專利名稱：用毛細(xì)管電泳法分析dna的制作方法
用毛細(xì)管電泳法分析DNA本發(fā)明涉及檢測核酸的方法，其中通過毛細(xì)管電泳分離待分析核酸存在情況的 樣品。注入和分離樣品的條件使得該方法具有極高的靈敏度，該方法可用于，例如，為 質(zhì)控目的測定用于治療或免疫接種(具體是抗流感)的樣品中基因組DNA污染物的存在 和/或其大小。流感是由正粘病毒屬病毒引起的疾病。所引起的疾病主要是A型流感，罕見B 型流感，特別不可能的是C型流感。預(yù)防流感的最好方法是接種疫苗，目前已有A型和B型流感疫苗。自1952年 以來就知道流感疫苗。用雞蛋增殖病毒的常規(guī)方法生產(chǎn)疫苗至少需要6個月。另一種用 細(xì)胞培養(yǎng)病毒的方法比用雞蛋有幾個優(yōu)點(diǎn)。管理當(dāng)局對細(xì)胞培養(yǎng)制備產(chǎn)品進(jìn)行評估的一種參數(shù)是DNA殘留量，因?yàn)橛棉D(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞培養(yǎng)可能殘留有宿主細(xì)胞DNA成分。最大程度減少宿主細(xì)胞DNA所致相關(guān) 危害的一種可行方法是減少疫苗中存在的DNA量?；蛘?，可以證明最終產(chǎn)品中殘留的核 酸是喪失致癌潛能的DNA。關(guān)于MDCK細(xì)胞(Madin-Darby狗腎細(xì)胞)，家犬(Canisfamiliaris)的基因組已 于2004年完成測序，可從英特網(wǎng)上獲得。研究諾華(Novartis)疫苗時，顯示約25000個 基因中只有13個具有特定功能，其長度不到500bp。發(fā)現(xiàn)這13個基因沒有一個有致癌潛 能。此發(fā)現(xiàn)揭示需要開發(fā)高靈敏度方法來分析可能含有核酸的樣品(例如疫苗)是否 存在核酸及其大小分布。為評估疫苗制品加工過程中核酸的含量和大小分布，可分析不同加工階段的樣 品。這導(dǎo)致困難增加，因?yàn)檫@些加工過程中的樣品的化學(xué)組成彼此不同。所含DNA的濃 度差別很大，可高達(dá)三個數(shù)量級。因此，其分析方法的開發(fā)是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)?？刹捎脦追N方法實(shí)現(xiàn)核酸絕對濃度的定量測定。例如，用光度計檢測280nm與 260nm光密度可推斷樣品的核酸濃度和蛋白質(zhì)含量。熒光染色試驗(yàn)更為靈敏。例如，孔 雀綠(PicoGreen )的檢測下限低于約312pg/ml。然而此試驗(yàn)對樣品中的雜質(zhì)也非常敏 感，其結(jié)果差異程度很高。域系統(tǒng)(ThresholdSystem )試驗(yàn)?zāi)軌蚨?.2_400pg/ml濃 度的DNA。然而，這些試驗(yàn)不能提供任何質(zhì)量信息。對于核酸，例如基因組DNA的定性分析，最常采用經(jīng)典的瓊脂糖凝膠平板電 泳。因此，如下文實(shí)施例中所詳述，最初嘗試用瓊脂糖凝膠電泳分析生產(chǎn)的流感疫苗樣 品。雖然可用此法檢測初步純化的樣品，但因以后步驟的樣品和最終產(chǎn)品的DNA濃度太 低而不能分析。類似地，發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳不適合分析這種樣品。已知可用毛細(xì)管凝膠電泳分析的物質(zhì)范圍廣泛，例如有寡核苷酸或DNA[C. Heller, Electrophoresis 629, Issue 2 (2OOl) ； Menzinger 等，毛細(xì)管電泳的瓊脂化學(xué)分析 (Analysis of agrochemicals by capillary electrophoresis)， J.Chromatogr.A891 (2000), 45 ； Mitchelson.,核酸的毛細(xì)管電泳(Capillay electrophoresis ofnucleic acids)，第 2卷，毛細(xì)管 電泳的實(shí)際應(yīng)用(Practical applications of capillaryelectrophoresis)， Humana Press Totowa,新澤西，2001]。此法效率和靈敏度高，可快速實(shí)施。本發(fā)明人驚喜地發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)管凝膠電泳適合提供高靈敏度和可靠的試驗(yàn)來分析 疫苗生產(chǎn)各步驟的核酸，特別是DNA。得到的方法可滿足優(yōu)先領(lǐng)域的需要和解決本發(fā)明 的優(yōu)先問題。本發(fā)明人第一個開發(fā)了分析用毛細(xì)管凝膠電泳分離樣品中核酸的存在和/或大 小分布方法，包括a)按流體動力學(xué)法，以約7-35kPa壓力，用水預(yù)先注入毛細(xì)管2-10秒，優(yōu)選以 約7kPa注入約5秒；b)以5_15kV的電壓，按電動力學(xué)法注入樣品10-60秒，優(yōu)選以約IOkV注入約 30秒；C)然后按流體動力學(xué)法，以約3-14kPa，用水后注入2_10秒，優(yōu)選以約7kPa注 入約5秒；d)用 200-275V/cm，優(yōu)選用 225_250V/cm 分離；e)檢測核酸。為改進(jìn)本法的可靠性和牢固性，推薦在步驟a、b和/或c之后通過使毛細(xì)管二 末端接觸水進(jìn)行洗滌步驟。此法顯示，當(dāng)用毛細(xì)管凝膠電泳分離的樣品中DNA的存在和/或大小分布時分 析的靈敏度和可靠性最優(yōu)，包括a)按流體動力學(xué)法，以約21kPa，用水預(yù)先注入毛細(xì)管5秒；b)以IOkV按電動力學(xué)法注入樣品90秒；C)然后按流體動力學(xué)法，以約7kPa，用水后注入約5秒；d)用 250V/cm 分離；e)用激光誘導(dǎo)的熒光檢測核酸，其中，分離緩沖液含有嵌入性染料，如增強(qiáng)染料；在步驟a與b之間以21kPa壓 力，一起或分別注入內(nèi)標(biāo)和熒光溶液；在步驟b注入內(nèi)標(biāo)步驟后，和/或步驟c后進(jìn)行洗 滌步驟。在毛細(xì)管入口處施加壓力，如靜水壓，或在毛細(xì)管出口處產(chǎn)生真空或負(fù)壓可實(shí) 現(xiàn)流體動力學(xué)注射。通常依靠在樣品小瓶與毛細(xì)管一端之間產(chǎn)生壓力差來加樣，此時樣 品小瓶的壓力升高。優(yōu)選將毛細(xì)管另一端也浸沒在液體，如水或緩沖液中。為了靠靜水 壓(重力影響)注入，可提高毛細(xì)管入口處的小瓶到一定高度。緩沖液水平面與樣品水 平面之間的差異，以及樣品的密度可能影響加載。實(shí)施時，通過緩慢升高和降低水壓， 用產(chǎn)生的壓力和注入時間來計算出注入的樣品量。認(rèn)為約7kPa對應(yīng)于約Ipsi壓力。電動力學(xué)注射的基礎(chǔ)是毛細(xì)管電場產(chǎn)生的電流移動和電滲移動。當(dāng)將毛細(xì)管入 口伸入樣品瓶中時，施加電壓幾秒鐘，使樣品中的帶電組分移動進(jìn)入小瓶中。注入的樣 品成分濃度視注射時間或電壓而不同。因此，在本發(fā)明內(nèi)容中，可改變注射時間和電壓 以實(shí)現(xiàn)注入合適量的樣品。注入的樣品量還取決于毛細(xì)管中的電滲流和樣品諸組分的移 動。本領(lǐng)域知道電動力學(xué)注射將導(dǎo)致分析物濃縮，可利用此來高靈敏度分析 樣品(Krivacsy 等，JournalofChromatographyA, 834 (1999) 21-44 ； Butler 等，JChromatographyB，658(1994)，271-280)。然而，在本發(fā)明上下文中，發(fā)明人驚喜地發(fā)
現(xiàn)，對于DNA的CGE分析，可采用流體動力學(xué)注射來獲得甚至更高的靈敏度。出乎意 料的是，少見的將樣品注入到毛細(xì)管有效長度(檢測長度)的約20-40%中，雖相應(yīng)減少 了分離緩沖液的長度，但卻導(dǎo)致極佳結(jié)果。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明方法提高了可靠性 和靈敏度。因此，本發(fā)明提供分析核酸的存在和/或大小分布的方法，其中用毛細(xì)管凝膠 電泳分離包含核酸的樣品，該方法包括以下步驟i)通過流體動力學(xué)法注射將樣品注入毛細(xì)管有效長度的20-40%， )分離核酸，iii)檢測核酸。優(yōu)選地，所述核酸的DNA，優(yōu)選dsDNA。本發(fā)明方法特別適合于分析基因組 DNA和/或DNA的降解產(chǎn)物，具體是基因組DNA的降解產(chǎn)物。也可研究細(xì)菌基因組 DNA、質(zhì)粒DNA和/或病毒DNA及它們的降解產(chǎn)物。例如，本方法可用于檢測大小不 確的DNA降解產(chǎn)物的存在和/或其大小分布。本發(fā)明人出乎意料地證明，當(dāng)按流體動力學(xué)法將樣品注入毛細(xì)管有效長度的 20-40%時可獲得良好結(jié)果。優(yōu)選將樣品注入毛細(xì)管有效長度的25%-35%，最優(yōu)選注 入毛細(xì)管有效長度的約30%。在本領(lǐng)域中，通常是將樣品注入毛細(xì)管有效長度的最多 0.5% (Butler 等，J.Chromatogr.B，658(1994)，271-280)。一般，為提供一百萬理論平 板和5%峰寬，注入體積應(yīng)為毛細(xì)管容積的0.2% [ “毛細(xì)管電泳理論與實(shí)踐(Capillary electrophoresis theory and practice) ”， Patrickcamilleri 主編，第 2 版，CRC 出版社出版 (CRC Press), 1998 ； ISBN084939127X, 9780849391279 ； 26 頁]。技術(shù)人員不難確定注入樣品的條件，樣品注入毛細(xì)管的優(yōu)選長度。