳溫度，溫育 時(shí)間通常為1分鐘到18小時(shí)，這優(yōu)選為蛋白酶的最佳溫育時(shí)間。對(duì) 溫育方法沒(méi)有特別限定，并且可以用浸入熱浴或放入加熱室的方式 來(lái)實(shí)施。
在上述細(xì)胞膜和核膜被分解并且使核酸溶解、從而由試驗(yàn)品制 成含核酸的樣品溶液的上述步驟中，被加入到經(jīng)溫育的混合溶液中的 水溶性有機(jī)溶劑的實(shí)例為醇類(lèi)、丙酮、乙腈和二甲基甲酰胺。特別優(yōu) 選使用的是醇類(lèi)。任何伯醇、仲醇和叔醇都可以作為醇類(lèi)使用。優(yōu)選 使用的是甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體之類(lèi)的 醇。更優(yōu)選使用的是乙醇。這些水溶性有機(jī)溶劑中的每一種都可以單 獨(dú)使用或者可將其中的多種組合使用。在核酸溶解試劑溶液中，這種 水溶性有機(jī)溶劑的濃度優(yōu)選為1重量％到20重量％。在含核酸的樣 品溶液中，這種水溶性有機(jī)溶劑的最終濃度優(yōu)選為5重量％到90重
量％。
在通過(guò)裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有 核酸的樣品溶液的步驟中，核酸溶解試劑溶液的pH優(yōu)選為5到10，
更優(yōu)選為6到9，進(jìn)一步更優(yōu)選為7到8。
在上述細(xì)胞膜和核膜被分解并且使核酸溶解、從而由試驗(yàn)品制 成含核酸的樣品溶液的上述步驟中，所得到的含核酸的樣品溶液的表 面張力優(yōu)選為0.05J/m2或更低，其粘度優(yōu)選為lmPa至lj 10，000mPa， 而其比重優(yōu)選為0.8到1.2。
下文將對(duì)洗滌步驟進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施洗漆操作的結(jié)果是，可以提 高核酸的回收量和回收純度，并且使含核酸的試驗(yàn)品的需求量較少。 關(guān)于洗滌步驟，為了達(dá)到快速的目的，可進(jìn)行一次洗滌步驟，而如果 純度更重要時(shí)，則優(yōu)選為重復(fù)洗滌多次。
在洗滌步驟中，使用試管、移液管、自動(dòng)注入裝置或具有類(lèi)似 功能的供料裝置，將洗滌液提供給容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分 離純化柱。將洗滌液從核酸分離純化柱的第一個(gè)開(kāi)口 (含有核酸的核 酸混合物溶液已通過(guò)該開(kāi)口注入)供入，并且使用與所述第一個(gè)開(kāi)口 連接的壓力差產(chǎn)生裝置(例如，滴液管、注射器、泵和電動(dòng)移液管等)。 由此使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使洗滌液通過(guò)核酸 吸附性多孔膜，并從不同于所述第一個(gè)開(kāi)口的另一個(gè)開(kāi)口排出洗滌 液。此外，洗滌液可由第一個(gè)開(kāi)口供入并由該第一個(gè)開(kāi)口排出。此外， 洗滌液可由不同于所述第一個(gè)開(kāi)口(含有核酸的核酸混合物溶液已通 過(guò)該開(kāi)口注入)的另一個(gè)開(kāi)口供入，并由該同一開(kāi)口排出。在這些方 式中，非常優(yōu)選的方式如下洗滌液由核酸分離純化柱的第一個(gè)開(kāi)口 供入、通過(guò)核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一個(gè)開(kāi)口的另一個(gè)開(kāi) 口排出，這是因?yàn)樵摲绞骄哂袃?yōu)異的洗滌效率。
在洗滌操作中，洗滌液的量?jī)?yōu)選為2 ^L/mmS或更多。當(dāng)使用大 量的洗滌液時(shí)，可改善洗滌效果，但為了保持可操作性并防止樣品被 排出，其用量?jī)?yōu)選為200liL/mn^或更少。
當(dāng)在洗滌步驟中供入洗滌液、然后使其停留50秒或更長(zhǎng)時(shí)，可 以顯著提高核酸的回收量。當(dāng)洗滌液停留更長(zhǎng)的時(shí)間時(shí)，可預(yù)料到會(huì)
使回收量達(dá)到穩(wěn)定，但是為了加快操作，選擇1,000秒或更短的時(shí)間。 在本發(fā)明中，在自動(dòng)提取裝置供入洗滌液之后開(kāi)始計(jì)時(shí)，因此
允許停留時(shí)間是自動(dòng)控制的。
在洗滌過(guò)程中，在使洗滌液通過(guò)核酸吸附性多孔膜時(shí)，流速優(yōu)
選為每單位膜面積(cm2) 2pL/秒到1500liL/秒，更優(yōu)選為每單 位膜面積(cm2) 5 pL/秒到700 ^L/秒。通常，降低通過(guò)速度以延長(zhǎng) 時(shí)間，從而使洗滌進(jìn)行得更充分。但是，優(yōu)選的是，通過(guò)使用本發(fā)明 的上述范圍，可以使分離和純化RNA的步驟快速地實(shí)施，而不會(huì)降 低洗滌效率。
