專(zhuān)利名稱(chēng)：無(wú)儀器核酸提取裝置及微量核酸的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無(wú)儀器微量核酸提取裝置及微量核酸提取的方法。
背景技術(shù)：
臨床常常需要從各種生物組織或細(xì)胞中抽提基因組DNA或RNA，應(yīng)用核酸擴(kuò)增技 術(shù)測(cè)定其成分，這是用于病癥的輔助性分析和診斷的一種高度敏感，且最為直接的檢測(cè)手 段。由于臨床標(biāo)本中含有蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等物質(zhì)，會(huì)干擾其下游擴(kuò)增反應(yīng)，故在進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng) 前必須進(jìn)行生物樣本的處理和核酸提取。由于樣本的處理及保存對(duì)DNA和RNA(尤其是RNA) 的影響較大，因此在核酸標(biāo)本的適當(dāng)?shù)念A(yù)處理及保存對(duì)核酸模板的成功提取具有決定性作 用。臨床常見(jiàn)的標(biāo)本有全血、分泌物、棉拭子、膿液、體液、糞便等，這些臨床標(biāo)本的處理和保 存方法各有不同。不同臨床標(biāo)本的處理方法及步驟為一、痰標(biāo)本痰屬于分泌物，臨床上常用作結(jié)核桿菌DNA測(cè)定樣本，由于痰標(biāo)本中含大量粘蛋 白和雜質(zhì)，故在核酸提取時(shí)，一定要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理，即用液化液去除粘蛋白，然后用煮 沸或蛋白酶、酚/氯仿等經(jīng)典法提取核酸。二、棉拭子用核酸擴(kuò)增方法檢測(cè)性病病原體時(shí)(衣原體、支原體、淋球菌、梅毒螺旋體、單純 性皰疹病毒、人乳頭狀瘤病毒等)，臨床標(biāo)本一般為棉拭子?，F(xiàn)在應(yīng)用的處理棉拭子具體方 法為，用棉拭子取分泌物，置無(wú)菌試管或EP管內(nèi)，在樣本管中加無(wú)菌生理鹽水，充分震蕩混 勻后離心，棄上清，沉淀加無(wú)菌生理鹽水1ml，打勻的離心，重復(fù)洗滌一次，棄上清，沉淀即可 用于核酸提取。三、體液體液標(biāo)本，包括胸水、腹水、腦脊液、尿液等，可直接離心5分鐘，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可加等體積紅細(xì)胞裂解液，震蕩混勻后離心，可根據(jù)情況重復(fù)2-3 次，沉淀物用于核酸提取。四、膿液粘稠膿液同痰標(biāo)本處理，先將其液化，再離心取沉淀提取核酸。水樣膿液直接離心，沉淀用生理鹽水洗2-3次后用于核酸提取。五、全血標(biāo)本通常用來(lái)提取外周血單個(gè)核細(xì)胞核酸如基因組DNA、線(xiàn)粒體DNA、總RNA等。需要 采用前處理，即加適量的紅細(xì)胞裂解液(破膜液)，裂解全血中的紅細(xì)胞；隨后再加適量的 細(xì)胞核裂液(破核液)，裂解白細(xì)胞中的細(xì)胞核，使核內(nèi)核酸釋放出來(lái)；最后再加SDS (十二 烷基硫酸鈉)等去污劑，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。核酸提取已經(jīng)成為了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的最重要、最基本的操作，但是目前核酸的提取方案紛繁浩渺。分子診斷市場(chǎng)的發(fā)展和測(cè)序市場(chǎng)、功能基因組計(jì)劃的啟動(dòng)已經(jīng) 為核酸提取市場(chǎng)加足了油，傳統(tǒng)的操作流程已經(jīng)被更為簡(jiǎn)便和自動(dòng)化的化學(xué)溶液代替，現(xiàn) 在前市場(chǎng)上大部分核酸提取系統(tǒng)包括一個(gè)固體的純化支持物，如離心柱里的薄膜，或者磁 珠。有一些則設(shè)計(jì)成方便使用的微孔板的形式。