例如，條件 取決于所用毛細(xì)管的長度。宜采用長時間低壓力注入樣品。在一實(shí)施方式中，樣品注入 時間3分鐘以上，例如，在14-35kPa壓力下注入約3-4.5分鐘，優(yōu)選21_28kPa約3.5-4 分鐘，最優(yōu)選約2IkPa約4分鐘。這些條件適合于，例如，有效長度約35-45cm，如約 39cm的毛細(xì)管。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本方法包括在步驟i)之前，按流體動力學(xué)法用水預(yù)先注 入毛細(xì)管，優(yōu)選以l_34kPa注入2-10秒，更優(yōu)選以7kPa注入5秒。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本方法包括在步驟i)與ii)之間，按流體動力學(xué)法用水 后注入毛細(xì)管，優(yōu)選以l_34kPa注入2-10秒，更優(yōu)選以7kPa注入5秒本方法優(yōu)選包括在步驟i)之前按流體動力學(xué)法用水預(yù)先注入毛細(xì)管，和在步驟 i)與ii)之間，按流體動力學(xué)法用水后注入毛細(xì)管。在本發(fā)明方法中，宜進(jìn)行洗滌步驟，如在用水預(yù)先注入之前和/或注入樣品之 后進(jìn)行洗滌以減少污染。例如，可通過使毛細(xì)管二端接觸水進(jìn)行洗滌。在本發(fā)明方法中，宜用200-275V/cm，更優(yōu)選約200_255V/cm或約250V/cm進(jìn) 行分離?？捎媚苓_(dá)到所需應(yīng)用要求的靈敏度的合適方法檢測毛細(xì)管中的核酸。例如熒光 檢測，其檢測下限的靈敏度和選擇性極佳(即高靈敏度)，特別是如果激發(fā)光采用激光時 (激光誘導(dǎo)的熒光，LIF)。LIF的靈敏度比UV檢測高約2-100倍，可提供非常高的線性信號。在極端例子中，其靈敏度可延伸檢測到單個分子。因此，在本發(fā)明方法中，宜用 激光誘導(dǎo)的熒光檢測。對于DNA檢測，可采用不同方式的LIF檢測。第一種方法依據(jù)天然DNA在 低等UV(激發(fā)下)發(fā)出的天然熒光?？捎闷浞治鎏烊画h(huán)境中的DNA。例如，采用KrF 248nm脈沖激光或275nm的UV激光或此范圍或類似范圍波長的激光作為激發(fā)光源。第 二種變化采用間接熒光。在核苷酸或DNA分離期間用激光(如325nm氦-鎘激光)激 發(fā)毛細(xì)管區(qū)帶電泳系統(tǒng)的熒光。常用進(jìn)一步方法對DNA測序并需要用合適的熒光團(tuán)直接 共價標(biāo)記分析物。在該方法的最廣泛使用中，采用了能整合入核酸改變其分子長度、構(gòu)象和電荷 的嵌入性染料。該染料與核酸形成的復(fù)合物在激發(fā)波長光照射下可發(fā)出強(qiáng)熒光，而游 離染料則不能。此法488nm的氬離子激光最適合。溴化乙錠是最常用的嵌入性染料。 此外，也可購得其衍生物，常見為單體或二聚體嵌入劑。例如，噻唑黃染料(TO)有非 常高的檢測靈敏度。染料POPO-3、YOYO-3和YOYO-I甚至更靈敏。優(yōu)選的染料是 EnhiinCE染料(BC公司(Beckimn Coulter)，富勒頓(Fullerton)，美國)。其它有用的染 料參見 WO 03/089586。在本發(fā)明上下文中，毛細(xì)管凝膠電泳的分離液宜含適合檢測核酸的染料，優(yōu)選 嵌入性染料，最優(yōu)選EnhanCE染料。毛細(xì)管柱中的核酸被染色。所用的EnhanCE染料 濃度宜為每毫升(ml)分離液約0.25-1微升(μ 1)，最優(yōu)選每毫升分離液約0.5微升染料。在本發(fā)明一實(shí)施方式中，通過毛細(xì)管凝膠電泳分離待分析樣品中DNA的存在， 所述DNA優(yōu)選基因組DNA或其降解產(chǎn)物，包括以下步驟i)以約21-28kPa壓力，用流體動力學(xué)法注射約3-4.5分鐘，優(yōu)選以約28kPa壓力 注射約4分鐘，將樣品注入毛細(xì)管有效長度的約30%，ii)在約255V/cm下分離核酸，iii)用激光誘導(dǎo)的熒光檢測核酸。還包括在步驟i)前流體動力學(xué)法用水預(yù)先注入毛細(xì)管，宜用約7kPa注入約5 秒，還包括在步驟i)與ii)之間，流體動力學(xué)法用水后注入毛細(xì)管，優(yōu)選約7kPa注 入約5秒，其中在用水預(yù)先注入水之前和/或注入樣品后進(jìn)行洗滌步驟，其中分離緩沖液包含嵌入性染料，優(yōu)選EnhanCE染料，例如其濃度為每毫升分 離液0.5微升染料。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，如果采用內(nèi)標(biāo)來劃分相對遷移率值，可進(jìn)一步提高此法常規(guī)應(yīng)用的 可靠性。內(nèi)標(biāo)與樣品一起分離，可在注入樣品前將其直接注入，優(yōu)選約7-35kPa，約1-20 秒；最優(yōu)選約20kPa或約21kPa，約10秒。然而，如下文所述，也可參考除遷移外的 時間進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所選擇的內(nèi)標(biāo)應(yīng)能最大程度減少0對檢測樣品中核酸的干擾風(fēng)險。 在分析流感疫苗產(chǎn)品的樣品時，該ISTD可以是，例如單鏈或雙鏈DNA片段，特別是長 10-300bp,例如約20-200bp的雙鏈DNA片段。ISTD也可以是不到50bp的單鏈DNA， 例如23bp的單鏈DNA引物。在一實(shí)施方式中，ISTD是IObp的雙鏈DNA。它通常在 第一種核酸樣品之前即檢測到，因此它標(biāo)志已開始檢測核酸了，也可作為檢測的對照。
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為有利于分析核酸的大小，可在樣品中加入至少一種大小明確的感興趣核酸， 例如長約200bp，約500bp和/或約2000bp的DNA。也可將這種大小明確的核酸摻入到 內(nèi)標(biāo)中。此外或或者，可在注入水塞子后和注入樣品前，施加可檢測熒光染料如熒光黃 染料溶液，如用水1 10稀釋的熒光黃液。在約7-34kPa下，例如以流體動力學(xué)方法注 入熒光黃液2-10秒，優(yōu)選約21kPa，約5秒。在最小的標(biāo)準(zhǔn)品峰之前可檢測到此峰作為 兩末端首先，它是標(biāo)準(zhǔn)品的移動標(biāo)志，其次，它可作為激光的對照?？蓪STD和可檢測熒光染料溶液一起或以任何一種順序分別注入。也可將其一 種或二種與樣品混合。對于含中性內(nèi)涂層，優(yōu)選聚丙烯酰胺涂層的融合二氧化硅毛細(xì)管，已測定了其 樣品加載和樣品分離的最優(yōu)選參數(shù)。毛細(xì)管內(nèi)徑宜為75-125 μ m，優(yōu)選約100 μ m。最優(yōu)選采用BC公司eCAP dsDNA試劑盒中裝的毛細(xì)管(eCap DNA毛細(xì)管， 100 μ m內(nèi)徑，477477)。可將給定的參數(shù)轉(zhuǎn)換為其它中性涂層毛細(xì)管的參數(shù)。對于其它 毛細(xì)管，所需設(shè)置可在具體給定的范圍內(nèi)略微改變以獲得最佳結(jié)果。本發(fā)明人已證明， 可采用不同的毛細(xì)管和毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)進(jìn)行，例如聚乙烯醇涂層(PVA)毛細(xì)管(安 捷倫科技公司(AgilentTechnologies)，產(chǎn)品編號G160U-61419)實(shí)施本發(fā)明方法。為改善毛細(xì)管的穩(wěn)定性，常存在聚酰亞胺外涂層。優(yōu)選在毛細(xì)管兩端外側(cè)2mm 沒有此涂層以改善本方法的穩(wěn)定性。此外，需要去除檢測部位的外涂層。分析前，必須洗滌毛細(xì)管并平衡以確保背景信號低和高質(zhì)量檢測樣品。雖然可采用較長的毛細(xì)管，例如有效長度為50cm的60cm毛細(xì)管，但發(fā)現(xiàn)如果 有效長度約29-50cm，如39cm或約40cm(例如總長度為49cm或約50cm)不影響結(jié)果的質(zhì) 量?？s短毛細(xì)管長度導(dǎo)致分離時間縮短。根據(jù)有效長度，分離需要40分鐘或更長。分 離宜進(jìn)行約40-55分鐘，優(yōu)選約45分鐘，已證明此時間足以檢測約IO-IOOOObp的DNA。 如果需要，可改變檢測時間以檢測感興趣大小的核酸。分離時該系統(tǒng)的溫度約為17_30°C，優(yōu)選約18_25°C。發(fā)現(xiàn)用約20°C可獲得最佳結(jié)果。為消除毛細(xì)管中形成微小氣泡可能帶來的問題，分離期間可向毛細(xì)管施加約 14-69kPa,優(yōu)選約34kPa的壓力。優(yōu)選用于本發(fā)明方法的毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)是PACE MDQ分子特征分析系統(tǒng)或 ProteomeLab PA 800蛋白特征分析系統(tǒng)(BC公司)。優(yōu)選的分離緩沖液是pH8-9.5，優(yōu)選pH8.8的低粘度非交聯(lián)生理凝膠緩沖液。該 分離液含聚丙酰胺，可以是Tris-硼酸鹽緩沖液(Tris-Borat Buffer)。例如，可采用BC公 司eCAP dsDNA試劑盒中裝的分離液。所述樣品溶于與毛細(xì)管凝膠電泳相容的樣品緩沖液中，優(yōu)選該緩沖液是 Tris-HCI 緩沖液(10mM，pH8-9 最優(yōu)選 pH8.8)。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，待分析的樣品是用于治療或疫苗的藥物組合物或 給予哺乳動物，特別是人的其他組合物。待分析樣品宜含基因組DNA和/或DNA的降 解產(chǎn)物。