專利名稱：一種基于時(shí)間分辨熒光法和dna雜交的大腸埃希氏菌檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種基于時(shí)間分辨熒光法和DNA雜交的大腸埃希 氏菌的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
大腸埃希氏菌(E. coli)通常稱為大腸桿菌，是Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的，在相當(dāng)長的 一段時(shí)間內(nèi)一直被認(rèn)為是一種普通的原核微生物，是人類和大多數(shù)溫血?jiǎng)游锬c道中的正常菌 群即非致病菌。直到20世紀(jì)中葉，才認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性 ，常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。自1982年在美國首先發(fā)現(xiàn)以來，包括我國等許多國家都有報(bào)道 ，且日見增加。日本在1996年因食物污染該菌而導(dǎo)致數(shù)起大暴發(fā)事件格外引人注目。在美國 和加拿大通常分離的腸道致病菌中，它已排在前三位。目前，大腸埃希氏菌被定為指示水體 被糞便污染的一個(gè)指標(biāo)，是致病菌污染水體的間接指標(biāo)。因此，對(duì)大腸埃希氏菌的快速、準(zhǔn) 確檢驗(yàn)與鑒定是控制細(xì)菌性疾病發(fā)生及疾病診斷與治療的重要手段。
現(xiàn)有的大腸埃希氏菌檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法及生化鑒定、免疫學(xué)方法，這些 方法存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、檢測(cè)效率低等缺點(diǎn)；熒光原位雜交法(FISH， fluorescence in site hybridization)對(duì)于環(huán)境中常見的病原微生物的檢測(cè)來說，是應(yīng)用廣泛、最為有 效的技術(shù)之一，但FISH法中熒光探針易受生物體系內(nèi)源熒光背景和固定微生物基質(zhì)背景的干 擾，且靈敏度受到限制；基因芯片技術(shù)是近幾年來迅速發(fā)展起來的新技術(shù)，對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)具 有快速、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)勢(shì)，但其高昂的設(shè)備費(fèi)用以及運(yùn)行成本對(duì)于多數(shù)檢測(cè)機(jī)構(gòu)難以承擔(dān) ，其通用性受到極大制約。因此，如何采用更好的方法或較為簡(jiǎn)單的儀器進(jìn)行高靈敏度檢測(cè) 是目前對(duì)大腸埃希氏菌檢測(cè)研究的熱門課題。
將具有長壽命發(fā)光性能的熒光物質(zhì)與生物探針技術(shù)相結(jié)合，利用時(shí)間分辨的方法可有效 消除樣品中熒光背景和固體基質(zhì)背景熒光的干擾，能夠有效提高檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明將以 噻吩甲酰三氟丙酮(TTA) 、 5-氨基-l， 10-鄰菲啰啉(NH2-phen)為配體的長壽命熒光稀土 銪配合物Eu(TTA)3phen作為標(biāo)識(shí)DNA探針的熒光物質(zhì)，采用捕獲探針和識(shí)別探針串聯(lián)與目標(biāo) 特異性DNA片段形成雜交體系的檢測(cè)技術(shù)，初步建立了對(duì)大腸埃希氏菌檢測(cè)的一種通用性好 、高靈敏度和精確度的檢驗(yàn)方法，為發(fā)展新型的長壽命熒光生物傳感器，構(gòu)建高靈敏度、高 選擇性的長壽命熒光生物傳感新技術(shù)，應(yīng)用于環(huán)境中微生物等檢測(cè)有重要的理論意義與應(yīng)用
4價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于環(huán)境中大腸埃希氏菌的檢測(cè)新方法。其用時(shí)短，反應(yīng)結(jié)果 直觀、靈敏、準(zhǔn)確。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。 基于時(shí)間分辨熒光法和DNA雜交的大腸埃希氏菌檢測(cè)方法如下