核酸在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，在核酸提取過(guò)程中應(yīng)根據(jù)不同研 究需要，保證核酸結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；盡量排除其它大分子成分(蛋白質(zhì)、多糖等)的污染； 保證提取樣本中不含對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。表1是對(duì)幾種DNA 提取方法比較表1 各種DNA提取方法比較方法名稱(chēng)DNA提取適用范圍方法評(píng)價(jià)傳統(tǒng)法酚/氯仿等有機(jī) 溶劑抽提大多數(shù)標(biāo)本DNA提 取純化DNA純度高、片段大、含量多，但比較費(fèi) 時(shí)，步驟繁瑣，使用有機(jī)溶劑，有損操 作者健康。螯合樹(shù)脂法Chelex 100 樹(shù)脂培養(yǎng)及各種臨床標(biāo) 本可用于培養(yǎng)標(biāo)本和各種臨床標(biāo)本細(xì)菌及 部分病毒核酸的提取。旋轉(zhuǎn)離心柱 法硅載體吸附大多數(shù)標(biāo)本DNA提 取純化DNA純度高，但比較費(fèi)時(shí)，步驟繁瑣，洗 脫的效率是關(guān)鍵。玻璃粉法玻璃粉吸附，離 心分離土壤標(biāo)本方法簡(jiǎn)便，可用于土壤中細(xì)菌芽孢DNA的 提取，不能徹底除去PCR抑制劑。磁珠法磁珠吸附，磁場(chǎng) 分離冰凍、陳舊組織簡(jiǎn)單、快速，整個(gè)過(guò)程不到加分鐘，可 以獲得較純的DNA。適于少量樣本。免疫親和法抗原抗體反應(yīng)， 磁場(chǎng)分離冰凍、陳舊組織， 樣本含量很少的標(biāo) 本DNA純度高，含量多，適于樣本含量少的 標(biāo)本，抗DNA單克隆抗體的制備是關(guān)鍵。
目前基因診斷試劑的發(fā)展有兩個(gè)方向，一是高通量、自動(dòng)化、精密而復(fù)雜的儀器設(shè) 備，滿(mǎn)足高層次醫(yī)院的需求；二是快速、低價(jià)、使用簡(jiǎn)單儀器或無(wú)儀器的診斷試劑，用于床邊 快速診斷和基層醫(yī)療單位，直接服務(wù)于廣大人民大眾。目前大部分歐美國(guó)家的生物公司選 擇開(kāi)發(fā)利潤(rùn)豐厚的高端儀器，搶占高端市場(chǎng)。目前市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)一些利用固性吸附載體，將核酸吸附后再對(duì)固性吸附載體進(jìn) 行洗脫，從而達(dá)到提取核酸的目的。但已有技術(shù)中，核酸提取裝置普遍都體型龐大，并且價(jià) 格昂貴。專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00580016159. 1的發(fā)明申請(qǐng)公開(kāi)了一種提取核酸的方法和裝置，該 裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是一種高通量、自動(dòng)化的儀器，適用于高層次的醫(yī)院以及研究院所。專(zhuān)利申 請(qǐng)?zhí)枮?00710103868. 4的發(fā)明申請(qǐng)，公開(kāi)了一種核酸提取裝置，該裝置含有兩個(gè)相互連通的容器、送入/送出溶液的機(jī)構(gòu)以及兩個(gè)加壓減壓器，該發(fā)明的核酸提取裝置較為小型，但 是結(jié)構(gòu)仍然比較復(fù)雜，使用也不是十分方便需要先采用送入/送出溶液的機(jī)構(gòu)將待測(cè)樣 本送入，并且在使用時(shí)需要通過(guò)加壓減壓裝置同時(shí)采取一邊加壓、一邊減壓的操作。因此，目前市場(chǎng)上仍然需要一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便并且廉價(jià)的核酸提取裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的首要技術(shù)問(wèn)題在于提出一種無(wú)儀器微量核酸提取裝置。