測(cè)定紫杉醇含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定紫杉醇含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法，以兔抗鼠IgG包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，與樣品中的紫杉醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗紫杉醇的單抗，用稀土離子Eu計(jì)標(biāo)記7-xylosyltaxo1-HSA復(fù)合物作為示蹤物，以增強(qiáng)液作為發(fā)光增強(qiáng)系統(tǒng)，利用間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析法，測(cè)定所述樣品中的紫杉醇含量。本發(fā)明方法及試劑盒的靈敏度高，檢測(cè)范圍寬，穩(wěn)定性好，無(wú)毒性，利于樣品的快速高效檢測(cè)，具良好應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】測(cè)定紫杉醇含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于含量測(cè)定的化學(xué)方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種測(cè)定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法以試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離出來(lái)的一種三環(huán)二萜化合物，具有獨(dú)特的誘導(dǎo)微管蛋白聚合而抑制細(xì)胞分裂的抗腫瘤機(jī)制。紫杉醇在1992年被美國(guó)食品與藥物管理局(FAD)批準(zhǔn)作為抗晚期癌癥的新藥上市,到目前為止仍然是治療乳腺癌、子宮癌、卵巢癌等癌癥的臨床一線(xiàn)用藥。由于紫杉醇的市場(chǎng)需求量不斷增大，其生產(chǎn)的主要原料紅豆杉又屬于稀缺資源，再加上它在植物中的含量極低，因此紫杉醇醫(yī)療價(jià)值和研究?jī)r(jià)值有著很大的上升潛力。
[0003]準(zhǔn)確高效的檢測(cè)方法是紫杉醇研究中必不可少的。當(dāng)前用于紫杉醇檢測(cè)的方法有薄層色譜法，毛細(xì)管電泳法，高效液相色譜，超臨界色譜法，質(zhì)譜法，生物學(xué)化學(xué)方法，其中應(yīng)用最廣泛的方法是高效液相色譜法。這些方法盡管有些具有某方面的優(yōu)勢(shì)，但總體上存在著設(shè)備投入高、操作復(fù)雜、樣品前處理復(fù)雜、時(shí)間消耗長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的樣品預(yù)處理繁、進(jìn)行大樣本測(cè)量分析時(shí)耗時(shí)長(zhǎng)、需要使用大量有毒、昂貴的有機(jī)試劑、操作復(fù)雜、檢測(cè)范圍窄等上述缺陷，提出了一種測(cè)定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法，采用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)，建立紫杉醇的定量分析方法。本發(fā)明方法具有操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，尤其有利于大樣本或低濃度樣品的檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明提出了一種測(cè)定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法，以兔抗鼠IgG包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，與樣品中的紫杉醇(Paclitaxel)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的抗紫杉醇的單抗；用稀土離子Eu3+標(biāo)記7-xylosyltaxol-HSA復(fù)合物作為示蹤物；發(fā)光增強(qiáng)系統(tǒng)采用以β_ 二酮體為主的增強(qiáng)液；采用間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析法，從而測(cè)定樣品中的紫杉醇含量。其中，所述樣品包括待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。
[0006]本發(fā)明測(cè)定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法，包括如下步驟:
[0007](I)以4ug/ml兔抗鼠IgGlOOul/孔包被96孔酶標(biāo)板，4°C反應(yīng)過(guò)夜；
[0008](2)常溫振蕩lh，洗滌液清洗3次后，280ul/孔封閉液常溫封閉lh，清洗4次，拍干;