最優(yōu)選樣品是加工過程中的樣品或加工過程中的疫苗制品，具體是流感疫苗的 最終產(chǎn)品，例如，這些制品可以是以下定義的B1-B8的任何一種，或是疫苗制品的單價或三價半成品。所述樣品也可以是食物產(chǎn)品，如轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的食物產(chǎn)品，例如，需 要證明該食物產(chǎn)品不含有顯著量的DNA，特別是某些大小的DNA。優(yōu)選所述疫苗是細(xì)胞培養(yǎng)，例如MDCK、PER.C6、Vero細(xì)胞培養(yǎng)制備的流感疫 苗。所述疫苗可含完整的病毒顆粒，裂解的病毒顆?；蚣兓谋砻嫣堑鞍住７治隽鞲挟a(chǎn)疫苗產(chǎn)品，或通常是適合給予哺乳動物的組合物樣品時，宜用本發(fā) 明方法分析宿主細(xì)胞的DNA，優(yōu)選基因組DNA和/或其降解產(chǎn)物。這種DNA和DNA 降解產(chǎn)物的長度可以不明確，然而，本方法也可有利地應(yīng)用于檢測其它樣品中的DNA， 例如，分析長度明確的DNA、基因治療用的載體、RNA或ssDNA。優(yōu)選用本方法證明 樣品(例如疫苗制品)中不含潛在的致癌性DNA?？捎行У赜帽景l(fā)明方法證明樣品(如疫苗制品衍生的制品)沒有潛在的致癌潛 能，即不含長度500bp或更長，優(yōu)選400bp或更長，更優(yōu)選200bp或更長的DNA片段。對于某些樣品，特別是下文詳述的含有顯著量蛋白質(zhì)或高濃度鹽的那些樣品而 言，如果在毛細(xì)管電泳加樣前用以下方法預(yù)處理樣品可獲得好得多的結(jié)果，預(yù)處理方法 包括以下步驟i)優(yōu)選在存在SDS時用蛋白酶K消化樣品，和 )提取核酸。這種預(yù)處理具體可提高注入方法的質(zhì)量和靈敏度，特別是存在污染物，如蛋白 質(zhì)和/或鹽時。也可利用核酸提取來濃縮樣品，以提高本法的整個檢測下限。采用提取 核酸濃縮約10倍可獲得可靠的結(jié)果。提取核酸后宜將其溶于合適的緩沖液，如上文所述 的CGE的樣品緩沖液中。宜采用依據(jù)吸附于珠子，例如磁珠的核酸提取方法?？刹捎昧_氏(Roche)的 MagNA純化⑧系統(tǒng)提取核酸。因此本發(fā)明提供的DNA分析方法聯(lián)用了核酸提取和CGE。宜用本發(fā)明方法定量分析核酸，對于一種尺寸的DNA片段靈敏度可達(dá)至少 100pg/ml、至少 80pg/ml、至少 50pg/ml、至少 10pg/ml、至少 9pg/ml、至少 5pg/ml、 至少2pg/ml或至少lpg/ml。可采用約Ipg的，例如200bp、500bp或2000bp —種大小 的DNA加入樣品中，以提供可良好識別的標(biāo)記。檢測下限宜至少為200fg的一種尺寸 DNA,優(yōu)選至少20fg的一種尺寸DNA。一方面，本發(fā)明提供測定核酸大小的方法，包括實(shí)施上述方法。其中通過與內(nèi) 部或外部大小標(biāo)準(zhǔn)品或與加入樣品中所用的核酸進(jìn)行比較，測定核酸的大小分布。在一 實(shí)施方式中，即分析流感疫苗產(chǎn)品時，應(yīng)在電泳各系列樣品之前和之后，電泳所用的外 部大小標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明也提供測定樣品中核酸大小分布的方法，包括實(shí)施上述方法，其中，通 過與內(nèi)部或外部大小標(biāo)準(zhǔn)品或與加入樣品中所用的核酸進(jìn)行比較，測定核酸大小的分布。優(yōu)選將本方法檢測到的信號轉(zhuǎn)變成能顯示強(qiáng)度和時間或遷移率的曲線，并與大 小標(biāo)準(zhǔn)品或加入樣品中所用核酸的時間或遷移率作比較，來評估核酸的大小。如果對樣品中的核酸大小分布感興趣，可對其進(jìn)行分析以測定在感興趣大小 范圍內(nèi)(如200bp或更多，250bp或更多，300bp或更多，400bp或更多，500bp或更 多)的核酸。為此，可計算出感興趣大小范圍內(nèi)(即感興趣大小范圍二端點(diǎn)之間的，如0-500bp)曲線下的面積，并與曲線下總面積相比，以獲得大小在感興趣范圍的核酸的百 分比。由于本發(fā)明方法靈敏、可靠和牢固，故可有利地用于含治療或疫苗用蛋白質(zhì)或 核酸樣品的質(zhì)控。因此，優(yōu)選在制成疫苗，優(yōu)選流感疫苗后或其制備的同時使用本方 法。一方面，本發(fā)明提供給予哺乳動物組合物的制備方法，其中用本發(fā)明方法分析 這種組合物的樣品。所述組合物優(yōu)選藥物組合物，最優(yōu)選疫苗，例如流感疫苗。所述樣 品也可來自食品，例如轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的食品，以證明該食品不含有顯著量的DNA，特 別是某些大小的DNA。本發(fā)明還提供分析樣品中核酸的存在和/或大小分布的方法，所述樣品例如疫 苗(如流感疫苗)制備不同階段的樣品，包括通過毛細(xì)管電泳分離樣品并用激光誘導(dǎo)的熒 光檢測核酸。所述核酸優(yōu)選基因組DNA和/或DNA的，特別是基因組DNA的降解產(chǎn) 物。所述樣品可以是最終產(chǎn)品制備過程中的樣品，例如流感疫苗制備中的單價或三 價半成品?？捎欣夭捎妙A(yù)處理和/或加載樣品及進(jìn)行分析的該優(yōu)選方法，以實(shí)現(xiàn)該方 法的最優(yōu)靈敏度和可靠性?？捎欣夭捎迷摲椒▉碜C明樣品(例如給予哺乳動物的組合 物，如疫苗制品，特別是通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的流感病毒制品)不含有(或不含有某種有害 量的)致癌潛能的核酸，這種核酸的長度，例如為200bp或更多，250bp或更多，300bp 或更多，400bp或更多，500bp或更多。因此，可用本方法來檢測樣品的致癌潛能和/或 功能性基因的存在。本發(fā)明也提供檢測組合物，特別是給予哺乳動物的組合物，例如疫苗制品致癌 可能性的方法，其中，優(yōu)選按本發(fā)明方法，用毛細(xì)管凝膠電泳分析該組合物中的基因組 DNA或其降解產(chǎn)物。本發(fā)明也涉及用本發(fā)明方法分析疫苗。在下文中描述了導(dǎo)致本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)及其優(yōu)選實(shí)施方式，目的是描述而不是限制 本發(fā)明。技術(shù)人員不難明白，可對其作出修改，某些優(yōu)化步驟可有利地與或不與其它方
法一起使用。本文引用的所有出版物的內(nèi)容全部納入本文。附1用毛細(xì)管凝膠電泳分析含大量DNA污染的流感疫苗發(fā)酵培養(yǎng)過程中的樣 品，以103kPa通過流體動力學(xué)方法注入不稀釋的樣品30秒。樣品B3和B4的標(biāo)尺小5倍。圖2.用毛細(xì)管凝膠電泳分析MDCK基因組DNA，與Ikb標(biāo)準(zhǔn)品比較，以7kPa 通過流體動力學(xué)方法注入樣品10秒。括號內(nèi)的號碼表示校準(zhǔn)峰的標(biāo)準(zhǔn)化時間點(diǎn)。圖3.用6.7/6.8所述的方法分析B3樣品。圖示測定的尺寸范圍。圖4用6.7所 述的本發(fā)明方法分析含最低濃度DNA (用域試驗(yàn)Threshhold assay)測定< lng/ml)的 B8樣品。圖示測定的尺寸范圍。沒檢測到大于21bp的核酸。圖5.用6.7所述方法分析Ikb的標(biāo)準(zhǔn)品，以IOkV注入樣品30秒。圖6.分析不經(jīng)處理(上面的曲線)和用β-丙內(nèi)酯預(yù)處理16小時(下面的曲線) 的IObp標(biāo)準(zhǔn)品(起始濃度10 μ g/ml)，以9kV注入樣品5秒。糾正尺寸后，甚至在最低
10濃度時仍可檢測到1668bp峰。圖7.按照Ikb標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)(23個堿基ssDNA)的遷移率校準(zhǔn)后，諸峰的鑒定。圖8.十次發(fā)酵物8步加工過程中的DNA總含量比較(DNA含量μ g，加工過程 中的對照為B1-B8)。圖9.流體動力學(xué)注入(HD)樣品(含1 μ g/ml的194bp片段)到不同長度毛細(xì) 管中與窗口的比較。X軸長度占窗口的％，Y軸任意單位(32Karat軟件提供的絕對 值)，第一值194bp峰的峰高，第二值194bp峰的峰面積。

圖10.CGE分離通過流體動力學(xué)注入毛細(xì)管加入了 A: 25%和B: 50%的示范 性樣品(3psi/21kPa，A: 3.75分鐘，B 7.5分鐘)與檢測窗口的比較，各有三種濃度 (上-3- lng/ml,中 _2_ 100pg/ml,下 10pg/ml)。圖11.流感病毒株與標(biāo)記物濃度的CGE分析。CGE分析(以3psi (21kPa)通過 流體動力學(xué)方法注入檢測器窗口的30%長度)1-dsDNA 1000測試混合物，Beckman公 司，標(biāo)準(zhǔn)品100pg/ml。2-所羅門毒株(Solomon)，3-馬來西亞毒株(Malaysia)，4-威 斯康辛毒株(Wisconsin)。圖12.用CGE分析添加的樣品。以3psi(21kPa)通過流體動力學(xué)方法將樣品注 入檢測器窗口的30%長度1-經(jīng)添加的dsDNA標(biāo)準(zhǔn)品；2+3-布里斯班毒株，添加了長 度明確200bp、500bp和2000bp DNA片段的樣品(重復(fù)2次)。圖13.用CGE分析提取自經(jīng)蛋白酶K預(yù)處理的MDCK細(xì)胞的基因組DNA，和添 加的DNA提取物。添加了 200bp、500bp和2000bp明確長度DNA片段的基因組DNA(從 下到上1-經(jīng)添加的 dsDNA 標(biāo)準(zhǔn)品；2+3-10ng/ml MDCKDNA ； 4+5-110ng/ml MDCK DNA)。以3psi(21kPa)通過流體動力學(xué)方法將樣品注入檢測器窗口的30%長度。