本發(fā)明要解決的第二技術(shù)問(wèn)題在于提出一種無(wú)儀器微量核酸提取的方法。本發(fā)明要解決的第三技術(shù)問(wèn)題在于提出一種無(wú)儀器提取微量核酸的試劑盒。為完成本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種無(wú)儀器微量核酸提取裝置，所述的無(wú)儀器微量核酸提取裝置包括 管狀主體1，管狀主體一端設(shè)有用于與抽吸裝置連接的接頭2，另一端為插頭3，用于與核酸 結(jié)合的濾芯裝置4安裝于管狀主體或插頭內(nèi)。本發(fā)明的第一優(yōu)選方案為所述的管狀主體與插頭為一體或由管狀主體與插頭兩 個(gè)部件連接而成，其中，所述插頭為錐狀。本發(fā)明的第二優(yōu)選方案為所述的濾芯裝置4包括一個(gè)與管狀主體或插頭內(nèi)壁相 適應(yīng)的中空的套筒和設(shè)置在套筒內(nèi)部的濾膜，套筒兩端為設(shè)置有擋板6的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的第三優(yōu)選方案為所述的濾芯裝置的擋板5位于底面的中心，擋板的面 積大于插頭下孔的面積。本發(fā)明還涉及一種無(wú)儀器微量核酸提取的提取方法，所述的提取方法包括以下步 驟(1)裂解將待測(cè)樣本加入裂解液，混勻；(2)吸附將本發(fā)明中的微量核酸提取裝置與加壓減壓裝置連接，抽吸待測(cè)樣本， 待測(cè)樣本中的核酸成分吸附在濾膜上，棄去濾液；(3)清洗用微量核酸提取裝置抽吸清洗液，清洗濾膜，棄去濾液；(4)洗脫用微量核酸提取裝置抽吸洗脫液，洗脫液流經(jīng)濾膜將吸附在膜上的核 酸成分洗脫，得到核酸水溶液；(5)核酸擴(kuò)增。其中，優(yōu)選的，裂解液選自異硫氰酸胍、鹽酸胍或肌酸胍。裂解液的濃度為2 6mol/L，裂解液與待測(cè)樣本的體積比為1 5 1，優(yōu)選為1 1。清洗液為pH為4 8的Tris緩沖液，濃度為0. 01 lmol/L，洗脫液為pH為7 10 的 10mmol/L 的 Tris-HCl 溶液。本發(fā)明還涉及一種無(wú)儀器提取微量核酸的的試劑盒所述試劑盒包括本發(fā)明所述 的微核酸提取裝置、抽吸裝置、細(xì)胞裂解液、清洗液及洗脫液。本發(fā)明涉及所述的試劑盒在傳染病病原體、宿主或病原體基因突變和單核苷酸多 態(tài)性檢測(cè)中的用途。下面對(duì)本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)描述本申請(qǐng)人選擇不同的發(fā)展方向，致力于開(kāi)發(fā)研制滿(mǎn)足快速核酸診斷和基層醫(yī)療單 位的系列產(chǎn)品。微量臨床樣本核酸快速提取裝置就是以此為出發(fā)點(diǎn)，建立一種無(wú)需儀器的快速簡(jiǎn)單的微量核酸臨床樣本的提取辦法，為快速核酸診斷提供了一個(gè)良好的基礎(chǔ)，同時(shí) 在真正意義上體現(xiàn)了申請(qǐng)人致力于完成的使命作為溝通先進(jìn)生物技術(shù)和人民大眾間的橋 梁，開(kāi)發(fā)快速、低價(jià)、使用簡(jiǎn)單儀器的診斷試劑。本發(fā)明的核酸提取裝置結(jié)合了細(xì)胞裂解技 術(shù)，用無(wú)儀器濾膜吸附核酸的樣本提取裝置對(duì)已裂解的臨床樣本中的核酸進(jìn)行提取，用于 病癥的輔助性分析和診斷。更具體的說(shuō)，本發(fā)明提供了一種無(wú)儀器微量核酸提取裝置，所述的微量核酸提取 裝置包括管狀主體1，管狀主體一端設(shè)有用于與抽吸裝置連接的接頭2，另一端為插頭3， 用于與核酸結(jié)合的濾芯裝置4安裝于管狀主體或插頭內(nèi)。本發(fā)明的核酸提取裝置采用無(wú)色 透明的材料制備，以便于在操作中觀察；本發(fā)明的提取裝置設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、輕巧，使用方便。