在洗滌步驟中，洗滌液的溫度優(yōu)選為4 。C到70 °C。此外，更 優(yōu)選的是，洗滌液溫度為室溫。在進(jìn)行洗滌步驟的同時(shí)可對(duì)核酸分離 純化柱通過(guò)超聲波或機(jī)械振動(dòng)進(jìn)行攪動(dòng)。另一方面，可通過(guò)實(shí)施離心 操作來(lái)進(jìn)行洗滌。
通常，在洗滌步驟中，雖然洗滌液中不含諸如核酸降解酶之類(lèi) 的酶，但是其中可以含有降解諸如蛋白質(zhì)之類(lèi)的污染物的酶。在某些 情況下，洗滌液中也可以含有DNA降解酶、RNA降解酶等。使用含 DNA降解酶的洗滌液的結(jié)果是，只能夠選擇性地回收試驗(yàn)品中的 RNA。反之，使用含RNA降解酶的洗滌液的結(jié)果是，只能夠選擇性 地回收試驗(yàn)品中的DNA。
在洗滌步驟中，洗滌液優(yōu)選為這樣的溶液其含有水溶性有機(jī) 溶液和水溶性鹽中的至少 一 種。洗滌液必須具有的能力是能夠洗出核 酸混合物溶液中的雜質(zhì)，該雜質(zhì)是與核酸一起被吸附到核酸吸附性多 孔膜上的。在這一方面，洗滌液必須具有這樣的成分該成分僅使雜 質(zhì)從核酸吸附性多孔膜上解吸附，但不會(huì)使核酸解吸附。為達(dá)到所述 目的，由于核酸極難溶于水溶性有機(jī)溶劑(例如醇類(lèi))，因此水溶性 有機(jī)溶劑適合于保留核酸而使其它物質(zhì)解吸附。此外，加入水溶性鹽 可以增強(qiáng)核酸的吸附效果，因此可以使除去雜質(zhì)和不需要物質(zhì)的操作 的選擇性得以提高。
關(guān)于洗滌液中所含的水溶性有機(jī)溶劑，可以使用甲醇、乙醇、 異丙醇、正丙醇、丁醇、丙酮等，在這些有機(jī)溶劑中，優(yōu)選使用乙醇。
洗滌液中所含的水溶性有機(jī)溶劑的量?jī)?yōu)選為20重量％到100重量％，
更優(yōu)選為40重量％到80重量％。
另一方面，對(duì)于洗滌液中所含的水溶性鹽來(lái)說(shuō)，鹵鹽是優(yōu)選的， 并且在鹵鹽中，氯化物是更優(yōu)選的。水溶性鹽還優(yōu)選為一價(jià)陽(yáng)離子或 二價(jià)陽(yáng)離子的鹽，特別優(yōu)選堿金屬鹽或堿土金屬鹽。在這些金屬鹽中， 鈉鹽和鉀鹽是最優(yōu)選的。當(dāng)洗滌液中含有水溶性鹽時(shí)，其濃度優(yōu)選為 10毫摩爾/L或更高，并且對(duì)濃度上限沒(méi)有特別限定，只要該上限不 影響雜質(zhì)的溶解性即可，其濃度優(yōu)選為l摩爾/L或更低，更優(yōu)選為 0.1摩爾/L或更低。在上述所有情況中，水溶性鹽為氯化鈉并且氯化 鈉濃度為20毫摩爾/L或更高是特別優(yōu)選的。
此外，洗滌液的特征在于其中不含離液物質(zhì)。結(jié)果，可減小洗 滌步驟后離液物質(zhì)混入回收步驟中的可能性。在回收步驟中，當(dāng)離液 物質(zhì)混入其中時(shí)，該物質(zhì)通常會(huì)抑制諸如PCR反應(yīng)之類(lèi)的酶反應(yīng)， 因此，考慮到之后的酶反應(yīng)，理想的情況是洗滌液中不含離液物質(zhì)。 此外，因?yàn)殡x液性物質(zhì)具有腐蝕性和危害性，所以為了操作的安全性， 不需要時(shí)就不使用離液性物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員極為有利。
在本文中，離液物質(zhì)是指上文所述的脲、氯化胍、異硫氰酸胍、
硫氰酸胍、異硫氰酸鈉、碘化鈉和碘化鉀等。
由于洗滌液對(duì)柱或者類(lèi)似的容器具有高度的潤(rùn)濕性，所以在核 酸分離純化過(guò)程中的洗滌歩驟期間，洗滌液常常保留在容器中，結(jié)果 洗滌步驟之后的回收步驟受到洗滌液污染，從而導(dǎo)致核酸純度降低并 使隨后步驟中的反應(yīng)性降低。因此，在本發(fā)明的第一種方法和第二種 方法中，當(dāng)使用柱或類(lèi)似的容器進(jìn)行核酸的吸附和解吸附時(shí)，重要的 是，在吸附或洗滌中使用的溶液、特別是洗滌液不能留在柱內(nèi)，這樣 它就不會(huì)對(duì)下一步驟產(chǎn)生影響。
因此，為了防止洗漆步驟中使用的洗滌液對(duì)隨后步驟中使用的 回收液造成污染，并由此保持柱內(nèi)的洗滌液殘留量為最小，洗滌液的 表面張力小于0.035 J/n^是理想的。當(dāng)表面張力小時(shí)，可改善洗滌液 對(duì)柱的潤(rùn)濕性能并且可控制殘留溶液的體積。
然而，為了提高洗滌效率，可增加水的比例，但在這種情況下，
洗滌液的表面張力增大并且殘留溶液的量增多。當(dāng)洗滌液的表面張力