[0009](3)取廣州市藥檢局購(gòu)得紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，配制成溶劑為10%甲醇水的標(biāo)準(zhǔn)品，每孔加入 25ul 標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為 0ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml,400ng/ml、，每個(gè)濃度3孔。再加入以稀釋緩沖液1: 2000倍稀釋的抗紫杉醇皂苷單克隆抗體溶液和1: 300倍稀釋的標(biāo)記抗原復(fù)合物，貼封膜，于常溫下振蕩反應(yīng)Ih;[0010](4)反應(yīng)結(jié)束后，清洗6次，拍干，加入增強(qiáng)液200ul (該增強(qiáng)液采購(gòu)于廣州市達(dá)瑞抗體工程技術(shù)有限公司；成分包括:冰醋酸、鄰苯二甲酸氫鉀、Triton X-100、TOPO、β-NTA、純化水)，振蕩5min后，用熒光免疫分析儀Victor 1420測(cè)定其熒光信號(hào)。
[0011](5)根據(jù)熒光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0012]以紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)品建立TRFIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0013]以上步驟(3)中以同樣方法配制待測(cè)樣品，經(jīng)檢測(cè)，在步驟(5)中測(cè)得待測(cè)樣品中的紫杉醇含量。
[0014]7-xylosyltaxol-HSA 復(fù)合物的制備:在 lmll0mg/mlNa104 溶液中，加入 0.5ml 溶解7-xylosyltaxol5.0mg的甲醇溶液,室溫避光攪拌反應(yīng)lh。將反應(yīng)混合物加至lml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6)中，用lmol/L的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)至pH9左右，攪拌12h，對(duì)水透析5次。
[0015]銪標(biāo)記抗原結(jié)合物的制備:將合成的7-xylosyltaxol-HSA復(fù)合物用標(biāo)記緩沖液來(lái)純化、濃縮，再比例加入Eu-DTTA(抗原:Eu-DTTA = 2: I)，充分混勻后放入室溫孵育16-20小時(shí)后，緩慢加入純化柱內(nèi)，然后換成洗脫緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，待蛋白檢測(cè)儀顯示出現(xiàn)蛋白峰時(shí)，開(kāi)始收集樣品，1.5ml/管，加BSA溶液至含量0.1 %。分裝，部分于_20°C保存，部分于4°C備用。
[0016]其中，所述增強(qiáng)液由南方醫(yī)科大學(xué)抗體技術(shù)研究中心提供；成分:冰醋酸、鄰苯二甲酸氫鉀、Triton X-100、T0P0、β-NTA、純化水。增強(qiáng)液是以β-二酮體為主的增強(qiáng)液。
[0017]其中，所述方法以稀土離子EU3+標(biāo)記7-xylosyltaxol-HSA復(fù)合物作為示蹤物,并用增強(qiáng)-解離系統(tǒng)擴(kuò)大熒光信號(hào)。
[0018]其中，所述方法的檢測(cè)靈敏度為0.004ug/ml。
[0019]其中，所述方法的含量檢測(cè)范圍為5_400g/ml。
[0020]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，用于進(jìn)行本發(fā)明測(cè)定紫杉醇含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，其包括酶標(biāo)包被板，標(biāo)準(zhǔn)品，抗紫杉醇單克隆抗體，銪標(biāo)記復(fù)合物，洗漆液，稀釋液以及增強(qiáng)液。利用本發(fā)明試劑盒，以兔抗鼠IgG包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，與樣品中的紫杉醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗紫杉醇的單抗，用稀土離子EU3+標(biāo)記7-xylosyltaxol-HSA復(fù)合物作為示蹤物，以增強(qiáng)液作為發(fā)光增強(qiáng)系統(tǒng)，利用間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析法，測(cè)定所述樣品中的紫杉醇含量。
[0021 ] 本發(fā)明試劑盒中，所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為Ong/ml、5ng/ml, 15ng/ml, 50ng/ml, 150ng/ml,400ng/ml,加樣量25ul/孔；所述抗紫杉醇單克隆抗體在測(cè)定前以稀釋液稀釋2000倍，所述銪標(biāo)記復(fù)合物在測(cè)定前以稀釋液稀釋300倍，按先后順序分別加入IOOul/孔；所述增強(qiáng)液的加液量為200ul/孔。