其中，管狀主體與插頭為一體或由管狀主體與插頭兩個(gè)部件連接而成，其中，所述 插頭為錐狀。本發(fā)明的管狀主體可與插頭通過(guò)一體成型制備而成，也可以由主體和插頭兩 部分連接組裝而成。其中，管狀主體靠近連接裝置2的一端設(shè)置有用于標(biāo)記的磨砂區(qū)。在處理多個(gè)樣 本時(shí)，需要在微量提取裝置上做好標(biāo)記，磨砂區(qū)上可直接寫(xiě)字。濾芯裝置4包括一個(gè)與管狀主體或插頭內(nèi)壁相適應(yīng)的中空的套筒和設(shè)置在套筒 內(nèi)部的濾膜，套筒兩端為設(shè)置有擋板6的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。所述的濾芯裝置的擋板6位于底面的 中心，擋板的面積大于插頭下孔的面積。擋板優(yōu)選為圓型(見(jiàn)附圖3和4)。其中，擋板的作 用為控制吸入裝置內(nèi)溶液的流速，從而增加溶液與濾膜的反應(yīng)時(shí)間，增強(qiáng)吸附、洗滌以及脫 去步驟的效果本發(fā)明還涉及一種無(wú)儀器微量核酸提取的提取方法，所述的提取方法包括以下步 驟(1)裂解將待測(cè)樣本加入裂解液，混勻；(2)吸附將本發(fā)明中的微量核酸提取裝置與加壓減壓裝置連接，抽吸待測(cè)樣本， 待測(cè)樣本中的核酸成分吸附在濾膜上，棄去濾液；(3)清洗用微量核酸提取裝置抽吸清洗液，清洗濾膜，棄去濾液；(4)洗脫用微量核酸提取裝置抽吸洗脫液，洗脫液流經(jīng)濾膜將吸附在膜上的核 酸成分洗脫，得到核酸水溶液；(5)核酸擴(kuò)增。其中，所述的裂解液選自異硫氰酸胍、鹽酸胍或肌酸胍；所述的裂解液的濃度為 2 6mol/L，裂解液與待測(cè)樣本的體積比為1 5 1，優(yōu)選為1 1。所述的清洗液為pH為4 7的Tris緩沖液，濃度為0. 01 lmol/L，洗脫液為pH 為 7 10 的 10mmol/L 的 Tris-HCl 溶液。本發(fā)明還涉及一種無(wú)儀器提取微量核酸的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的 微核酸提取裝置、抽吸裝置、細(xì)胞裂解液、清洗液及洗脫液。用于本發(fā)明的硅膠過(guò)濾膜，是市場(chǎng)銷(xiāo)售的產(chǎn)品。用于實(shí)施本發(fā)明方法的抽吸操作的抽吸裝置是注射器或塑料泡，尤其是一次性注 射器。以下結(jié)合附圖1、附圖2和附圖3裝置結(jié)構(gòu)示意圖，簡(jiǎn)要說(shuō)明本發(fā)明的一項(xiàng)具體實(shí) 施方案的操作方式。
在本發(fā)明方法中使用的裝置結(jié)構(gòu)如附圖1 6所示，微量臨床樣本核酸快速提取 裝置由二部分組成核酸提取裝置和抽吸裝置。其中核酸提取裝置由管狀主體1和濾芯裝 置4組成。利用微量生物樣本提取核酸，以微量臨床樣本核酸快速提取裝置的吸附核酸作 用達(dá)到核酸分離的目的。本發(fā)明就是在臨床樣本進(jìn)行裂解后，利用微量臨床樣本核酸快速 提取裝置對(duì)臨床樣本過(guò)濾吸附、清洗，以及洗脫，提取DNA和RNA。首先用微量核酸提取裝置抽吸已裂解的微量核酸生物樣本，樣本流經(jīng)核酸提取裝 置1內(nèi)的濾膜后，核酸由于特異性的吸附作用而被吸附在過(guò)濾膜上，進(jìn)入核酸提取裝置和/ 或抽吸裝置的濾液則為不含有核酸成分的廢液，從而達(dá)到分離核酸的作用；然后將廢液推 出丟棄，接著用微量樣本核酸快速提取裝置抽吸清洗液，清洗過(guò)濾膜上的裂解液，雜質(zhì)，將 清洗液推出棄掉，這樣核酸成分由于濾器中濾膜的吸附作用而被留在了濾膜上，液體成分 被濾過(guò)，從而完成了樣本中核酸成分的富集和清洗；用微量臨床樣本核酸快速提取裝置抽 取一定量的洗脫液，沖洗吸附在濾膜上的核酸成分，然后將液體推出，得到核酸溶液，從而 用于核酸擴(kuò)增。在使用微量臨床樣本核酸快速提取裝置提取樣本的整個(gè)過(guò)程中起到最關(guān)鍵作用 的是核酸提取裝置和濾膜，其中的濾膜對(duì)核酸有特異的吸附作用，然后洗脫，以達(dá)到分離， 凈化，提純的目的，因而保證少量或高價(jià)值樣本的最大回收量。