專利名稱：熒光毛細反應裝置及熒光毛細分析法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種熒光毛細反應裝置及熒光毛細分析法(FCA)，屬于生化分析和定量技術領域。本發(fā)明適用于醫(yī)學、藥物、食品、衛(wèi)生、工業(yè)、農(nóng)林、環(huán)境等微量樣品中各種微量組分的熒光分析。
背景技術：
許多物質(zhì)當吸收了紫外光和可見光譜區(qū)的輻射時，其電子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當激發(fā)態(tài)的電子在返回到基態(tài)時，一部分能量以熱輻射的形式放出，而另一部分則以光的形式放出，這種光稱為熒光。利用熒光對未知樣品進行化學分析的方法稱為熒光分析法。
熒光分析法選擇性好，靈敏度高，比普通的分光光度法高103倍以上；能夠產(chǎn)生熒光的化合物或通過一些化學反應能夠間接生成熒光化合物的物質(zhì)，均可采用熒光分析法進行定性或定量分析。熒光分析法已廣泛應用于化學、化工、生物、醫(yī)藥、食品、衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、輕工、冶金、地質(zhì)以及環(huán)境保護等各個領域。用熒光分析法鑒別和定量有機物、無機物、生物物質(zhì)、醫(yī)農(nóng)藥物、污染毒物等的種類和數(shù)量與日劇增，是目前一種重要且有效的光譜化學分析手段。
常規(guī)的熒光分析法是利用試液槽進行測定。具體測定時，如圖1所示，是將被測液(S)移入試液槽(SC)，再將此試液槽(SC)置于熒光儀暗室內(nèi)(BC)的光路中。由光源(Lamp)發(fā)出的光，經(jīng)激發(fā)光單色器(ExMC)后，穿過試液槽(SC)，使被測液(S)的熒光物質(zhì)受激發(fā)產(chǎn)生熒光；與入射光方向垂直的熒光，經(jīng)過熒光單色器(EmMC)，到達熒光檢測器(PMT)被檢出；最后，根據(jù)熒光強度定量樣品濃度?，F(xiàn)有技術存在的主要問題是a).常規(guī)熒光分析法使用的試液槽，每次被測液用量需4mL左右，這樣不但浪費大量的貴重試劑，而且實驗成本高，廢液多，造成排廢污染，很難實現(xiàn)微量樣品分析。
b).使用試液槽時，激發(fā)光通過長吸收液層產(chǎn)生自吸收，常導致長波位移，即在藍區(qū)內(nèi)所產(chǎn)生的黃色熒光再吸收而引起的熒光作用。
c).由于試液槽的液層厚，發(fā)光物質(zhì)分子間的碰撞機率大，當熒光物質(zhì)濃度較大時，常產(chǎn)生熒光自猝滅現(xiàn)象。
d).使用試液槽，只能進行液態(tài)酶熒光分析，無法實現(xiàn)固定化酶熒光分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對常規(guī)熒光分析中所存在的缺陷，開發(fā)一種熒光毛細反應裝置及熒光毛細分析法(FCA)，從而解決了現(xiàn)有技術中所存在的主要問題。
本發(fā)明的基本思想是采用熒光毛細反應裝置替代常規(guī)的試液槽，顯著降低了每次被測液用量，能節(jié)約大量貴重試劑，實驗成本降低；而且廢液量排放顯著減少；實現(xiàn)微量樣品的微量分析；消除了激發(fā)光通過常規(guī)熒光分析中試液槽的長吸收層所產(chǎn)生的自吸收；毛細管的徑向液層很薄，發(fā)光物質(zhì)分子間的碰撞機率降低，即使熒光物質(zhì)濃度較大時，熒光自猝滅現(xiàn)象也能顯著減輕；毛細管垂直于光路中，在激發(fā)光斑的幾何尺寸范圍內(nèi)，在毛細管縱向上可以盡最大可能增加受光面積，增加被測液的被照射機會，增加熒光產(chǎn)率，增加分析測定的靈敏度；毛細管內(nèi)壁固定不同用途的各種化學試劑、酶制劑、或DNA探針，能形成各種專用的微型熒光毛細生物反應器、微型熒光生物傳感器，或制成各種專用的熒光毛細測試盒。用熒光毛細反應裝置替代常規(guī)試液槽，形成熒光毛細分析法(FCA)，可用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、工業(yè)、食品和環(huán)境等樣品中的各種組分測定。
