專利名稱：用于在腫瘤細胞中有效給予和表達治療性基因的腺病毒/α病毒雜交載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于獲得治療性產(chǎn)物的衍生自腺病毒的基因表達載體。
發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)面臨傳統(tǒng)癌癥治療的主要問題之一是缺少腫瘤特異性，這種情況通常會導(dǎo)致嚴重的副作用，并限制了可以應(yīng)用的治療劑量。盡管基因治療具有用于癌癥治療的很好的潛力，但是其也面臨著特定的問題將轉(zhuǎn)基因表達靶向癌癥位點。許多研究暗示，當基于損傷內(nèi)給予病毒載體時，盡管轉(zhuǎn)基因表達基本上被限制在針的路線附近的區(qū)域，但是這類表達也會出現(xiàn)在其它組織中。因此，應(yīng)用于癌癥的基因治療的一個重要的目標是將治療性基因表達定向至腫瘤，其通過特異性的給予瘤組織(“組織目標”)以及/或在瘤組織內(nèi)的特異性激活(“轉(zhuǎn)錄目標”)實現(xiàn)，而不影響健康細胞。可以通過制備載體來實現(xiàn)“組織目標”，該載體通過修飾受體-配體的相互作用而定向，這樣能夠感染表達特異受體的細胞?？梢允褂媚[瘤特異性的啟動子控制轉(zhuǎn)基因表達來達到“轉(zhuǎn)錄目標”。之前的研究已經(jīng)使用不同的特異性啟動子。然而，這具有實質(zhì)上限制，即它們不能夠產(chǎn)生高水平的基因表達，其結(jié)果是限制了抗癌活性。
在Lundstrom K.“Latest development in viral vectors for genetherapy(用于基因治療的病毒載體的最新進展)”；Trends inBiotechnology，2003，21118-122中可以得到開發(fā)用于基因治療的病毒載體方面最新的進展。
目前使用的病毒載體包括α病毒。α病毒是有包膜的病毒，其含有簡單的正RNA鏈作為基因組。已經(jīng)設(shè)計和開發(fā)了來自α病毒Sindbis病毒(SIN)、Semliki Forest病毒(SFV)以及委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎(VEE)病毒的表達載體。這些α病毒載體基于使用衍生自α病毒基因組的自復(fù)制RNA分子，其中保留了復(fù)制必需的5’和3’序列和復(fù)制酶(Rep)基因，而刪除了編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因并被替換成轉(zhuǎn)基因。在將這些載體轉(zhuǎn)染細胞后，Rep得到翻譯，并且RNA載體被拷貝在負RNA鏈中，其將用作擴增RNA載體的模版。Rep也能夠識別負RNA鏈中的亞基因組啟動子，接著從中又合成較小的亞基因組RNA片段，其能夠被翻譯以產(chǎn)生高水平的外源蛋白質(zhì)。當在體外從原核啟動子(如SP6或T7)進行轉(zhuǎn)錄時，α病毒載體可直接用作RNA，或者當復(fù)制子序列位于真核啟動子(例如CMV)下游時，也用作DNA。通過將RNA載體與一種或者多種“協(xié)助”RNA在細胞中進行共轉(zhuǎn)染，可以將RNA載體包裝在病毒顆粒中，其中所述“協(xié)助”RNA編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。α病毒載體具有許多使其適合基因治療的性質(zhì)非常廣泛的向性(tropism)、低免疫原性以及高水平的外源蛋白質(zhì)表達水平。然而，這類表達是瞬時的，因為當發(fā)生復(fù)制時，會誘導(dǎo)細胞的凋亡。文獻Rayner J.O.，Dryga S.A.，Kamrud K.I.“Alphavirus vectors andvaccination(α病毒載體與接種疫苗)”；Rev.Med.Virol.2002；12279-296描述了基于α病毒開發(fā)在疫苗領(lǐng)域應(yīng)用的表達載體。
另一系列的病毒載體基于腺病毒。有大量關(guān)于腺病毒的應(yīng)用的文獻，其已經(jīng)被開發(fā)以克服基因治療的某些不便，并作為制備表達載體的來源。文獻Volpers C，Kochanek S.“Adenoviral vectors for genetransfer and therapy(用于基因轉(zhuǎn)移和治療的腺病毒載體)”；J Gene.Med.2004；6S164-S171報道了腺病毒載體領(lǐng)域的最近進展。腺病毒具有提供高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的優(yōu)點，以及具有保持游離形式(episomal form)的能力。然而，腺病毒蛋白質(zhì)的表達誘導(dǎo)了較強的免疫反應(yīng)，這限制了轉(zhuǎn)基因表達的持續(xù)時間，并在感染了載體的細胞中引發(fā)毒性。已經(jīng)開發(fā)了無腸腺病毒(gutless adenoviruse)以解決這些問題。這些無腸腺病毒已經(jīng)被去除了所有相應(yīng)的腺病毒基因(所保留的序列只有兩個反向末端重復(fù)序列和包裝信號)，因此，被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞不表達腺病毒產(chǎn)物，并且不誘導(dǎo)對載體的免疫反應(yīng)。簡單的說，全部腺病毒基因的去除為容納大表達盒(expression cassette)留出了充分的空間，這是無腸腺病毒也被稱作高容量腺病毒載體的原因。Morsy MA等人公開了描述腺病毒載體具體方面的文獻，其涉及去除所有編碼病毒蛋白質(zhì)的序列，參見“An adenoviral vector deleted for all viral coding sequencesresults in enhanced safety and extended expression of a leptin transgene(去除所有病毒編碼序列的腺病毒載體導(dǎo)致增強的安全性和增強的瘦素蛋白轉(zhuǎn)基因的表達)”；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，957866-7871。Schiedner G等人公開的文獻“Variables affecting in vivoperformance of high-capacity adenovirus vectors(影響高容量腺病毒載體體內(nèi)性能的因素)”；J.Virol.2002，761600-1609描述了在基于無腸腺病毒的表達載體中使用填充片段DNA(stuffer DNA)，其表明這種填充片段DNA的存在對于基因表達的大幅提高是必須的，并且通?；诟呷萘肯俨《?無腸腺病毒)的載體的設(shè)計能夠充分地修飾基因表達的程度和持續(xù)時間。
另一方面，文獻US-5,981,225描述了基于腺病毒用于基因轉(zhuǎn)移的載體，其包括反向末端重復(fù)(ITR)序列、至少一個包裝信號序列以及VAI腺病毒基因和/或VAII腺病毒基因；并包括與腺病毒無關(guān)的基因，該基因被可操作地連接到腺病毒的靶細胞內(nèi)的功能性啟動子。
文獻US-5,985,846描述了一種基因轉(zhuǎn)移載體，其包括腺病毒的反向末端重復(fù)(ITR)序列和含有這些序列的腺病毒的重組顆粒。
文獻US-6,566,093描述了衍生自α病毒的cDNA載體，其由與α病毒的RNA的至少一部分互補的DNA(對于α病毒的復(fù)制是必須的)，以及外源cDNA(例如編碼期望物質(zhì)的cDNA)組成。后者可以是生物活性蛋白質(zhì)或者多肽以及免疫原蛋白(多肽)或者抗原蛋白(多肽)、治療活性蛋白或多肽、或者治療活性RNA。
本發(fā)明的目的是在體外和體內(nèi)改進轉(zhuǎn)基因表達和雜交載體介導(dǎo)的腫瘤細胞的凋亡。另一目的是通過雜交載體改進動物模型內(nèi)腫瘤治療的效率。
另一目的是通過使用雜交載體開發(fā)基因治療的方法，特別是用于治療癌癥。
本發(fā)明的目的是通過將下列性質(zhì)結(jié)合在單一載體中完成的-高感染能力，其通過使用腺病毒釋放系統(tǒng)；-高轉(zhuǎn)基因表達和凋亡的誘導(dǎo)，其通過使用衍生自諸如SFV的α病毒的載體；以及-腫瘤特異性，其通過使用腫瘤特異性啟動子。
發(fā)明描述本發(fā)明首先涉及基因表達腺病毒雜交載體，特征在于沿5’至3’方向，其至少包括下列元件i.腺病毒來源的第一鏈，其包括第一反向末端重復(fù)(ITR)序列和用于包裝腺病毒的信號序列；ii.第一非編碼填充片段序列；iii.對應(yīng)于組織特異性啟動子的序列；iv.衍生自α病毒的cDNA鏈，其序列部分地互補于α病毒RNA，至少包括編碼至少一種目的外源基因的序列；v.多聚腺苷酸化序列；以及vi.第二腺病毒反向末端重復(fù)(ITR)序列。
更具體地，本發(fā)明涉及構(gòu)建腺病毒雜交載體，該腺病毒雜交載體包括在腫瘤特異性啟動子(元件iii.)轉(zhuǎn)錄控制下的作為元件iv的衍生自α病毒的cDNA鏈，其相應(yīng)于SFV重組復(fù)制子的序列，其中所述啟動子是α-甲胎蛋白(AFP)的啟動子。在該構(gòu)建體中，可以將轉(zhuǎn)基因插入SFV復(fù)制子中，其由SFV亞基因組啟動子引導(dǎo)。在以這種雜交載體感染腫瘤細胞后，SFV復(fù)制子的mRNA從腫瘤特異性啟動子得到轉(zhuǎn)錄，從SFV復(fù)制子的所述mRNA翻譯非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)-nsPs-其構(gòu)成了SFV復(fù)制酶基因。這些nsPs蛋白質(zhì)-病毒復(fù)制酶-起始了SFV復(fù)制子的mRNA的復(fù)制，以產(chǎn)生SFV的亞基因組RNA。因此，所述轉(zhuǎn)基因可從SFV的亞基因組RNA高水平表達。這種完整的病毒復(fù)制過程將導(dǎo)致被感染細胞細胞中凋亡的產(chǎn)生。在這些雜交載體感染非腫瘤細胞時，SFV復(fù)制子的mRNA不會從在這些細胞中沒有活性的腫瘤特異性啟動子轉(zhuǎn)錄。因此，在感染雜交載體的正常細胞中將不會有轉(zhuǎn)基因的表達，也不會發(fā)生凋亡。
本發(fā)明還涉及獲得所述腺病毒雜交載體的方法，其包括通過基因工程技術(shù)將上述的腺病毒雜交載體的元件i.至vi.進行組裝。
本發(fā)明還涉及上述雜交載體在將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞中的用途，更具體地，其用于將外源基因?qū)胝婧思毎⑦M行表達，其中所述真核細胞可以是腺病毒的靶細胞。
遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)入優(yōu)選導(dǎo)致在所述細胞中誘導(dǎo)針對外源抗原的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還涉及含有所述腺病毒-α病毒雜交載體的藥物組合物，及其在治療癌癥中的用途，其包括以所述藥物組合物對個體給藥。
本發(fā)明還涉及通過使用前述雜交載體治療癌癥的方法，其包括以所述雜交載體對個體給藥。