[0022]本發(fā)明區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)包括:用三價(jià)稀土離子及其鰲合物作為示蹤物，并用增強(qiáng)-解離系統(tǒng)擴(kuò)大熒光信號(hào)，利用單克隆抗體技術(shù)制造出抗紫杉醇單克隆抗體，使得免疫熒光分析方法應(yīng)用于中藥成分的含量測(cè)定。本發(fā)明中采用現(xiàn)有技術(shù)來(lái)制備抗紫杉醇單克隆抗體以及制備紫杉醇與人血清白蛋白復(fù)合物。
[0023]區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明分析法包括了解離增強(qiáng)步驟和熒光檢測(cè)環(huán)節(jié)。
[0024]本發(fā)明分析法中包括的解離增強(qiáng)步驟:現(xiàn)有技術(shù)中的解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?DELFIA)是時(shí)間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪(Eu)連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過(guò)免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。但由于這種復(fù)合物在水中的熒光強(qiáng)度非常弱，因此，在本發(fā)明方法中采用解離-增強(qiáng)步驟，通過(guò)加入一種增強(qiáng)劑，使Eu從復(fù)合物上解離下來(lái)，解離下來(lái)的自由Eu同增強(qiáng)劑中的另一種螫合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，信號(hào)增強(qiáng)了百萬(wàn)倍。
[0025]本發(fā)明分析方法中包括的熒光檢測(cè)環(huán)節(jié):普通物質(zhì)熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，在選擇熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物時(shí)，必須考慮激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差，即Stokes位移的大小。如果Stokes位移小,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊,相互干擾,影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。而本發(fā)明中的熒光檢測(cè)環(huán)節(jié)，鑭系元素的熒光光譜有較大的Stokes位移,最大可達(dá)290nm，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜問(wèn)不會(huì)相互重疊，加上其發(fā)射的光譜信號(hào)峰很窄，熒光壽命長(zhǎng)，銪的熒光壽命可達(dá)730us，檢測(cè)中只要在每個(gè)激發(fā)光脈沖過(guò)后采用延緩測(cè)量時(shí)間的方式，待短壽命的背景熒光衰變消失后，再打開(kāi)取樣門(mén)儀器記錄長(zhǎng)壽命銪鰲合物發(fā)射的特異性熒光，可以避免本底熒光干擾，提高本發(fā)明方法的檢測(cè)精密度。TRFIA的測(cè)量?jī)x器是時(shí)間分辨熒光計(jì)，由三大部分組成:光源:脈沖光源:氙燈(每秒閃爍1000次)；小型N2激光器；輸出脈沖波長(zhǎng):337nm突光信號(hào)獲取系統(tǒng)。
[0026]本發(fā)明方法中，以三價(jià)銪離子為示蹤物，標(biāo)記結(jié)合7-xylosyltaxol-HSA復(fù)合物，結(jié)合抗紫杉醇單克隆抗體后，經(jīng)過(guò)解離-增強(qiáng)步驟，測(cè)定熒光值。TRFIA法用稀土元素離子Eu3+作為示蹤物，以其熒光壽命長(zhǎng)，激發(fā)譜帶寬而發(fā)射光譜很窄等特點(diǎn)排除非特異性熒光的干擾，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。至目前為止，尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道如本發(fā)明的利用時(shí)間分辨熒光免疫分析方法來(lái)測(cè)定紫杉醇含量的先例及相應(yīng)的試劑盒。
[0027]本發(fā)明分析法及試劑盒具有較高的靈敏度和較寬的檢測(cè)范圍:圖1表示使用單克隆抗體的紫杉醇含量測(cè)定的TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，本發(fā)明方法測(cè)定紫杉醇含量的靈敏度為
0.004ug/ml，在確保線(xiàn)性良好又有較好的檢測(cè)結(jié)果的情況下，確定本方法的含量檢測(cè)范圍為5-400ng/ml。而現(xiàn)有文獻(xiàn)高效液相色譜法的紫杉醇的檢測(cè)下限為較低的8ug左右。本發(fā)明方法的靈敏度是高效液相色譜法的近2000倍。顯然本方法更為敏感，且檢測(cè)范圍更寬。