本發(fā)明的技術方案是由測定原理、熒光毛細反應裝置及熒光毛細分析法(FCA)組成。
本發(fā)明的測定原理被測液產(chǎn)生的熒光強度和濃度的關系，可以根據(jù)比爾定律推導得出。當一束激發(fā)光從一個含有被測液的常規(guī)試液槽穿過時，其透射光的強度I可以表達為I＝I0e-εbc(1)式中，ε為摩爾吸光系數(shù)；εbc為吸光度；I0為入射光強度。被吸收的光強度可表示為I0-I＝I0(1-e-εbc)(2)從理論上講，被測液發(fā)射的熒光強度IF與吸收掉的激發(fā)光強度(I0-I)、熒光效率、激發(fā)光在試液槽光窗上的照射面積p成比例，即IF＝k(I0-I)p·＝kpI0(1-e-εbc)(3)式中k為系數(shù)，用于處理不同熒光分析儀器光路的幾何形狀所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。對公式(3)中的指數(shù)項冪級數(shù)展開，得下式 如果樣品液濃度很稀，被吸收的總激發(fā)光能不超過5％(即εbc≤0.05)時，公式(4)括號內(nèi)第二項以后可以忽略不計，則公式(4)可簡化成IF＝kpI0εbc (5)式中b為液層厚度；c為樣品液濃度。在實際測定時，kpI0εb為一常數(shù)，當被測液濃度很稀時，樣品液發(fā)射的熒光強度IF和其濃度c成正比。
但是，當樣品液濃度c最大＞0.05/εb時，熒光強度增加不大。從公式(3)中可以看出當c增大時，e-εbc變小，熒光強度IF增大；當樣品濃度繼續(xù)增大，e-εbc趨近于零，則公式(3)變成了IF＝kpI0，說明此時熒光強度與樣品液濃度無關。所以樣品濃度增大到某一限度后，熒光強度不再增加，甚至降低。這是因為，在較濃溶液中，試液槽前部的溶液強吸收，產(chǎn)生強熒光，后部的溶液不易接受入射光，不產(chǎn)生熒光，綜合因素導致熒光強度降低；另外，當樣品濃度較大時，試液槽前部的溶液所產(chǎn)生的熒光通過后部溶液時，短波長的熒光被自吸收，也導致熒光強度降低。
根據(jù)公式(3)可知，如果樣品濃度一定，使用常規(guī)的試液槽，其液層厚度b對熒光強度影響很大。當b增大時，e-εbc變小，當b繼續(xù)增大，e-εbc趨近于零，則式3變成IF＝kpI0，此時熒光強度與b無關。
從公式(5)可以看出如果IF、kpI0ε一定，b減少可以使樣品濃度c相應增大；因此，本發(fā)明采用毛細管作為反應容器，毛細管的徑向液層厚度b降到試液槽的1/10以下，所以，實現(xiàn)了在靈敏度不變的情況下使測定的線性范圍增大的目的。
另外，從公式(5)可以看出如果kpI0εbc一定，熒光強度IF將和激發(fā)光照射在試液槽光窗上的面積p成正比，即，p越大，樣品產(chǎn)生的熒光強度IF越大。本發(fā)明將毛細管反應器垂直置入光路中，增加受光面積，減少透光距離就是基于此考慮。這樣，激發(fā)光照射毛細管內(nèi)物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光可以均勻分布于溶液中，把自吸收、自熄滅因素降到最低。
本發(fā)明熒光毛細反應裝置如圖2所示，它包括固定座、固定座上的激發(fā)光入射窗、熒光發(fā)射窗、固定座頂部的毛細管插入孔和毛細管。使用時，用它替代常規(guī)熒光分析中的試液槽，將熒光毛細反應裝置置于熒光儀光路中。