本發(fā)明涉及基因表達腺病毒雜交載體，特征在于沿5’至3’方向其至少包括下列元件i.腺病毒來源的第一鏈，其包括第一反向末端重復(fù)(ITR)序列和用于包裝腺病毒的信號序列；ii.第一非編碼填充片段序列；iii.對應(yīng)于組織特異性啟動子的序列；iv.衍生自α病毒的cDNA鏈，其序列部分地互補于α病毒RNA序列，至少包括編碼至少一種目的外源基因的序列；v.多聚腺苷酸化序列；以及vi.第二腺病毒反向末端重復(fù)(ITR)序列。
本發(fā)明的α病毒-腺病毒雜交載體中元件i.的性質(zhì)，即腺病毒來源的包括第一反向末端重復(fù)(ITR)序列和用于包裝腺病毒的信號序列(ψ)的鏈的性質(zhì)并不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面，其可源自任何腺病毒血清型。所述血清型是該技術(shù)領(lǐng)域中熟知的，并包括例如Ad12(A亞屬)、Ad3和Ad7(B亞屬)、d2和Ad5(C亞屬)、Ad8(D亞屬)、Ad4(E亞屬)、Ad40(F亞屬)以及其它已知的可以來自例如豬、羊、牛和鳥類的物種的非人類腺病毒。因此，這種可以含有大約100至500bp長度的第一反向末端重復(fù)序列會根據(jù)所使用的腺病毒血清型而變化。同樣，用于包裝腺病毒的信號序列也會根據(jù)所采用的腺病毒血清型而變化。
根據(jù)優(yōu)選的特定實施方案，所述基因表達腺病毒載體包括的元件i.具有SEQ ID No 1的序列，或者具有與SEQ ID No 1有充分的同源性以發(fā)揮相同功能的任何其它序列。
同樣，在本發(fā)明腺病毒雜交載體中元件ii.的性質(zhì)也不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。所述元件ii.的功能是提高構(gòu)建體的總大小，其可以是任何非編碼的填充片段序列。優(yōu)選所述序列是人非編碼填充片段序列。甚至更加優(yōu)選的是，該非編碼填充片段序列是人基因組次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的內(nèi)含子區(qū)域。
優(yōu)選地，所述的腺病毒雜交載體還包括定位在上述元件v.和元件vi.之間的元件vii.，其是第二非編碼填充片段序列。
在本發(fā)明腺病毒雜交載體中，元件iii.的性質(zhì)不是其關(guān)鍵方面。這種組織特異性啟動子iii.優(yōu)選是腫瘤特異性啟動子。腫瘤特異性啟動子的例子包括啟動子AFP、端粒酶TERT、PAP(胰腺相關(guān)蛋白)、E2F和HIF。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特定實施方案，所述腫瘤特異性啟動子具有與AFP啟動子/增強子(AFP p+e)對應(yīng)的序列SEQ ID No 7，或者與端粒酶TERT對應(yīng)的序列SEQ ID No 15，或者分別與序列SEQ ID No 7或序列SEQ ID No 15有充分的同源性以發(fā)揮相同功能的任何其它序列。
在本發(fā)明腺病毒雜交載體中，元件iv.的性質(zhì)不是其關(guān)鍵方面。元件iv.的α病毒序列優(yōu)選衍生自Semliki Forest病毒(SFV)。然而，其可能使用衍生自任何屬于披膜病毒科(Togaviridae family)的物種(例如SIN、RRV和VEE)的其它α病毒序列。
所述衍生自α病毒的cDNA鏈的序列部分地互補于α病毒RNA，優(yōu)選包括(除了編碼至少一種目的外源基因的序列外)a)α病毒復(fù)制所需的5’序列；b)編碼α病毒RNA的復(fù)制所需的非結(jié)構(gòu)蛋白的序列；c)α病毒的至少一種亞基因組啟動子；以及d)α病毒復(fù)制所需的3’序列。
優(yōu)選地，元件iv.形成了功能上受啟動子iii.控制的復(fù)制子，并且接著包括在iv.c)中的α病毒亞基因組啟動子在功能上控制目的外源基因的表達。
根據(jù)優(yōu)選的特定實施方案，元件iv.的序列a)至c)作為整體具有這樣的序列，該序列選自SEQ ID No 3(SFV 5’-rep-Psg)或者任何其它與SEQ ID No3有充分的同源性以發(fā)揮相同功能的序列，以及SEQID No 4(SFV 5’-rep-Psg-enh)或者任何其它與SEQ ID No 4有充分的同源性以發(fā)揮相同功能的序列。
根據(jù)特別優(yōu)選的特定實施方案，元件iv.d)具有序列SEQ ID No5，或者任何其它與SEQ ID No 5有充分的同源性以發(fā)揮相同功能的序列。
在本發(fā)明α病毒-腺病毒雜交載體的元件iv.中，目的外源基因優(yōu)選是治療性基因或者報告基因，或者是它們的組合。不被認為是限制性的，所述治療性基因優(yōu)選選自哺乳動物白介素IL-12、集落刺激因子GMCSF、α-干擾素以及單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)。
在元件iv.中的目的外源基因還可以是報告基因。不被認為是限制性的，所述報告基因可選自LacZ、熒光素酶、tk和GFP。
治療性基因特別優(yōu)選是哺乳動物白介素IL-12，甚至更優(yōu)選的是治療性基因是人白介素，hIL-12。
所述基因表達腺病毒雜交載體可在元件iv中系列地包括一個或者多個(亞基因組啟動子+目的外源基因)亞組合(subset)。
在本發(fā)明的腺病毒雜交載體中的元件v.的性質(zhì)不是其關(guān)鍵方面。優(yōu)選元件v.是SV40的多聚腺苷酸化序列。所述SV40的多聚腺苷酸化序列特別優(yōu)選為序列SEQ ID No 6，或者任何其它與序列SEQ IDNo 6有充分的同源性以發(fā)揮相同功能的序列。
在本發(fā)明的腺病毒雜交載體中的元件vi.的性質(zhì)不是其關(guān)鍵方面。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，所述基因表達腺病毒載體包括反向末端重復(fù)(ITR)序列作為元件vi.，其具有序列SEQ ID No 2或者任何其它與SEQID No 2有充分的同源性以能夠發(fā)揮相同功能的序列。
在本發(fā)明的腺病毒雜交載體中的元件vii.的性質(zhì)不是其關(guān)鍵方面。所述第二非編碼填充片段序列可以是任何這樣的序列。優(yōu)選是人非編碼序列，特別優(yōu)選的是來自人粘粒C346的序列。
在本發(fā)明的腺病毒雜交載體可具有不同的長度，并優(yōu)選具有在27kb至38kb之間的長度。
根據(jù)優(yōu)選的特定實施方案，所述腺病毒雜交載體包括作為第一反向末端重復(fù)序列的ITR 5’；作為第一填充片段序列的人基因組次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HPRT的內(nèi)含子區(qū)域；腫瘤特異性啟動子AFP(p+e)；含有來自小鼠的白介素-12即mIL-12的SFV復(fù)制子序列；SV40的多聚腺苷酸化序列SV40 PolyA；作為第二填充片段序列的人基因組粘粒C346即C346；以及作為第二反向末端重復(fù)序列的ITR 3’。
根據(jù)其它優(yōu)選的特定實施方案，所述腺病毒雜交載體包括作為第一反向末端重復(fù)序列的ITR 5’；作為第一填充片段序列的人基因組次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HPRT的內(nèi)含子區(qū)域；腫瘤特異性啟動子AFP(p+e)；含有LacZ的SFV復(fù)制子序列；SV40的多聚腺苷酸化序列SV40 PolyA；作為第二填充片段序列的人基因組粘粒C346即C346；以及作為第二反向末端重復(fù)序列的ITR 3’。
根據(jù)特別優(yōu)選的其它實施方案，所述腺病毒雜交載體包括作為第一反向末端重復(fù)序列的ITR 5’；作為第一填充片段序列的人基因組次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HPRT的內(nèi)含子區(qū)域；腫瘤特異性啟動子AFP(p+e)；含有人白介素-12hIL-12的SFV復(fù)制子序列；SV40的多聚腺苷酸化序列SV40 PolyA；作為第二填充片段序列的人基因組粘粒C346即C346；以及作為第二反向末端重復(fù)序列的ITR 3’。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特定實施方案，所述基因表達腺病毒雜交載體具有序列SEQ ID No 8，或者任何其它與SEQ ID No 8有充分的同源性以發(fā)揮相同功能的序列。
根據(jù)本發(fā)明其它優(yōu)選的特定實施方案，所述基因表達腺病毒雜交載體具有序列SEQ ID No 9，或者任何其它與SEQ ID No 9有充分的同源性以發(fā)揮相同功能的序列。
根據(jù)本發(fā)明其它優(yōu)選的特定實施方案，所述基因表達腺病毒雜交載體具有序列SEQ ID No 10，或者任何其它與SEQ ID No 10有充分的同源性以發(fā)揮相同功能的序列。
本發(fā)明還涉及獲得所述腺病毒雜交載體的方法，其包括通過基因工程技術(shù)將上述的腺病毒雜交載體的元件i.至vi.或者元件i.至vii.進行組裝。
本發(fā)明還涉及所述雜交載體在將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞中的用途，更具體的是在將外源基因?qū)胝婧思毎⑦M行表達中的用途，其中所述真核細胞可為腺病毒的靶細胞。所述用途包括將向個體給予所述雜交載體。
以本發(fā)明的腺病毒雜交載體感染腫瘤細胞導(dǎo)致SFVα病毒復(fù)制子的mRNA從腫瘤特異性啟動子轉(zhuǎn)錄，因此Rep基因會被翻譯，SFV的RNA會被擴增。Rep還會產(chǎn)生SFV的亞基因組RNA，治療性基因或者報告基因?qū)钠湟愿咚奖磉_。由被感染細胞分泌的治療性基因產(chǎn)物將會在感染位點激活免疫細胞。SFV的復(fù)制將會進一步誘導(dǎo)所感染細胞的凋亡，這導(dǎo)致從凋亡細胞釋放腫瘤抗原，腫瘤抗原能夠被抗原遞呈細胞(APC)捕獲，進而激活針對腫瘤的免疫應(yīng)答。然而，如果這種雜交載體感染非腫瘤細胞，SFV復(fù)制子的mRNA將不會被轉(zhuǎn)錄，因此不會出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達或者凋亡。
優(yōu)選地，使用本發(fā)明的腺病毒雜交載體感染腫瘤細胞，這樣SFV復(fù)制子的mRNA從腫瘤特異性啟動子AFP轉(zhuǎn)錄，因此Rep基因會被翻譯，SFV的RNA會被擴增。Rep也將產(chǎn)生SFV的亞基因組RNA，mIL-12或者hIL-12將從其以高水平進行表達。由被感染細胞分泌的mIL-12或者hIL-12將會在感染位點激活免疫細胞。SFV的復(fù)制將會進一步誘導(dǎo)所感染細胞的凋亡，這導(dǎo)致從凋亡細胞釋放腫瘤抗原，腫瘤抗原能夠被抗原遞呈細胞(APC)捕獲，進而激活針對腫瘤的免疫應(yīng)答。然而，如果這種雜交載體感染非腫瘤細胞，SFV復(fù)制子的mRNA將不會被轉(zhuǎn)錄，因此不會出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達或者凋亡。
