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通過毛細(xì)管電泳法分析試樣的方法

文檔序號:5831652閱讀:494來源:國知局
專利名稱:通過毛細(xì)管電泳法分析試樣的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及通過毛細(xì)管電泳法分析試樣的方法,用于該方 法的毛細(xì)管和毛細(xì)管電泳裝置。
背景技術(shù)
在毛細(xì)管電泳法中,集中在毛細(xì)管內(nèi)壁的離子通過施加的 電壓移動而產(chǎn)生電滲流,由此試樣移動而進(jìn)^亍電泳。作為毛細(xì) 管,使用熔融二氧化硅制的毛細(xì)管,有時(shí)會存在由于試樣吸附 而無法獲得良好的電滲流。因此,提出了覆蓋毛細(xì)管內(nèi)壁的技
術(shù)(專利文獻(xiàn)l、 2、 3、 4)。另一方面,血液中的血紅蛋白(Hb ) 與血液中的葡萄糖反應(yīng),形成糖化Hb。血液中的糖化Hb由于反 映了生物體血糖值的以往歷程,因此作為糖尿病診斷和治療等 中的指標(biāo),其中,P鏈N末端的纈氨酸糖化的物質(zhì)被稱為血紅蛋 白Alc(HbAlc),作為特別重要的指標(biāo),在臨床檢查等中其對 進(jìn)行測定。血液中的血紅蛋白的測定方法有例如瓊脂糖電泳法、 毛細(xì)管電泳法、HPLC法、免疫法、酶法等。這些當(dāng)中,能檢測 出血紅蛋白遺傳變異等微小變異的是毛細(xì)管電泳法和HPLC法。 另一方面,對于血紅蛋白的分析裝置,要求小型化。對于這一 點(diǎn),HPLC法難以實(shí)現(xiàn)裝置整體的小型化。相反,在毛細(xì)管電泳 法中,通過微芯片化,能使裝置整體小型化。
然而,在上述現(xiàn)有的毛細(xì)管電泳法中,存在難以高精度分 析血紅蛋白的問題,為了解決該問題,提出了用蛋白質(zhì)覆蓋毛 細(xì)管內(nèi)壁,再在其上覆蓋多糖類的技術(shù)(專利文獻(xiàn)5)。然而, 在該技術(shù)中,必須在每次分析時(shí)進(jìn)行用蛋白質(zhì)覆蓋毛細(xì)管內(nèi)壁 的操作,存在分析變復(fù)雜的問題。另一方面,提出了在兩性離子性類型的運(yùn)行緩沖液中含有脂肪族二胺等流動抑制劑以進(jìn)行 毛細(xì)管電泳而不覆蓋毛細(xì)管內(nèi)壁的方法(專利文獻(xiàn)6)。然而, 在該方法中,存在雖然能分離變異血紅蛋白,但無法分離出血
紅蛋白Alc的問題。這些問題并不限于血紅蛋白,也是其它試樣
的毛細(xì)管電泳法普遍的問題。
專利文獻(xiàn)l
專利文獻(xiàn)2 專利文獻(xiàn)3 專利文獻(xiàn)4 專利文獻(xiàn)5 專利文獻(xiàn)6
曰本特開2005 — 291926號/>才艮 日本特開平4 - 320957號7>才艮 曰本凈爭表平5 — 503989號7>才艮 曰本凈爭表平8 — 504037號7>才艮 日本特開平9 - 105739號7>才艮 曰本4爭開2006 _ 145537號7>才艮

發(fā)明內(nèi)容
于是,本發(fā)明的目的是提供一種通過可實(shí)現(xiàn)裝置的小型化、 分析精度高、容易實(shí)施的毛細(xì)管電泳法分析試樣的方法,用于 該方法的毛細(xì)管和毛細(xì)管電泳裝置。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的分析方法,其特征在于,其 是通過毛細(xì)管電泳法分析試樣的方法,包括
準(zhǔn)備上述毛細(xì)管電泳法中使用的毛細(xì)管的工序,和
在上述毛細(xì)管中,使試樣與含有陰極性基團(tuán)的化合物結(jié)合 而成的復(fù)合物進(jìn)4于電泳的工序,
其中上述毛細(xì)管是在上述毛細(xì)管內(nèi)壁層疊有由含有陰極性 基團(tuán)的化合物形成的陰極性層的毛細(xì)管,上述陰極性層通過共 價(jià)鍵固定在上述毛細(xì)管內(nèi)壁。
本發(fā)明的毛細(xì)管,其特征在于,其是在上述本發(fā)明的分析 方法中使用的毛細(xì)管電泳用的毛細(xì)管,其中,在上述毛細(xì)管內(nèi) 壁,層疊有由含有陰極性基團(tuán)的化合物形成的陰極性層,上述
5陰極性層通過共價(jià)鍵固定在上述毛細(xì)管內(nèi)壁。
本發(fā)明的毛細(xì)管電泳裝置,其特征在于,其是在上述本發(fā) 明的分析方法中使用的毛細(xì)管電泳裝置,其中,包含上述本發(fā) 明的毛細(xì)管。如后述那樣,本發(fā)明的毛細(xì)管電泳裝置可以為小 型化(微芯片化)的微芯片電泳裝置。
