專利名稱：定量分析鎖鏈素和異鎖鏈素的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及定量分析生物樣品中鎖鏈素和異鎖鏈素的方法，該方法可以采用專用的試劑盒，尤其涉及用于定量分析生物樣品中鎖鏈素和異鎖鏈素的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法的建立及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自上個(gè)世紀(jì)50年代，人們就開始對(duì)彈性蛋白的生理功能進(jìn)行研究。人們發(fā)現(xiàn)作為一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，彈性蛋白的含量變化與生物體發(fā)生的多種疾病都有著十分重要的聯(lián)系。例如肺部彈性蛋白的含量就與阻塞性肺氣腫、慢性支氣管炎等疾病的診斷和病理研究有著十分重要的作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈彈性蛋白與許多血管疾病相關(guān)。目前已經(jīng)知道在高血壓、腦動(dòng)脈瘤、腦動(dòng)脈粥樣硬化、煙霧病等多種疾病中都伴有彈性蛋白的變化，提示彈性蛋白在疾病過(guò)程中的變化規(guī)律在臨床上具有重要意義。因此，研究彈性蛋白含量變化是研究血管疾病的一個(gè)重要組成部分。鎖鏈素(DES)和異鎖鏈素(IDES)是彈性蛋白發(fā)生降解即氧化脫酰氨反應(yīng)后所產(chǎn)生的特征性的兩種交聯(lián)氨基酸，分子量都為526，為同分異構(gòu)體。因此通過(guò)對(duì)血管組織樣品中DES和IDES的定性和定量分析，就可以得到樣品中彈性蛋白含量變化的數(shù)據(jù)和信息。由此可見(jiàn)，建立一種可靠、準(zhǔn)確靈敏度高的測(cè)定DES和IDES的方法是極為重要的。
目前對(duì)于DES和IDES的定量檢測(cè)方法常用的有反相高效液相色譜法[Stone，P.J.，Bryan-Rhadfi，J.，Lucey，E.C.，Ciccolella，D.E.，Crombie，G.，F(xiàn)aris，B.，Sinder，G.L.，F(xiàn)ranzblau，C.，Am.Rev.Respir.Dis.1991，144，284]和以十二烷基硫酸鈉(SDS)為準(zhǔn)固定相的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法[Viglio，S.，Zanaboni，G.，Luisetti，M.，Trisolini，R.，Grimm，R.，Cetta，G.，Iadarola，P.，J.Chromatogr.B 1998，714，87]。已有文獻(xiàn)報(bào)道的用反相高效液相色譜法測(cè)定生物樣品中的DES和IDES，需要預(yù)先用凝膠色譜柱把DES和IDES與生物基質(zhì)中的大部分雜質(zhì)分離提純，再用反相高效液相色譜分離DES和IDES。每一步處理都要通過(guò)添加已知量的C14標(biāo)記的DES和IDES標(biāo)準(zhǔn)品到樣品中測(cè)定回收率。雖然這個(gè)方法的可靠性比以前的放射免疫測(cè)定法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)要高得多，但是仍然費(fèi)時(shí)費(fèi)力。Iadarola等人用SDS為準(zhǔn)固定相的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法同步檢測(cè)到了慢性阻塞肺病病人尿樣中的DES、IDES和肌酸酐，這個(gè)方法與反相高效液相色譜法相比，由于無(wú)需預(yù)先對(duì)樣品進(jìn)行純化，所以更為簡(jiǎn)單，能進(jìn)行大量樣品的檢測(cè)。但是該方法在進(jìn)行分離檢測(cè)時(shí)仍然受到生物樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，DES和IDES沒(méi)有完全基線分離，因而其準(zhǔn)確度和紫外檢測(cè)靈敏度都不是很理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種比現(xiàn)有技術(shù)更準(zhǔn)確、更靈敏、更簡(jiǎn)便省時(shí)的定量分析鎖鏈素和異鎖鏈素的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜方法。并提供一種的試劑盒。