本發(fā)明熒光毛細分析法(FCA)如圖3所示，先將熒光毛細反應裝置的固定座置于熒光分析儀的光路中。測定前，先設定好所需的單色激發(fā)光和熒光發(fā)射光波長之后，利用毛細現(xiàn)象將被測液即被測樣品、或被測樣品和試劑的混合液吸入到毛細管內(nèi)，再將含有被測液的毛細管插入固定座的插入孔內(nèi)。測定時，單色激發(fā)光從毛細管固定座的激發(fā)光入射窗進入，照射到固定座中的毛細管內(nèi)；毛細管內(nèi)的被測液或反應產(chǎn)物被激發(fā)光照射后產(chǎn)生特征熒光；此熒光從熒光發(fā)射窗射出，經(jīng)過熒光單色器到達熒光檢測器，熒光信號被檢出；最后根據(jù)熒光強度可定量毛細管內(nèi)被測樣品濃度。
本發(fā)明熒光毛細反應裝置中各組成部分結構特征如下本發(fā)明的關鍵部分是由固定座和毛細管組成的熒光毛細反應裝置，兩者是缺一不可。固定座是外形高28～40mm、邊長12～14mm的立方體，它也可以做成圓柱體、或三角形柱體。固定座所用的材質(zhì)為金屬、或非金屬；固定座的激發(fā)光入射窗和熒光發(fā)射窗分別設置在其相鄰的兩個側面；激發(fā)光入射窗和熒光發(fā)射窗的開口長為15～20mm、寬0.50～1.0mm；兩個光窗可以避免雜散光、折射光進入測定光路中。
毛細管插入孔設置在固定座頂部的中心位置，它可以為圓孔、或矩形孔，其尺寸以毛細管能插入并與毛細管尺寸相吻合，毛細管垂直置于毛細管插入孔，使毛細管與光路保持垂直。
毛細管的作用，既是被測液容器，又是微型反應容器；毛細管所用材質(zhì)為石英玻璃、光學玻璃、或透明塑料。毛細管的長度為30～50mm，內(nèi)徑為0.14～0.90mm，外徑為0.55～1.20mm，壁厚為0.10～0.25mm；毛細管可以是圓孔、或矩形孔；毛細管是矩形孔時，其邊長為0.25～0.45mm，壁厚為0.10～0.25mm。
毛細管內(nèi)壁固定不同用途的各種化學試劑、酶制劑、或DNA探針，可以形成各種專用的微型熒光毛細生物反應器、微型熒光生物傳感器，以及制成各種專用的熒光毛細測試盒。
熒光毛細反應裝置作為一個附件可直接用于目前已商品化的各種熒光分析儀，實施FCA法和相關的測定及研究。
本發(fā)明熒光毛細分析法(FCA)的特征如下本發(fā)明采用熒光毛細反應裝置替代常規(guī)熒光分析中的試液槽，將熒光毛細反應裝置置于熒光分析儀暗室內(nèi)的光路中，設定好所需的單色激發(fā)光和熒光發(fā)射光波長，利用毛細現(xiàn)象將被測樣品、或被測樣品與試劑的混合液吸入毛細管內(nèi)，再將此毛細管垂直插入固定座頂部的插入孔內(nèi)，來源于光源的單色激發(fā)光進入固定座側面的入射窗，照射到固定座中的毛細管內(nèi)，毛細管內(nèi)的被測樣品或反應產(chǎn)物被激發(fā)光照射后產(chǎn)生特征熒光；該特征熒光從固定座另一側面的發(fā)射窗射出，經(jīng)過熒光單色器到達熒光分析儀的檢測器，熒光信號被檢出；最后，根據(jù)檢測出的熒光強度即可定量被測樣品濃度。
常規(guī)熒光法的各種方法，如直接測定法、化學轉化法、熒光猝滅法、敏化發(fā)光法、時間分辨熒光分析法等，能形成直接測定FCA法、化學轉化FCA法、熒光猝滅FCA法、敏化發(fā)光FCA法、時間分辨熒光FCA法等。
基于FCA法，可派生出傳統(tǒng)熒光法中所沒有的新方法，如固定化酶FCA法(IEFCA)等。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是用熒光毛細反應裝置替代常規(guī)的熒光試液槽，形成了一種新的、具有很大潛力的化學分析領域。它可以完全繼承常規(guī)熒光法中的各種測定方法，如直接測定法、化學轉化法、熒光猝滅法、敏化發(fā)光法、時間分辨熒光分析法等；還能派生出傳統(tǒng)熒光法中所沒有的固定化酶FCA法(IEFCA)等。