實(shí)施例1.樣品為制備疫苗，按本領(lǐng)域已知方案采用MDCK細(xì)胞(Madin-Darby狗腎細(xì)胞)，例 如，制備得到EMEA承認(rèn)的Optafhi產(chǎn)品。優(yōu)選采用懸浮細(xì)胞系MDCK-CDM (諾華疫苗)。簡言之，為制備該流感亞單位疫苗，在MDCK-CDM懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)流 感病毒，通過包含幾個步驟的方法純化。離心澄清收集的病毒，過濾(0.45 μ m)后進(jìn)行陽離子交換層析。用NaCI溶液洗 與脫層析柱結(jié)合的病毒，然后濃縮病毒。用β-丙內(nèi)酯(BPL)滅活病毒也嚴(yán)重破壞了仍 存在的MDCK DNA。用CTAB (溴化十六烷基三甲基銨硝酸鹽)促溶亞單位疫苗制品的表面抗原、血 凝素和神經(jīng)氨酸酶，超離心去除病毒核心。去除CTAB。然后用22μιη膜過濾。這些步 驟之后為離子交換層析和雙向超濾。過濾后結(jié)束純化。借此獲得濃縮的抗原，也稱為單 價半成品或單價原料(monobulk)。將微膜過濾后的單價原料送到混合裝置中配成疫苗。該方法也可參見以下流程，其中給出了各步驟的體積，B1-B8表示在某確定步 驟后采樣 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，和
培養(yǎng)病毒 分離和過濾(Bi) 澄清收獲的病毒 陽離子交換層析(B2) 第一次濃縮/透析(B3) 滅活/水解(B4)· CTAB-處理 / 超濾 第一次除菌過濾(0.2 μ m) (B5) 吸附處理(30升) 第二次除菌過濾(0.2 μ m) (B6) 陰離子交換層析(B7) 第二次濃縮/透析(10升) 濃縮抗原/單價半成品(10升)獲得單價半成品后，制備含三株不同病毒(通常2個A株，1個B株)抗原的三 價半成品?，F(xiàn)有的疫苗大多數(shù)為三價疫苗。如果遵從了所有的規(guī)范和安全性要求，該疫 苗即可準(zhǔn)備銷售。注意，樣品B8對于該疫苗的分析和質(zhì)控有決定性的重要意義。在標(biāo)出的時間點(diǎn)采集的分析樣品可用作加工過程中的“窗口”。顯然，這些加 工過程中的樣品其化學(xué)組成互不相同。其所含DNA濃度的巨大差異可高達(dá)三個數(shù)量級。在簡單特征鑒定樣品的組成后，提出可能要分析的問題(引用的DNA含量是10 次連續(xù)分析的結(jié)果)是· Bl 澄清的收獲病毒污染有蛋白質(zhì)。DNA含量在100_4500ng/ml之間，包 括高含量的基因組DNA(高達(dá)40000bp)。蛋白質(zhì)可能有干擾影響到測定。這種可變的高 含量DNA可能導(dǎo)致凝膠超載。所選方法檢測的DNA大小范圍必須適合感興趣DNA分 子的大小?！う? 第一次濃縮步驟經(jīng)陽離子交換從CS下來的40%峰去除了部分DNA后， DNA含量在50-750ng/ml之間，但強(qiáng)污染蛋白質(zhì)和鹽(從柱上洗脫)。蛋白質(zhì)可能有干 擾影響到測定?！?B3 第二次濃縮步驟透析排除了 500kDa大小的DNA并交換緩沖液。蛋 白濃度1000-3000 μ g/ml。此外，樣品含多達(dá)5 μ g/ml的非離子洗滌劑吐溫80在加工 至單價半成品過程中沒有被去除可能會影響檢測結(jié)果。加工過程中DNA的最高濃度是 500-5500ng/ml,不同于 Bi?！?B4 與B3的差別只是加入了 BLP和培養(yǎng)了幾小時。DNA含量下降至 50-1200ng/ml,其特征改變。蛋白質(zhì)和洗滌劑含量類似于B3。·Β4 膜蛋白已被CTAB溶解并進(jìn)行了超濃縮。CTAB含量在800-3000 μ g/ml
之間。洗滌劑和蛋白濃度類似于B3。DNA含量降至5-26ng/ml。·Β6 CTAB已去除，樣品已過濾除菌。洗滌劑和蛋白含量降低。DNA含量 < l-15ng/ml,直到加工結(jié)束不變?！う?已進(jìn)行了最后的陰離子交換層析純化步驟。其余物質(zhì)含量類似于Β6?！う?:單價半成品。該物質(zhì)已經(jīng)過透析/超濾和緩沖液交換，導(dǎo)致蛋白濃度升
12高約2倍。這是分析DNA大小的最重要樣品。蛋白含量1500yg/ml，DNA含量不到 lng/ml (低于常規(guī)檢測下限)-15ng/ml。2.樣品預(yù)處理根據(jù)要分析的樣品，樣品的預(yù)處理可以不同，例如可改變各步驟的順序以獲得
最佳結(jié)果。2.1 蛋白酶 K對于某些實(shí)驗(yàn)(見下文)，用蛋白酶K消化樣品，此步可去除干擾性蛋白質(zhì)，特 別是核酸酶。Iml樣品用20 μ 1不稀釋的酶貯存液(2mg/ml蛋白酶K，分類號19133，恰根公 司(Qiagen))，560C (水浴，士3°C )培育 16_20 小時。發(fā)現(xiàn)如果存在SDS時進(jìn)行消化可獲得更好結(jié)果。將2% SDS液以1 1加入蛋 白酶K液(2mg/ml)中。用50 μ 1此混合液消化500 μ 1樣品。混合后培育混合液過夜 (56°C, 16-20 小時)。2.2DNA 提取可利用DNA提取來純化樣品中的DNA，例如去除污染的蛋白質(zhì)和鹽，以及任選 濃縮樣品?？捎肳ako純化化學(xué)產(chǎn)業(yè)公司(Wako Pure Chemical Industries)的碘化鈉法試劑
盒，按照廠商說明書提取DNA?；蛘?，用羅氏的MagNA pure 系統(tǒng)，按照廠商說明書提取DNA。這樣可以自 動化進(jìn)行該提取?？蓪?shí)現(xiàn)DNA濃縮10倍。2.3 濃縮真空離心(Speedvak) 60分鐘完全干燥DNA提取物(500 μ 1)純化樣品。用10 μ 1
水不能成功溶解沉淀物。提高溶劑體積至50μ1(濃縮10倍)只導(dǎo)致部分成功。樣品沉 淀物中能很好溶解的DNA含量低，而樣品的其它沉淀物不能完全溶解。以下實(shí)驗(yàn)不再采 用此法。接著，用濾膜濃縮，檢測了排除分子大小為3kDa和IOkDa的親水性纖維素膜 (密里博公司(Millipore)，Microcon YM-3和YM-10膜)。所用的最大載量為500 μ 1。 當(dāng)濾膜上不再有液體流出時停止離心，然后，以推薦的時間最大速度離心濾器2次。如 果濾膜上仍有液體，懷疑濾膜已堵塞不再適合濃縮各自樣品。所用濾膜的死腔為10 μ 1， 因此理論上的濃縮了 50倍。離心時采用以下參數(shù)3kDa 膜14000g，100 分鐘，25°ClOkDa 膜14000g，30 分鐘，25°C收集濃縮的樣品時，倒置濾器蓋上新蓋子后離心(1000G，3分鐘，25°C)。發(fā)現(xiàn)含蛋白質(zhì)的樣品不經(jīng)預(yù)處理時不大適合用此法濃縮。此例中兩種膜均易堵 塞。只用蛋白酶K消化的樣品必須離心二倍時間。對于樣品Bl和B3，用3kDa膜仍堵 塞。用IOkDa膜時間縮短并獲得了好得多的結(jié)果。比較性實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)未顯示)證明不會 丟失IOO-IOOObp感興趣的DNA片段，膜離心可實(shí)現(xiàn)濃縮40倍。離心膜濃縮DNA可以用于或不用于本發(fā)明方法的樣品預(yù)處理。
3.DNA的定量測定可根據(jù)260nm吸光值測定核酸濃度(與之相比，蛋白質(zhì)用280nm吸光值)。然 而，其檢測下限約為0.25 μ g/ml，因?yàn)槠渌鼛追N物質(zhì)也吸收同一波長光?？兹妇GdsDNA定量試劑(分子探針公司)依據(jù)熒光染料的高靈敏度，其檢測下 限為約312pg/ml dsDNA。此法也適合檢測RNA或ssDNA，該試驗(yàn)快速而且相當(dāng)便宜。 然而，取決于樣品中污染物的濃度其結(jié)果差別高達(dá)30%?？衫么嗽囼?yàn)的結(jié)果估計樣品 的DNA濃度。宜用Threshold 系統(tǒng)[分子裝置公司(Molecular Devices)的 Threshold ⑧總 DNA
檢測試劑盒]測定DNA濃度。用小牛胸腺DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品。疫苗產(chǎn)品加工過程各步驟的所有樣品經(jīng)過以下預(yù) 處理56°C蛋白酶K-SDS消化16-20小時(見上文)，用商品化試劑盒提取DNA。105°C 變性對照品、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品15-30分鐘，如此以后存在的樣品為ssDNA。37°C培育所有 樣品與標(biāo)記試劑(生物素化-SSB (單鏈結(jié)合蛋白)和偶聯(lián)脲酶的DNA抗體60分鐘。用 含結(jié)合有鏈霉親和素的硝酸纖維膜的專用濾器過濾獲得反應(yīng)復(fù)合物。洗滌步驟后，將濾 膜放入充滿底物液的電勢檢測器中開始檢測。脲酶催化脲降解導(dǎo)致表面電勢變化。電壓 隨時間變化的曲線與樣品中DNA的濃度成比例。動態(tài)記錄數(shù)據(jù)并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。 聯(lián)用本發(fā)明方法檢測核酸大小的分布，例如用Threshold 系統(tǒng)檢測DNA的絕對含量，可 用于定量特定大小的核酸。4.瓊脂糖凝膠平板電泳按照廠商方案采用含溴化丙錠(EtBr)的即用型凝膠盒(因維曲根公司 (Invitrogen))。根據(jù)DNA的大小范圍，采用0.8%、1.2%, 2%和4%濃度的凝膠。60V 分離38分鐘。采用1 200稀釋的lkb+DNA梯標(biāo)準(zhǔn)品(因維曲根公司)作為大小標(biāo)記 物。為改進(jìn)靈敏度，打開凝膠盒用SYBR -金(分子探針公司(MolecularProbes)， 尤金，美國)染色凝膠30-45分鐘。