本發(fā)明的定量分析鎖鏈素和異鎖鏈素的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法是通過(guò)在電泳緩沖液中采用混合膠束或兩性離子表面活性劑為準(zhǔn)固定相作為分離介質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便省時(shí)地定量分析鎖鏈素和異鎖鏈素的含量。所述混和膠束推薦由兩性離子表面活性劑和非離子表面活性劑組成。所述的兩性離子表面活性劑推薦為3-(N，N-二甲基烷基銨)-丙烷磺酸鹽，所述的烷基推薦為正十二烷基至正十八烷基，進(jìn)一步推薦3-(N，N-二甲基十六烷基銨)-丙烷磺酸鹽(PAPS)，所述的非離子表面活性劑為聚乙二醇烷基醚，所述的烷基推薦為正十二烷基至正十八烷基，進(jìn)一步推薦聚乙二醇十二烷基醚(Brij35)。推薦采用含有5-100mmol/L的PAPS和0-30％(m/v，單位g/mL)的Brij35形成的膠束相作為準(zhǔn)固定相，其濃度是相對(duì)于電泳緩沖液的體積而言。進(jìn)一步推薦采用含有5-100mmol/L的PAPS和0.01-30％(m/v，單位kg/L)的Brij35形成的混合膠束相作為準(zhǔn)固定相。推薦使用含有5-16mmol/L的PAPS或含有20-100mmol/L的PAPS，尤其是含有20-80mmol/L的PAPS和0.04-10％(m/v，單位kg/L)的Brij35形成的混合膠束相作為準(zhǔn)固定相。電泳緩沖液中的背景電解質(zhì)可為三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、硼酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽等，背景電解質(zhì)的濃度推薦為10-100mmol/L。電泳緩沖液的pH推薦為1-6。
所述的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法可以采用內(nèi)徑為25-100μm的熔融石英毛細(xì)管柱，長(zhǎng)度推薦為20-80cm，分離電壓推薦為10-30kV，檢測(cè)波長(zhǎng)推薦200-260nm，進(jìn)一步推薦檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm；柱溫推薦為25℃。
定量分析過(guò)程的采用的標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以是內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法。外標(biāo)法進(jìn)一步描述如下首先用一組已知濃度的DES和IDES標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)出其峰面積與濃度的校準(zhǔn)曲線，得到線性范圍和線性方程式，之后用電泳分離檢測(cè)待測(cè)樣品的峰面積，將其代入校準(zhǔn)曲線線性方程式得出樣品中DES和IDES的濃度。
此外，通過(guò)毛細(xì)管電泳儀的連續(xù)進(jìn)樣，來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品定量分析的高通量。
具體操作步驟推薦如下1.緩沖液的配制背景電解質(zhì)可為10-100mmol/L的三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、硼酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽等，pH為1-6，其中僅含有5-100mmol/L的PAPS作為準(zhǔn)固定相，或含有5-100mmol/L的PAPS和0.01-30％(m/v，單位kg/L)Brij35形成的混合膠束相作為準(zhǔn)固定相；2.標(biāo)樣溶液的配制及其檢測(cè)先將鎖鏈素和異鎖鏈素標(biāo)準(zhǔn)品分別用超純水溶解，配成已知濃度的標(biāo)樣溶液，再取不同體積的上述標(biāo)樣溶液，分別加入不同體積的超純水稀釋成不同數(shù)量級(jí)濃度的標(biāo)樣溶液，電泳檢測(cè)，做出峰面積與濃度的校正曲線圖，得到其線性范圍的方程式(1)yi＝Axi+B(1)方程式(1)中xi為標(biāo)樣中鎖鏈素或異鎖鏈素的濃度，yi為標(biāo)樣中鎖鏈素或異鎖鏈素的峰面積，A和B分別為其線性范圍在X軸和Y軸上的截距。
3.樣品溶液的配制及其檢測(cè)經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理后的被測(cè)樣品不需要再提純，直接加入超純水配成一定體積的樣品溶液后進(jìn)樣，電泳檢測(cè)，根據(jù)所得的峰面積，將其代入方程式(1)，計(jì)算出樣品中鎖鏈素和異鎖鏈素各自的濃度及含量。