a)使用本發(fā)明熒光毛細反應裝置，每次分析的被測液用量是常規(guī)熒光分析法的1/400，這樣不但節(jié)約了大量的貴重試劑，降低實驗成本，真正實現(xiàn)了微量樣品的微量分析，而且大大減少了排廢污染，在環(huán)保方面有著非常重要的意義。
b)本發(fā)明采用毛細管，可以消除常規(guī)熒光分析中激發(fā)光通過試液槽的長吸收液層時所產(chǎn)生的自吸收現(xiàn)象。
c)本發(fā)明毛細管內(nèi)的徑向液層厚度b很薄，使發(fā)光物質(zhì)分子間的碰撞機率降到使用試液槽時的1/10；所以，使用本發(fā)明毛細管時即使熒光物質(zhì)濃度較大，熒光自猝滅現(xiàn)象也能得到消除。
d)本發(fā)明采用毛細反應裝置替代常規(guī)熒光分析法的試液槽后，可以用于不透明試樣、渾濁溶液、濃溶液的測定。
e)本發(fā)明熒光毛細反應裝置可作為一個附件，直接用于目前已商品化的各種熒光光度分析儀。
f)本發(fā)明毛細管的內(nèi)壁還可以固定不同用途的各種化學試劑或酶制劑，形成各種專用的微型熒光毛細反應器、或微型生物傳感器，在此基礎上制成各種用途的專用熒光毛細測試盒，使熒光分析法真正進入實用化、普及化階段。
g)本發(fā)明派生的固定化酶FCA法，特別適用于試劑昂貴、樣品量少、濃度低的樣品測定；固定有酶或試劑的毛細管，即毛細生物反應器可以重復使用，用于批量樣品的測定；這樣不但使測定成本顯著降低，而且便于攜帶、保存，利于普及推廣，使酶熒光分析法真正進入實用化階段。
本發(fā)明可用于醫(yī)學、藥物、生物、食品、衛(wèi)生、工業(yè)、農(nóng)林、環(huán)境等樣品中各種組分含量的測定，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。


圖1常規(guī)熒光分析法系統(tǒng)示意中S被測液、Lamp光源、ExMC激發(fā)光單色器、SC被測液槽、EmMC熒光單色器、PMT熒光檢測器、BC暗室。
圖2本發(fā)明熒光毛細反應裝置結構示意中S被測液、1激發(fā)光、2入射窗、3熒光、4發(fā)射窗、5固定座、6插入孔、7毛細管。
圖3本發(fā)明熒光毛細分析法(FCA)系統(tǒng)示意中S被測液、1激發(fā)光、2入射窗、3熒光、4發(fā)射窗、5固定座、6插入孔、7毛細管、Lamp光源、ExMC激發(fā)光單色器、SC被測液槽、EmMC熒光單色器、PMT熒光檢測器、BC暗室。
圖4實施例1用FCA法測定核黃素濃度得到的標準曲線5實施例2用FCA法測定NADH濃度得到的標準曲線6實施例3用FCA法測定乙醇濃度得到的標準曲線7實施例4用FCA法測定EB濃度得到的標準曲線圖實施例結合附圖并用實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例1利用本發(fā)明對核黃素(VB2)標準溶液(S)濃度進行了測定。測定條件激發(fā)光波長500nm，發(fā)射光波長550nm，室溫20℃，樣品用量10μL。測定時，將熒光毛細反應裝置的固定座(5)置于熒光分析儀的光路中；用毛細管(7)分別吸入濃度為0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50μg/L的VB2標準溶液之后，將毛細管(7)分別插入固定座(5)頂部的插入孔(6)內(nèi)，測定其熒光強度，結果如圖4所示。VB2濃度與熒光強度在0.10-2.50μg/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性相關性。