按廠商說明書用TE緩沖液1 10000稀釋濃染料 (分子探針公司，產(chǎn)品信息，2001綜述)5天后更換稀釋液。用SYBR 金染色凝膠 30-45分鐘，靈敏度比Effir染色提高5倍。采用含最高濃度DNA的系列產(chǎn)品。先分析 含最高濃度DNA的二個樣品，作為DNA濃度的參比品，采用Threshold 總DNA試驗(yàn)。 所用的這二個樣品不經(jīng)預(yù)處理，或用蛋白酶K消化后不經(jīng)DNA提取。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過預(yù)處理與 不經(jīng)預(yù)處理的差異顯著是由于蛋白質(zhì)與DNA之間發(fā)生相互反應(yīng)所致(數(shù)據(jù)未顯示)。有 可能是形成的較大復(fù)合物不能遷移入凝膠中?？捎妹赶鉀Q這些問題。提取DNA不 會導(dǎo)致此法進(jìn)一步優(yōu)化。因此，可證實(shí)對這些樣品的預(yù)處理達(dá)到了改進(jìn)檢測的目的。用同一系列的所有加工過程中的樣品重復(fù)該試驗(yàn)。在此實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DNA提取沒 有干擾化合物有助于獲得清晰的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，單用蛋白酶K處理不能去除B2樣 品中的高濃度鹽和B5樣品中的CTAB(溴化十六烷基三甲基銨硝酸鹽)干擾。DNA提取 則去除了所有的這種干擾物質(zhì)。然而，分析顯示取自加工后續(xù)步驟或終末產(chǎn)品的樣品中的DNA濃度不夠高不能 用本方法檢測。為獲得關(guān)于靈敏度的清晰結(jié)果，分析了 MDCK細(xì)胞基因組DNA的系列 稀釋液(數(shù)據(jù)未顯示)。
發(fā)現(xiàn)可檢測的最低DNA濃度為lOng/ml。這證明需要建立更靈敏的DNA分析 方法，因?yàn)橐呙缟a(chǎn)過程中，從樣品B5開始，可能已經(jīng)達(dá)到這種DNA濃度。分析關(guān)注于DNA的大小分布。顯示用1.2%瓊脂糖凝膠電泳不能檢測到任何樣 品中的小于IOObp的片段。相反，用毛細(xì)管電泳可檢測到許多小于IOObp的片段，特別 是用β-丙內(nèi)酯處理后。觀察凝膠平板中的此大小范圍，采用4%瓊脂糖凝膠與0.8%瓊脂糖凝膠相反， 分析了 2個單價半成品(Β8)的樣品。0.8%凝膠不適合分離小片段，它們滯留在膠的上 端呈現(xiàn)為錯誤大小的條帶。4%凝膠較適合檢測小片段。因此，需要二種濃度的瓊脂糖 凝膠來分析全部大小范圍的DNA。5.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺可制備成清澈的非常薄的凝膠(Imm)，產(chǎn)生非常清晰的細(xì)條帶。對于聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用4-20% TBE (Tris-Borat-EDTA緩沖液，Novex 公司)的梯度膠。200V下分離35分鐘。用SYBR -金染色凝膠。采用1 200稀 釋的1Kb+標(biāo)準(zhǔn)品作為大小標(biāo)志。分析了加工過程中的全系列樣品(Β1-Β8)(數(shù)據(jù)未顯 示)°與瓊脂糖平板凝膠相比，獲得的條帶更明確，特別是低于IOOkb的感興趣范圍 的DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳對分析全范圍大小的片段更佳。然而，平板聚丙烯酰胺凝膠電泳對后續(xù)加工過程中樣品的核酸檢測不能達(dá)到所 需靈敏度。此外，此法費(fèi)用高還需要處理有毒性的丙烯酰胺。6.毛細(xì)管凝膠電泳6.1分離系統(tǒng)的基礎(chǔ)設(shè)置用BC公司的P/ACE分子特征系統(tǒng)進(jìn)行分離。采用激發(fā)光波長為488nm的氬 離子激光，濾去520nm的發(fā)射光進(jìn)行檢測。此系統(tǒng)所用的毛細(xì)管是融合的二氧化硅毛細(xì) 管，內(nèi)徑100 μ m，內(nèi)側(cè)有中性涂層(eCapdsDNA試劑盒，BC公司)。也可采用其它材 料的毛細(xì)管。該中性涂層(聚丙烯酰胺親水表面)可以幾乎完全抑制電滲流(EOF)和最 大程度減少分析物與毛細(xì)管內(nèi)表面的相互作用。這二種功能改善了條帶的清晰度和重復(fù) 性。采用雙涂層來覆蓋毛細(xì)管內(nèi)表面。第一涂層結(jié)合于融合二氧化硅毛細(xì)管的游離 硅醇基團(tuán)而覆蓋內(nèi)表面。親水聚丙烯酰胺第二涂層降低了疏水相互反應(yīng)。此涂層經(jīng)過約 200次或更多次分離后仍穩(wěn)定，可利用其中分離的彎曲力作為穩(wěn)定性喪失的指標(biāo)。檢測時需要去除覆蓋毛細(xì)管外表面約10 μ m厚的為改進(jìn)毛細(xì)管機(jī)械穩(wěn)定性的聚 酰亞胺涂層，因?yàn)榇送繉覷V光不能透過。最初使用的毛細(xì)管全長為60cm，有效長度為50cm。優(yōu)化過程中將其長度改為 50cm,有效長度為40cm(39cm)。用倒置電極，即檢測器在陽極端進(jìn)行所有的分離。所 用分離液為pH8.8-8.9的-Tris-硼酸鹽緩沖液。該緩沖液屬于低粘度非交聯(lián)生理凝膠所 用，最適合本發(fā)明方法。它所含孔的動力學(xué)結(jié)構(gòu)對加熱不敏感。用前，以0.45μιη針筒 過濾器過濾并用超聲浴除氣10分鐘以防形成氣泡。每次用后更換凝膠基質(zhì)。第一次分離前，用新鮮緩沖液以136kPa(20psi(磅/平 方英寸)條件化新的毛細(xì)管，Ipsi對應(yīng)于6666894，75728034313Pa)。每次電泳前，用新鮮緩沖液以136kPa充填毛細(xì)管5分鐘。每次分離后，用緩沖液以204kPa洗滌毛細(xì)管5 分鐘。優(yōu)選洗滌步驟不用雙蒸水，因?yàn)檫@樣毛細(xì)管的條件化維持得更恒久，導(dǎo)致毛細(xì)管 內(nèi)涂層壽命更長。毛細(xì)管的容積為3.9 μ 1，所需的緩沖液用量可忽略不計。廠商提議分 離溫度采用20°C。LIF-檢測器參數(shù)的設(shè)置如下-動力學(xué)范圍100RFU-濾器常規(guī)濾膜-峰寬16-25-數(shù)據(jù)速率4Hz設(shè)置為“標(biāo)準(zhǔn)CE”并參比遷移時間進(jìn)行集成算法。按廠商方案[P/ACE MDQLIF檢測器手冊，718113-AB，BC公司，富勒頓，美國]和利用獲得的1.1因數(shù)進(jìn)行 LIF-單位的校正。6.2 優(yōu)化從一系列加工過程中的樣品選擇，采用DNA含量最高的二種樣品(B3和B4)。 如上所述采用該樣品的提取純化的DNA。首先，采用按照[eCapdsDNAlOOO，726412-C，BC公司的維護(hù)使用說明書]方
案的標(biāo)準(zhǔn)方法。電場強(qiáng)度200V/cm，以3kPa流體動學(xué)注入樣品19秒鐘。所用時間共 20分鐘。研究了毛細(xì)管柱加樣的參數(shù)和它們是否適合高靈敏度檢測基因組DNA并對這2 個選擇的樣品進(jìn)行優(yōu)化。β-丙內(nèi)酯處理疫苗制品的效果清晰可見。與Β3樣品相反，未測到基因組DNA 峰，但觀察到DNA降解成小片段(數(shù)據(jù)未顯示)。在長期貯存的Β3-樣品中，也觀察到基因組DNA降解成較小片段。例如，比較 了剛剛發(fā)酵生產(chǎn)的Β3樣品與4-8°C存4個月的Β3樣品(同一病毒株發(fā)酵生產(chǎn)的)?？?能由于樣品中的核酸酶活性最強(qiáng)使DNA降解成中等長度片段(20-25分鐘)。如果樣品 中存在核酸酶由于這種作用，必須立即用蛋白酶K處理樣品防止其降解才能分析。內(nèi)切 蛋白酶K特異性低，能降解和滅活所有的蛋白質(zhì)。后續(xù)加工過程的樣品(B4-B8)沒有觀察到這種作用?？砂踩卦O(shè)想下游加工中 這些酶不起作用。進(jìn)一步分析了維持參數(shù)與最佳結(jié)果的聯(lián)合效果。對加工過程中的全系列樣品進(jìn)行DNA提取純化并分析，以了解是否能測定所有 樣品中的核酸(圖1)。在這些初步實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)了幾個問題，主要是該分析的靈敏度不夠高不能分析 所有樣品中的核酸。此外，如預(yù)計的那樣，DNA不呈現(xiàn)為分開的細(xì)條帶峰，難以作出 精確的大小測定。此外，加工過程前3步樣品的全部DNA測得值與作為參比試驗(yàn)的 Threshold 試驗(yàn)(表明B3的DNA濃度比Bl高5倍)不相關(guān)。然而，從圖1可見，DNA 含量為980ng/ml的Bl樣品的電泳圖看來更類似于含12ng/m的B7樣品。6.3 校準(zhǔn)為定了量分析，必須有大小合適的標(biāo)準(zhǔn)品，目的是用于完全分離時的參比 品。比較了 IObp標(biāo)記(DNA梯，因維曲根公司，分類號10821-051)、Ikb標(biāo)記(eCAP