在本發(fā)明的分析方法中,由于使用在毛細(xì)管內(nèi)壁形成有通 過共價(jià)鍵固定的陰極性層的毛細(xì)管,因此可以防止血紅蛋白等 血液試樣中的蛋白質(zhì)等吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁,由此,可以產(chǎn)生良 好的電滲流。此外,在本發(fā)明的分析方法中,由于試樣與含有 陰極性基團(tuán)的化合物結(jié)合而生成復(fù)合物并使其進(jìn)行電泳,因此, 與試樣單獨(dú)進(jìn)行電泳相比,分離效率提高。由此,根據(jù)本發(fā)明 的分析方法,能短時(shí)間且高精度地分析血紅蛋白等的試樣。此 外,上述陰極性層被牢固地固定在毛細(xì)管內(nèi)壁,因此一旦形成, 即使清洗,也不會容易地剝離,可重復(fù)使用。因此,在本發(fā)明 的分析方法中, 一旦形成陰極性層,無需在每次分析時(shí)形成陰 極性層,可以容易地進(jìn)行分析。此外,在本發(fā)明中,由于采用 毛細(xì)管電泳法,因此可以將分析裝置小型化。


圖l是表示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中血紅蛋白分析結(jié)果的圖表。
圖2是表示本發(fā)明其他實(shí)施例中血紅蛋白分析結(jié)果的圖表。 圖3是表示本發(fā)明毛細(xì)管電泳裝置 一 個(gè)例子結(jié)構(gòu)的圖。圖3 的(A)是該例子的毛細(xì)管電泳裝置的俯視圖。圖3的(B)是 圖3的(A)的I-I剖面圖。圖3的(C)是圖3的(A)的II-II 剖面圖。
圖4是表示本發(fā)明毛細(xì)管電泳裝置其他例子的結(jié)構(gòu)的圖。 圖5是表示本發(fā)明毛細(xì)管電泳裝置另 一其他例子的結(jié)構(gòu)的圖。
圖6是表示本發(fā)明毛細(xì)管電泳裝置另 一 其他例子的結(jié)構(gòu)的圖。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中,上述運(yùn)行緩沖液,是指在實(shí)際分離工序中使
用的緩沖液(buffer )。優(yōu)選在本發(fā)明分析方法的上述毛細(xì)管中, 向包含含有陰極性基團(tuán)的化合物的運(yùn)行緩沖液中添加試樣,接 著,在毛細(xì)管兩端施加電壓,從而使上述試樣與含有陰極性基 團(tuán)的化合物的復(fù)合物進(jìn)行電泳。
在本發(fā)明的分析方法和毛細(xì)管中,作為與上述試樣形成復(fù) 合物的上述含有陰極性基團(tuán)的化合物,優(yōu)選為含有陰極性基團(tuán) 的多糖類。作為上述含有陰極性基團(tuán)的多糖類,例如是硫酸化 多糖類、羧酸化多糖類、磺酸化多糖類和磷酸化多糖類,其中, 優(yōu)選硫酸化多糖類和羧酸化多糖類。作為上述硫酸化多糖類, 優(yōu)選硫酸軟骨素、肝素等,更優(yōu)選為硫酸軟骨素。作為上述羧 酸化多糖類,優(yōu)選海藻酸或其鹽(例如海藻酸鈉)。硫酸軟骨素 有A、 B、 C、 D、 E、 H、 K七種,可以使用任一種。
在本發(fā)明的分析方法和毛細(xì)管的形成上述陰極性層的上述 含有陰極性基團(tuán)的化合物中,上述陰極性基團(tuán)優(yōu)選為磺基和羧 基的至少一種。
在本發(fā)明中,上述試樣優(yōu)選為含有血紅蛋白的試樣。
在本發(fā)明的毛細(xì)管電泳裝置中,包括基板、多個(gè)液槽、毛 細(xì)管,在上述基板上形成有上述多個(gè)液槽,上述多個(gè)液槽通過 上述毛細(xì)管連通,上述毛細(xì)管還可以是上述本發(fā)明的毛細(xì)管。 在該情況下,上述基板的最大長度例如在10 100mm的范圍內(nèi), 優(yōu)選在30 ~ 70mm的范圍內(nèi),上述基^1的最大寬度例如在10 ~ 760mm的范圍內(nèi),上述基板的最大厚度例如在0.3 ~ 5mm的范圍 內(nèi)。另外,所謂上述基板的最大長度是指上述基板長度方向最 長部分的長度,所謂上述基板的最大寬度是指上述基板的與上 述長度方向垂直的方向(寬度方向)的最長部分的長度,所謂 上述基板的最大厚度是指上述基板的與上述長度方向和上述寬 度方向兩者垂直的方向(厚度方向)的最長部分的長度。如此, 本發(fā)明的毛細(xì)管電泳裝置還可以是小型化(微芯片化)的微芯 片電泳裝置。
以下,對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