為0.035 J/iT^或更大時(shí)，可通過(guò)增強(qiáng)柱的斥水性從而控制殘留溶液的
量。通過(guò)增強(qiáng)柱的斥水性，而形成液滴，并且可通過(guò)液滴的向下流動(dòng)
來(lái)控制殘留溶液的量。用于增強(qiáng)斥水性的方法的實(shí)例包括在柱表面 上涂敷防水劑(例如硅)；在柱成形時(shí)，混入防水劑(例如硅)；以 及類(lèi)似的方法，但不限于此。
在使用本發(fā)明中的核酸吸附性多孔膜時(shí)，可以簡(jiǎn)化洗滌步驟。 由此，(1)洗滌液通過(guò)核酸吸附性多孔膜的次數(shù)在這種情況下僅為 一次；(2)能在室溫下實(shí)施洗滌步驟；(3)在洗滌后，在這種情況 下可以直接將回收液注入到提取柱內(nèi)；(4)可以是上述(1) 、 (2) 和(3)中的任何一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)步驟。其原因在于，在常規(guī)方法 中，為了快速地除去洗滌液中所含的有機(jī)溶劑，因此通常需要干燥步 驟，但是由于本發(fā)明中的核酸吸附性多孔膜是薄膜，所以可以省略干 燥步驟。
在常規(guī)的核酸分離和純化的步驟中，存在以下問(wèn)題在洗滌步
驟期間，洗滌液經(jīng)常濺散并附著在其它部位上，從而造成樣品玷污(污 染)。通過(guò)改善廢液容器和核酸分離純化柱的形狀，可以抑制洗滌步 驟中的這類(lèi)污染，其中，在所述柱內(nèi)，核酸吸附性多孔膜被容納在具 有兩個(gè)開(kāi)口的容器中。
下面，將說(shuō)明核酸從核酸吸附性多孔膜上解吸附并回收的步驟。 在回收步驟中，使用自動(dòng)注入裝置或具有類(lèi)似功能的供料裝置將回收 液供給裝有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱。將回收液由核酸分 離純化柱的第一個(gè)開(kāi)口(含有核酸的樣品溶液已通過(guò)該開(kāi)口注入)供 入，并在使用與所述第一個(gè)開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純 化柱的內(nèi)部形成真空的狀態(tài)下，使回收液通過(guò)核酸吸附性多孔膜，并 且可從不同于所述第一個(gè)開(kāi)口的另一個(gè)開(kāi)口排出。也可以將回收液由 所述第一個(gè)開(kāi)口供入并由同一開(kāi)口排出。還可以使回收液由不同于核 酸分離純化柱的所述第一個(gè)開(kāi)口(含有核酸的樣品溶液已通過(guò)該開(kāi)口 注入)的另一個(gè)開(kāi)口供入，并且也從該開(kāi)口排出。然而，以下方法具
有優(yōu)異的回收效率，因而是更優(yōu)選的，所述方法為回收液由核酸分
離純化柱的第一個(gè)開(kāi)口供入、通過(guò)核酸吸附性多孔膜并由不同于所述 第一個(gè)開(kāi)口的另一個(gè)開(kāi)口排出。
當(dāng)在回收步驟中供入回收液、然后使其停留20秒或更長(zhǎng)時(shí)，可
以顯著提高核酸的回收量。當(dāng)回收液停留更長(zhǎng)的時(shí)間時(shí)，可預(yù)料到會(huì)
使回收量達(dá)到穩(wěn)定，但是為了加快操作，選擇300秒或更短的時(shí)間。
在本發(fā)明中，在自動(dòng)提取裝置供入回收液之后開(kāi)始計(jì)時(shí)，因此 可以自動(dòng)控制回收液的允許停留時(shí)間。
調(diào)節(jié)回收液的體積與含核酸的樣品溶液(由試驗(yàn)品制備得到) 的體積之比，由此可實(shí)現(xiàn)核酸的解吸附。含有經(jīng)分離和純化的核酸的 回收液的體積取決于當(dāng)時(shí)所使用的試驗(yàn)品的量。盡管回收液的常規(guī)用 量為幾十微升到幾百微升，但是當(dāng)樣品的量極少，或者反之，當(dāng)大量 核酸待分離和純化時(shí)，回收液的用量可在1微升到幾十毫升之間變 化。
關(guān)于回收液，可優(yōu)選使用經(jīng)純化的蒸餾水、Tris/EDTA緩沖液以 及類(lèi)似的溶液。此外，當(dāng)使回收的核酸進(jìn)行PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 時(shí)，可使用PCR用的緩沖液(例如，含有最終濃度為50毫摩爾/L 的KC1、 10毫摩爾/L的Tris-HCl和1.5毫摩爾/L的MgCl2的水溶液)。
優(yōu)選的是，回收液的pH為pH 2到pH 11，更優(yōu)選為pH 5到pH 9。此外，離子強(qiáng)度和鹽濃度會(huì)對(duì)被吸附核酸的洗脫產(chǎn)生特別影響。 優(yōu)選的是，回收液的離子強(qiáng)度為290毫摩爾/L或更低，鹽濃度為90 毫摩爾/L或更低。其結(jié)果是，核酸的收率提高，并且可回收更多的 核酸。被回收的核酸可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。