16IOOOdsDNA測試混合物，OX-174HaeIII，BC公司，分類號477414)和2kb標(biāo)記 (20.000dsDNA測試混合物，λ DNA/HindIII片段，BC公司，分類號477483)。評估的 標(biāo)準(zhǔn)是二種大小相鄰的DNA組分的基線能分開并能形成符合它們集成的峰。對分離時間 只有微小興趣。注意力集中在樣品中全范圍長度的DNA能否適當(dāng)分離。用上述標(biāo)記校 準(zhǔn)后顯示，采用所選基質(zhì)分離時，長約IOOObp的DNA停留在線性區(qū)。較短的bp范圍則 延伸到約IObp (數(shù)據(jù)未顯示)。如預(yù)計的那樣，對IOOObp以上的DNA區(qū)分能力降低，該分離基質(zhì)不大適合較大 分子。用毛細(xì)管電泳分析了 MDCK基因組DNA(圖2)。寬大MDCK峰表明DNA沒有 分離，可能不易分析其大小。然而，重點(diǎn)是可檢測存在的基因組DNA，這就足以解決本 發(fā)明的問題。在所選條件下，良好檢測基因組DNA需要35分鐘。如果將大小標(biāo)準(zhǔn)品與樣品共同注入可獲得最精確的定量結(jié)果。測試了在一次電 泳中是否可能分離上述所有3種大小的標(biāo)準(zhǔn)品(數(shù)據(jù)未顯示)，獲得了分離良好的峰。如 果已知樣品中要分離的DNA長度，共同注入看來是分析的好方法。然而，在DNA片段 的大小未知或大小與標(biāo)記物的大小相對應(yīng)時，此選項不宜，因?yàn)橛袠悠贩迮c標(biāo)記物峰堆 疊形成高峰的危險。在每次系列樣品分離開始與結(jié)束時，可用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)。對于本發(fā)明的分析，所 有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)優(yōu)選和采用Ikb標(biāo)準(zhǔn)品(最小條帶為72bp)。因?yàn)橛盟x基質(zhì)分離時，線 性范圍為10bp，據(jù)此推知可用于檢測72bp以下大小的DNA片段。宜以貯藏液濃度(如200 μ g/ml)貯藏標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)每天制備新鮮稀釋液。6.4分離長度和電場強(qiáng)度對于上述實(shí)驗(yàn)，以7kPa流體動力學(xué)注入樣品15秒后，以200V/cm倒置電極進(jìn) 行分離，毛細(xì)管有效長度為50cm，分離溫度20°C。用這些設(shè)置，可在約35分鐘內(nèi)分離 Ikb標(biāo)準(zhǔn)品。然而發(fā)現(xiàn)用250V/em獲得了非常好的結(jié)果，具體是分離效果較好，分析時間縮 短。用更高的電壓顯著降低了分辨率。因此，優(yōu)選用200-275V/cm分離，特別優(yōu)選 225-265或240-260V/cm。關(guān)于分析時間，所選的毛細(xì)管有效長度為40cm。這種變化 不影響分離效率。通過這些檢測，可將分析時間從35分鐘縮短至23分鐘。為了進(jìn)一步減少所需時間，分析了溫度對分離時間的影響。顯示分離溫度 30°C可減少分離時間，然而也減少了 271bp和281bp峰的分離。因此，分離溫度宜用 16-25 "C。選擇較高分離溫度時，應(yīng)對參數(shù)或基質(zhì)作進(jìn)一步修改。6.5改進(jìn)分析的質(zhì)量分析了幾種時間，樣品所攜帶的污染物。此外，對同一樣品反復(fù)分析所得結(jié)果
存在顯著差異。為解決此問題，注入樣品后，只簡單流體動力學(xué)注入水。令人驚奇的是，僅此 步驟就顯著改善了該分析的再現(xiàn)性。在毛細(xì)管每次接觸樣品小瓶之前和/或之后洗滌毛細(xì)管二端進(jìn)一步改善了檢測 結(jié)果。洗滌優(yōu)選將毛細(xì)管/電極二末端浸入小瓶的水中。為盡可能減少污染，應(yīng)用不同小瓶裝水洗滌和流體動力學(xué)注入水。所述水優(yōu)選純水，特別是蒸餾水或去離子水或雙蒸水。另外，如果(例如用火焰)去除毛細(xì)管兩端外面長約2mm的涂層將改善檢測結(jié)果。6.6靈敏度靈敏度問題證明瓊脂糖凝膠電泳的檢測結(jié)果和瓊脂糖凝膠電泳的初步結(jié)果(不 滿意)，具體說，當(dāng)用其分析含pg/ml濃度范圍DNA的單價半成品樣品時存在靈敏度不 夠的問題?，F(xiàn)已能廣泛選擇DNA的染料，例如嵌入性染料。特別是可用氬激光激發(fā)熒光 檢測的染料最適合用于本發(fā)明方法。優(yōu)選溴化乙錠或其衍生染料，特別是BC公司的 EnhanCE染料。宜將過量的該染料加入分離液來染色毛細(xì)管柱上的DNA。因此，不需 要在注入前使DNA與染料接觸。比較性實(shí)驗(yàn)顯示此法優(yōu)于將染料加入注入前的樣品中， 因?yàn)榇朔僧a(chǎn)生非常“平滑”的基線和高靈敏度。采用該染料可增強(qiáng)信號10倍(數(shù)據(jù)未顯示)。嵌入性染料使DNA分子增長從而 略為增加了分離時間。峰形增高看來是由于分子電荷改變所致。觀察到背景信號稍微升 高但恒定。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選在分離液中加入適合LIF檢測的以溴化乙錠衍生物為基 礎(chǔ)的嵌入性染料，具體說，每毫升分離緩沖液中加入0.1-5 μ 1，優(yōu)選0.5-1 μ 1的EnhanCE 染料。通過膜(0.22或0.45 μ m)過濾去除顆粒，超聲浴脫氣或抽真空濃縮10分鐘，然 后將染料加入制備的緩沖液中。加染料后不再過濾或脫氣，因?yàn)槿玖蠈@些處理敏感。 因此，應(yīng)均勻混合染料但不要引入空氣。最合適的方法是用移液器小心地反復(fù)吹吸該溶 液。該制品對光也敏感。稀釋后約10小時染料會降解從而限制了分離DNA序列的總時 間。技術(shù)上一次可分離約40份樣品，然而每次電泳總時間為40分鐘，染料不夠穩(wěn)定。 故優(yōu)選一次檢測最多15份樣品。6.7濃縮樣品對于核酸濃度非常低的樣品，如某些單價半成品樣品，本方法檢測核酸的靈敏 度仍不夠高?？赏ㄟ^離心濾膜濃縮樣品，具體是在提取DNA后，濃縮DNA可顯著提高檢測 靈敏度。提取DNA后樣品體積為500 μ 1。CE的最小體積為約10 μ 1。因此，如上文所 詳述通過離心膜最大可濃縮50倍。然而，由于本方法得到的濃縮液體積不同，有可能不 能精確確定濃縮倍數(shù)。改進(jìn)靈敏度的第二種可能方法是在線濃縮，然后做毛細(xì)管電泳[Osboum 等.，“毛細(xì)管電泳的在線預(yù)濃縮方法(On-linepreconcentrationmethods for capillaryelectrophoresis)，，，Electrophoresis 21 (2000) , 2768-2779 ； Quirino 等， “毛 細(xì)管電泳中的陽離子和陰離子分析物的樣品堆疊法，，，Journal ofChromatographyA, 902(2000), 119-135]。有二種可能的方法，一種流體動力學(xué)方法采用“放大電場的樣品 堆疊”法使樣品聚集(FASS)，或“放大電場的樣品注入法”利用電動力學(xué)注入使樣品聚 集(FASI)。對于FASS，必須將樣品溶于導(dǎo)電率比電泳緩沖液本身低的樣品緩沖液中，或最簡單的例子溶于水中。然后流體動力學(xué)注入樣品。在樣品液與該緩沖液之間的介面，核 酸分子在電壓作用下向介面加速移動從而使樣品聚集。在注入樣品之前先短暫塞住毛細(xì) 管同時注入高濃度緩沖液可增強(qiáng)這種作用。FASI利用電動力學(xué)注射將第一個小瓶中電導(dǎo)率低的樣品液注入裝滿(分離)液 的毛細(xì)管中。理論上，濃度差別高可導(dǎo)致強(qiáng)聚集。另一種注入大體積樣品的FASS法描述參見[Osboum等，“毛細(xì)管電泳的在線預(yù) 濃縮方法”，Electrophoresis 21 (2000)，2768-2779],該法基于EOF。實(shí)驗(yàn)表明此法不適
合用于上述有涂層的毛細(xì)管，因中其中的EOF不夠(數(shù)據(jù)未顯示)。嘗試了通過在出口 側(cè)施壓是否能補(bǔ)償EOF的缺乏，用此法在反向電壓作用下可去除樣品栓塞。然而，要找 到停止樣品聚集的最優(yōu)時間不能改變電流方向，故難以得到可重復(fù)的結(jié)果。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)關(guān)注于不用EOF而使樣品聚集。迄今描述的方法適應(yīng)于預(yù)先注入水的樣品動電注入。發(fā)現(xiàn)此步驟能顯著提高本 方法的靈敏度。為最大程度濃縮樣品，可聯(lián)用樣品在線聚集動電注入法與膜過濾濃縮樣品法。以下方案描述了樣品處理和在導(dǎo)致最佳結(jié)果的條件下用動電樣品注入進(jìn)行分 析。用蛋白酶K消化流感疫苗制品加工過程中的樣品(如56°C 1小時或過夜)，然后 提取DNA。離心濾膜(用截留值IOkDa的centricon膜)濃縮所得樣品(如500 μ 1)。在以下條件下用毛細(xì)管凝膠電泳分離10-25 μ 1樣品 通過流體動力學(xué)方法預(yù)先注入水，例如3kPa，5秒， 通過電動力學(xué)注入樣品，例如10kV，30秒， 然后通過流體動力學(xué)方法后注入水，例如lkPa，5秒， 用含DNA染料(如3 μ 1/ml EnhanCE)的分離緩沖液分離樣品，例如250kV， 35分鐘。在相同條件下每次系列分離開始和結(jié)束時同時電泳分子大小標(biāo)記物。如上所述，用蛋白酶K處理樣品和提取DNA只需用于蛋白含量顯著的樣品，如 B3樣品和/或含高濃度鹽樣品。然而，為更好地比較樣品，所有樣品應(yīng)同法處理。按照 此方案，完整分析了疫苗制備發(fā)酵過程幾個步驟的樣品。發(fā)酵開始時，存在的DNA為基 因組DNA，發(fā)酵結(jié)束時，此DNA受β-丙內(nèi)酯強(qiáng)烈處理而破壞。因此，出現(xiàn)寬大峰， 有時峰寬幾分鐘，使得難于精確劃定DNA片段的大小。6.8結(jié)果分析可利用時間或遷移率窗口來分析前文所述結(jié)果。優(yōu)選用遷移率代替時間來鑒定峰。此法可補(bǔ)償每次電泳所得結(jié)果的微小變化。 具體說，在依賴時間的峰鑒定時，聚丙烯酰胺網(wǎng)絡(luò)緩慢水解可導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)之間時間軸的 輕微倒退。如果各峰偏離了確定它們的時間窗口，就難以鑒定它們。遷移率是一種能確定帶電顆粒在電場中如何移動的定量參數(shù)。遷移率高的組分 移動比遷移率低組分快。遷移率不恒定，取決于分析時所選的參數(shù)，分離參數(shù)的變化， 如所提供電壓的變化或基質(zhì)緩慢水解，可采用遷移率明確的標(biāo)準(zhǔn)品來補(bǔ)償補(bǔ)償。一種先 決條件是用緩沖液保證ρΗ穩(wěn)定。