通常情況下，裂解后的核酸提取需要在液相非均勻體系中，利用離心力來(lái)達(dá)到液 液分離，液固分離的效果，含有目的核酸的水溶液就會(huì)被分離出來(lái)。而采用本發(fā)明的微量 臨床樣本核酸快速提取裝置進(jìn)行核酸抽提時(shí)只要簡(jiǎn)單的撊匠槲馱就可以完成所有操作 搭懷閿用臨床樣本核酸快速提取裝置抽吸上述裂解后的生物樣本液體，樣本中的核酸成 分被吸附并富集于濾膜；核酸提取裝置中和抽吸裝置里的濾液是不含核酸成分的廢液；摱 閿繼續(xù)抽吸清洗液，從而完成清洗雜質(zhì)的目的；撊閿將吸附在濾膜上的核酸成分洗 脫，從而完成了生物樣本中核酸成分的提取。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的微量核酸快速提取裝置由發(fā)明人所設(shè)計(jì) 的核酸提取裝置和所購(gòu)的市售部件抽吸裝置組成，抽吸裝置為普通臨床用的一次性塑料注 射器一次性醫(yī)用注射器，如附圖5。在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方案中，所述的微量核酸快速提取裝置的抽吸裝置采用 積壓后可以抽吸液體的塑料泡，如附圖6。發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的突出的有益效果是在處理生物樣本的過(guò)程中取代了高轉(zhuǎn)速離心機(jī)，利用 微量臨床樣本核酸快速提取裝置就可以在液相非均勻體系中達(dá)到分離的效果。微量臨床樣 本核酸快速提取裝置成本低廉，操作簡(jiǎn)單同時(shí)又不需要任何特殊儀器，操作時(shí)間(不包括 樣本預(yù)處理和裂解時(shí)間)極短，只需要幾分鐘，因而本發(fā)明可以被廣泛地應(yīng)用于一些實(shí)驗(yàn) 條件相對(duì)較差的基層醫(yī)院和經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)或國(guó)家；同時(shí)，也可以很好地滿(mǎn)足高層次醫(yī)院 的需求，特別是急診室和床邊的核酸快速診斷。本發(fā)明的方法可以作為核酸擴(kuò)增前對(duì)生物樣本進(jìn)行核酸提取的一種無(wú)儀器、簡(jiǎn)捷 手段，提取出的樣本純度足夠符合下一步核酸擴(kuò)增的要求，同時(shí)不需要任何儀器、操作安全 和簡(jiǎn)單、一次性使用，因而可以被廣泛地應(yīng)用于病原體或宿主核酸提取，用于臨床檢測(cè)和診 斷。
下表是微量臨床樣本核酸快速提取裝置與離心機(jī)處理技術(shù)對(duì)生物樣本處理時(shí)各 種性能的比較表2 離心機(jī)與微量臨床樣本核酸快速提取裝置性能比較比較項(xiàng)目離心機(jī)處理微量臨床樣本核酸快速提取裝置液固分離能能操作時(shí)間長(zhǎng)，約加-90分鐘短，約5分鐘完成通量大，根據(jù)離心機(jī)性能不等小，每次只能完成一個(gè)樣本操作復(fù)雜性低極低對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求較高極低(無(wú)儀器要求)


圖1是無(wú)儀器微量核酸提取裝置的示意圖，其中1為管狀主體，2為接頭，3為插 頭，4為濾芯裝置；圖2是無(wú)儀器微量核酸提取裝置-I的示意圖，其中1為管狀主體，2為接頭，3為 插頭，4為濾芯裝置；圖3是無(wú)儀器微量核酸提取裝置的濾芯裝置4的示意圖；圖4是無(wú)儀器微量核酸提取裝置的濾芯裝置4的俯視圖；圖5是無(wú)儀器微量核酸提取裝置-II的結(jié)構(gòu)示意圖，其中采用注射器為抽吸裝 置；圖6是無(wú)儀器微量核酸提取裝置-III的結(jié)構(gòu)示意圖，其中采用塑料泡為抽吸裝 置；圖7是實(shí)施例1得到的結(jié)核桿菌(TB)DNA擴(kuò)增核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果；圖8是實(shí)施例2得到的沙眼衣原體(CT)DNA擴(kuò)增核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果；圖9是實(shí)施例3得到的丙型肝炎病毒(HCV) RNA擴(kuò)增核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果；圖10是實(shí)施例4得到的犬細(xì)小病毒(CPV)DNA擴(kuò)增核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)地闡述本發(fā)明