如上所述,本發(fā)明中的毛細(xì)管在其內(nèi)壁形成有上述陰極性層。
對上述毛細(xì)管的材料沒有特別的限定,可以列舉例如玻璃、 熔融二氧化硅、塑料等。玻璃制、熔融二氧化硅制的毛細(xì)管的 內(nèi)壁通常為具有陰性電荷的狀態(tài)。塑料制的毛細(xì)管內(nèi)壁根據(jù)塑 料中有無極性基團(tuán)或極性基團(tuán)的種類而成為具有陽性或陰性電 荷的狀態(tài)或?yàn)闊o電荷(無極性)的狀態(tài)。此外,即使是不具有 極性基團(tuán)的塑料,也能通過導(dǎo)入極性基團(tuán),從而成為具有電荷 的狀態(tài)。作為上述塑料制的毛細(xì)管,可以使用市售品,可以列 舉例如由聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、 聚四氟乙烯(PTFE)、聚醚醚酮(PEEK)等形成的毛細(xì)管。上 述毛細(xì)管的內(nèi)徑例如在10 ~ 200jim的范圍內(nèi),優(yōu)選在25 ~ 100nm的范圍內(nèi)。上述毛細(xì)管的長度例如在10 1000mm的范圍 內(nèi)。
由上述含有陰極性基團(tuán)的化合物在上述毛細(xì)管內(nèi)壁形成上 述陰極性層時(shí),例如,使用包含前述陰極性基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)的 化合物即可。在上述毛細(xì)管為玻璃制或熔融二氧化硅制的情況 下,可以使用具有陰極性基團(tuán)和硅的化合物(曱硅烷基化劑)。作為上述陰極性基團(tuán),如上所述,優(yōu)選磺基和羧基中的至少一 個(gè),這一點(diǎn)3。前所述。
上述甲硅烷基化劑例如是2- (4-氯代磺?;交?乙基 三曱氧基硅烷、2- (4-氯代磺?;交?乙基三氯硅烷。
在上述曱硅烷基化劑中,還可以使用硅原子被鈦或鋯取代 的物質(zhì)。上述曱硅烷基化劑可以單獨(dú)使用一種,也可以將二種 以上并用。
使用上述甲硅烷基化劑形成陰極性層時(shí),例如如下進(jìn)行。 首先,制備在有機(jī)溶劑中溶解或分散甲硅烷基化劑的處理液。
如二氯曱烷、甲苯等。對上述處理液中的甲硅烷基化劑的濃度 沒有特別的限定。將該處理液通入到玻璃制或熔融二氧化硅制 的毛細(xì)管內(nèi),加熱。通過該加熱,上述甲硅烷基化劑通過共價(jià) 鍵鍵合到上述毛細(xì)管內(nèi)壁,其結(jié)果,陰極性基團(tuán)被配置在上述 毛細(xì)管內(nèi)壁。然后,使用有機(jī)溶劑(二氯甲烷、甲醇、丙酮等)、 酸性溶液(磷酸等)、堿性溶液和表面活性劑溶液的至少一種進(jìn) 行洗滌(后處理)。另外,該洗滌是任意進(jìn)行的,優(yōu)選進(jìn)行洗滌。 通過上述甲硅烷基化劑形成有陰極性層的毛細(xì)管可以使用市售
口口
對上述運(yùn)行緩沖液沒有特別的限定,優(yōu)選為使用酸的緩沖 液。上述酸例如是馬來酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、鄰苯二 曱酸、丙二酸、蘋果酸。此外,上述運(yùn)行緩沖液優(yōu)選為含有弱 堿。作為上述弱^威,例如是精氨酸、賴氨酸、組氨酸和三羥基 曱基氨基曱烷(tris)等。上述運(yùn)行緩沖液的pH例如在pH4.5 ~ 6的范圍內(nèi)。上述運(yùn)行緩沖液的緩沖液種類有MES、 ADA、 ACES、 BES、 MOPS、 TES、 HEPES等。在上述運(yùn)行緩沖液中, 與上述試樣形成復(fù)合物的上述含有陰極性基團(tuán)的化合物的濃度
9例如在0.01 ~ 5重量%的范圍內(nèi)。
接著,本發(fā)明的分析方法例如對含有血紅蛋白的試樣可以 如下實(shí)施。
首先,制備玻璃制或熔融二氧化硅制的毛細(xì)管。在該毛細(xì) 管的內(nèi)壁,通過共價(jià)鍵固定有含有陰極性基團(tuán)的化合物。在該 毛細(xì)管中通入提純水洗滌。上述提純水的通液時(shí)間例如為1 ~ 10 分鐘,上述通液時(shí)的壓力例如為0.05 ~ O.lMPa。接著,在上述 毛細(xì)管內(nèi),通過泵施加壓力,通入包含硫酸軟骨素等含有陰極 性基團(tuán)的多糖類的運(yùn)刊-緩沖液。該通液的時(shí)間例如為10 ~ 60分 鐘,通液的壓力例如為0.05 ~ O.lMPa。在上述毛細(xì)管內(nèi)填充有 上述運(yùn)行緩沖液的狀態(tài)下,在上述毛細(xì)管內(nèi)導(dǎo)入含有血紅蛋白 的試樣,在上述毛細(xì)管的兩端施加電壓,進(jìn)行電泳。