當(dāng)參照含核酸的樣品溶液的初始體積來(lái)減小回收液的體積時(shí)， 可以得到含有濃縮核酸的回收液。優(yōu)選的是，可以使(回收液的體 積)(樣品溶液的體積)為1:100到99:100，更優(yōu)選的是，可以使(回 收液的體積):(樣品溶液的體積)為1:10到9:10 。其結(jié)果是，在這種 情況下可以容易地濃縮核酸，而無(wú)需在核酸分離純化之后的步驟中實(shí) 施濃縮操作。根據(jù)這種方法，可提供一種用于制備核酸溶液的方法， 其中，該溶液中的核酸濃度比試驗(yàn)品中的高。
另一種方法是，在回收液的體積大于含核酸的樣品溶液的初始
體積的條件下使核酸解吸附，由此可制備出含有所需濃度的核酸的回 收液，并且可制備出適合于下步操作(例如PCR)的含核酸的回收
液。優(yōu)選的是，可以使(回收液的體積):(樣品溶液的體積)為1:1到 50:1，更優(yōu)選的是，可以使(回收液的體積):(樣品溶液的體積)為1:1 到5:1 。其結(jié)果是得到這樣的優(yōu)點(diǎn)在核酸分離純化之后，不再需 進(jìn)行繁瑣的濃度調(diào)整操作。此外，使用足量的回收液的結(jié)果是，能夠 提高從多孔膜回收的核酸的回收率。
對(duì)回收液注入的次數(shù)沒(méi)有限定，注入次數(shù)可以是一次或多次。 通常，在方便快捷地分離和純化核酸時(shí)，可通過(guò)一次回收操作的方式 來(lái)進(jìn)行，但是在要回收大量核酸時(shí)，可以多次注入回收液。
在回收步驟中，可將核酸的回收液配制成在后續(xù)步驟中可以使 用的組合物。經(jīng)分離和純化的核酸經(jīng)常要通過(guò)PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng))方法進(jìn)行擴(kuò)增。在此情況下，經(jīng)分離和純化的核酸溶液必須使用 適合于PCR方法的緩沖液來(lái)進(jìn)行稀釋。當(dāng)適合于PCR方法的緩沖液 被用于本發(fā)明的回收步驟的回收液中時(shí)，就可以方便快捷地轉(zhuǎn)入隨后 的PCR步驟。
并且，在回收步驟中，可加入用于阻止RNA (被回收在RNA 回收液中)降解的穩(wěn)定劑。作為穩(wěn)定劑，可加入抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、 核酸降解抑制劑以及類(lèi)似的試劑。作為核酸酶抑制劑，可舉例為 EDTA及類(lèi)似的試劑。此外，作為另一種實(shí)施方案，也可以預(yù)先向回 收容器中加入穩(wěn)定劑。
并且，對(duì)回收步驟中所使用的回收容器沒(méi)有特別限定，可使用 由在260nm處沒(méi)有吸收的原料制成的回收容器。在此情況下，無(wú)需 把回收的RNA溶液轉(zhuǎn)移到其它容器就可測(cè)量該溶液的濃度。作為在 260nm處沒(méi)有吸收的原料，可使用(例如)石英玻璃和類(lèi)似的原料， 但該原料不限于此。
可使用容納有核酸吸附性多孔膜(各溶液能按上文所述的方式 通過(guò)該膜)的核酸分離純化柱、并按照以下步驟來(lái)分離和純化核酸。 可列出以下步驟(a)向在具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器內(nèi)容納有核酸吸 附性多孔膜(溶液可以通過(guò)該膜)的核酸分離純化柱的第一個(gè)開(kāi)口注
入含核酸的樣品溶液；(b)使用與核酸分離純化柱的所述第一個(gè)開(kāi)口 連接的壓力差產(chǎn)生裝置，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，使 被注入的含核酸的樣品溶液通過(guò)核酸吸附性多孔膜、并從核酸分離純 化柱的另一個(gè)開(kāi)口排出，由此將核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；(C) 向核酸分離純化柱的所述第一個(gè)開(kāi)口注入洗滌液；(d)使用與核酸分 離純化柱的所述第一個(gè)開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置，使核酸分離純化 柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，使被注入的洗滌液通過(guò)核酸吸附性多孔膜、 并從另一個(gè)開(kāi)口排出，由此在核酸仍吸附在核酸吸附性多孔膜上的狀 態(tài)下，洗滌該膜；(e)向核酸分離純化柱的所述第一個(gè)開(kāi)口注入回收 液；以及(f)使用與核酸分離純化柱的所述第一個(gè)開(kāi)口連接的壓力差 產(chǎn)生裝置，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，使被注入的回收 液通過(guò)核酸吸附性多孔膜、并從另一個(gè)開(kāi)口排出，由此使核酸從核酸 吸附性多孔膜上解吸陽(yáng)，并且將解吸附的核酸排放到核酸分離純化柱 的外部。