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遷移率的分析需要參比點(diǎn)，可選擇第一標(biāo)準(zhǔn)品的峰(72bp)作參比點(diǎn)。分析軟件32kanit 可分析與所選大小范圍相對應(yīng)的時間窗口?？偨Y(jié)此大小范圍 內(nèi)的峰計算出它們的面積。因此，可測定某大小范圍DNA占總面積的比例(圖3)。分析含最低濃度DNA的B8樣品(用threshold 試驗(yàn)檢測< lng/ml)時，可測 出18-21bp的DNA片段?？捎帽景l(fā)明方法顯示樣品所含的短于21bp的核酸片段。6.9測定靈敏度介限分析了相隔Ikb大小的DNA片段系列稀釋液以測定本法的靈敏度介限。只將信 /噪比大于3的峰視為峰?？蓽y得標(biāo)準(zhǔn)品DNA的最低濃度為lOOpg/ml。不能將這些結(jié) 果與用單一 DNA組分測定的瓊脂糖凝膠電泳可檢測的最低DNA濃度直接相比。相反， 上述Ikb標(biāo)準(zhǔn)品含有11種片段，不能定量算出其組成各組分的量。為了能估計出關(guān)于最 小DNA片段(72bp)的靈敏度，計算出其相應(yīng)峰面積占總面積的百分比(0.69%)，所測 定72bp片段的濃度為約0.7pg/ml。基于毛細(xì)管凝膠電泳方法的靈敏度比瓊脂糖凝膠高14000倍！此靈敏度只適用 于檢測一種長度的DNA片段。這解釋了檢測含lng/ml DNA的樣品為何需要濃縮步驟。靈敏度取決于DNA片段的長度，因?yàn)檩^長的片段可嵌入更多的染料導(dǎo)致更強(qiáng)的 信號(圖5)。6.10最大程度減少分析費(fèi)用在研究過程中調(diào)查了不會直接影響分離效果，但極大影響實(shí)驗(yàn)成本的幾種情 況。所用的最貴試劑是分離液。按廠商(BC公司)的標(biāo)準(zhǔn)方案所提議，采用了 2ml 貯液小瓶。在調(diào)節(jié)毛細(xì)管溫度的同時，通常在室溫下將電極和毛細(xì)管末端浸入小瓶的分 離液中。這可導(dǎo)致緩沖劑快速水解從而喪失篩濾作用。此外，該染料超過一天就不穩(wěn) 定，有給樣品帶來污染的危險，因而優(yōu)選每日更換緩沖液小瓶。發(fā)現(xiàn)優(yōu)選200 μ 1的PCR小瓶用作毛細(xì)管凝膠電泳分離液的貯藏瓶。根據(jù)所測定 的電流，測得每對貯藏分離液的小瓶分離液最佳最多裝5次分離用液，而觀察到區(qū)分能 力不降低。一項代表性的計算證明這樣可實(shí)現(xiàn)顯著的節(jié)約。因此，裝有60ml分離液的 試劑盒價格為900C。按廠商提出的方法，可作約150次電泳。用更小的貯液瓶裝同樣 量的分離液可作600次電泳。因此，此種小瓶費(fèi)用雖低但能有效測定。毛細(xì)管凝膠電泳試劑盒提供多個200 μ 1小瓶的分離液。優(yōu)選該試劑盒裝有 合適的染料如EnhanCE染料，和標(biāo)準(zhǔn)品如BC公司的Ikb標(biāo)準(zhǔn)品(HaeIII限制酶消化的 OX-174DNA,含72bp_l,353bp的11種片段)，和任選上述有涂層的毛細(xì)管。6.11故障排除實(shí)驗(yàn)過程中，可能見到散在發(fā)生的停電故障。此時，可能不能進(jìn)行電泳分析。 另一問題是分離過程中毛細(xì)管中可能形成微小氣泡。如果制備分離液中遺漏脫氣步驟， 這種影響會頻繁出現(xiàn)。脫氣較長時間可減少此問題發(fā)生的頻率。分離期間通過在毛細(xì)管 二端施加約34kPa壓力可有效解決此問題。采用粘稠凝膠的一種危險是溶劑蒸發(fā)可導(dǎo)致分離液貯液小瓶蓋、毛細(xì)管外側(cè)和 電極處形成硬痂。貯液小瓶蓋上有容納毛細(xì)管的開口，如果此地形成痂，可能導(dǎo)致取回 的毛細(xì)管在下一次實(shí)驗(yàn)中破裂。電極上的沉積物可導(dǎo)致不良的蠕動電流而對峰的分離產(chǎn)
20生不良影響。因此，推薦每日更換瓶蓋、清潔電極和毛細(xì)管外側(cè)面。在實(shí)驗(yàn)過程中，觀察到樣品注入小瓶時可能被稀釋(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，如果 計劃對同一份樣品作多次檢測應(yīng)提供多份樣品。6.12β-丙內(nèi)酯處理的影響研究了 β -丙內(nèi)酉旨(BPL)是否影響用CGE分離DNA。疫苗發(fā)酵過程中所用的BPL可通過烷化滅活DNA。BPL分子能與DNA的親核 中心反應(yīng)導(dǎo)致交聯(lián)和變性。DNA接觸BPL較長時間后會出現(xiàn)斷裂的單鏈，也可能丟失單 個堿基。如果接觸時間足夠長，DNA將被片段化喪失其生物學(xué)活性。用BPL處理實(shí)驗(yàn)所用的三種大小標(biāo)記物(10bp、Ikb和2kb標(biāo)準(zhǔn)品，見上文)16 小時，與疫苗制品相同。觀察到DNA的強(qiáng)度均降低(圖6)。小濃度峰完全消失。此 實(shí)驗(yàn)顯示BPL不影響DNA的分離特征。只要存在DNA，染料就會嵌入產(chǎn)生信號。較 短的片段看來被分解得比較長片段更快。6.13采用內(nèi)標(biāo)更精確分析采用內(nèi)標(biāo)(ISTD)可提高該分析的精確度。注入前每份樣品中可加入用作鑒定 峰的合適參比物質(zhì)，如此可消除外部影響。標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)屬于樣品的同類物質(zhì)。為最大程 度減少干擾樣品，ISTD峰應(yīng)出現(xiàn)在樣品峰之前。第一次實(shí)驗(yàn)選擇了 23個堿基長的引物 (ssDNA)證明可被檢出。此峰劃分的遷移率為“-10.000”，然而其精確值取決于分離參 數(shù)，例如用不同軟件計算可能不同。代數(shù)負(fù)符號的解釋是電極倒置(陽極在入口處)所 致。因此，在一示范性實(shí)驗(yàn)中，將大小標(biāo)準(zhǔn)品的峰劃分為與ISTD相比的相對遷移率。 用此法校準(zhǔn)后對外部影響的敏感就降低了。ISTD的濃度為lOyg/ml，以21kPa流體動力 學(xué)注入5秒鐘(圖7)。6.14 總結(jié)對72bp dsDNA片段本發(fā)明方法所能達(dá)到的檢測下限約為9pg/ml，對應(yīng)于100微 微微微微摩爾(10_21摩爾)，對應(yīng)于每毫升90210個dsDNA分子，分子量660g/ml。分 析只用了 ΙΟΟμΙ。假設(shè)電動力學(xué)注入樣品30秒小瓶中的所有分子均移動進(jìn)入毛細(xì)管中， 這樣這種大小的dsDNA分子有大約9000個，足以檢測出。詳述，在一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括以下步驟1.優(yōu)選取樣后直接用蛋白酶K于56°C消化樣品1小時?；蛘?，將樣品貯藏 在-20°C或以下直到可以一起處理所有相關(guān)樣品時。優(yōu)選如上文所述在存在SDS時用蛋 白酶K處理樣品。2.提取樣品的DNA (如用從Wako公司購得的DNA提取試劑盒)，然后將其溶于 純水或緩沖液。具體說，濃縮后的樣品(DNA)，體積應(yīng)與提取DNA之前的體積相同。3.用排除3kDa，優(yōu)選IOkDa大小分子的濾膜，如密里博公司的親水性纖維素 Centricon濾膜(離心)濃縮樣品。離心后濾膜上不應(yīng)看見液體。合適的離心參數(shù)是，例 如20°C、14000g、15分鐘，和20°C、2000g離心3分鐘收集濃縮物。比較性實(shí)驗(yàn)顯示，如果樣品的蛋白質(zhì)含量可忽略不計(如樣品B6-B8)就不需要 步驟1。此時，觀察到消化與不消化的和提取與不提取DNA的樣品之間無差異(數(shù)據(jù)未 顯示)。如果鹽與其它污染物的含量不干擾分析就不需要步驟2。如果樣品的核酸濃度不 事先濃縮而不夠高不能檢測則不需要步驟3。宜用相同方法處理作比較的不同樣品。如果要分析的樣品是單價半成品樣品或作比較的樣品，推薦無需蛋白酶K消化和提取DNA， 這樣可節(jié)省費(fèi)用，每份樣品的分析時間可從約3小時減少到約30分鐘。4.如下準(zhǔn)備毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，如BC公司的P/ACE MDQ分子特征分析系統(tǒng)一用488nm激光誘導(dǎo)的熒光檢測，發(fā)射的熒光為520nm，一毛細(xì)管中性涂層，—毛細(xì)管尺寸50.2cm，總有效長度約40cm(39cm)，內(nèi)徑100μ m，-新的毛細(xì)管用分離液條件化10分鐘。當(dāng)然，可采用比較系統(tǒng)和毛細(xì)管。5.關(guān)于控制軟件，應(yīng)輸入以下設(shè)置—集成模塊“標(biāo)準(zhǔn)品CE”，一根據(jù)遷移率鑒定峰，一樣品分離溫度20°C，樣品貯藏溫度4°C，-達(dá)到分離溫度后開始電泳，一用參照通用條件控制電泳—動力學(xué)范圍100RFU-濾膜常規(guī)濾膜—峰寬16-25—數(shù)據(jù)速率4Hz。6.制備分離緩沖液(如Tris-硼酸鹽-凝膠緩沖液，pH8.8-8.9 (如購自BC公司， 購買凍干品，4-8°C持續(xù)攪拌下24小時溶解，4-8°C可穩(wěn)定30小時)。用0.45 μ m濾膜 純化所需量的緩沖液，在超聲浴中脫氣約10分鐘。保留2ml分離液不加染料作為洗滌 液。其余Iml分離液加入3μ1染料，小心用移液器處吹吸混合液至均勻，確保沒有引入 空氣。將分離液分置入200 μ IPCR小瓶中。該制劑對光敏感可存放10小時。7.制備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。具體說，如果樣品可溶于水，采用純水。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 100ng/ml。推薦用“eCAP IOOOdsDNA測試混合物OX-174HaeIII”作為大小標(biāo)記物。 在與樣品同樣的條件下檢測標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)選在同一天各系列電泳開始和結(jié)束時檢測。8.檢測樣品的以下事項或校準(zhǔn)電泳-136kPa,用含染料的分離液平衡毛細(xì)管5分鐘，一將毛細(xì)管兩端和電極浸入水中，OkPa洗滌1秒鐘，—2 IkPa流體動力學(xué)注入水5秒鐘，—2 IkPa流體動力學(xué)注入ISTD 5秒鐘，一將毛細(xì)管兩端和電極浸入水中，OkPa洗滌1秒鐘，—倒置電極(陽極在入口處)IOkPa電動力學(xué)注入樣品30秒鐘，一將毛細(xì)管兩端和電極浸入水中，OkPa洗滌1秒鐘，-倒置電極(陽極在入口處)12kV分離30分鐘，優(yōu)選每次15個樣品，更換分 離液小瓶，一收集數(shù)據(jù)約30分鐘，—用不含DNA染料的分離液，204kPa洗滌毛細(xì)管5分鐘，一將毛細(xì)管兩端和電極浸入水中，OkPa洗滌1秒鐘，