上述含有 血紅蛋白的試樣沒有特別的限制,可以列舉例如對全血進(jìn)行溶 血處理的試樣,此外,還可以用^是純水或運(yùn)行緩沖液稀釋該試 樣。上述含血紅蛋白的試樣的導(dǎo)入是從上述毛細(xì)管的陽極側(cè)進(jìn) 行。被導(dǎo)入的血紅蛋白與上述運(yùn)行緩沖液中的含陰極性基團(tuán)的 多糖類結(jié)合,形成復(fù)合物。通過施加電壓,在上述毛細(xì)管內(nèi)的 運(yùn)行緩沖液中產(chǎn)生電滲流,上述復(fù)合物向毛細(xì)管的陰極側(cè)移動。 上述電壓施加的程度例如為10 ~ 30kV。該移動通過光學(xué)方法枱r 測。對光學(xué)方法的檢測沒有特別限制,優(yōu)選在415nm的波長下 進(jìn)行。
在本發(fā)明中,對作為分析對象的血紅蛋白沒有特別限制, 例如是正常血紅蛋白、糖化血紅蛋白(例如HbAlc、不穩(wěn)定型 HbAlc、 GHbLys等)、遺傳變異型血紅蛋白等。在本發(fā)明中,可 以將HbAlc與其他血紅蛋白分離并分析。
接著,通過舉例對本發(fā)明的毛細(xì)管電泳裝置進(jìn)行說明。然 而,本發(fā)明的毛細(xì)管電泳裝置并不限定在下述例子。在圖3中示出本發(fā)明毛細(xì)管電泳裝置的一個(gè)例子。圖3的 (A)是該例的毛細(xì)管電泳裝置的俯視圖,圖3的(B)是圖3 的(A)的I-I剖面圖,圖3的(C)是圖3的(A)的II-II的剖 面圖。此外,在該圖中,為了容易看懂,各結(jié)構(gòu)要素的大小和 比率等與實(shí)際不同。該例的毛細(xì)管電泳裝置是小型化(微芯片
化)的微芯片電泳裝置。如圖所示,該微芯片電泳裝置包含基 板l、多個(gè)(在該例中為4個(gè))的液槽2a 2d、 4才艮毛細(xì)管3xl、 3x2、 3yl和3y2。上述4才艮毛細(xì)管全部是上述本發(fā)明的毛細(xì)管。 上述4個(gè)液槽2a 2d包括第l導(dǎo)入槽2a、第l回收槽2b、第2導(dǎo)入 槽2c和第2回收槽2d。上述4根毛細(xì)管其各自的一端在中心部分c 集合,連結(jié)成十字狀。其結(jié)果,上述4根毛細(xì)管在其內(nèi)部連通。 在上述基板l中設(shè)有用于嵌入上述4根毛細(xì)管的空洞(未圖示)。 將上述毛細(xì)管3xl嵌入上述基板l中,使其另 一端位于上述第1 導(dǎo)入槽2a的底面。將上述毛細(xì)管3x2嵌入上述基板l中,使其另 一端位于上述第l回收槽2b的底面。上述毛細(xì)管3xl和3x2構(gòu)成試 樣分析用的毛細(xì)管流路3x。將上述毛細(xì)管3yl嵌入上述基板l中, 使其另 一端位于上述第2導(dǎo)入槽2c的底面,將上述毛細(xì)管3y2嵌 入上述基板l中,使其另 一端位于上述第2回收槽2d的底面。上 述毛細(xì)管3yl和3y2構(gòu)成試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流^各3y。上述多個(gè) 液槽2a 2d分別在上述基板l上形成為凹部。上述基板l在上述 試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流路3y的第l回收槽2b側(cè)具有長方體狀的 開口部分(窗)9。另外,該例的微芯片電泳裝置為長方體狀。 然而,本發(fā)明并不限定于這些。本發(fā)明的微芯片毛細(xì)管電泳裝 置只要在電泳測定中沒有障礙,就可以是任意的形狀。此外, 該例的微芯片電泳裝置的平面形狀是長方形。然而,本發(fā)明并 不限定于這些。本發(fā)明微芯片電泳裝置的平面形狀例如還可以 是正方形或其他形狀。此外,在該例的微芯片電泳裝置中,上說明書第9/15頁
述試樣分析用的毛細(xì)管流路3x和上述試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流路 3y的最大長度不同。然而,本發(fā)明并不限定于此。在本發(fā)明的 微芯片電泳裝置中,上述試樣分析用的毛細(xì)管流路3x和上述試 樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流路3y的最大長度也可以相同。對此外的結(jié) 構(gòu)來說,本發(fā)明微芯片電泳裝置的結(jié)構(gòu)也并不限定于該例。
接著,對該例的微芯片電泳裝置的制造方法進(jìn)行說明。不 過,上述微芯片電泳芯片也可以通過下述制造方法以外的方法 制造。