[0028]本發(fā)明分析法及試劑盒具有同樣的準(zhǔn)確性:Chao等比較了高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法得到的結(jié)果之間的相關(guān)性，其研究證明，兩檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定紫杉醇濃度的相關(guān)性系數(shù)r = 0.999。本發(fā)明方法研究者研究了建立的時(shí)間分辨熒光免疫分析法和已報(bào)道的酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定各個(gè)紅豆杉樣品的紫杉醇的含量的相關(guān)性。圖2表示，同樣提取方法下，比較ELISA法和TRFIA法的含量測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性，r2 = 0.9972。表明，本發(fā)明建立的TRFIA分析法與HPLC法、ELISA法有同樣的準(zhǔn)確性。
[0029]本發(fā)明有益效果包括:(I)零背景、高特異性:利用斕系元素極長(zhǎng)的熒光衰退時(shí)間這一特點(diǎn)，激發(fā)后以固定時(shí)間檢測(cè)熒光，在此時(shí)間之前，非特異性熒光已完全衰減消失，從而通過(guò)時(shí)間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開(kāi)來(lái)，可以避免本底熒光干擾，提高檢測(cè)的精密度。利用斕系元素發(fā)射光與激發(fā)光波長(zhǎng)問(wèn)巨大的Strokes位移這一熒光重要特征。(2)靈敏度高:解離一增強(qiáng)使熒光性大大提高近百萬(wàn)倍，此步驟加入一種增強(qiáng)劑，使Eu從復(fù)合物上解離下來(lái)，自由Eu同增強(qiáng)劑中的另一種螫合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，信號(hào)增強(qiáng)了百萬(wàn)倍。因?yàn)檫@種分析方法使用了解離增強(qiáng)步驟，因此稱(chēng)為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觥?3)高穩(wěn)定性、高精確度:低分子量原子標(biāo)記，不影響被標(biāo)記物的空間立體結(jié)構(gòu)，保證其穩(wěn)定性。且衰變壽命較長(zhǎng)、受環(huán)境影響小。標(biāo)記粒子的鰲合物穩(wěn)定性強(qiáng)，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度高，又使其靈敏度高、重復(fù)性更好、線(xiàn)性范圍更寬。時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相當(dāng)穩(wěn)定穩(wěn)定可達(dá)一年以上。例如在具體實(shí)施中，本發(fā)明方法的靈敏度為0.004ug/ml，設(shè)定其檢測(cè)范圍為5?400ng/ml，批內(nèi)CV平均值為7.98%，批問(wèn)CV為7.76%。平均回收率為107.7%，相關(guān)系數(shù)為0.992。
[0030]本發(fā)明分析法(TRFDWi)與HPLC法比較，其取樣量少，前處理簡(jiǎn)單，并可在同一塊板上同時(shí)測(cè)定40多個(gè)樣品。樣品的提取時(shí)用少量甲醇，測(cè)定過(guò)程不需有機(jī)溶劑，毒性小，對(duì)人體的健康和環(huán)境影響小，節(jié)省人力、物力。本發(fā)明分析法與ELISA法相比，用稀土元素離子Eu3+作為示蹤物，以其熒光壽命長(zhǎng)，激發(fā)譜帶寬而發(fā)射光譜很窄等特點(diǎn)排除非特異性熒光的干擾，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)的紫杉醇的含量檢測(cè)方法包括薄層掃描色譜法、高效液相色譜法等。高效液相色譜法要求的樣品預(yù)處理繁瑣，精度要求高，進(jìn)行大樣本測(cè)量分析時(shí)耗時(shí)長(zhǎng)，需要使用大量有毒、昂貴的有機(jī)試劑。相對(duì)于傳統(tǒng)的測(cè)定方法，本發(fā)明方法利用單克隆抗體技術(shù)和熒光免疫分析技術(shù)，簡(jiǎn)化樣品前處理操作，減少有機(jī)試劑的使用，降低對(duì)環(huán)境和人體健康的的危害；大大提高測(cè)定方法的靈敏度；同時(shí)可進(jìn)行多個(gè)樣本的測(cè)定。
[0031]本發(fā)明提供了紫杉醇單克隆抗體的制備及使用該單抗建立起的用于紫杉醇檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)TRFIA方法。相對(duì)于傳統(tǒng)的測(cè)定方法，本發(fā)明TRFIA利用單克隆抗體技術(shù)和熒光免疫分析技術(shù)，簡(jiǎn)化樣品前處理操作，減少有機(jī)試劑的使用，降低對(duì)環(huán)境和人體健康的的危害；大大提高測(cè)定方法的靈敏度；同時(shí)可進(jìn)行多個(gè)樣本的測(cè)定。TRFIA多用于臨床生化指標(biāo)和病原微生物的檢測(cè)，目前，尚未見(jiàn)其在中藥成分含量測(cè)定上的應(yīng)用。