本發(fā)明的另一目的是前述腺病毒雜交載體在將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞、優(yōu)選腫瘤細胞的方法中的用途，其包括將所述雜交載體給予個體。更優(yōu)選地，所述細胞是表達AFP的腫瘤細胞。
本發(fā)明另一目的是所述腺病毒雜交載體在制備治療腫瘤的有效藥物中的用途，以及在誘導(dǎo)針對外源抗原的免疫應(yīng)答中的用途。所述用途包括將所述藥物給予個體。
本發(fā)明的另一目的是藥物組合物，其至少包括根據(jù)本發(fā)明所述的腺病毒雜交載體，及其在治療腫瘤的方法中的用途，或者在誘導(dǎo)針對外源抗原的免疫應(yīng)答中的用途。
優(yōu)選所述藥物組合物包括本發(fā)明的腺病毒雜交載體，其中所述目的外源基因是哺乳動物白介素，IL-12，優(yōu)選人白介素hIL-12。所述用途包括將包含所述雜交載體的藥物組合物給予個體。
本發(fā)明還涉及通過使用本發(fā)明的雜交載體治療癌癥的方法，所述方法包括將所述雜交載體給予個體。
因此，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，AFP(p+e)被選作腫瘤特異性啟動子，構(gòu)建了兩種腺病毒雜交載體，分別為Ad/AFP-SFV-LacZ和Ad/AFP-SFV-mIL-12，其中SFV復(fù)制子被AFP啟動子所控制，插入的報告基因LacZ以及治療性基因IL-12處于SFV亞基因組啟動子的控制下；并制備了兩個無腸腺病毒載體Ad/AFP-LacZ和Ad/AFP-mIL-12作為對照載體，它們攜帶直接被AFP啟動子控制的LacZ和來自小鼠的IL-12。已顯示本發(fā)明的雜交載體比目前所使用的對照載體更有效的發(fā)揮作用。
根據(jù)本發(fā)明，已顯示載體Ad/AFP-SFV-mIL-12可為用于治療表達AFP的HCC(肝癌)腫瘤的載體。
也已經(jīng)顯示，將在大多數(shù)惡性腫瘤中被廣泛激活的其它腫瘤啟動子(例如端粒酶啟動子，TERT)用于控制SFV能夠?qū)㈦s交載體的應(yīng)用(例如本發(fā)明的應(yīng)用)轉(zhuǎn)化為治療所有類型癌癥的通用策略。
進一步以及有利的是，本發(fā)明的雜交載體特異性地與腫瘤細胞發(fā)揮作用，并破壞腫瘤細胞，而不需要加入治療性基因。另外，顯示本發(fā)明的雜交載體在其含有治療性基因如IL-12時，將有利地誘導(dǎo)有效的抗腫瘤活性。


圖1(A)表示本發(fā)明實施方案的雜交載體Ad-SFV的圖解，含有無腸腺病毒序列，其中插入的SFV復(fù)制子處于AFP啟動子/增強子(AFP p+e)的控制下，并含有外源mIL-12基因，其置于SFV亞基因組啟動子(Pr sg)的控制下。圖1(B)表示本發(fā)明雜交載體的抗腫瘤活性在以該雜交載體感染HCC腫瘤細胞后(右)，由于在雜交載體中存在含有mIL-12的SFV復(fù)制子，所以出現(xiàn)了mIL-12的高水平表達，這將在感染位點激活免疫細胞。SFV的復(fù)制還將誘導(dǎo)被感染細胞的凋亡。然而，如果該雜交載體感染非腫瘤細胞，SFV復(fù)制子的mRNA將不會被轉(zhuǎn)錄，由此將不會有轉(zhuǎn)基因表達或者凋亡。在該圖中-ITR，腺病毒反向末端重復(fù)序列；-ψ，腺病毒包裝信號；-HPRT和C346，分別為來自人基因組次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)含子區(qū)域的序列或者來自人粘粒C346的序列；-PolyA，多聚腺苷酸化信號(例如SV40的)；-APC，抗原遞呈細胞。
圖2表示無腸腺病毒雜交載體和無腸腺病毒載體的結(jié)構(gòu)。AFP-SFV-LacZ和AFP-SFV-mIL-12是雜交腺病毒載體，其中SFV復(fù)制子處于AFP啟動子/增強子(AFP p+e)的控制下，克隆的外源基因LacZ或mIL-12分別處于SFV亞基因組啟動子(Pr sg)的控制下。AFP-lacZ和AFP-mIL-12是腺病毒載體，其含有直接受AFP(p+e)控制的LacZ或者mIL-12。SFV nsp l-4，SFV的非結(jié)構(gòu)蛋白。
圖3表示在體外以Ad-SFV雜交載體AFP-mIL-12(AFP-12)、AFP-SFV-mIL-12(AFP-SFV-12)或者以對照載體AdCMVmIL-12(CMV-12)感染后，mIL-12在表達AFP的肝癌細胞HCC(A)以及非衍生自HCC的細胞(B)中的特異性表達。檢測了不同的感染復(fù)數(shù)“moi”(10，100和1000)。Hep3B、Huh-7、HepG2和PLC/PRF/5HCC細胞系；Hela、A549、MHC1、SK-Hep-1和Clon 9非衍生自HCC的細胞系。圖3B只顯示對應(yīng)于1000moi的表達。
圖4表示在體外以雜交載體AFP-SFV-lacZ或者以對照載體AFP-LacZ以不同“moi”(10，100或1000)感染后，β-gal在4種細胞系(Hep3B，Huh-7，HepG2和PLC/PRF/5)中的特異性表達。
圖5表示對以AFP-LacZ和AFP-SFV-LacZ感染的HCC細胞系中β-gal表達的分析。以AFP-LacZ(A-C)或AFP-SFV-LacZ(D-F)感染并用X-Gal進行染色的細胞顯微圖片。A和D，Hep3B；B和E，Huh7；C和F，HepG2。
圖6表示在體外以1000“moi”腺病毒載體AFP-mIL-12(AFP-12)或者AFP-SFV-mIL-12(AFP-SFV-12)感染的HCC細胞系Hep3B(A)和Huh-7(B)中IL-12的表達動力學(xué)。
圖7表示在體外以載體AFP-IL-12(AFP-12)、AFP-SFV-IL-12(AFP-SFV-12)、AFP-LacZ、AFP-SFV-LacZ或?qū)φ蛰d體Ad/CMVmIL-12(CMV-12)感染HCC細胞系Hep3B(A)和McA-RH7777后所誘導(dǎo)的細胞死亡。細胞存活率顯示為在被感染的孔中活細胞與未感染的對照孔中活細胞相比的百分比。
圖8表示在以1000“moi”的載體AFP-mIL-12(A和B)或AFP-SFV-mIL-12(C-F)感染后，SFV Rep在HCC細胞Hep3B(A-D)和Huh-7(E和F)中的表達。感染兩天后，將細胞進行固定，并使用Rep的特異抗體通過免疫熒光進行分析。在帶有FITC濾光片的熒光顯微鏡下對表達Rep的細胞進行觀察(A，C，和E)，而以帶有UV濾光片的熒光顯微鏡對所有細胞中以DAPI染色的細胞核進行觀察(B，D和F)。
圖9表示使用無腸雜交載體在體內(nèi)在Huh-7腫瘤中進行的基因轉(zhuǎn)移(A-D)，基因轉(zhuǎn)移的效率以及凋亡的誘導(dǎo)。通過以1×1010病毒顆粒/動物向瘤體內(nèi)注射載體AFP-LacZ(n＝4)或AFP-SFV-LacZ(n＝4)對在免疫缺陷裸鼠中建立的人Huh-7腫瘤進行處理。在給予所述病毒三天后，處死小鼠，并通過使用X-Gal染色對腫瘤切片進行分析以研究轉(zhuǎn)基因表達(A-B)，或者通過使用TUNEL研究凋亡的誘導(dǎo)(C-D)。A，C接受AFP-LacZ的腫瘤的顯微照片。B，D接受AFP-SFV-LacZ的腫瘤的顯微照片。(E-G)，無腸雜交載體基因表達的特異性。將健康Balb/c小鼠靜脈注射1×1010載體AFP-LacZ(E)、AFP-SFV-LacZ(F)或Ad/CMV-LacZ(G)的病毒顆粒。顯示了接種后三天并用X-Gal進行染色后，所拍攝的肝組織切片的顯微照片。
圖10表示以雜交載體處理HCC腫瘤。通過將McH-RH7777細胞植入大鼠肝臟內(nèi)，建立原位HCC腫瘤。當所述腫瘤達到直徑為7至10mm的尺寸時，使用1011(A-C)或者2×1011(D-G)AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12病毒顆?；蛘咦鳛閷φ盏柠}水溶液對動物進行處理。在給予鹽水溶液(A和E)、AFP-mIL-12(B和F)或AFP-SFV-mIL-12(C和G)15天和30天后檢測到的腫瘤尺寸。G；動物存活率。
圖11表示在接種表達IL-12的載體的大鼠中的毒性研究。測定大鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶(GPT，GOLT和GGTL)(A)或IL-12(B)的水平，其中所述大鼠在肝臟攜帶HCC腫瘤并且已在瘤體內(nèi)接種了腺病毒載體AFP-SFV-IL-12、AFP-SFV-mIL-12、α病毒載體SFV-IL-12或者鹽水溶液。
圖12表示使用蘇木精/曙紅對以腺病毒雜交載體處理的大鼠的肝臟切片進行的染色。通過瘤體內(nèi)注射鹽水溶液(A)、腺病毒載體AFP-IL-12(B)、AFP-SFV-IL-12(C)或者SFV-IL-12病毒顆粒(D)對攜帶HCC腫瘤的大鼠進行處理。在處理后三天，將動物處死，并取出肝臟，使用甲醛進行固定，獲取切片并以蘇木精/曙紅染色。黑色箭頭表示具有嗜曙紅肝細胞的區(qū)域。
圖13A和13B分別表示質(zhì)粒pGL3/AFP和pBS/mIL-12的限制性圖譜。
圖14A和14B分別表示質(zhì)粒pTGC3001和pTGC3011的限制性圖譜。
圖15A和15B分別表示質(zhì)粒pTGC3012和pTGC3013的限制性圖譜。
圖16表示質(zhì)粒pTGC3014的限制性圖譜。
發(fā)明實施方式質(zhì)粒pGEM-T“簡易”(pGEM-T″easy″)和pCMVb是從美國Promega獲得，pBS-SK+來自美國Stratagene。pSTK120是由Kochanek博士友好贈予(University of Ulm，Germany)。在Berglund P.等人在“Enhancingimmune responses using suicidal DNA vaccines(使用自殺性DNA疫苗增強免疫反應(yīng))”Nature Biotechnology 1998，16562-565中已經(jīng)描述了pBK-SFV-1和pBK-SFV-3。在我們實驗室中制備了pGL3/AFP和pBS/mIL-12(Yonglian Sun，Cheng Qian，Dacheng Peng and Jesús Prieto.2000.Gene transfer to liver cancer cells of B7-1 in addition to IL-12changes immunoeffector mechanisms and suppresses Th1 cytokineproduction induced by IL-12alone(除了IL-12外B7-1基因轉(zhuǎn)入肝癌細胞改變免疫效應(yīng)子機制并抑制由IL-12單獨誘導(dǎo)的Th1細胞因子產(chǎn)生)Human Gene Therapy 11127-138)。
對于構(gòu)建pGL3/AFP，通過PCR擴增人基因組DNA得到了AFP啟動子/增強子(p+e)區(qū)域。用于擴增AFP啟動子(AFP pro)的引物是CTCTAGATTTTCTGCCCCAAAGAGCTC和CGGGATCCTGTTATTGGCAGTGGTGGAA。用于擴增AFP增強子的引物是CGGAATTCGCCTGTCATACAGCTAATAA和CTCTAGACTGTCAAATAAGTGG CCTGG。將啟動子(217個堿基對)和增強子(785個堿基對)的序列克隆到pGEM-T質(zhì)粒內(nèi)。接著，通過測序?qū)λ鶖U增的片段進行確認。通過使用Xba I/BamHI進行限制性酶切將AFP啟動子從pGEM-T/AFP-p質(zhì)粒切出，并通過平末端連接插入以Sma I消化的pGL3-基礎(chǔ)(pGL3-basic)質(zhì)粒中。以這種方式得到了pGL3/AFP-p質(zhì)粒。通過使用Xba I/Eco RI進行限制性酶切將AFP增強子從pGEM-T/AFP-e質(zhì)粒切出，并通過平端連接插入以Nhe I消化的pGL3/AFP-p質(zhì)粒，最終得到了pGL3/AFP質(zhì)粒。