在該例的微芯片電泳裝置中,作為上述基板l,可以使用例 如由玻璃、聚合物材料等形成的基板。作為上述玻璃材料,可 以列舉例如合成石英玻璃、硼硅酸玻璃等。作為上述聚合物材 料,可以列舉例如聚曱基丙烯酸甲酯(PMMA)、環(huán)烯烴聚合物 (COP)、聚碳酸酯(PC)、聚二曱基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙 烯(PS)、聚乳酸等。
在該例的微芯片電泳裝置中,上述基板l的最大長度、最大 寬度和最大厚度如前所述。
上述4根毛細(xì)管的內(nèi)徑分別如上述本發(fā)明毛細(xì)管的內(nèi)徑。上 述試樣分析用的毛細(xì) 管流路3x和上述試樣導(dǎo)入用的毛纟田管流路 3y的最大長度,例如在0.5~ 15cm的范圍內(nèi)。上述4根毛細(xì)管的 長度分別根據(jù)上述試樣分析用的毛細(xì)管流路3x和上述試樣導(dǎo)入 用的毛細(xì)管流路3y的最大長度決定。
對上述多個(gè)液槽2a 2d的容積沒有特別限制,例如分別在 1 ~ 1000mm3的范圍內(nèi),優(yōu)選在50~ 100mm3的范圍內(nèi)。在圖3中, 上述多個(gè)液槽2a 2d的形狀為圓柱狀。不過,本發(fā)明并不限定 于此。在本發(fā)明的微芯片電泳裝置中,上述多個(gè)液槽的形狀只 要對后述的試樣的導(dǎo)入和回收沒有妨害,就沒有限制,可以是 例如四棱柱狀、四棱錐狀、圓錐狀、將它們組合的形狀等任意
12的形狀。此外,上述多個(gè)液槽的容積和形狀可以全部相同,也 可以各自不同。
以下示出該例的微芯片電泳裝置制造工序的一個(gè)例子。不 過,上述微芯片電泳裝置還可以通過下述制造工序以外的工序 制造。
首先,制備上述基板l。在上述基板1中形成上述4個(gè)液槽 2a 2d和上述開口部分(窗)9的形成方法沒有特別的限制。例 如,在上述基板l的材料是上述玻璃的情況下,作為上述形成方 法,可以列舉例如超聲波加工等。例如,在上述基板l的材料是 上述聚合物材料的情況下,作為上述形成方法,可以列舉例如 使用模具的注射成型、澆鑄成型、擠壓成型等成型法或切削加 工法等。上述4個(gè)液槽2a 2d和上述開口部分(窗)9可以分別 另行形成,也可以全部同時(shí)形成。在另行形成上述4個(gè)液槽2a 2d和上述開口部分(窗)9的情況下,可以以任意順序形成。通 過上述使用才莫具的方法等,上述4個(gè)液槽2a 2d和上述開口部分 (窗)9全部同時(shí)形成時(shí),工序少,是優(yōu)選的。
接著,在上述基板1中嵌入上述4根毛細(xì)管。由此可以獲得 該例的微芯片電泳裝置。
上述微芯片電泳裝置還可以進(jìn)一步具有多個(gè)電極。在圖4 中示出上述具有多個(gè)電極的該例的微芯片電泳裝置。在該圖中, 與圖3相同的部分標(biāo)有相同符號。如圖所示,該微芯片電泳裝置 具有4個(gè)電極6a 6d。將上述4個(gè)電極6a 6d分別嵌入上述基板l 中,4吏其一端位于上述多個(gè)液槽2a 2d內(nèi)。上述4個(gè)電才及6a 6d, 例如可以在制造上述基板1時(shí)在上述基^反1側(cè)面預(yù)先形成上述4 個(gè)電極6a 6d的導(dǎo)入孔,從而容易地設(shè)置。另外,在上述微芯 片電泳裝置中,上述多個(gè)電極為任意的結(jié)構(gòu)部件。還可以在例 如上述微芯片電泳裝置使用時(shí)將上述多個(gè)電極插入到上述多個(gè)上述多個(gè)電極6a 6d只要是能在電泳法中使用的電極,就 可以是任意的物質(zhì)。上述多個(gè)電極6a ~ 6d例如分別為不銹鋼 (SUS)制電極、鉑(Pt)電極、金(Au)電極等。
上述微芯片電泳裝置還可以包括用于將含有血紅蛋白等的 試樣溶血并稀釋的前處理槽。前述含有血紅蛋白的試樣的溶血 處理沒有特別限制,例如,可以為通過溶血劑將上述含有血紅 蛋白的試樣進(jìn)行溶血的處理。上述溶血劑例如可以石皮壞上述含 有血紅蛋白的試樣中的血細(xì)胞成分的細(xì)胞膜。作為上述溶血劑,
可以列舉例如上述運(yùn)行緩沖液、皂戒、Nacalai Tesque, Inc.制造 的商品名"Triton X- IOO,,等,特別優(yōu)選上述運(yùn)行緩沖液。上述 前處理槽優(yōu)選例如與上述導(dǎo)入槽連通。上述前處理槽只要形成 在與其連通的液槽、例如上述第2導(dǎo)入槽2 c的附近等適當(dāng)?shù)牡胤?即可。在具有上述前處理槽的情況下,將上述含有血紅蛋白的 試樣導(dǎo)入上述前處理槽。由此經(jīng)過前處理的上述含有血紅蛋白 的試樣,通過連接上述前處理槽和與其連通的液槽、例如上述 第2導(dǎo)入槽2c的流路,被導(dǎo)入上述第2導(dǎo)入槽2c中。上述前處理 槽還可以是將用于使上述含有血紅蛋白的試樣溶血的槽和用于 稀釋上述含有血紅蛋白的試樣的槽這2個(gè)槽連通的結(jié)構(gòu)。