實施例2本實施例是用本發(fā)明測定了還原型輔酶I(NADH)濃度。測定條件激發(fā)光波長352nm，發(fā)射光波長456nm，室溫20℃，樣品用量為10μL。測定時，將熒光毛細反應裝置的固定座(5)置于熒光分析儀的光路中；用毛細管(7)分別吸入濃度為50、100、150、200、250、350μmol/L的NADH標準溶液之后，將毛細管(7)分別插入固定座(5)頂部的插入孔(6)內(nèi)，測定其熒光強度，結果如圖5所示。NADH濃度與熒光強度在50-350μmol/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性相關性。用氧化型輔酶I、輔酶II(NAD+或NADP+)作為輔酶的脫氫酶反應，其最終生成物都是還原型輔酶I、輔酶II(NADH或NADPH)。因此，本發(fā)明根據(jù)NADH或NADPH的生成量或減少量，可以定量所有以NAD(H)+或NADP(H)+為輔酶的脫氫酶反應底物以及這些脫氫酶的活性。
實施例3本實施例是基于固定化酶FCA法測定乙醇濃度。測定條件激發(fā)光波長352nm，發(fā)射光波長456nm，室溫20℃，被測液用量10μL。測定前，將酶固定在毛細管(7)的內(nèi)壁，制成乙醇毛細生物反應器。測定時，將熒光毛細反應裝置的固定座(5)置于熒光分析儀的光路中；用乙醇毛細生物反應器分別吸入濃度為2、4、8、10、15g/L的乙醇標準液和反應試劑的混合液之后，將其分別插入固定座(5)的插入孔(6)內(nèi)，測定其熒光強度，結果如圖6所示。乙醇濃度和熒光強度在2.0-15.0g/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性相關性。由此證明，本發(fā)明可派生出傳統(tǒng)熒光法中所沒有的固定化酶熒光光度分析法。
在本實施例中，同一毛細生物反應器能達到重復使用的目的，顯著地降低了測定成本。
實施例4本實施例是用本發(fā)明測定溴化乙啶(EB)濃度。測定條件激發(fā)光波長526.4nm，發(fā)射光波長584nm，室溫20℃；測定前，將熒光毛細反應裝置的固定座(5)置于熒光分析儀的光路中；用毛細管(7)分別吸入濃度為60、200、300、400、500μg/L的EB標準溶液之后，將其分別插入固定座(5)的插入孔(6)內(nèi)，測定其熒光強度，結果如圖7所示。結果表明，EB濃度和熒光強度在60-500μg/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性相關性。EB對雙鏈DNA的選擇性遠大于單鏈DNA，常作為雙鏈DNA的嵌入型熒光染料，因此，本發(fā)明也可用于被EB標記物(DNA及細胞)的定量、定性測定。
權利要求
1.一種熒光毛細反應裝置，其特征在于它包括固定座(5)、固定座(5)上的激發(fā)光入射窗(2)、熒光發(fā)射窗(4)、固定座頂部的毛細管插入孔(6)和毛細管(7)。
2.按照權利要求1所述的裝置實現(xiàn)的熒光毛細分析法(FCA)，其特征在于采用熒光毛細反應裝置替代常規(guī)熒光分析中的試液槽(SC)，將熒光毛細反應裝置置于熒光分析儀暗室(BC)內(nèi)的光路中，設定好所需的單色激發(fā)光(1)和熒光發(fā)射光(3)波長，利用毛細現(xiàn)象將被測樣品、或被測樣品與試劑的混合液吸入毛細管(7)內(nèi)，再將此毛細管(7)垂直插入固定座(5)頂部的插入孔(6)內(nèi)，來源于光源(Lamp)的單色激發(fā)光(1)經(jīng)激發(fā)光單色器(ExMC)進入固定座(5)側面的入射窗(2)，照射到固定座(5)中的毛細管(7)內(nèi)，毛細管(7)內(nèi)的被測樣品或反應產(chǎn)物被激發(fā)光照射后產(chǎn)生特征熒光；該特征熒光從固定座另一側面的發(fā)射窗(4)射出，經(jīng)過熒光單色器(EmMC)到達熒光分析儀的檢測器(PMT)，熒光信號被檢出；最后，根據(jù)檢測出的熒光強度即可定量被測樣品濃度。