本發(fā)明中，用三價(jià)稀土離子及其鰲合物作為示蹤物代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽，激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞；當(dāng)反應(yīng)體系發(fā)生后，如抗原抗體免疫反應(yīng)，革巴細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)，核酸探針雜交反應(yīng)等發(fā)生后，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定最后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。相較于酶聯(lián)免疫吸附法的酶標(biāo)記物不穩(wěn)定性，熒光衰變周期短。本發(fā)明分析法(TRFIA法)用稀土元素離子Eu3+作為示蹤物，以其熒光壽命長(zhǎng)，激發(fā)譜帶寬而發(fā)射光譜很窄等特點(diǎn)排除非特異性熒光的干擾，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明方法的靈敏度高，檢測(cè)范圍寬，穩(wěn)定性好，無(wú)毒性，尤其利于大樣本的檢測(cè)時(shí)快速、高效，極為良好的廣泛應(yīng)用價(jià)值。此外，我國(guó)有豐富稀土元素資源，本發(fā)明方法具有穩(wěn)定性好的同時(shí)又合理利用了稀土元素資源。至今尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道本發(fā)明方法用于中藥材成分測(cè)定領(lǐng)域。在中藥材成分測(cè)定領(lǐng)域的應(yīng)用中，本發(fā)明方法可成為一種行之有效的新方法。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1表示本發(fā)明分析法測(cè)定紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0033]圖2表示本發(fā)明分析法和ELISA法測(cè)定紅豆杉中紫杉醇含量的相關(guān)性。
【具體實(shí)施方式】
[0034]結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書(shū)為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專(zhuān)門(mén)提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。
[0035]實(shí)驗(yàn)儀器和試劑:96孔酶標(biāo)反應(yīng)板(丹麥Nunc);半自動(dòng)VICT0R?1420熒光檢測(cè)儀(PerkinElmer產(chǎn)品)；紫杉醇(Paclitaxel)標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；人血清白蛋白(HSA)(美國(guó)Sigma公司);兔抗鼠IgG(Rockland公司);銪離子標(biāo)記HAS-Paclitaxel復(fù)合物；小鼠抗Paclitaxel單克隆抗體(自制)；增強(qiáng)液，洗漆液來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)抗體技術(shù)研究中心；紫杉醇藥材樣品來(lái)自各藥店；其它試劑:蒸餾水，甲醇等為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0036]本發(fā)明提出的測(cè)定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法，是以兔抗鼠IgG包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的紫杉醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的抗紫杉醇的單抗；用稀土離子EU3+標(biāo)記7-xylosyltaxol-HSA復(fù)合物作為示蹤物,采用以β - 二酮體為主的增強(qiáng)液作為發(fā)光增強(qiáng)系統(tǒng)，利用間接競(jìng)爭(zhēng)TRFIA法測(cè)定紅豆杉藥材中紫杉醇的含量。
[0037]本發(fā)明測(cè)定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法，方法建立的基本步驟:
[0038](I)以4ug/ml兔抗鼠IgGlOOul/孔包被96孔酶標(biāo)板，4°C反應(yīng)過(guò)夜；
[0039](2)常溫振蕩lh，洗滌液清洗3次后，280ul/孔封閉液常溫封閉lh，清洗4次，拍干;
[0040](3)取廣州市藥檢局購(gòu)得紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，配制成溶劑為10%甲醇水的標(biāo)準(zhǔn)品，每孔加入 25ul 標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為 0ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml,400ng/ml、，每個(gè)濃度3孔。再加入以稀釋緩沖液1: 2000倍稀釋的抗紫杉醇皂苷單克隆抗體溶液和1: 300倍稀釋的標(biāo)記抗原復(fù)合物，貼封膜，于常溫下振蕩反應(yīng)Ih;