細胞系和組織培養(yǎng)從ATCC獲得了人HCC細胞系Hep3B、PLC/PRF/5、HepG2和SK-Hep-1、人宮頸上皮腺癌細胞系HeLa、人肺癌細胞系A(chǔ)549、人胚腎細胞系293、大鼠HCC細胞McA-RH7777、MHC1和正常大鼠肝細胞的Clone 9以及大鼠HCC細胞系Hepa1-6。表達Cre重組酶的293細胞(293Cre4)是從Merck Research Laboratories獲得。將Hep3B、PLC/PRF/5、HeLa、SK-Hep-1、Clone 9、Huh-7和Hepa1-6細胞在DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中該DMEM培養(yǎng)基補充了10％的經(jīng)過熱失活的胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素。將HepG2和A549細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中該RPMI 1640培養(yǎng)基補充了10％的經(jīng)過熱失活的FBS和青霉素/鏈霉素。將McH-RH7777和MHC1細胞在補充了20％馬血清和5％FBS的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。將293Cre4細胞在補充了10％FBS和0.4mg/ml G418的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
動物從Charles Rivers Laboratories(Barcelona，Spain)獲得七周齡的雌性免疫缺陷裸鼠BALB/c。從CIFA(Animal Installations of theUniversity of Navarra)獲得了年齡為4～6周的雄性Buffalo大鼠。在CIFA中小鼠與大鼠在通常條件下進行飼養(yǎng)。裸鼠接受經(jīng)過輻射的食物以及經(jīng)過高壓滅菌的飲用水。對裸鼠的處理一直在層流室中進行。對動物的所有程序均遵守照料和使用實驗動物的標準建議和規(guī)程進行。
構(gòu)建載體構(gòu)建表達盒AFP-SFV使用pBK-SFV-1質(zhì)粒(含有SFV復(fù)制子的全序列)作為模板通過PCR擴增了SFV的5′末端序列(1-292nt)。引物1在其5’末端含有SpeI限制性酶切位點(下劃線部分)，接著是50nt的AFP啟動子序列和SFV序列的起始20nt(斜體部分)5’ACT AGTTAA CAG GCA TTGCCT GAA AAG AGT ATA AAA GAA TTTCAG CAT GAT TTT CCATGG CGG ATG TGT GAC ATA C-3’。引物2含有XhoI限制性酶切位點(下劃線部分)，接著是SFV序列的19nt(斜體部分)5’CTC GAGGATATC CAA GAT GAG TGT GT-3’。通過PCR產(chǎn)生342bp的DNA片段，并將其直接克隆入pGEM-T-easy質(zhì)粒以產(chǎn)生pGEM-Te-SFV-1。通過測序確認在該質(zhì)粒中沒有出現(xiàn)PCR錯誤。通過使用Spe I和Xho I進行消化，從pGEM-Te-SFV-1釋放該342bp的片段，并將其克隆入被同樣酶消化的pGL3/AFP以產(chǎn)生pGL3/AFP-SFV-1，其具有完整的AFP啟動子(217bp)和增強子(785bp)，接著是SFV的5’末端(SFV-1，含有292bp)。通過使用Mlu I/Xho I進行消化，從pGL3/AFP-SFV-1獲得了AFP-SFV-1(1342bp)盒，使用Klenow進行處理并克隆進被EcoR V消化的pBS-SK+，這產(chǎn)生了pBS/AFP-SFV-1。通過Xba I/BamHI消化從pGL3/AFP切出SV40的后部多聚腺嘌呤(Poly A)(262bp)，使用Klenow進行平端化并插入同樣使用Klenow進行平端化的pBS/AFP-SFV-1的Sal I位點，這樣得到了pBS/AFP-SFV-1-pA。將含有單一Apa I和Nru I位點的多接頭插入pBS/AFP-SFV-1-pA的BamHI和Xma I之間。通過使用Spe I/EcoR V進行消化，從pBK-SFV-1切出含有7985bp的SFV的3’末端序列，使用Klenow進行平端化，并插入pBS/AFP-SFV-1-pA的EcoR V位點，這得到了pBS/AFP-SFV-pA。
通過使用Not I消化，從pCMVb獲得了LacZ報告基因，使用Klenow進行處理，并插入經(jīng)過Klenow處理的pBS/AFP-SFV-pA的BamH I位點以形成pBS/AFP-SFV-LacZ-pA。通過使用Spe I/Xho I消化從pBS/mIL-12分離mIL-12盒，其含有被內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)連接的編碼p35和p40亞基的基因，使用Klenow進行處理并插入也被Klenow平端化的pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA的BamH I位點，這樣產(chǎn)生了質(zhì)粒pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA。
構(gòu)建雜交無腸腺病毒載體如圖2所示，構(gòu)建了四種無腸腺病毒載體。AFP-SFV-lacZ和AFP-SFV-mIL-12含有被AFP啟動子和增強子控制的SFV復(fù)制子序列。在這些載體中，報告基因LacZ或者治療性基因mIL-12分別克隆在SFV亞基因組啟動子的控制之下。AFP-lacZ和AFP-mIL-12也是無腸腺病毒載體，它們分別含有直接受AFP啟動子/增強子控制的LacZ和mIL-12基因。下面描述了構(gòu)建這些載體所采用的方法。為了產(chǎn)生具有充分克隆空間以容納AFP-SFV-IL-12表達盒的腺病毒載體，將含有無腸腺病毒序列的pSTK120質(zhì)粒進行修飾。為此，通過使用Apa I進行消化從pSTK120去除9kb的片段。另外，將含有Asc I和Sbf I的多聚接頭插入該新質(zhì)粒中，這得到了pTGC3001。該質(zhì)粒含有左ITR、包裝信號、來自HPRT和C346的填充片段DNA以及右ITR。通過Apa I消化，從pBS/AFP-SFV-lacZ-pA分離出AFP-SFV-LacZ盒，并插入pTGC3001的Apa I位點，這產(chǎn)生了pTGC3011。相似地，通過使用BssH II進行消化，從pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA釋放出AFP-SFV-mIL-12盒，使用Klenow進行處理，并插入同樣以Klenow處理的pTGC3001的Asc I位點，以產(chǎn)生pTGC3012。
構(gòu)建對照載體構(gòu)建無腸腺病毒載體AFP-LacZ通過使用Mlu I/Xho I消化，從pGL3/AFP分離出AFP增強子/啟動子(AFP p+e)序列，使用Klenow進行處理，并插入之前被EcoRI/Xho I消化并使用Klenow處理過的pCMVb。以此方式，將CMV中早期啟動子(immediate early promoter)從pCMVb去除，并替換為AFP(p+e)以產(chǎn)生pAFPb。接著通過使用Xba I/Nar I從pAFPb切出AFP-LacZ盒(5077bp)，使用Klenow進行處理，并插入同樣被Klenow平端化的pSTK120的Swa I位點，這產(chǎn)生了pTGC3013。
構(gòu)建無殼腺病毒載體AFP-mIL-12通過使用Xho I/Spe I消化，從pBS/mIL-12切出mIL-12框，并插入pGL3/AFP中產(chǎn)生了pAFP-mIL-12，其中所述pGL3/AFP之前被Xho I/Xba I消化，這從該質(zhì)粒中去除了熒光素酶基因。通過使用BamHI/Sca I進行消化從pAFP-mIL-12切出了AFP-mIL-12盒(3760bp)，使用Klenow進行處理并插入被Swa I消化并同樣被Klenow處理的pSTK120以產(chǎn)生pTGC3014。
回收無殼腺病毒載體在使用Pme I進行消化，酚/氯仿提取以及乙醇沉淀后，將2μgpTGC3011、pTGC3012、pTGC3013或者pTGC3014 DNA分別轉(zhuǎn)染入293Cre4細胞。轉(zhuǎn)染后，使用輔助病毒AdLC8cluc感染細胞。根據(jù)先前的描述(Philip Ng.，Robin J.Parks，and Frank L Graham.Preparationof helper-dependent adenoviral vectors(制備依賴輔助物的腺病毒載體).Methods in Molecular Medicine，Vol.69，Gene Therapy Protocols，2nd.Ed.69，371-88，2002；H.Zhou，L.Pastore，A.L.Beaudet.Helper-dependent adenoviral vectors(依賴輔助物的腺病毒載體).Methods in Enzymology，vol，346，177-198，2002；Hillgenberg M.等人，System for efficient helper-dependent minimal adenovirus constructionsand rescue(用于構(gòu)建和回收有效的依賴輔助物的最小腺病毒的系統(tǒng)).Hum Gene Ther.，12；643-657，2001)進行后續(xù)大規(guī)模的擴增和制備步驟。通過CsCl梯度離心兩次純化所有的載體制備物。通過使用限制性內(nèi)切酶消化分析所純化的DNA載體，并顯示沒有序列重排(sequence rearrangement)。使用定量PCR進行無殼腺病毒和輔助病毒污染滴度的評價。總病毒顆粒與感染單位(iu)的比例是20∶1。輔助病毒顆粒的污染為大約0.5-1％。
定量PCR為了確定輔助病毒污染的程度，使用TaqMan程序(TaqMan Probe#2)設(shè)計了用于Ad5 E4區(qū)域定量PCR的探針和引物，并由Sigma-Genosys Ltd.(引物)和Applied Biosystems(探針)進行合成。為了確定無殼腺病毒的滴度，使用TaqMan程序(TaqMan Probe #2)設(shè)計了用于LacZ和來自小鼠的mIL-12序列的定量PCR的探針和引物，并由Sigma-Genosys Ltd.(引物)和Applied Biosystems(探針)進行合成。為了確定由野生型Ad的污染，使用TaqMan程序(TaqMan Probe #2)設(shè)計了用于Ad5 E1區(qū)域定量PCR的探針和引物，并由Sigma-GenosysLtd.(引物)和Applied Biosystems(探針)進行合成。