在上述步驟(b)、 (d)和(f)中的每一步中，含核酸的樣品溶液、洗 滌液或回收液都是在加壓狀態(tài)下通過(guò)核酸吸附性多孔膜。更優(yōu)選的 是，在上述步驟(b)、 (d)和(f)中的每一步中，含核酸的樣品溶液、洗 滌液和回收液都被注入到在具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器內(nèi)容納有核酸 吸附性多孔膜的核酸分離純化柱的第一個(gè)開(kāi)口中，并且都使用與該柱 的所述第一個(gè)開(kāi)口連接的壓力差產(chǎn)生裝置使該柱的內(nèi)部形成加壓狀 態(tài)，由此每種被注入的溶液都從所述柱流過(guò)并由另一個(gè)開(kāi)口排放。含 核酸的樣品溶液、洗滌液或回收液在加壓狀態(tài)下通過(guò)上述多孔膜的結(jié) 果是，所述裝置能夠以緊湊的方式自動(dòng)操作，因此是優(yōu)選的。實(shí)施加 壓的程度優(yōu)選為約10kpa到200kpa，更優(yōu)選為40kpa到100kpa。
在上述分離和純化核酸的步驟中，從最開(kāi)始注入含核酸的樣品 溶液，直到在核酸分離純化柱的外部得到核酸，該過(guò)程可以在10分 鐘之內(nèi)完成，或者，在合適的環(huán)境下，該過(guò)程可以在2分鐘之內(nèi)完成。 在按照上述步驟分離純化核酸之后，還可以制備出收率為試驗(yàn)品所含 核酸的總量的50重量％或更高的核酸，在合適的環(huán)境下，其收率為 90重量％或更高。
在上述分離和純化核酸的步驟中，可以回收分子量范圍寬達(dá)為
lkpb到200kpb (特別是20kpb到140kpb)的核酸。與使用玻璃濾膜 的離心柱的常規(guī)方法相比，本發(fā)明能夠回收鏈更長(zhǎng)的核酸。
此外，在上述分離和純化核酸的步驟中，可回收得到這樣的核 酸在含有DNA的情況下，可回收得到其純度與紫外光-可見(jiàn)光分光 光度計(jì)的吸光度測(cè)量值(260nm/280nm)為1.6到2.0相對(duì)應(yīng)的核酸； 在含有RNA的情況下，可回收得到其純度與紫外光-可見(jiàn)光分光光度 計(jì)的吸光度測(cè)量值(260nm/280nm)為1.8到2.2相對(duì)應(yīng)的核酸，并 且可以穩(wěn)定地得到幾乎不含雜質(zhì)污染物的高純度核酸。此外，可回收 得到紫外光-可見(jiàn)光分光光度計(jì)的吸光度測(cè)量值(260nm/280nm)為 約1.8的DNA和吸光度測(cè)量值(260nm/280nm)為約2.0的RNA。
實(shí)施例
實(shí)施例1
以下對(duì)通過(guò)采用本發(fā)明的核酸提取方法而進(jìn)行的核酸提取步驟 所收集的核酸的收率進(jìn)行測(cè)量試驗(yàn)。在本試驗(yàn)中，使用上述實(shí)施方案 中所說(shuō)明的核酸提取裝置。
(1) 核酸分離純化容器的制作 關(guān)于用作本實(shí)施例的提取柱的核酸分離純化容器，用高抗沖聚
苯乙烯制成這樣的核酸分離容器其內(nèi)徑為7mm，其中容納有用于 吸附核酸的固相，并具有兩個(gè)開(kāi)口。底端開(kāi)口的直徑為2.5mm。
(2) 核酸分離純化單元
關(guān)于核酸吸附性多孔膜，使用通過(guò)將三醋酸纖維素多孔膜進(jìn)行 皂化處理而制備的多孔膜(膜厚80pm)，并將其裝在上述(1)所 制作的核酸分離柱的核酸吸附性多孔膜的容納部分中。
(3) RNA溶解試劑和洗滌液的制備 按照以下配方來(lái)制備RNA溶解試劑和洗滌液。
(RNA溶解試劑的配方) 鹽酸胍(由Life Technology公司生產(chǎn)) 382g Tris (由Life Technology公司生產(chǎn)) 12.lg
Triton X-100 (由ICN公司生產(chǎn)) 蒸餾水
(洗滌液的配方) 10毫摩爾/L Tris-HCl (pH7.5) 30%的乙醇
(回收液的配方) 1毫摩爾/L Tris-HCl (pH6.5)