[0041]其中，稀釋緩沖液由南方醫(yī)科大學(xué)抗體技術(shù)研究中心提供；成分:Tris-base、DTPA、NaCl、Tween-20、BSA、ProClin300、Bovine gamma globulin、PHloxine B?？棺仙即荚碥諉慰寺】贵w溶液是以稀釋液稀釋后的抗紫杉醇單克隆抗體溶液。其中，標(biāo)記抗原復(fù)合物是以3價(jià)銪離子標(biāo)記的已合成的7-木糖基紫杉醇和人血清白蛋白復(fù)合物。
[0042](4)反應(yīng)結(jié)束后，清洗6次，拍干，加入增強(qiáng)液(由南方醫(yī)科大學(xué)抗體技術(shù)研究中心提供；成分:冰醋酸、鄰苯二甲酸氫鉀、Triton Χ-100、Τ0Ρ0、β-ΝΤΑ、純化水)200ul，振蕩5min后，用熒光免疫分析儀Victor 1420測(cè)定其熒光信號(hào)。
[0043](5)根據(jù)熒光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0044]以紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)品建立TRFIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。
[0045]在上述步驟(2)中，在每孔加入25ul待測(cè)樣品，其他步驟及條件相同，則測(cè)得待測(cè)樣品的熒光值。
[0046]7-xylosyltaxol-HSA 復(fù)合物的制備:
[0047]在lmll0mg/mlNal04 溶液中，加入 0.5ml 溶解 Paclitaxel5.0mg 的甲醇溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)lh。將反應(yīng)混合物加至lml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6)中，用lmol/L的Na2C03溶液調(diào)節(jié)至pH9左右，攪拌12h，對(duì)水透析5次。
[0048]銪標(biāo)記抗原結(jié)合物的制備:
[0049]將合成的7-xylosyltaxol-HSA復(fù)合物用標(biāo)記緩沖液來(lái)純化、濃縮，再比例加入Eu-DTTA (抗原:Eu-DTTA = 2: I)，充分混勻后放入室溫孵育16-20小時(shí)后，緩慢加入純化柱內(nèi)，然后換成洗脫緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，待蛋白檢測(cè)儀顯示出現(xiàn)蛋白峰時(shí)，開(kāi)始收集樣品，1.5ml/管，加BSA溶液至含量0.1 %。分裝，部分于_20°C保存，部分于4°C備用。
[0050]對(duì)于間接競(jìng)爭(zhēng)法標(biāo)記免疫分析，1g-1ogit數(shù)學(xué)模型的計(jì)算方法相對(duì)簡(jiǎn)單，且大多數(shù)情況下可以得到較好相關(guān)性，因此是評(píng)價(jià)這類(lèi)試劑盒的首選數(shù)學(xué)模型。方程式:1gitY = A+B*log X，式中:1git Y = B/B0/(1-B/B0)，同時(shí)，曲線(xiàn)最高濃度點(diǎn)和最低濃度點(diǎn)之間，使曲線(xiàn)在規(guī)定的劑量范圍內(nèi)有足夠的落差，即結(jié)合率(Β/Β0%)為25% (或20%)所對(duì)應(yīng)的劑量濃度點(diǎn)應(yīng)小于曲線(xiàn)最高劑量點(diǎn)，結(jié)合率為75%或(80% )所對(duì)應(yīng)的劑量濃度點(diǎn)應(yīng)大于曲線(xiàn)最低劑量點(diǎn)。本發(fā)明分析方法中，以紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)品建立TRFIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)利用間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定樣品中的紫杉醇的熒光值，經(jīng)1g-1ogit函數(shù)處理得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定紫杉醇的突光值，經(jīng)1g-1ogit函數(shù)處理得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。1gitY = ln[Y/(1-Y)]，Y = B/B0, B0為零濃度點(diǎn)的的熒光值。在測(cè)量范圍5-400ng/ml問(wèn)相關(guān)系數(shù)R2 =
0.992，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)量很高。
[0051]實(shí)施例1測(cè)定不同種紅豆杉不同部位紫杉醇的含量