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的具體實(shí)施方式
僅對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋和說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容 進(jìn)行限制。實(shí)施例1痰液處理及肺結(jié)核桿菌DNA的提取1.痰液液化取結(jié)核桿菌(TB)待檢者的痰液，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，加入1倍體積的氫氧化鈉 痰液液化液充分震蕩混勻，95°C -100°C加熱10分鐘，冷卻至室溫；2.裂解
取Iml液化后的痰液，加入等量的裂解液；混勻后室溫靜置5分鐘；利用微量臨床 樣本核酸快速提取裝置吸取上述混合液，將抽吸裝置中的濾液推出棄掉；3.清洗利用微量臨床樣本核酸快速提取裝置在裝有清洗液的離心管里抽吸后，將抽吸裝 置中的濾液推出棄掉；4. DNA 洗脫繼續(xù)使用微量臨床樣本核酸快速提取裝置抽吸IOOul洗脫液，把抽吸裝置中的液 體推出至一新的離心管中，備用。5.核酸擴(kuò)增應(yīng)用TB恒溫?cái)U(kuò)增試劑，擴(kuò)增提取出的TB DNA,具體反應(yīng)如下TB擴(kuò)增反應(yīng)液 10微升提取DNA溶液 5微升ddH205 微升總體積為20微升反應(yīng)溫度及時(shí)間63°C，60分鐘6.結(jié)果檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如附圖7。從附圖7的結(jié)果可以看出，結(jié)核桿菌鏡檢結(jié)果陽(yáng)性樣本經(jīng)擴(kuò)增后核酸試紙條檢測(cè) 結(jié)果均為陽(yáng)性。注4+、3+、2+、1+結(jié)核桿菌鏡檢結(jié)果均呈陽(yáng)性。P為陽(yáng)性對(duì)照；N為陰性對(duì)照。實(shí)施例2性傳播疾病樣本(棉拭子)的處理及病原體DNA的提取1.洗脫取性病衣原體(CT)待檢患者的棉拭子樣本，在其樣本采集管中加入Iml生理鹽 水，振蕩混勻，確保棉拭子上分泌物被充分洗脫；2.裂解在上述洗脫液中加入等量的裂解液；混勻后室溫靜置5分鐘；利用微量臨床樣本 核酸快速提取裝置吸取上述混合液，將抽吸裝置中的濾液推出棄掉；3.清洗利用微量臨床樣本核酸快速提取裝置在裝有清洗液的離心管里抽吸后，將抽吸裝 置中的濾液推出棄掉；4. DNA 洗脫繼續(xù)使用微量臨床樣本核酸快速提取裝置抽吸IOOul洗脫液，把抽吸裝置中的液 體推至一新的離心管中，備用。5.核酸擴(kuò)增應(yīng)用CT PCR擴(kuò)增試劑，分別擴(kuò)增提取出的DNA，具體反應(yīng)如下CT擴(kuò)增反應(yīng)液 10微升提取DNA溶液 4微升ddH206 微升總體積為20微升
反應(yīng)程序95 °C，5分鐘94°C，10 秒58°C，10 秒 ？ 0 循環(huán)72°C，20 秒72°C，5 分鐘95°C，5 分鐘6.結(jié)果檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如附圖8。從附圖8的結(jié)果可以看出，不同病原體拷貝數(shù)的樣本經(jīng)過(guò)微量臨床樣本核酸快速 提取裝置處理后，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。