(4)核酸的純化操作 制備經(jīng)溫育的人骨髓瘤細(xì)胞(HL60)溶液。收集經(jīng)溫育的溶液， 使其含有1X1()S個(gè)細(xì)胞，將得到的細(xì)胞溶液在300X 5g的條件下離 心沉淀，并除去上清液從而得到細(xì)胞。向上述HL60細(xì)胞(1X1()S個(gè)) 中加入200pL的上述RNA溶解試劑，然后進(jìn)行攪動(dòng)，向其中加入 200pL的乙醇，并對(duì)混合物進(jìn)行攪動(dòng)從而得到含RNA的樣品溶液。 將含RNA的樣品溶液注入到核酸純化單元(在上述(1)和(2)中 制備)的第一個(gè)開(kāi)口中，其中，所述的核酸純化單元具有有機(jī)大分子 物質(zhì)的多孔膜，并且所述的有機(jī)大分子物質(zhì)含有具有不同乙酰值的醋 酸纖維素的混合物；然后將壓力差產(chǎn)生裝置與所述第一個(gè)開(kāi)口連接， 使核酸分離純化單元的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使被注入的含RNA 的樣品溶液通過(guò)上述多孔膜以便與多孔膜接觸，然后從核酸分離純化 單元的另一個(gè)開(kāi)口排放出樣品溶液。之后，將洗滌液注入到上述核酸 分離純化單元的所述第一個(gè)開(kāi)口，將壓力差產(chǎn)生裝置與所述第一個(gè)開(kāi) 口連接，使核酸分離純化單元的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使被注入的 洗滌液通過(guò)上述多孔膜、并從另一個(gè)開(kāi)口排出。接著，將回收液注入 到上述核酸分離純化單元的所述第一個(gè)開(kāi)口，將壓力差產(chǎn)生裝置與核 酸分離純化單元的所述第一個(gè)開(kāi)口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形 成加壓狀態(tài)，從而使被注入的回收液通過(guò)所述多孔膜、并從另一個(gè)開(kāi) 口排出，同時(shí)回收排出的溶液。
10g
1,000mL
(5)經(jīng)分離和純化的RNA的確認(rèn)
測(cè)量回收液在260nm處的吸收光譜，從而確定RNA的收率，并 對(duì)RNA的收率與本實(shí)施例的核酸提取步驟中的洗滌液允許停留時(shí)間 和回收液允許停留時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)。作為本實(shí)施例的結(jié)果，核酸 的收率與注入洗滌液之后使其停留的時(shí)間這兩者之間的關(guān)系顯示在 圖11中。此外，核酸的收率與注入回收液之后使其停留的時(shí)間這兩 者之間的關(guān)系顯示在圖12中。
如圖11和圖12所示，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)注入洗滌液之后使其停 留的時(shí)間和注入回收液之后使其停留的時(shí)間進(jìn)行控制、從而使它們達(dá) 到預(yù)定的時(shí)間時(shí)，RNA的收率顯著提高。更具體地說(shuō)，如圖ll所示， 可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)使被注入的洗滌液停留50秒或更長(zhǎng)時(shí)，可以顯著提高 RNA的收率，并且當(dāng)時(shí)是使洗滌液與RNA —起停留。如圖12所示， 可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)使被注入的回收液停留20秒或更長(zhǎng)時(shí)，可以顯著提高 RNA的收率，并且當(dāng)時(shí)是使回收液與RNA—起停留。
工業(yè)適用性
根據(jù)本發(fā)明，在通過(guò)用核酸吸附性多孔膜吸附含核酸的樣品溶 液中的核酸、然后通過(guò)洗滌等使核酸解吸附的核酸分離純化方法中， 可以以緊湊和廉價(jià)的方式來(lái)制定核酸提取方法并構(gòu)造核酸提取裝置，
用該方法和該裝置來(lái)處理含核酸的樣品溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)高效、簡(jiǎn)
便、快速、優(yōu)異的自動(dòng)化適應(yīng)性和良好的重復(fù)性。
本申請(qǐng)要求的外國(guó)優(yōu)先權(quán)所對(duì)應(yīng)的各外國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的全部公開(kāi) 內(nèi)容都以引用方式并入本文，如同其全部?jī)?nèi)容在此描述一樣。
權(quán)利要求