[0052]樣品前處理:將采得的紅豆杉分別取莖皮和葉，烘干，分別粉碎，過(guò)四號(hào)篩，精密稱(chēng)取50mg,加入1ml甲醇,超聲處理10分鐘，10000r/min離心10min,取上清液,重復(fù)3次,合并上清液待溶劑揮干，用甲醇將提取物溶解轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶定容。將其適當(dāng)稀釋成含20%甲醇的溶液，進(jìn)行檢測(cè)。
[0053]實(shí)驗(yàn)方法:測(cè)定時(shí)，取出包被好的酶反應(yīng)板，每孔加入25ul標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，復(fù)孔加樣。再加入以稀釋緩沖液1: 2000稀釋的抗紫杉醇皂苷單克隆抗體溶液和1: 300稀釋的標(biāo)記抗原復(fù)合物于常溫下振蕩反應(yīng)Ih ;反應(yīng)結(jié)束后，清洗6次，加入增強(qiáng)液200ul，振蕩5min后，用Victorl420測(cè)定其熒光信號(hào)，取得樣品濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
[0054]表3TRFIA法測(cè)定紅豆杉樣品中的紫杉醇的含量
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定紫杉醇含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析法，其特征在于，以兔抗鼠IgG包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，與樣品中的紫杉醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗紫杉醇的單抗，用稀土離子Eu3+標(biāo)記7-xylosyltaxol-HSA復(fù)合物作為示蹤物，以增強(qiáng)液作為發(fā)光增強(qiáng)系統(tǒng)，利用間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析法，測(cè)定所述樣品中的紫杉醇含量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以兔抗鼠IgG包被96孔酶標(biāo)板，4°C反應(yīng)過(guò)夜； (2)常溫振蕩，洗滌液清洗，常溫封閉，清洗，拍干； (3)配制紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，溶劑為10%甲醇水，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，濃度分別為 Ong/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml, 400ng/ml ;再加入以稀釋緩沖液I: 2000倍稀釋的抗紫杉醇皂苷單克隆抗體溶液和1: 300倍稀釋的標(biāo)記抗原復(fù)合物，貼封膜，常溫下振蕩反應(yīng)； (4)清洗，拍干，加入增強(qiáng)液，振蕩后，用熒光免疫分析儀VictOrl420測(cè)定其熒光信號(hào)； (5)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；測(cè)得待測(cè)樣品的熒光值即得為樣品的紫杉醇含量。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法以稀土離子Eu3+標(biāo)記7-xylosyltaxol-HSA復(fù)合物作為示蹤物，并用增強(qiáng)-解離系統(tǒng)擴(kuò)大熒光信號(hào)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的檢測(cè)靈敏度為0.004ug/ml。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的含量檢測(cè)范圍為5-400ng/ml ο
6.一種試劑盒，用于測(cè)定紫杉醇含量的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于，包括酶標(biāo)包被板，標(biāo)準(zhǔn)品，抗紫杉醇單克隆抗體，銪標(biāo)記復(fù)合物，洗滌液，稀釋液以及增強(qiáng)液。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于,所述標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為0ng/ml、5ng/ml, 15ng/ml, 50ng/ml, 150ng/ml, 400ng/ml,加樣量25ul/孔；所述抗紫杉醇單克隆抗體在測(cè)定前以稀釋液稀釋2000倍，所述銪標(biāo)記復(fù)合物在測(cè)定前以稀釋液稀釋300倍，按先后順序分別加入IOOul/孔；所述增強(qiáng)液的加液量為200ul/孔。
【文檔編號(hào)】G01N33/15GK103884843SQ201410134000
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】晁志, 崔倩 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)