體外實驗以無殼腺病毒載體感染的細胞中的轉(zhuǎn)基因表達以四種無殼腺病毒載體(AFP-LacZ，AFP-SFV-LacZ，AFP-mIL-12或者AFP-SFV-mIL-12)中的每一種分別以1000，100或10“moi”(顆粒/細胞)感染衍生自HCC的細胞系(Hep3B，Huh7，HepG2和PLC/PRF/5)、不是衍生自HCC的細胞系(A549，HeLa，MHCl和Clone 9)或者衍生自HCC但不表達AFP的細胞系(SK-Hep-1)。使用三種第一代腺病毒(Ad/CMV-mIL-12、Ad/CMV-LacZ和Ad/AFP-LacZ)作為對照。從孔中雙份收集感染mIL-12載體的細胞的上清液和感染LacZ載體的細胞的裂解液，以分別確定mIL-12和β-半乳糖苷酶(β-gal)的水平。還使用X-gal對感染LacZ載體的細胞進行染色。使用ELISA試劑盒(Pharmingen，San Diego，CA)對mIL-12水平(p70)進行檢測。使用ELISA試劑盒(Roche，Switzerland)對β-gal水平進行檢測。檢測以1000“moi”感染AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12或者對照載體Ad/CMV-mIL-12后，在HCC細胞(Hep3B，Huh7)中mIL-12表達的時程(time course)。感染后，每天收集上清液，進行5天。
在體外分析使用SFV雜交載體的轉(zhuǎn)基因表達的特異性為了檢測使用前述重組載體的基因表達的特異性，將四種人HCC細胞系(Hep3B，HepG2，Huh7和PLC/PRF/5)，兩種不是衍生自HCC的人細胞系(HeLa和A549)或者衍生自HCC但不表達AFP的細胞系(SK-Hep-1)以不同“moi”(10，100或者1000)的AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12或者作為陽性對照的Ad-CMV-mIL-12感染。感染兩天后，收集上清并確定其mIL-12含量。其結(jié)果顯示在圖3(A)和(B)中。當以10或100“moi”用AFP-mIL-12感染時，在人HCC細胞中沒有觀察到mIL-12表達，只有在1000“moi”時才在某些細胞系中觀察到非常低水平的mIL-12(圖3A)。相反，以10、100或1000“moi”的AFP-SFV-mIL-12感染這些細胞則得到了劑量依賴形式的mIL-12表達(圖3A)。在以10“moi”AFP-SFV-mIL-12感染的細胞中mIL-12的表達水平與在以1000“moi”AFP-mIL-12感染的細胞中所得到的水平相當。另外，以不同“moi”的AFP-SFV-mIL-12感染的HCC細胞中mIL-12的水平與以對照載體Ad-CMV-mIL-12感染的細胞中所得到的水平相當。然而，即使在使用最高“moi”(1000)時，以AFP-mIL-12或者AFP-SFV-mIL-12感染不表達AFP的細胞也不產(chǎn)生可檢測水平的mIL-12(圖3B)。在這些細胞中，只有對照載體Ad-CMV-mII-12能夠產(chǎn)生高水平的mIL-12表達。
另一方面，使用LacZ-AFP-lacZ或者AFP-SFV-lacZ雜交載體以不同的“moi”(10，100或1000)感染四種HCC細胞系(Hep3B，Huh-7，HepG2和PLC/PRF/5)，并測定β-gal的特異性表達。在這種情況中得到了類似的數(shù)據(jù)，其結(jié)果表示在圖4中。
圖5表示以無腸腺病毒載體AFP-LacZ和AFP-SFV-lacZ感染HCC細胞后，接著使用X-gal進行染色的顯微照片。以AFP-lacZ感染HCC細胞導(dǎo)致被感染細胞中的低表達水平，其只被微弱地染色。相反，以X-gal染色的強度反映出，使用AFP-SFV-lacZ感染HCC細胞導(dǎo)致高水平的β-gal表達。這項數(shù)據(jù)表示含有受AFP啟動子控制的SFV復(fù)制子的雜交載體Ad-SFV可在表達AFP的腫瘤細胞中產(chǎn)生高水平的強烈轉(zhuǎn)基因表達。
在體外mIL-12在HCC細胞中表達的時程為了研究在以Ad-SFV雜交載體感染后在不同時間的mIL-12生成，以AFP-mIL-12或者以AFP-SFV-mIL-12感染兩種HCC細胞系(Hep3B和Huh-7)，在感染后，每天收集上清液，進行5天。圖6表示在感染上述細胞后，所得到的轉(zhuǎn)基因表達結(jié)果。所述結(jié)果反映出在以AFP-SFV-mIL-12感染細胞后1至4天在mIL-12表達方面有穩(wěn)定的提高(圖6)。然而，在感染后第5天，mIL-12水平稍微降低。在被AFP-mIL-12感染的細胞中，表達水平非常低，整個過程中只注意到mIL-12生成的稍微增加。
細胞毒性檢測-通過MTT摻入法評價細胞增殖使用AFP-LacZ、AFP-SFV-LacZ、AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12或者Ad/CMV-mIL-12以1000“moi”感染HCC細胞(Hep3B，Huh7，MCH-RH7777，Hep1-6)。感染后5天，通過MTT測定(3-(4，5-二甲基噻唑基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)確定細胞存活率。Mosmann，T.(1983)J.Immunol.Meth.65，55-63；Tada，H.等人(1986)J.Immunol.Meth.93，157-65。簡言之，使用PBS對細胞清洗一次，將200μl新制備的MTT染料溶液加入到(48孔板中的)每個孔中。再培養(yǎng)細胞3至4小時，然后加入500μl溶解緩沖液。每個樣品取100μl，用于在分光光度計中570nm波長處測定吸光度。
在體外使用Ad-SFV雜交載體感染HCC細胞后細胞死亡的誘導(dǎo)已經(jīng)描述過，SFV載體的復(fù)制在大多數(shù)脊椎動物來源的細胞中會通過凋亡誘導(dǎo)細胞死亡。為了分析是否在被Ad-SFV雜交載體感染的HCC細胞也是這種情況，使用這些載體感染Hep3B和Huh-7細胞，并在感染5天后確定細胞存活率。從圖7可以看出，在被AFP-SFV-mIL-12或AFP-SFV-lacZ感染的細胞中，在這個感染后時間點的存活率低于20％。然而，使用AFP-mIL-12或AFP-lacZ或者對照載體AdCMVmIL-12感染同樣的細胞并不影響細胞存活率。這些結(jié)果預(yù)示SFV在被AFP-SFV載體感染的細胞中復(fù)制。
通過免疫熒光檢測SFV Rep將HCC細胞(Hep3B，Huh7，MCH-RH7777)接種在6孔板的蓋玻片上(1×105細胞/孔)，并以1000“moi”的AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12或者Ad/CMV-mIL-12感染。在感染兩天后，使用PBS清洗蓋玻片兩次，在-20℃下使用甲醇將細胞固定6分鐘。再使用PBS將板清洗3次，并在室溫(RT)下與含有0.5％明膠和0.25％BSA的PBS孵育30分鐘以阻斷非特異性結(jié)合。接著使用在封閉緩沖液中1∶1稀釋的第一抗體(抗復(fù)制酶MAb)替換封閉緩沖液，并在室溫下孵育30分鐘。再以PBS-0.25％BSA將細胞清洗3次，并在室溫下與在封閉緩沖液中1∶250稀釋的第二抗體(偶聯(lián)FITC的抗小鼠兔血清，Sigma)孵育30分鐘。最后，使用PBS-0.25％BSA將細胞清洗3次，使用水清洗一次，并使用帶有Dapi的Vecta覆蓋物(Vecta shield with Dapi)將其布置在蓋玻片上，以對細胞核染色。
在體外Ad-SFV雜交載體感染的細胞中SFV Rep的表達在Ad-SFV雜交載體感染的HCC細胞中采用該蛋白質(zhì)特異性的單克隆抗體通過免疫熒光檢測SFV Rep的表達。圖8顯示以AFP-SFV-mIL-12或AFP-SFV-lacZ感染的HCC細胞表現(xiàn)出Rep的強細胞質(zhì)陽性。相反，以AFP-mIL-12或者AFP-lacZ感染的細胞沒有表現(xiàn)出染色。
體內(nèi)實驗HCC異種移植物的誘導(dǎo)和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率和特異性的研究收集Huh-7細胞并用無血清培養(yǎng)基清洗兩次。將2×106個細胞懸浮在100μl鹽水血清中，并皮下注射(s.c.)入BALB/c裸鼠的右側(cè)。接種這些細胞后四個星期，當腫瘤節(jié)達到直徑6-8mm時，將1×1010稀釋在80μl鹽水中的AFP-LacZ(n＝4)或者AFP-SFV-LacZ(n＝4)的病毒顆粒瘤體內(nèi)注射。對照動物(n＝3)在腫瘤內(nèi)注射80μl鹽水。在接種后第3天或者第6天處死小鼠。在這些時間，從每個動物中取出腫瘤和肝，包在O.C.T.(Sakura，Holland)中，并在-80℃下冷凍。將冷凍的組織進行切片并置于載玻片上進行用X-gal染色或者通過TUNEL進行分析。為了研究體內(nèi)使用這些雜交載體進行感染的特異性，將正常Balb/c小鼠靜脈以1010病毒顆粒/小鼠的劑量注射AFP-LacZ(n＝4)，AFP-SFV-LacZ(n＝4)或者Ad/CMV-LacZ。在接種后第3天將所述動物處死，并收集主要的器官，通過X-gal染色進行LacZ表達的分析。
免疫缺陷裸鼠內(nèi)人HCC異種移植中Ad-SF雜交載體基因轉(zhuǎn)移的效率為了研究體內(nèi)無腸雜交載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，采用了基于能夠表達AFP的人HCC模型。將Huh7細胞皮下接種到免疫缺陷Balb/c小鼠，并在30后產(chǎn)生腫瘤結(jié)節(jié)后，向動物瘤內(nèi)注射1×1010個AFP-SFV-LacZ病毒顆粒或者作為對照的AFP-LacZ病毒顆粒。在注射這些病毒后3天或者6天將小鼠處死，并取出腫瘤和肝，使用X-gal進行染色。從圖9A可以看出，在接受AFP-lacZ的動物的腫瘤切片中有微弱的轉(zhuǎn)基因表達。相反，在接受AFP-SFV-LacZ的動物的腫瘤切片中有強烈的LacZ表達(圖9B)。在接受AFP-LacZ或者AFP-SFV-LacZ的動物肝切片中沒有觀察到轉(zhuǎn)基因表達，這預(yù)示所述載體可能限制在接種位置(數(shù)據(jù)未示出)。為了研究Ad-SFV雜交載體是否在感染腫瘤細胞中誘導(dǎo)凋亡，通過TUNEL技術(shù)分析所處理的腫瘤切片。在來自接種AFP-LacZ的小鼠的樣品中沒有觀察到凋亡(圖9C)。然而，在接受AFP-SFV-LacZ的動物的腫瘤中觀察到了大量的凋亡細胞(圖9D)。該數(shù)據(jù)預(yù)示Ad-SFV雜交載體不僅特異地在腫瘤中誘導(dǎo)基因表達，而且這些相同細胞中通過凋亡誘導(dǎo)選擇性細胞死亡。
Ad-SFV雜交載體的體內(nèi)特異性為了顯示雜交載體的特異性，將1010個AFP-LacZ、AFP-SFV-LacZ或者對照載體Ad/CMV-LacZ的病毒顆粒靜脈注射入Balb/c小鼠中。在給予這些載體3天后，分析β-半乳糖苷酶在肝內(nèi)的表達。如圖9(E-F)所示，AFP-LacZ和AFP-SFV-LacZ都不能夠在肝內(nèi)誘導(dǎo)可檢測的轉(zhuǎn)基因表達。然而，在接受Ad/CMV-LacZ的動物中觀察到在肝組織切片中高比例的β-半乳糖苷酶陽性細胞(圖9G)。這些數(shù)據(jù)確認由雜交載體介導(dǎo)的表達對于是腫瘤細胞特異性的。