上述微芯片電泳裝置還可以具有分析部分。在圖5中,示出 具有上述分析部分的該例的微芯片電泳裝置。在該圖中,與圖3 和圖4相同的部分標(biāo)有相同符號。如圖所示,該微芯片電泳裝置 具有分析部分7。在該例的微芯片電泳裝置中,上述分析部分7 是檢測器(線檢測器)。上述線檢測器以位于從上述試樣分析用 的毛細(xì)管流^各3x與上述試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流^各3y的交叉部分 的上述第l回收槽2b側(cè)的方式直接設(shè)置在上述毛細(xì)管3x2上。在 該微芯片電泳裝置中,在基板l上除了設(shè)置用于嵌入上述4根毛
14細(xì)管的空洞以外,還設(shè)置用于嵌入上述分析部分(線檢測器)7 的空洞(未圖示)。上述線檢測器內(nèi)設(shè)光源和檢測部分。上述線 檢測器由上述光源向試樣發(fā)出光并通過上述檢測部分檢測來自
試樣的反射光,從而測定吸光度。上述分析部分7并不限定于上
述線檢測器,例如,只要是能分析含有血紅蛋白的試樣的儀器,
就可以任意使用。例如,上述分析部分7還可以由設(shè)置在上述微 芯片電泳裝置的下方的光源和設(shè)置在與上述線檢測器的部位對 應(yīng)的位置的4全測部分構(gòu)成。在該情況下,通過由上述光源向試 樣發(fā)出光并由上述4企測部分才企測從試樣透過的透射光,乂人而測 定吸光度。
在圖6中示出本發(fā)明微芯片電泳裝置的另一例子。在該圖 中,與圖5相同的部分標(biāo)有相同符號。如圖所示,該例的微芯片 電泳裝置除了分析部分7不同以外,具有與圖5中所示微芯片電 泳裝置相同的結(jié)構(gòu)。如該例所示,上述分析部分7還可以在1點(diǎn) 上測定吸光度。
使用圖5和6中所示的微芯片電泳裝置的本發(fā)明的分析方法 例如可以針對含有血紅蛋白的試樣,如下進(jìn)行。
首先,在上述試樣分析用的毛細(xì)管流路3x和上述試樣導(dǎo)入 用的毛細(xì)管流路3y中,通入提純水進(jìn)行洗滌。上述提純水的通 液時(shí)間和上述通液時(shí)的壓力例如如上所述。4妻著,通過泵等施 加壓力,將包含硫酸軟骨素等含有陰極性基團(tuán)的多糖類的緩沖 液通入上述試才羊分沖斤用的毛細(xì) 管流路3x和上述試樣導(dǎo)入用的毛 細(xì)管流路3y中。該通液時(shí)間和通液壓力例如如上所述。接著, 在上述試樣分析用的毛細(xì)管流路3x和上述試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管 流路3y中,通過壓力或毛細(xì)管作用填充上述運(yùn)行緩沖液。
另外,在微芯片電泳裝置不使用時(shí)(不分析時(shí)),如果預(yù)先 完成上述運(yùn)行緩沖液的填充工序,則可以省略上述各工序,直接進(jìn)行以下工序,故優(yōu)選。
接著,向上述第2導(dǎo)入槽2c中導(dǎo)入含有血紅蛋白的試樣。作
為上述含有血紅蛋白的試樣,如上所述。在微芯片電泳裝置具 有上述前處理槽(未圖示)的情況下,向上述前處理槽中導(dǎo)入 上述含有血紅蛋白的試樣,在此處進(jìn)行前處理。接著,對上述
電極6c和上述電才及6d施加電壓,在上述試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流 路3y的兩端產(chǎn)生電位差。由此,在上述試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流 路3y中導(dǎo)入上述含有血紅蛋白的試樣。被導(dǎo)入的血紅蛋白與上 述運(yùn)行緩沖液中的含有陰極性基團(tuán)的多糖類結(jié)合而形成復(fù)合 物。通過施加電壓,從而在上述試樣導(dǎo)入用毛細(xì) 管流路3 y內(nèi)的 運(yùn)行緩沖液中產(chǎn)生電滲流,上述復(fù)合物移動至上述試樣分析用 的毛細(xì)管流路3 x與上述試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流路3 y的交叉部 分。
上述電極6c和上述電極6d之間的電位差例如在0.5 ~ 5kV的 范圍內(nèi)。