注106拷貝/ml、105拷貝/ml、104拷貝/ml分別為處理樣本的病原體的實(shí)際拷貝 數(shù)；P為陽(yáng)性對(duì)照；N為陰性對(duì)照。實(shí)施例3血清樣本處理及丙型肝炎病毒(HCV) RNA的提取1.裂解取HCV血清樣本200ul (凍存血清使用前在室溫融解，振蕩混勻10秒鐘)，加入等 量裂解液，充分混勻，室溫靜置5分鐘；利用微量臨床樣本核酸快速提取裝置吸取上述混合 液，將抽吸裝置中的濾液推出棄掉；2.清洗利用微量臨床樣本核酸快速提取裝置在裝有清洗液的離心管里抽吸后，將抽吸裝 置中的濾液推出棄掉；3. RNA 洗脫繼續(xù)使用微量臨床樣本核酸快速提取裝置抽吸IOOul洗脫液，把抽吸裝置中的液 體推至一新的離心管中，備用；4.核酸擴(kuò)增應(yīng)用RT-HCV恒溫?cái)U(kuò)增試劑，擴(kuò)增提取出的HCV RNA,具體反應(yīng)如下RT-HCV擴(kuò)增反應(yīng)液 14微升提取RNA溶液6微升總體積為20微升反應(yīng)溫度及時(shí)間60°C，120分鐘5.結(jié)果檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如附圖9。從附圖9的結(jié)果可以看 出，不同病原體拷貝數(shù)的樣本經(jīng)過(guò)微量臨床樣本核酸快速提取裝置處理后，檢測(cè)結(jié)果均為 陽(yáng)性。同時(shí)采用體液病毒RNA提取試劑盒處理同樣的血清標(biāo)本，進(jìn)行對(duì)照。注107拷貝/ml、IO6拷貝/ml、IO5拷貝/ml、IO4拷貝/ml分別為處理血清樣本中 病毒顆粒的實(shí)際拷貝數(shù)，P為陽(yáng)性對(duì)照；N為陰性對(duì)照。實(shí)施例4犬糞便樣本處理及犬細(xì)小病毒(CPV)DNA的提取1.洗脫取待檢犬(CPV)的肛門(mén)拭子，在其樣本采集管中加入Iml生理鹽水，振蕩混勻，確保棉拭子上糞便被充分洗脫；2.裂解在上述洗脫液中加入等量的裂解液；混勻后室溫靜置5分鐘；利用微量臨床樣本 核酸快速提取裝置吸取上述混合液，將抽吸裝置中的濾液經(jīng)尖口吸管推出棄掉；3.清洗利用微量臨床樣本核酸快速提取裝置在裝有清洗液的離心管里抽吸后，將抽吸裝 置中的濾液推出棄掉；4. DNA 洗脫繼續(xù)使用微量臨床樣本核酸快速提取裝置抽吸IOOul洗脫液，把抽吸裝置中的液 體推至一新的離心管中，備用。5.核酸擴(kuò)增應(yīng)用CPV擴(kuò)增試劑，擴(kuò)增提取的DNA，具體反應(yīng)如下CPV擴(kuò)增反應(yīng)液 10微升提取DNA溶液 2微升ddH208 微升總體積為20微升反應(yīng)程序63°C，30分鐘6.結(jié)果檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如附圖10。從附圖10結(jié)果可以看出，經(jīng)犬細(xì)小病毒抗體免疫試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性的樣本經(jīng)擴(kuò)增 后核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。注4+、3+分別為犬細(xì)小病毒抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果；P為陽(yáng)性對(duì)照；N 為陰性對(duì)照。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)儀器微量核酸提取裝置，其特征在于，所述的微量核酸提取裝置包括管狀主 體(1)，管狀主體一端設(shè)有用于與抽吸裝置連接的接頭O)，另一端為插頭(3)，用于與核酸 結(jié)合的濾芯裝置(4)安裝于管狀主體或插頭內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量核酸提取裝置，其特征在于，所述的管狀主體與插頭為 一體或由管狀主體與插頭兩個(gè)部件連接而成，其中，所述插頭為錐狀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量核酸提取裝置，其特征在于，所述的濾芯裝置4包括一個(gè) 與管狀主體或插頭內(nèi)壁相適應(yīng)的中空的套筒和設(shè)置在套筒內(nèi)部的濾膜，套筒兩端為設(shè)置有 擋板(5)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量核酸提取裝置，其特征在于，所述的濾芯裝置的擋板(5) 位于底面的中心，擋板面積大于插頭下孔的面積。