原位HCC誘導(dǎo)和體內(nèi)基因治療將5×105個McA-RH7777細胞接種到Buffalo大鼠的肝左葉。在接種腫瘤細胞10天后，在每個動物中出現(xiàn)了直徑為7-10mm的單一腫瘤結(jié)節(jié)。使用1011或2×1011個AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12病毒顆?；蛘呤褂名}水溶液作為對照對腫瘤進行處理。在處理2周和4周后，將動物麻醉并進行剖腹手術(shù)以觀察腫瘤的發(fā)展。還進行了動物存活率的分析。通過檢測每個腫瘤結(jié)節(jié)的長度和寬度并使用公式腫瘤體積＝(長度mm)×(寬度mm)2×0.5236(Janik等人，1975)來評估腫瘤的大小。
Buffalo大鼠中原位HCC處理的有效性為了研究攜帶IL-12的Ad-SFV雜交載體抗腫瘤的有效性，通過在肝中植入大鼠McH-RH7777細胞，在大鼠中建立原位HCC腫瘤。選擇該模型，因為已經(jīng)證明McH-RH7777細胞表達AFP。在第一個實驗中，使用一次瘤體內(nèi)注射1×1011個AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12病毒顆?；蛘呤褂米鳛閷φ盏柠}水溶液對動物進行處理(圖10A-C)。與對照動物相比，接受AFP-mIL-12的動物表現(xiàn)出腫瘤大小減小，而對照動物在整個實驗中經(jīng)歷了穩(wěn)定的腫瘤大小的增長(圖10A-B)。然而，使用AFP-SFV-mIL-12的處理導(dǎo)致在1/4的被處理的大鼠中腫瘤的完全消退，兩只動物中疾病穩(wěn)定，1只動物中沒有反應(yīng)(圖10C)。為了確認更大劑量的雜交載體是否能夠提高抗腫瘤效果，進行了第二個實驗，其中對動物在瘤內(nèi)以2×1011個AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12的病毒顆粒或者使用作為對照的鹽水溶液處理(圖10D-G)。如同在之前的實驗中，接受AFP/IL-12載體的動物只表現(xiàn)出輕微的抗腫瘤反應(yīng)，其結(jié)果是在12只接受處理的動物中，只有1只完全消退，4只動物具有比對照生長更慢的腫瘤，7只動物沒有反應(yīng)(圖10E)。然而，使用AFP-SFV-IL-12載體處理具有更強的作用，在全部12只處理的動物中，在4只動物中誘導(dǎo)完全的腫瘤消退(33％)，6只動物中部分消退(50％)，2只動物中延遲腫瘤生長進展(16％)，以及在另外2只動物中沒有反應(yīng)(16％)(圖10F)。在該第二項研究中，AFP/SFV-IL-12載體使處理動物的有50％的存活率，而在使用AFP-IL-12或者鹽水溶液處理的動物中存活率為0％(圖10G)。
體內(nèi)毒性研究確定血清轉(zhuǎn)氨酶和Il-12水平和肝組織學(xué)研究以2×1011劑量的AFP-SFV-IL-12或者AFP-IL-12腺病毒載體或者以鹽水溶液在瘤內(nèi)處理大鼠，在接種4和8天后，收集血樣。該研究還包括以108個SFV-IL-12α病毒顆粒接種的大鼠。通過2000rpm離心15分鐘從血中分離血清。使Hitachi 911自動分析儀(BoehringerMannheim，Germany)分析轉(zhuǎn)氨酶水平。通過ELISA確定IL-12水平。通過在處理3天后，提取被接種動物的肝進行組織學(xué)研究。將該器官固定在甲醛中，包埋在石蠟中，并使用超薄切片機切片成6μm的厚度。接著將這些切片使用蘇木精/曙紅進行染色。
Ad-SFV雜交載體在大鼠中毒性的研究為了評估與給予AFP-SFV-IL-12雜交載體相關(guān)的毒性，在經(jīng)過以2×1011個不同載體的病毒顆粒進行瘤內(nèi)處理(參見之前部分)的大鼠血清中測定轉(zhuǎn)氨酶(GOT、GPT和GGTL)的水平。該研究還包括一組在瘤內(nèi)接種108個α病毒載體SFV-IL-12的病毒顆粒的大鼠(圖11A)。接種了AFP-SFV-IL-12或AFP-IL-12腺病毒載體的大鼠表現(xiàn)出非常低的轉(zhuǎn)氨酶水平，其與接種鹽水溶液的對照動物非常相似。然而，以SFV-IL-12顆粒處理的動物中轉(zhuǎn)氨酶水平顯著地高于其它組(p＜0.05)。在這項研究中，還確定了在相同的時間點出現(xiàn)在動物血清中的IL-12水平。在接種Ad AFP-SFV-IL-12或AFP-IL-12載體或者鹽水溶液的動物的血清中沒有檢測到IL-12(圖11B)，這預(yù)示這些載體中轉(zhuǎn)基因的表達限于腫瘤，并暗示Ad-SFV雜交載體的毒性非常低。然而，使用SFV-IL-12病毒顆粒處理在短時間后誘導(dǎo)了IL-12的高血清水平，這種情況可能引起肝毒性。最后，在被蘇木精/曙紅染色的肝切片中通過組織分析完成了毒性研究，其中所述肝切片來自以前面所述的相同載體和相同劑量瘤內(nèi)處理的大鼠(圖12)。這項研究表明在接受鹽水溶液的大鼠和接受AFP-SFV-IL-12或者AFP-IL-12腺病毒載體的大鼠中沒有組織學(xué)差異。然而，在以SFV-IL-12病毒顆粒處理的大鼠的肝切片中觀察到了嗜曙紅干細胞和這些肝細胞的融合，這預(yù)示某種程度的毒性(黑箭頭，圖12D)。
序列表<110>西瑪生物醫(yī)學(xué)信息公司<120>用于在腫瘤細胞中有效給予和表達治療性基因的腺病毒/α病毒雜交載體<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>438<212>DNA<213>腺病毒<400>1aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag120tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt180ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg240tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga300ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc360ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg420ttccgggtca aagttggc 438<210>2<211>161<212>DNA<213>腺病毒<400>2caagcttatc gataccgtcg agacctcgag ggggggcatc actccgccct aaaacctacg 60tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac tccaccccct cattatcata120ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat tgatgatgtt t161<210>3<211>7412<212>DNA<213>Semliki Forest病毒(SFV)<400>3gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc 60gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg120acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc180
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<213>嵌合的<220>
<221>5′ITR<222>(1)..(438)<223>第一反向末端重復(fù)序列和用于包裝的信號序列<220>
<221>填充片段<222>(439)..(10990)<223>第一非編碼填充片段序列<220>
<221>AFP(p+e)<222>(10991)..(11930)<223>α甲胎蛋白(AFP)啟動子.包括啟動子區(qū)域(p)和增強子區(qū)域(e)<220>
<221>SFV<222>(12257)..(19366)<223>SFV復(fù)制子序列區(qū)域<220>
<221>mIL-12<222>(19389)..(21722)<223>小鼠白介素-12(IL12)基因序列(外源基因)<220>
<221>PolyA<222>(22621)..(22880)<223>衍生自SV40病毒的多聚腺苷酸化序列<220>
<221>填充片段<222>(22881)..(28731)<223>第二填充片段非編碼序列<220>
<221>3′ITR<222>(28732)..(28892)<223>第二反向末端重復(fù)序列<400>8aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag120tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt180ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg240tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga300ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc360
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<221>5′ITR<222>(1)..(438)<223>第一反向末端重復(fù)序列和用于包裝的信號序列<220>
<221>填充片段<222>(439)..(10905)<223>第一非編碼填充片段序列<220>
<221>AFP(p+e)<222>(10906)..(11845)<223>α甲胎蛋白(AFP)啟動子.包括啟動子區(qū)域(p)和增強子區(qū)域(e)<220>
<221>SFV<222>(12175)..(19281)<223>SFV復(fù)制子序列區(qū)域<220>
<221>LacZ<222>(19325)..(22397)<223>Escherichia coli LacZ基因序列(外源基因作為報告基因)<220>
<221>PolyA<222>(23295)..(23554)<223>衍生自SV40病毒的多聚腺苷酸化序列<220>
<221>Relleno<222>(23555)..(29350)<223>第二填充片段非編碼序列<220>
<221>3′ITR<222>(29351)..(29511)<223>第二反向末端重復(fù)序列<400>9aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag120tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt180ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg240tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga300ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc360ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg420ttccgggtca aagttggcgt tttgatatca agcttatcga taccgtcaaa caagtcttta480attcaagcaa gactttaaca agttaaaagg agcttatggg taggaagtag tgttatgatg540