此外，為確保定量分析鎖鏈素和異鎖鏈素的準(zhǔn)確性，需要對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)樣品日內(nèi)和日間的連續(xù)進(jìn)樣和檢測(cè)，從所得的出峰面積和出峰時(shí)間來(lái)判定該方法是否具有良好的重現(xiàn)性。
本發(fā)明采用兩性離子型和非離子型表面活性劑形成的混合膠束為準(zhǔn)固定相作為分離介質(zhì)來(lái)定量分析鎖鏈素和異鎖鏈素的含量。該方法可被用于與彈性蛋白相關(guān)疾病的病理學(xué)研究、臨床診斷以及蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的研究。
本發(fā)明提供了一種在上述毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜中使用到的混合膠束體系，即用一種兩性離子表面活性劑3-(N，N-二甲基烷基銨)-丙烷磺酸鹽類(所述的烷基推薦為正十二烷基至正十八烷基，進(jìn)一步推薦3-(N，N-二甲基十六烷基銨)-丙烷磺酸鹽(PAPS))和非離子表面活性劑聚乙二醇烷基醚類(所述的烷基推薦為正十二烷基至正十八烷基，進(jìn)一步推薦聚乙二醇十二烷基醚(Brij35))組成的混合膠束，其比例推薦為5-100mmol/L的PAPS和0.01-30％(m/v，單位kg/L)的Brij35形成的混合膠束相。
本發(fā)明提供了一種專用于毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法定量測(cè)定鎖鏈素和異鎖鏈素的試劑盒，該試劑盒含有5-100mmol/L的3-(N，N-二甲基十六烷基銨)-丙烷磺酸鹽、0.01-30％(m/v)的聚乙二醇十二烷基醚和背景電解質(zhì)水溶液組成的緩沖液，所述的背景電解質(zhì)推薦為10-100mmol/L的三(羥甲基)氨基甲烷、硼酸鹽、磷酸鹽或醋酸鹽，所述的緩沖液pH推薦為1-6。該試劑盒用于毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法定量測(cè)定鎖鏈素和異鎖鏈素的含量，從而可獲知彈性蛋白變化的數(shù)據(jù)和信息，應(yīng)用于與彈性蛋白相關(guān)疾病的病理學(xué)研究、臨床診斷以及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其積極效果及優(yōu)點(diǎn)是1)本方法操作簡(jiǎn)便，實(shí)現(xiàn)了鎖鏈素和異鎖鏈素的基線分離，因而定量分析更為快速準(zhǔn)確，相對(duì)誤差小，成本低。
2)紫外檢測(cè)靈敏度高。與已報(bào)道的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法對(duì)鎖鏈素和異鎖鏈素的紫外最低檢出限(LOD)10-4mol/L相比，本方法對(duì)鎖鏈素和異鎖鏈素的紫外最低檢出限(LOD)分別可達(dá)到9.3×10-7mol/L和8.4×10-7mol/L，靈敏度提高了三個(gè)數(shù)量級(jí)。
3)本方法重復(fù)性好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。
4)結(jié)合毛細(xì)管電泳的高效分離和自動(dòng)化操作，可實(shí)現(xiàn)定量分析的自動(dòng)化和高通量。


圖1是鎖鏈素(DES)的出峰面積及其濃度的校正曲線圖。
圖2是圖1中虛線區(qū)域的放大圖。
圖3是異鎖鏈素(IDES)的出峰面積及其濃度的校正曲線4是圖3中虛線區(qū)域的放大圖。
圖5是對(duì)血管樣品中鎖鏈素(DES)和異鎖鏈素(IDES)的電泳分離圖。
圖6是圖5中虛線區(qū)域的放大圖。
符號(hào)說(shuō)明附圖中DES為鎖鏈素，IDES為異鎖鏈素，Peak area表示出峰面積，C表示被測(cè)物濃度，AU表示紫外吸光度，min表示分鐘，arbitrary units代表任意單位。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)下述實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)例以血管的外膜和中膜組織作為樣品，用含有PAPS和Brij35組成的混合膠束的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法來(lái)測(cè)定樣品中鎖鏈素和異鎖鏈素的濃度；另外還考察了該方法的重復(fù)性，回收率等方面。
1.毛細(xì)管的處理首先對(duì)毛細(xì)管壁用0.1mol/L氫氧化鈉預(yù)處理5分鐘，再用水沖洗5分鐘，接著將膠束溶液在20psi的壓力下充入毛細(xì)管柱2分鐘，柱溫為25℃，待進(jìn)樣分離檢測(cè)。