1. 一種提取核酸的方法，該方法包括通過(guò)使含核酸的樣品溶液與核酸吸附性固體載體接觸，從而將核酸吸附到所述的核酸吸附性固體載體上；在所述核酸吸附在所述的核酸吸附性固體載體上時(shí)，通過(guò)使洗滌液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而對(duì)所述的核酸吸附性固體載體進(jìn)行洗滌；以及通過(guò)將回收液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而使所述核酸從所述的核酸吸附性固體載體上解吸附；其中，在所述洗滌液的分注及允許停留的時(shí)間以及所述回收液的分注及允許停留的時(shí)間這二者中，至少有一個(gè)所述時(shí)間被控制為預(yù)定時(shí)間。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述洗滌液的允許停留時(shí)間控制為50秒到1,000秒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述洗滌液的允許停留時(shí)間控制為100秒到300秒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3中的任意一項(xiàng)所述的方法， 其中將所述回收液的允許停留時(shí)間控制為20秒到300秒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到3中的任意一項(xiàng)所述的方法， 其中將所述回收液的允許停留時(shí)間控制為25秒到60秒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1到5中的任意一項(xiàng)所述的方法， 其中所述的核酸吸附性固體載體是通過(guò)基本不涉及離子鍵的相互作用來(lái)吸附核酸的核酸吸附性固體載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1到6中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中用于制備含核酸的樣品溶液的方法包括將含有選自離液鹽、表面活性劑、消泡劑、蛋白酶和核酸穩(wěn)定劑 中的化合物的預(yù)處理溶液與試驗(yàn)樣品混合，從而得到混合后的溶液；以及向所述的混合溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的核酸穩(wěn)定劑為巰基化合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法， 其中所述的離液鹽為胍鹽。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7到9中的任意一項(xiàng)所述的方法， 其中所述的水溶性有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一種。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1到10中的任意一項(xiàng)所述的方法， 其中所述的核酸吸附性固體載體被容納于核酸提取柱的、具有至少兩個(gè)開(kāi)口的容器的內(nèi)部；以及 其中所述方法包括在將所述的含核酸的樣品溶液分注到所述的核酸提取柱中之后， 通過(guò)壓力差使所述的樣品溶液中的所述核酸吸附到所述的核酸吸附 性固體載體上；在將所述的洗滌液分注到所述的核酸提取柱中之后，通過(guò)壓力差 除去雜質(zhì)；以及在將所述的回收液分注到所述的核酸提取柱中之后，通過(guò)壓力差 使吸附到所述的核酸吸附性固體載體上的所述核酸從該核酸吸附性 固體載體上分離出來(lái)，從而與所述回收液一起回收所述核酸。
12. —種用于實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求11的所述方法的核酸提取裝置， 其中所述的核酸吸附性固體載體為過(guò)濾材料。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的核酸提取裝置， 其中所述的核酸提取裝置通過(guò)加壓自動(dòng)地實(shí)施提取操作；以及 其中所述的提取操作包括在將含核酸的樣品溶液分注到核酸提取柱中之后，使所述的樣品溶液中的所述核酸吸附到所述的過(guò)濾材料上；在將洗滌液分注到所述的核酸提取柱中之后，除去雜質(zhì)；以及在將回收液分注到所述的核酸提取柱中之后，使吸附到所述的過(guò) 濾材料上的所述核酸從該過(guò)濾材料上分離出來(lái)，從而與所述回收液一 起回收所述核酸。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的核酸提取裝置，該裝置包括壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，其通過(guò)加壓嘴將壓縮空氣引入到所述的核酸提取柱中；以及分注機(jī)構(gòu)，該機(jī)構(gòu)包括第一分注嘴，用于將洗滌液分注到所述的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用于將回收液分注到所述的核酸 提取柱中。