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<221>TERT<222>(10991)..(11285)<223>端粒酶啟動子(TERT)<220>
<221>SFV<222>(11556)..(18665)<223>SFV復(fù)制子序列區(qū)域<220>
<221>mIL-12<222>(18688)..(21021)<223>小鼠白介素-12(IL12)基因序列<220>
<221>PolyA<222>(21920)..(22179)<223>衍生自SV40病毒的多聚腺苷酸化序列<220>
<221>填充片段<222>(22180)..(28030)<223>第二非編碼填充片段序列<220>
<221>3′ITR<222>(28031)..(28191)<223>第一反向末端重復(fù)序列<400>10aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60
agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag120tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt180ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg240tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga300ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc360ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg420ttccgggtca aagttggcgt tttgatatca agcttatcga taccgtcaaa caagtcttta480attcaagcaa gactttaaca agttaaaagg agcttatggg taggaagtag tgttatgatg540tatgggcata aagggtttta atgggatagt gaaaatgtct ataataatac ttaaatggct600gcccaatcac ctacaggatt gatgtaaaca tggaaaaggt caaaaacttg ggtcactaaa660atagatgatt aatggagagg atgaggttga tagttaaatg tagataagtg gtcttattct720caataaaaat gtgaacataa ggcgagtttc tacaaagatg gacaggactc attcatgaaa780cagcaaaaac tggacatttg ttctaatctt tgaagagtat gaaaaattcc tattttaaag840gtaaaacagt aactcacagg aaataccaac ccaacataaa atcagaaaca atagtctaaa900gtaataaaaa tcaaacgttt gcacgatcaa attatgaatg aaattcacta ctaaaattca960cactgatttt gtttcatcca cagtgtcaat gttgtgatgc atttcaattg tgtgacacag 1020gcagactgtg gatcaaaagt ggtttctggt gcgacttact ctcttgagta tacctgcagt 1080cccctttctt aagtgtgtta aaaaaaaagg gggatttctt caattcgcca atactctagc 1140tctccatgtg ctttctagga aacaagtgtt aacccacctt atttgtcaaa cctagctcca 1200aaggactttt gactccccac aaaccgatgt agctcaagag agggtatctg tcaccagtat 1260gtatagtgaa aaaagtatcc caagtcccaa cagcaattcc taaaaggagt ttatttaaaa 1320aaccacacac acctgtaaaa taagtatata tcctccaagg tgactagttt taaaaaaaca 1380gtattggctt tgatgtaaag tactagtgaa tatgttagaa aaatctcact gtaaccaagt 1440gaaatgaaag caagtatggt ttgcagagat tcaaagaaaa tataagaaaa cctactgttg 1500ccactaaaaa gaatcatata ttaaatatac tcacacaata gctcttcagt ctgataaaat 1560ctacagtcat aggaatggat ctatcactat ttctattcag tgctttgatg taatccagca 1620ggtcagcaaa gaatttatag ccccccttga gcacacagag ggctacaatg tgatggcctc 1680ccatctcctt catcacatct cgagcaagac gttcagtcct acagaaataa aatcaggaat 1740ttaatagaaa gtttcataca ttaaacttta taacaaacac ctcttagtca ttaaacttcc 1800acaccaacct gggcaatata gtgagacccc atgcctgcaa aaaaaaaaaa attagccagg 1860
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<221>MCS<222>(1)..(25)<223>多克隆位點<220>
<221>AFP增強子<222>(26)..(820)<223>AFP增強子<220>
<221>AFP pro<222>(828)..(1054)
<223>AFP啟動子<400>11ggtaccgagc tcttacgcgt gctagaattc gcctgtcata cagctaataa ttgaccataa 60gacaattaga tttaaattag ttttgaatct ttctaatacc aaagttcagt ttactgttcc120atgttgcttc tgagtggctt cacagactta tgaaaaagta aacggaatca gaattacatc180aatgcaaaag cattgctgtg aactctgtac ttaggactaa actttgagca ataacacaca240tagattgagg attgtttgct gttagcatac aaactctggt tcaaagctcc tctttattgc300ttgtcttgga aaatttgctg ttcttcatgg tttctctttt cactgctatc tatttttctc360aaccactcac atggctacaa taactgtctg caagcttatg attcccaaat atctatctct420agcctcaatc ttgttccaga agataaaaag tagtattcaa atgcacatca acgtctccac480ttggagggct taaagacgtt tcaacataca aaccggggag ttttgcctgg aatgtttcct540aaaatgtgtc ctgtagcaca tagggtcctc ttgttcctta aaatctaatt acttttagcc600cagtgctcat cccacctatg gggagatgag agtgaaaagg gagcctgatt aataattaca660ctaagtcaat aggcatagag ccaggactgt ttgggtaaac tggtcacttt atcttaaact720aaatatatcc aaaactgaac atgtacttag ttactaagtc tttgacttta tctcattcat780accactcagc tttatccagg ccacttattt gacagtctag ctagccccta gattttctgc840cccaaagagc tctgtgtcct tgaacataaa atacaaataa ccgctatgct gttaattatt900ggcaaatgtc ccattttcaa cctaaggaaa taccataaag taacagatat accaacaaaa960ggttactagt taacaggcat tgcctgaaaa gagtataaaa gaatttcagc atgattttcc 1020atattgtgct tccaccactg ccaataacag gatcgggctc gagatctgcg atctaagtaa 1080gcttggcatt ccggtactgt tggtaaagcc accatggaag acgccaaaaa cataaagaaa 1140ggcccggcgc cattctatcc gctggaagat ggaaccgctg gagagcaact gcataaggct 1200atgaagagat acgccctggt tcctggaaca attgctttta cagatgcaca tatcgaggtg 1260gacatcactt acgctgagta cttcgaaatg tccgttcggt tggcagaagc tatgaaacga 1320tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc gtatgcagtg aaaactctct tcaattcttt 1380atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg cgcccgcgaa cgacatttat 1440aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgggc atttcgcagc ctaccgtggt gttcgtttcc 1500aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg caaaaaaagc tcccaatcat ccaaaaaatt 1560attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt cgatgtacac gttcgtcaca 1620tctcatctac ctcccggttt taatgaatac gattttgtgc cagagtcctt cgatagggac 1680aagacaattg cactgatcat gaactcctct ggatctactg gtctgcctaa aggtgtcgct 1740