3.按照權利要求1所述的裝置，其特征在于固定座是外形高28～40mm、邊長12～14mm的立方體，它也可以做成圓柱體、或三角形柱體；固定座(5)所用的材質(zhì)為金屬、或非金屬。
4.按照權利要求1所述的裝置，其特征在于固定座(5)上的激發(fā)光入射窗(2)和熒光發(fā)射窗(4)分別設置在固定座上相鄰的兩個側面；激發(fā)光入射窗(2)和熒光發(fā)射窗(4)的開口長為15～20mm、寬0.50～1.0mm。
5.按照權利要求1所述的裝置，其特征在于毛細管插入孔(6)設置在固定座頂部的中心位置，它可以為圓孔、或矩形孔，其尺寸以毛細管能插入并與毛細管尺寸相吻合，毛細管(7)垂直置于毛細管插入孔，使毛細管與光路保持垂直。
6.按照權利要求1所述的裝置，其特征在于毛細管(7)所用材質(zhì)為石英玻璃、光學玻璃、或透明塑料。
7.按照權利要求1所述的裝置，其特征在于毛細管(7)的長度為30～50mm，內(nèi)徑為0.14～0.90mm，外徑為0.55～1.20mm，壁厚為0.10～0.25mm；毛細管(7)可以是圓孔、或矩形孔；毛細管(7)是矩形孔時，其邊長為0.25～0.45mm，壁厚為0.10～0.25mm。
8.按照權利要求1所述的熒光毛細反應裝置，其特征在于它作為一個附件可直接用于目前已商品化的各種熒光分析儀，實施FCA法和相關的測定及研究。
9.按照權利要求2所述的FCA法，其特征在于毛細管(7)內(nèi)壁固定不同用途的各種化學試劑、酶制劑、或DNA探針，可以形成各種專用的微型熒光毛細生物反應器、微型熒光生物傳感器，以及制成各種專用的熒光毛細測試盒。
10.按照權利要求2所述的FCA法，其特征在于常規(guī)熒光法的各種方法，如直接測定法、化學轉化法、熒光猝滅法、敏化發(fā)光法、時間分辨熒光分析法等，能形成直接測定FCA法、化學轉化FCA法、熒光猝滅FCA法、敏化發(fā)光FCA法、時間分辨熒光FCA法等。
11.按照權利要求2所述的FCA法，其特征在于基于FCA法，可派生出常規(guī)熒光法中所沒有的新方法，如固定化酶FCA法(IEFCA)等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熒光毛細反應裝置及熒光毛細分析法(FCA)。該裝置包括固定座、毛細管插入孔、激發(fā)光入射窗、熒光發(fā)射窗和毛細管；用該裝置實施FCA法，將固定座置于熒光儀光路中，再將毛細管吸入被測液后插進固定座頂部的毛細管插入孔內(nèi)，激發(fā)光穿過固定座入射窗照射到毛細管內(nèi)，被測液受激產(chǎn)生熒光，從固定座發(fā)射窗射出，經(jīng)單色器到達檢測器被檢出。本發(fā)明用熒光毛細反應裝置替代常規(guī)試液槽，形成FCA法，能顯著降低被測液用量，節(jié)約貴重試劑，減少排廢；毛細管內(nèi)壁固定不同的化學試劑、酶制劑或DNA探針，能形成專用的毛細生物反應器、熒光毛細測試盒。本發(fā)明適用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、工業(yè)、食品和環(huán)境等樣品中各種組分濃度的測定。
文檔編號G01N21/01GK1737538SQ20051002154
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月26日 優(yōu)先權日2005年8月26日
發(fā)明者李永生, 高秀峰 申請人:四川大學