接著,對上述電極6a和上述電極6b施加電壓,在上述試樣 分析用的毛細(xì)管流路3x的兩端產(chǎn)生電位差。由此,通過將兩端 具有電位差的毛細(xì)管流路由上述試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流路3y瞬 間切換為上述試樣分析用的毛細(xì)管流路3x,從而如圖5和6中箭 頭所示,將上述試樣8從上述試樣分析用的毛細(xì)管流路3x與上述 試樣導(dǎo)入用的毛細(xì)管流路3y的交叉部分向上述第l回收槽2b側(cè) 移動。
上述電極6a和上述電極6b之間的電位差例如在0.5 ~ 5kV的
范圍內(nèi)。
接著,通過上述檢測器7,對由于移動速度之差而分離的上 述含有血紅蛋白的試樣中的各成分進(jìn)行檢測。由此,可以將上 述含有血紅蛋白的試樣中的各成分分離來進(jìn)行分析。實(shí)施例
以下,對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說明。 (實(shí)施例l )
制備在內(nèi)壁具有通過共價(jià)鍵固定具有磺基的曱硅烷基化劑
而形成的陰極性層的熔融二氧化硅制的毛細(xì)管(全長32cm、有 效長度8.5cm、內(nèi)徑50[im )。在該毛細(xì)管中,以0.1MPa( 1000mbar ) 的壓力通入提純水20分鐘,洗滌。接著,在100mM蘋果酸和精 氨酸水溶液中,以0.5重量%的比例添加碌u酸軟骨素,制備運(yùn)行 緩沖液(pH5.5)。以與上述相同的壓力將該運(yùn)行緩沖液通入上 述毛細(xì)管內(nèi)。在上述毛細(xì)管內(nèi)填充有運(yùn)行緩沖液的狀態(tài)下,向 上述毛細(xì)管內(nèi)注入由血紅蛋白溶解于提純水中得到的試樣,在 上述毛細(xì)管的兩端施加10kV的電壓進(jìn)行電泳。上述含有血紅蛋 白的試樣的注入是從上述毛細(xì)管的陽極側(cè)進(jìn)行。以415nm的吸 光度檢測移動的血紅蛋白。其結(jié)果在圖l的圖表中示出。如圖所 示,在本實(shí)施例中,可以將正常血紅蛋白(HbAO)和糖化血紅 蛋白(HbAlc)分離并檢測。此外,本實(shí)施例中使用的毛細(xì)管 在洗滌后可以立即進(jìn)行分析。 (實(shí)施例2)
除了使用在內(nèi)壁具有通過共價(jià)鍵固定具有羧基的曱硅烷基 化劑而形成的陰極性層的熔融二氧化硅制的毛細(xì)管(全長 32cm、有效長度8.5cm、內(nèi)徑50(im)以外,與實(shí)施例l同樣進(jìn)行 毛細(xì)管電泳,分析血紅蛋白。其結(jié)果在圖2的圖表中示出。如圖 所示,在本實(shí)施例中,可以將正常血紅蛋白(HbAO)和糖化血 紅蛋白(HbAlc)分離并4全測。此外,本實(shí)施例中4吏用的毛細(xì) 管可以在洗滌后立即進(jìn)行分析。
工業(yè)上的可利用性
如上所述,才艮據(jù)本發(fā)明,通過毛細(xì)管電泳法,可以容易且高精度地進(jìn)行血紅蛋白等的試樣分析。而且,本發(fā)明由于釆用 毛細(xì)管電泳法,因此還可以使分析裝置小型化。本發(fā)明可以在 臨床檢查、生化檢查、醫(yī)學(xué)研究等分析血紅蛋白等試樣的所有 領(lǐng)域中適用,對其用途沒有限定,可以在廣泛的領(lǐng)域中使用。
權(quán)利要求
1. 一種分析方法,其特征在于,其是通過毛細(xì)管電泳法分析試樣的方法,該方法包括準(zhǔn)備所述毛細(xì)管電泳法中使用的毛細(xì)管的工序,和在所述毛細(xì)管中,使試樣與含有陰極性基團(tuán)的化合物結(jié)合而成的復(fù)合物進(jìn)行電泳的工序,所述毛細(xì)管是在所述毛細(xì)管內(nèi)壁層疊有由含有陰極性基團(tuán)的化合物形成的陰極性層的毛細(xì)管,所述陰極性層通過共價(jià)鍵固定在所述毛細(xì)管內(nèi)壁。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析方法,其中,在所述毛細(xì)管 中,在包含含有陰極性基團(tuán)的化合物的運(yùn)行緩沖液中添加試樣, 接著,在毛細(xì)管的兩端施加電壓,使試樣與含有陰極性基團(tuán)的 化合物的復(fù)合物進(jìn)4亍電泳。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析方法,其中,與所述試樣形 成復(fù)合物的所述含有陰極性基團(tuán)的化合物是含有陰極性基團(tuán)的 多糖類。