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1.基因表達腺病毒雜交載體，特征在于沿5’至3’方向其至少包括下列元件i.腺病毒來源的第一鏈，其包括第一反向末端重復(fù)(ITR)序列和用于包裝所述腺病毒的信號序列；ii.第一非編碼填充片段序列；iii.對應(yīng)于組織特異性啟動子的序列；iv.衍生自α病毒的cDNA鏈，其序列部分地互補于α病毒RNA序列，至少包括編碼至少一種目的外源基因的序列；v.多聚腺苷酸化序列；以及vi.第二腺病毒反向末端重復(fù)(ITR)序列。
2.如權(quán)利要求1所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于其在元件v和元件vi之間還包括元件vii，所述元件vii是第二非編碼填充片段序列。
3.如權(quán)利要求1所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件ii是人非編碼填充片段序列。
4.如權(quán)利要求1或3所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件ii是人基因組次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HPRT的內(nèi)含子區(qū)域。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件i具有序列SEQ ID No 1。
6.如權(quán)利要求1所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件iii是腫瘤特異性啟動子。
7.如權(quán)利要求6所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件iii是選自AFP、端粒酶TERT、PAP、E2F和HIF的腫瘤特異性啟動子。
8.如權(quán)利要求1所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件iii是具有選自與AFP p+e對應(yīng)的SEQ ID No 7和與端粒酶TERT對應(yīng)的SEQ ID No 15的序列的腫瘤特異性啟動子。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件iv包括衍生自Semliki Forest病毒(SFV)的序列。
10.如權(quán)利要求1或9所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于所述衍生自α病毒的cDNA的鏈iv，其序列部分地互補于α病毒RNA，包括至少一段編碼至少一種目的外源基因的序列，并且其還包括a)所述α病毒復(fù)制所需的5’序列；b)編碼所述α病毒RNA的復(fù)制所需的非結(jié)構(gòu)蛋白的序列；c)所述α病毒的至少一種亞基因組啟動子；以及d)所述α病毒復(fù)制所需的3’序列。
11.如權(quán)利要求10所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件iv的序列a)至c)作為整體具有選自SEQ ID No 3和SEQ ID No 4的序列。
12.如權(quán)利要求10或11所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于在元件iv中d)具有序列SEQ ID No 5。
13.如前述權(quán)利要求中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于所述目的外源基因選自一種或者多種治療性基因、一種或者多種報告基因及其組合。
14.如權(quán)利要求13所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于所述目的外源基因是哺乳動物白介素IL-12治療性基因。
15.如權(quán)利要求13所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于所述目的外源基因是人白介素hIL-12治療性基因。
16.如權(quán)利要求13所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于，所述目的外源基因是選自集落刺激因子(GMCSF)、α-干擾素以及單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的治療性基因。
17.如權(quán)利要求11所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件iv系列地包括一個或者多個(亞基因組啟動子+目的外源基因)亞組合。
18.如權(quán)利要求13所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于所述目的外源基因是選自LacZ、熒光素酶、單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和GFP的報告基因。
19.如權(quán)利要求9至18中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件iv形成在功能上受啟動子iii控制的復(fù)制子，并且包括在iv c)中的所述α病毒亞基因組啟動子在功能上控制所述目的外源基因的表達。
20.如前述權(quán)利要求中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件v是SV40的多聚腺苷酸化序列。
21.如前述權(quán)利要求中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件v具有序列SEQ ID No 6。
22.如權(quán)利要求2所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于所述第二非編碼填充片段序列是C346。
23.如前述權(quán)利要求中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于元件vi具有序列SEQ ID No 2。
24.如前述權(quán)利要求中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于，其包括i.腺病毒來源的第一鏈，其包括第一反向末端重復(fù)(ITR)序列和用于包裝所述腺病毒的信號序列；ii.第一非編碼填充片段序列，其為人基因組次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的內(nèi)含子區(qū)域；iii.對應(yīng)于組織特異性啟動子的序列，其為AFP啟動子；iv.衍生自α病毒的cDNA鏈，其序列部分地互補于衍生自SFV病毒的α病毒RNA，其包括編碼目的外源基因hIL-12的序列；v.SV40的多聚腺苷酸化序列；vi.第二腺病毒反向末端重復(fù)(ITR)序列；以及vii.定位在元件v和元件vi之間的第二非編碼填充片段序列，其為人基因組C346。
25.如前述權(quán)利要求中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于其包括i.腺病毒來源的第一鏈，其包括第一反向末端重復(fù)(ITR)序列和用于包裝所述腺病毒的信號序列；ii.第一非編碼填充片段序列，其為人基因組次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的內(nèi)含子區(qū)域；iii.對應(yīng)于組織特異性啟動子的序列，其為AFP啟動子；iv.衍生自α病毒的cDNA鏈，其序列部分地互補于衍生自SFV病毒的α病毒RNA，其包括編碼選自mIL-12和LacZ的目的外源基因的序列；v.SV40的多聚腺苷酸化序列；vi.第二腺病毒反向末端重復(fù)(ITR)序列；以及vii.定位在元件v和元件vi之間的第二非編碼填充片段序列，其為人基因組C346。
26.如前述權(quán)利要求中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于其具有27kb至38kb的長度。
27.如前述權(quán)利要求中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于其具有序列SEQ ID NO 8。
28.如權(quán)利要求1至26中任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于其具有序列SEQ ID NO 9。
29.如權(quán)利要求1至26任一項所述的基因表達腺病毒雜交載體，特征在于其具有序列SEQ ID NO 10。
30.前述權(quán)利要求中任一項所述的腺病毒雜交載體在將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞的方法中的用途。
31.如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述細胞是腫瘤細胞。
32.如權(quán)利要求31所述的用途，其中所述細胞是表達AFP的腫瘤細胞。
33.權(quán)利要求1至29中任一項所述的腺病毒雜交載體在制備治療腫瘤的有效藥物中的用途。
34.權(quán)利要求1至29中任一項所述的腺病毒雜交載體在誘導(dǎo)針對外源抗原的免疫應(yīng)答中的用途。
35.藥物組合物，特征在于其含有至少一種權(quán)利要求1至29中任一項所述的腺病毒雜交載體。
36.藥物組合物，特征在于其含有至少一種權(quán)利要求1至29中任一項所述的腺病毒雜交載體，其中所述目的外源基因是hIL-12。
37.藥物組合物在誘導(dǎo)針對外源抗原的免疫反應(yīng)的方法中的用途，其中所述藥物組合物含有至少一種權(quán)利要求1至29中任一項所述的腺病毒雜交載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及雜交的腺病毒基因表達載體，其特征在于沿著5′至3′方向其至少包括下列元件，即i.腺病毒來源的第一鏈，其含有第一反向末端重復(fù)序列(ITR)和用于包裝腺病毒的信號序列；ii.第一非編碼填充片段序列；iii.對應(yīng)于組織特異性啟動子的序列；iv.衍生自α病毒的cDNA鏈，其序列部分地互補于α病毒RNA，至少包括編碼至少一種目的外源基因的序列；v.多聚腺苷酸化序列；以及vi.第二腺病毒反向末端重復(fù)序列(ITR)。本發(fā)明優(yōu)選涉及包括哺乳動物白介素治療性基因IL－12、更優(yōu)選人白介素hIL－12作為目的外源基因的腺病毒雜交載體。本發(fā)明還涉及所述雜交載體在將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞的方法中的用途，特別是腫瘤細胞，優(yōu)選表達α－甲胎蛋白(AFP)的細胞；本發(fā)明還涉及所述雜交載體在誘導(dǎo)針對外源基因的免疫應(yīng)答中的用途。
文檔編號C12N15/861GK1957086SQ200580016133
公開日2007年5月2日 申請日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
發(fā)明者錢程, 關(guān)敏, 克里斯蒂安·斯梅爾多畢加索, 赫蘇斯·普列托巴爾圖埃納 申請人:西瑪生物醫(yī)學(xué)信息公司