2.緩沖液的優(yōu)化本發(fā)明所使用的混合膠束溶液由PAPS和Brij35兩種表面活性劑組成，我們首先考察了緩沖液中pH值及背景電解質(zhì)中鹽離子強(qiáng)度對(duì)樣品分離度的影響，再分別考察了組成混合膠束的兩種表面活性劑濃度對(duì)樣品分離度的影響，對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。
實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)混合膠束溶液的pH值、鹽離子強(qiáng)度、PAPS和Brij35的濃度和組成比例對(duì)樣品的分離都有較大影響。電泳條件范圍例如毛細(xì)管柱總長(zhǎng)20-80cm，有效長(zhǎng)度30-70cm，柱內(nèi)徑25-100μm，柱溫25℃，緩沖液為10-100mMTris、硼酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽等之一種，含5-100mM PAPS和0.01-30％Brij35，pH為1-6，壓力進(jìn)樣，電壓10-30kV，檢測(cè)波長(zhǎng)200nm。
3.在如下條件下，即毛細(xì)管柱總長(zhǎng)40cm，有效長(zhǎng)度30cm，柱內(nèi)徑50μm，柱溫25℃，緩沖液為20mmol/L Tris，含30mmol/L PAPS和10％(m/v)Brij35，pH為3，壓力進(jìn)樣，電壓20kV，檢測(cè)波長(zhǎng)200nm，對(duì)已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行電泳分離，做出峰面積與濃度的校正曲線圖。先將鎖鏈素和異鎖鏈素標(biāo)準(zhǔn)品分別用超純水溶解，配成1mmol/L的標(biāo)樣溶液，再取不同體積的上述標(biāo)樣溶液，分別加入不同體積的超純水稀釋成不同數(shù)量級(jí)濃度的標(biāo)樣溶液，電泳檢測(cè)，分別做出DES出峰面積與其濃度的校正曲線圖(圖1)和IDES出峰面積與其濃度的校正曲線圖(圖2)。由圖可知，DES和IDES的出峰面積與其濃度成一定的線性關(guān)系，其線性范圍的方程式分別為DESy＝6.17006×108x+26.92979，r2＝0.99999(1)IDESy＝7.00269×108x+133.4154，r2＝0.99998(2)方程式(1)和(2)中x分別為鎖鏈素和異鎖鏈素標(biāo)樣的濃度，y為出峰面積，r2為線性相關(guān)系數(shù)。
同時(shí)得到DES和IDES的最低檢測(cè)量(LOQ)分別為3.085×10-6mol/L和2.769×10-6mol/L。
4.樣品溶液的測(cè)定經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理后的血管組織外膜和中膜樣品不需要再提純，直接加入超純水配成一定體積的樣品溶液后進(jìn)樣，電泳檢測(cè)，得到樣品的電泳圖，如圖3所示，其中圖3(b)為圖3(a)中虛線區(qū)域的放大圖，DES和IDES由箭頭標(biāo)出。DES和IDES遷移時(shí)間分別為16.875±0.15min和17.142±0.15min。根據(jù)所得的DES和IDES出峰面積，將其分別代入方程式(1)和(2)，計(jì)算出樣品中鎖鏈素和異鎖鏈素各自的濃度，平行測(cè)定3次，計(jì)算樣品定量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表1表1.血管組織外膜和中膜樣品中鎖鏈素和異鎖鏈素的定量分析結(jié)果


由上述數(shù)據(jù)可以看出該發(fā)明用于定量分析血管樣品中的鎖鏈素和異鎖鏈素是很精準(zhǔn)和可靠的。
5.通過(guò)回收率實(shí)驗(yàn)可以得出本發(fā)明的回收率的大小。將已測(cè)定DES和IDES濃度的血管組織樣品溶液每份平均分為體積相同的兩份，第一份用純蒸餾水將其體積稀釋一倍作為被測(cè)組分的原含量樣品，第二份加入與其等體積的已知濃度的DES和IDES標(biāo)樣溶液將其稀釋一倍作為加入標(biāo)樣后的樣品，電泳檢測(cè)每份樣品中的DES和IDES濃度。用第二份樣品溶液中各待測(cè)組分的被測(cè)濃度減去第一份樣品中待測(cè)組分的原濃度所得的差值除以加標(biāo)量，計(jì)算DES和IDES的回收率，見(jiàn)表2表2.樣品中鎖鏈素和異鎖鏈素的回收率


可以看出，本發(fā)明的回收率在96.45-98.68％之間，因此，此方法能對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。
權(quán)利要求