A、 捕獲探針DNA^勺固定
先將玻片醛基化，再將堿基序列為5' -ACA TTG ACG CAG GTG ATC GGA CG TTTTTTTTTT-3' -^12的捕獲探針0魁1配成使用濃度5 y g/mL，取40 y LDNA^商加到已醛基化的玻 片表面，室溫反應(yīng)3 h;最后洗滌并封閉剩余的醛基；
B、 稀土銪配合物標(biāo)記識(shí)別探針DNA2
(1) 將2mg稀土銪配合物Eu(TTA)3(NH2-phen)分散到5mL 2. 5%戊二醛溶液中，室溫下劇 烈震蕩5h，離心后用二次蒸餾水洗3次，得到醛基修飾的Eu(TTA)3phen顆粒重新懸于4mL pH 為7. 2的PBS溶液中；
(2) 再將堿基序列為NH2-5'- TTTTTTTTTT GTA TCG GTG TGA GCG TCG CAG AA-3'的識(shí) 別探針DNA2配成使用濃度15yg/mL，加入到稀土銪配合物顆粒懸浮的PBS溶液中，3(TC下于 震蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)5 h，反應(yīng)完成后離心洗滌；再分散于2 mL PBS緩沖液中備用；
C、 提取大腸埃希氏菌DNA
D、 雜交
(1) 在雜交反應(yīng)前，將提取的大腸埃希氏菌基因組DNA通過高溫解鏈?zhǔn)蛊渥冃猿蔀閱捂?br> (2) 將標(biāo)記上稀土銪配合物的識(shí)別探針DNA2與提取的待測(cè)單鏈DNA在固定了DNA工的玻片 上雜交10h;雜交體系為10uL提取的變性單鏈DNA溶液，10uL標(biāo)記了稀土銪配合物的 DNA2溶液，10yL12XSSC溶液；保持雜交溫度為43i:;
(3) 雜交后，將玻片依次在以下三種洗滌液中清洗，洗滌液I IXSSC/O.03% SDS、洗 液II 0. 2XSSC和洗液m 0. 05XSSC，洗滌時(shí)間均為2min，洗滌溫度為43。C;
E、 雜交后信號(hào)檢測(cè)
雜交清洗后帶有稀土銪配合物標(biāo)記的識(shí)別DNA2、捕獲DNA^n提取的待測(cè)單鏈DNA探針形 成的雜交體，在激光激發(fā)下產(chǎn)生一個(gè)光信號(hào)，檢測(cè)出玻片上的稀土長壽命發(fā)光配合物的光信 號(hào)，激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為8. Onm，延遲時(shí)間O. lms，門時(shí)間1.0ms;根據(jù)檢測(cè)的光信號(hào)檢測(cè)樣品中是否存在大腸埃希氏菌DNA。
所述的A步中洗滌和封閉剩余的醛基過程如下
(1) 用0.2y。的SDS洗滌2次玻片，二次蒸餾水洗滌2次，室溫晾干；
(2) 將O. 1 M甘氨酸封閉玻片上剩余的醛基，作用時(shí)間為l h;
(3) 0.2y。的SDS洗滌2次玻片，二次蒸餾水洗滌2次，室溫晾干備用。 本發(fā)明的有益效果
1、 本發(fā)明中使用的探針是從大腸埃希氏菌的16SrRNA的保守區(qū)域中篩選，再通過 GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對(duì)得到的特異性片段目標(biāo)DNA序列，與目標(biāo)序列互補(bǔ)的另一條DNA 序列經(jīng)過Primer Premier 5軟件分析將其切斷為兩段，分段的依據(jù)是兩段的Tm值大體一致。 其中一段作為捕獲探針DNAh另一段作為識(shí)別探針DNA2，捕獲探針DNA工固定標(biāo)記在玻璃片上 ;識(shí)別探針DNA2聯(lián)接長壽命發(fā)光稀土配合物。其中DNA^勺3'端與DNA2的5'端連接10個(gè)T，減 少探針與連接物間的位阻，使DNA!與DNA2串聯(lián)時(shí)能夠與目標(biāo)DNA (即待測(cè)生物的DNA )更加 有效的發(fā)生堿基互補(bǔ)的雜交反應(yīng)。將雜交反應(yīng)中非特異性吸附排除，得到可信的熒光信號(hào)， 對(duì)大腸埃希氏菌進(jìn)行定性和定量的檢驗(yàn)。