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分析方法,其中,所述含有陰極 性基團(tuán)的多糖類是選自由硫酸化多糖類、羧酸化多糖類、磺酸 化多糖類和磷酸化多糖類所組成的組中的至少 一種多糖類。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的分析方法,其中,所述硫酸化多 糖類是硫酸軟骨素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析方法,其中,在形成所述陰 極性層的所述含有陰極性基團(tuán)的化合物中,所述陰極性基團(tuán)是 磺基和羧基中的至少一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析方法,其中,所述試樣是含 有血紅蛋白的試樣。
8. —種毛細(xì)管,其特征在于,其是在權(quán)利要求l的分析方 法中使用的毛細(xì)管電泳用的毛細(xì)管,其中,在所述毛細(xì)管內(nèi)壁,層疊有由含有陰極性基團(tuán)的化合物形成的陰極性層,所述陰極 性層通過共價(jià)鍵固定在所述毛細(xì)管內(nèi)壁。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的毛細(xì)管,其中,與所述試樣形成 復(fù)合物的所述含有陰極性基團(tuán)的化合物是含有陰極性基團(tuán)的多 糖類。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的毛細(xì)管,其中,所述含有陰極性 基團(tuán)的多糖類是選自由硫酸化多糖類、羧酸化多糖類、磺酸化 多糖類和磷酸化多糖類所組成的組中的至少 一種多糖類。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的毛細(xì)管,其中,所述硫酸化多 糖類是硫酸軟骨素。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的毛細(xì)管,其中,在形成所述陰極 性層的所述含有陰極性基團(tuán)的化合物中,所述陰極性基團(tuán)是磺 基和羧基中的至少一種。
13. —種毛細(xì)管電泳裝置,其特征在于,其是在權(quán)利要求l 所述的分析方法中使用的毛細(xì)管電泳裝置,包含權(quán)利要求8所述 的毛細(xì)管。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的毛細(xì)管電泳裝置,其包含基板、 多個(gè)液槽和毛細(xì)管,在所述基板上形成有所述多個(gè)液槽,所述 多個(gè)液槽通過所述毛細(xì)管連通,所述毛細(xì)管是權(quán)利要求8所述的 毛細(xì)管。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的毛細(xì)管電泳裝置,其中,所述 基板的最大長度在10~ 100mm的范圍內(nèi),所述基板的最大寬度 在10~ 60mm的范圍內(nèi),所述基板的最大厚度在0.3 ~ 5mm的范 圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過可實(shí)現(xiàn)裝置的小型化、分析精度高、容易實(shí)施的毛細(xì)管電泳法分析試樣的方法。本發(fā)明的分析方法,其特征在于,其是通過毛細(xì)管電泳法分析試樣的方法,包括準(zhǔn)備上述毛細(xì)管電泳法中使用的毛細(xì)管的工序,和在上述毛細(xì)管中使試樣與含有陰極性基團(tuán)的化合物結(jié)合而成的復(fù)合物進(jìn)行電泳的工序,其中上述毛細(xì)管是在上述毛細(xì)管內(nèi)壁層疊有由含有陰極性基團(tuán)的化合物形成的陰極性層的毛細(xì)管,上述陰極性層通過共價(jià)鍵固定在上述毛細(xì)管內(nèi)壁。
文檔編號G01N27/447GK101501485SQ20078002954
公開日2009年8月5日 申請日期2007年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月4日
發(fā)明者中山雄介, 田中喜秀, 米原聰, 脅田慎一 申請人:獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所;愛科來株式會社
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