一將毛細(xì)管放回水中的開始位置，—結(jié)束。9.收集數(shù)據(jù)用32-Karat軟件分析。用軟件識別分析的每個峰。然而，如需要， 可手工集成數(shù)據(jù)。優(yōu)選分析疫苗制品加工過程中的樣品是否存在4種大小范圍的DNA。 因此，加入4組DNA，校準(zhǔn)后劃分成確定的時間窗口 /遷移率窗口。這些窗口對應(yīng)于以 下大小DNA的范圍< 200bp、200-500bp> 500_1000bp和> lOOObp。計算出峰面積的
百分比。10如果需要，起草報告可用二種方法檢驗(yàn)此法所獲數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性。峰鑒定的標(biāo)準(zhǔn)偏差相對百分率為 1.28%。面積集成此數(shù)值為4.04%。因此，本方法的結(jié)果有高度再現(xiàn)性。6.15錯誤討論測量的系統(tǒng)性變化可用每次測量的內(nèi)標(biāo)補(bǔ)償，因?yàn)橛绊憸y量的所有條件變化也 影響ISTD。檢驗(yàn)了此法所得數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性。必須明白需要計算出內(nèi)標(biāo)峰的置信區(qū)。10次測量，此峰遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏 差為0.24分鐘。將此0.24分鐘值定義為該軟件計算的ISTD時間窗口。將此值引入設(shè) 置的程序約0.5分鐘左右。對于該軟件，這意味此峰必須在所定義時間之前或之后0.25 分鐘出現(xiàn)，否則不分析測量數(shù)據(jù)。峰鑒定標(biāo)準(zhǔn)偏差的相對百分率很低為1.28% (這意味 IOOObp大小片段的偏差為士 12bp，可忽略不計)。面積集成的標(biāo)準(zhǔn)偏差相對百分率為4.04%。因此，本方法的測量結(jié)果有高度再現(xiàn)性。決定用大小標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)樣品峰與各大小范圍的關(guān)聯(lián)。相關(guān)系數(shù)是對各校準(zhǔn)點(diǎn)線 性關(guān)系的一種衡量，經(jīng)測定IObp標(biāo)準(zhǔn)品的此系數(shù)為0.99，Ikb標(biāo)準(zhǔn)品為0.95。這些數(shù)值 已足夠。6.16樣品中DNA的大小分布和濃度表1提供了 5次發(fā)酵加工過程中樣品核酸大小分布的研究結(jié)果。核酸大小的分 布見表2。表1 大小分布為5次發(fā)酵的平均值。樣品經(jīng)蛋白酶K處理和DNA提取。DL =檢測介限9pg/mL
權(quán)利要求
1.一種分析核酸的存在和/或大小分布的方法，其中用毛細(xì)管凝膠電泳分離包含核酸 的樣品，該方法包括以下步驟(i)通過流體動力學(xué)法注射將樣品注入毛細(xì)管有效長度的20-40%；(ii)分離核酸；(iii)檢測核酸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸是DNA，更優(yōu)選基因組DNA和 /或DNA的降解產(chǎn)物。
3.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述樣品以14-35kPa的壓力 注入3-4.5分鐘。
4.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，該方法還包括在步驟(i)之前 用水以流體動力學(xué)法預(yù)先注入毛細(xì)管，優(yōu)選以l_34kPa的壓力注入2-10秒鐘。
5.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，該方法還包括在步驟(i)與 (ii)之間用水以流體動力學(xué)法后注入毛細(xì)管，優(yōu)選以l_34kPa的壓力注入2-10秒鐘。
6.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述分離在200-275V/cm電 壓下進(jìn)行。
7.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，用激光誘導(dǎo)的熒光進(jìn)行檢測。
8.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述樣品中添加了至少一種 感興趣的大小明確的核酸。
9.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述分離緩沖液含有適合于 檢測核酸的染料，優(yōu)選EnhanCE染料。
10.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，通過毛細(xì)管凝膠電泳分離待 分析是否存在基因組DNA或其降解產(chǎn)物的樣品，包括以下步驟(i)以21-28kPa壓力，用流體動力學(xué)法注射3-4.5分鐘，將樣品注入毛細(xì)管有效長度 的約30% ；(ii)在255V/cm下分離核酸；(iii)用激光誘導(dǎo)的熒光檢測核酸；還包括在步驟ω之前用水以流體動力學(xué)法預(yù)先注入毛細(xì)管，優(yōu)選以7kPa的壓力注 入5秒鐘；還包括在步驟G)與Gi)之間用水以流體動力學(xué)法后注入毛細(xì)管，優(yōu)選以7kPa壓力 注入5秒鐘；其中在預(yù)先注入水之前和/或注入樣品后進(jìn)行洗滌步驟，優(yōu)選使毛細(xì)管兩端與水接觸；其中分離緩沖液包含嵌入性染料，優(yōu)選濃度為每毫升分離緩沖液0.5 μ 1的EnhanCE 染料。
11.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，該方法適合檢測至少200fg 的一種尺寸DNA。
12.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述毛細(xì)管的有效長度為 39cm，電泳分離時間為40-55分鐘，優(yōu)選約45分鐘。
13.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述分離緩沖液是pH 8-9.5，優(yōu)選pH 8.8的緩沖液，最優(yōu)選具有所述pH的Tris-硼酸鹽緩沖液。
14.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述樣品是藥物組合物，并 且待分析是否存在DNA或其片段，其中所述DNA優(yōu)選基因組DNA，優(yōu)選證明該樣品包 含或不包含含有功能性基因的DNA和/或具有致癌潛能的DNA。
15.如以上權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，所述樣品用包括以下步驟的 方法預(yù)處理 任選用蛋白酶K消化樣品，優(yōu)選在存在SDS時消化樣品； 提取核酸。
16.一種制備給予哺乳動物的組合物的方法，其中所述組合物樣品通過以上權(quán)利要求 任何一項所述的方法分析。
17.一種分析樣品中核酸的存在和/或大小分布的方法，包括用毛細(xì)管凝膠電泳分離 樣品，和用激光誘導(dǎo)的熒光檢測核酸，其中所述核酸是基因組DNA和/或DNA的降解產(chǎn) 物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述分析核酸的存在和/或其大小分布 是為了確定樣品的致癌潛能和/或樣品中功能性基因的存在。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述樣品得自疫苗制品，優(yōu)選流感疫苗。
20.如權(quán)利要求17-19所述的方法，其特征在于，按照權(quán)利要求1-15所述的方法分析樣品。
21.用以上權(quán)利要求任何一項所述方法分析的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測核酸的方法。該方法采用毛細(xì)管電泳分離樣品然后分析其中存在的核酸。注入和分離樣品的條件使得該方法具有極高的靈敏度，可用于，例如為質(zhì)控目的，測定含有治療或疫苗用蛋白質(zhì)樣品中是否存在基因組DNA污染物，和其含量及/或大小。
文檔編號G01N27/447GK102016560SQ200980115748
公開日2011年4月13日 申請日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者H·科斯特, S·拉姆澤格 申請人:諾華有限公司