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12到14中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置， 該裝置包括保持機(jī)構(gòu)，用于保持多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱和多個(gè)經(jīng)排布的回 收容器，所述回收容器用于接收所述的含核酸的回收液；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，用于將壓縮空氣由單個(gè)加壓嘴引入到所述的 多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱中；分注機(jī)構(gòu)，該機(jī)構(gòu)包括第一分注嘴，用于將洗漆液分注到所述 的多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用于將回收液分注 到所述的多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱中；以及移動(dòng)裝置，用于使所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)的所述的單個(gè)加壓嘴 和所述的保持機(jī)構(gòu)這兩者之一相對(duì)于另一者進(jìn)行相對(duì)移動(dòng)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12到15中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置， 其中，所述的多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱被支承在固定側(cè)；以及 其中，所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)的所述的單個(gè)加壓嘴以在所述的多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱的排布方向上可移動(dòng)的方式受到支承。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12到16中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置， 其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴中的至少一者與所述的單個(gè)加壓嘴被設(shè)置成一體化的可移動(dòng)件。
18. 根據(jù)權(quán)利要求12到17中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置， 其中，所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)的所述的單個(gè)加壓嘴被支承在固定側(cè)；以及其中，所述的多個(gè)經(jīng)排布的核酸提取柱以在該多個(gè)經(jīng)排布的核酸 提取柱的排布方向上可移動(dòng)的方式受到支承。
19. 根據(jù)權(quán)利要求12到18中的任意一項(xiàng)所述的核酸提取裝置， 其中，以相同的排布間距來(lái)設(shè)置所述的多個(gè)核酸提取柱；以及 其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴分別與所述的單個(gè)加壓嘴的排布距離均為所述的多個(gè)核酸提取柱的所述的相同的排布 間距的整數(shù)倍。
全文摘要
一種提取核酸的方法，該方法包括通過(guò)將含核酸的樣品溶液與核酸吸附性固體載體接觸，從而使核酸被吸附到所述的核酸吸附性固體載體上；在所述核酸吸附在所述的核酸吸附性固體載體上時(shí)，通過(guò)將洗滌液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而洗滌該核酸吸附性固體載體；通過(guò)將回收液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而使所述核酸從所述的核酸吸附性固體載體上解吸附，其中在所述洗滌液的分注及允許停留的時(shí)間以及所述回收液的分注及允許停留的時(shí)間這二者中，至少有一個(gè)時(shí)間被控制為預(yù)定時(shí)間。
文檔編號(hào)C12M1/00GK101389757SQ200580016159
公開(kāi)日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月18日
發(fā)明者森壽弘 申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社