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量核酸提取裝置，其特征在于，所述的濾芯裝置位于插頭 端到管狀主體總長(zhǎng)的1/2處，優(yōu)選靠近插頭端的管狀主體總長(zhǎng)的1/4處到1/2處。
6.一種無(wú)儀器微量核酸提取的提取方法，其特征在于，(1)裂解將待測(cè)樣本加入裂解液，混勻；(2)吸附將權(quán)利要求1 5所述的微量核酸提取裝置與加壓減壓裝置連接，抽吸待測(cè) 樣本，待測(cè)樣本中的核酸成分吸附在濾膜上，棄去濾液；(3)清洗用微量核酸提取裝置抽吸清洗液，清洗濾膜，棄去濾液；(4)洗脫用微量核酸提取裝置抽吸洗脫液，洗脫液流經(jīng)濾膜將吸附在膜上的核酸成 分洗脫，得到核酸水溶液；(5)核酸擴(kuò)增。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微量核酸的提取方法，其特征在于，所述的裂解液選自異硫 氰酸胍、鹽酸胍或肌酸胍。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微量核酸的提取方法，其特征在于，所述的裂解液的濃度為 2 6mol/L，裂解液與待測(cè)樣本的體積比為1 5 1，優(yōu)選為1 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微量核酸的提取方法，其特征在于，所述的清洗液為pH為 4 8的Tris緩沖液，洗脫液為pH為7 10的10mmol/L的Tris-HCl溶液。
10.一種無(wú)儀器提取微量核酸的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1 5 所述的微核酸提取裝置、抽吸裝置、細(xì)胞裂解液、清洗液及洗脫液。
11.權(quán)利要求10所述的無(wú)儀器提取微量核酸的試劑盒在傳染病病原體、宿主或病原體 基因突變和單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無(wú)儀器微量核酸提取裝置及微量核酸的提取方法。本發(fā)明的微量核酸提取裝置包括管狀主體1，管狀主體一端設(shè)有用于與抽吸裝置連接的接頭2，另一端為插頭3，用于與核酸結(jié)合的濾芯裝置4安裝于管狀主體或插頭內(nèi)。本發(fā)明的微量核酸提取裝置取代了高轉(zhuǎn)速離心機(jī)，可在液相非均勻體系中達(dá)到良好的分離效果，并且成本低廉，操作簡(jiǎn)單，操作時(shí)間短，可廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)較差的基層醫(yī)院和急診室的核酸快速診斷。本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法作為提取生物樣本核酸的一種簡(jiǎn)捷手段，提取的樣本純度符合核酸擴(kuò)增的要求，不需要其他儀器并且一次性使用，可廣泛應(yīng)用于病原體或宿主核酸提取，用于臨床檢測(cè)和診斷。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102041255SQ20091030843
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者尤其敏, 徐高連, 王宏瑩, 石堅(jiān), 祁軍, 胡林, 賈子冬, 鐘華燕 申請(qǐng)人:杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司