1，一種用于定量分析鎖鏈素和異鎖鏈素的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法，分離介質(zhì)采用膠束相和背景電解質(zhì)水溶液組成的緩沖液，其特征是所述的膠束相是混合膠束的膠束相或兩性離子表面活性劑的膠束相。
2，如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法，其特征是所述的混合膠束的膠束相為兩性離子表面活性劑和非離子表面活性劑組成的混合膠束。
3，如權(quán)利要求1或2所述的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法，其特征是所述的兩性離子表面活性劑是3-(N，N-二甲基烷基銨)-丙烷磺酸鹽，所述的烷基為正十二烷基至正十八烷基；所述的非離子表面活性劑是聚乙二醇烷基醚，所述的烷基為正十二烷基至正十八烷基。
4，如權(quán)利要求1或2所述的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法，其特征是所述的兩性離子表面活性劑是3-(N，N-二甲基十六烷基銨)-丙烷磺酸鹽，所述的非離子表面活性劑是聚乙二醇十二烷基醚。
5，如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法，其特征是所述的背景電解質(zhì)為三(羥甲基)氨基甲烷、硼酸鹽、磷酸鹽或醋酸鹽。
6，如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法，其特征是所述的緩沖液pH為1-6。
7，如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法，其特征是所述的緩沖液為10-100mmol/L的三(羥甲基)氨基甲烷、硼酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液之一種，其中含有5-100 mmol/L的3-(N，N-二甲基十六烷基銨)-丙烷磺酸鹽和0-30％(m/v)的聚乙二醇十二烷基醚，分離電壓為10-30kV，檢測(cè)波長(zhǎng)200-260nm。
8，如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法，其特征是采用的毛細(xì)管柱總長(zhǎng)為20-80cm，柱內(nèi)徑為25-100μm，柱溫25℃。
9，如權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法，其特征是分離后采用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法測(cè)定鎖鏈素和異鎖鏈素的含量。
10，一種用于毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法定量測(cè)定鎖鏈素和異鎖鏈素的試劑盒，其特征是含有5-100mmol/L的3-(N，N-二甲基十六烷基銨)-丙烷磺酸鹽、0.01-30％(m/v)的聚乙二醇十二烷基醚和背景電解質(zhì)水溶液組成的緩沖液，所述的背景電解質(zhì)為10-100mmol/L的三(羥甲基)氨基甲烷、硼酸鹽、磷酸鹽或醋酸鹽，所述的緩沖液pH為1-6。
11，權(quán)利要求10所述的試劑盒的用途，其特征是用于彈性蛋白變化的數(shù)據(jù)和信息分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量分析鎖鏈素(DES)和異鎖鏈素(IDES)的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜方法及專用的試劑盒。其緩沖液由兩性離子表面活性劑3－(N，N－二甲基烷基銨)－丙烷磺酸鹽類，所述的烷基為正十二烷基至正十八烷基，推薦3－(N，N－二甲基十六烷基銨)－丙烷磺酸鹽(PAPS)和非離子表面活性劑聚乙二醇烷基醚類，所述的烷基為正十二烷基至正十八烷基，推薦聚乙二醇十二烷基醚(Brij35)組成的混合膠束和背景電解質(zhì)水溶液組成。本方法操作簡(jiǎn)便，定量快速準(zhǔn)確，檢測(cè)靈敏度高，相對(duì)誤差小，穩(wěn)定性好，成本低，可用于與彈性蛋白相關(guān)疾病的病理學(xué)研究、臨床診斷以及蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的研究。
文檔編號(hào)B01J20/281GK1963495SQ20061011896
公開日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2006年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月1日
發(fā)明者康經(jīng)武, 黃靖 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所