2、 首次將提取的原始基因組DNA直接用于本發(fā)明模型的雜交反應(yīng)，解決了微生物檢測(cè)中 遇到的實(shí)際問題，該DNA在雜交過程中為長鏈雜交形式，為基于時(shí)間分辨熒光法和DNA雜交方 法的實(shí)踐應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，提取的DNA無需純化和PC財(cái)廣增等步驟，降低了DNA 降解的幾率，減少實(shí)驗(yàn)中引進(jìn)的污染物，這幾點(diǎn)都大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程。
3、 已有技術(shù)中是應(yīng)用稀土銪配合物制成的納米顆粒標(biāo)記DNA，本發(fā)明直接運(yùn)用稀土銪配 合物單分子標(biāo)記在DNA上，完全能滿足熒光檢測(cè)的需要，而且還能省去制備納米顆粒的繁瑣 過程，節(jié)約了成本，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟。
4、 雜交反應(yīng)時(shí)間和洗滌時(shí)間是雜交反應(yīng)的重要影響因素，反應(yīng)的質(zhì)量和效率直接關(guān)系 到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明通過嚴(yán)格控制雜交條件與洗滌條件等措施，尤其是在雜交和洗 滌時(shí)間上做了大量的工作。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，最終摸索出一套適合于大腸埃希氏菌雜交檢測(cè)的 最佳條件。
5、 首次將捕獲探針DNA工與識(shí)別探針DNA2串聯(lián)形式，與目標(biāo)DNA堿基序列的互補(bǔ)雜交方式 應(yīng)用到大腸埃希氏菌的檢測(cè)，大大提高了雜交反應(yīng)的特異性，其檢測(cè)方法用時(shí)短，傳統(tǒng)的菌 落總數(shù)測(cè)定方法需要24小時(shí)以上才能得到結(jié)果，本發(fā)明得到檢測(cè)結(jié)果只需要12小時(shí)，而且反 應(yīng)靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確，能夠很直觀的得到檢測(cè)結(jié)果，具有十分顯著的優(yōu)點(diǎn)。
6、 運(yùn)用普通玻片作為雜交反應(yīng)的載體，長壽命發(fā)光的稀土銪配合物作為雜交反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)物，實(shí)現(xiàn)了固-液-固體系的化學(xué)反應(yīng)，能有效地將雜交信號(hào)與非雜交信號(hào)進(jìn)行分離。 7、將長壽命發(fā)光的稀土銪配合物作為雜交反應(yīng)的標(biāo)記物，利用時(shí)間分辨熒光的方法能 有效消除生物體內(nèi)源熒光背景和固體基質(zhì)背景熒光的干擾，增強(qiáng)了熒光信號(hào)強(qiáng)度，提高了檢 測(cè)的靈敏度。


圖l為不同雜交時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響； 圖2為不同洗滌時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；
圖3為景觀水中大腸埃希氏菌樣品在玻片上檢測(cè)到的時(shí)間分辨熒光的光譜圖(延遲時(shí)間 0. 1 ms，門時(shí)間1. 0 ms)。
圖中l(wèi)為檢測(cè)景觀水樣品的信號(hào)強(qiáng)度，2為空白對(duì)照的信號(hào)強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式
以下旨在說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步限定，本發(fā)明可以按發(fā)明內(nèi)容所述任一方式 實(shí)施。
一、捕獲探針和識(shí)別探針的設(shè)計(jì)
本發(fā)明DNA探針序列根據(jù)已公開專利(姚志建，于勇，馬立人等，檢測(cè)多種常見細(xì)菌病 原體的基因芯片、制備方法、試劑盒，中國專利，
公開日2007年10月3日，
發(fā)明者慧 何, 曾光明, 牛承崗, 王曉鈺, 秦品珠, 敏 阮, 兢 黃 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)