專利名稱：皮下轉(zhuǎn)移的臟器癌熒光原位移植模型建立的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)臟臟器(如結(jié)腸等臟器)癌變的研究方法，尤其是結(jié)腸癌變原 位移植模型建立的方法。
二背景技術(shù)：
中國專利CN200710019273.0是本申請發(fā)明的一種結(jié)直腸癌造口原位移植模型的 建立方法，包括以下步驟a)細(xì)胞株選擇或進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用結(jié)腸腺癌細(xì)胞株 細(xì)胞濃度制成(1±0.5) 乂106的細(xì)胞懸液；b)對動物活體結(jié)腸造口，步驟是，將其 盲腸提出腹壁，視實驗動物不同長度為0.3-2cm并與周圍皮膚固定、愈合；d)造口 處腫瘤原位移植，步驟是，取小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞混懸液0.1-lml接種在造口黏膜下， 自然生長。但對動物活體結(jié)腸造口原位移植模型的建立在研究觀察過程中仍有不足之 處。
結(jié)腸癌原位移植模型的建立對于結(jié)腸癌的治療研究有重要的意義，但是由于結(jié)腸 癌位置較深，難以觀察腫瘤的大小，更無法觀察腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的情況，在研究中的 應(yīng)用受到一定的限制。熒光蛋白在激發(fā)的情況下可以發(fā)生熒光，如果移植的腫瘤中攜 帶熒光，這樣就可以直接觀察到腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移的情況。但是如果腫瘤生長在腹腔 中，即使有熒光腫瘤觀察也不十分容易。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提出一種皮下轉(zhuǎn)移的臟器癌熒光原位移植模型建立的方法，尤其 是結(jié)腸、胰腺等內(nèi)臟臟器癌熒光原位移植模型建立的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是將移植了腫瘤的盲腸轉(zhuǎn)移至皮下，本發(fā)明方法使腫瘤生長實驗條 件更接近于生長在臟器內(nèi)，而且熒光觀察更為容易，是臟器癌研究方法的重要改進(jìn)。 本發(fā)明的技術(shù)方案是皮下轉(zhuǎn)移的臟器癌熒光原位移植模型建立的方法，其特征 是選用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株或相應(yīng)臟器的癌細(xì)胞株，綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒通過 逆轉(zhuǎn)錄病毒pLPCX對臟器的癌細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染使臟器的癌細(xì)胞株含有GFP的表達(dá)
質(zhì)粒，選擇表達(dá)GFP的包裝細(xì)胞，然后細(xì)胞株中加入病毒并培養(yǎng)在含有800 ug/叩l of G418的選擇液中。.GFP基因通過T4連接酶與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體 被轉(zhuǎn)染至PT67包裝細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞株.選用裸鼠并在其皮下接種Lcwo細(xì)胞 懸液注入皮下0.2mL/只，注射完畢后，對注射部位進(jìn)行觀察，約4周成瘤，腫瘤生長 至5mm，觀察到綠色熒光后開始進(jìn)行原位移植；結(jié)腸皮下轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌熒光原位移 植模型建立裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘酊消毒，將皮膚及腹膜剪一小口，將裸 鼠肓腸提出腹膜外約lcm，縫合盲腸與腹膜間隙，將盲腸轉(zhuǎn)移至皮下；讓切開盲腸漿 膜，縫線2塊直徑約為lmm的攜帶熒光的腫瘤移植在盲腸處，關(guān)閉皮膚。
同樣，在胰腺癌模型胃癌建立時，尋找相應(yīng)的臟器,將臟器的部分轉(zhuǎn)移在皮下,縫合
3腹膜后,在轉(zhuǎn)移在皮下的部分移植帶熒光的組織塊，縫合腹部.
四

圖l:將腫瘤移植在就盲腸處，然后將盲腸移植至皮下的裸鼠照片 圖2:皮下腫瘤在熒光燈下顯示綠色熒光，可觀察腫瘤大小
五具體實施方式
材料與方法
1、試驗動物BALB/C nu/nu裸鼠，SPF級，購自北京科麗華實驗動物中心，體 重24 28g，分籠飼養(yǎng)于獨立送風(fēng)籠具，室溫控制在24°C 25°C ，相對濕度50% 60%。
2、 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)選擇相應(yīng)腫瘤得細(xì)胞株,以RPMI-1640培養(yǎng)基，10%小 牛血清，在37。C， 5XC02培養(yǎng)，0.25。/。胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃 度制成1乂106的細(xì)胞懸液。
3、 綠色熒光蛋白(GFP) pLPCX逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染含 有GFP的表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3 (-)購自BD Biosciences Clontech (BD Biossciences, CA USA)，逆轉(zhuǎn)錄病毒pLPCX購自Clontech Laboratories, Inc. (Takara, J叩an).使用含有限 制性內(nèi)切酶BglII和ClaI位點的引物擴(kuò)增GFP片段，PCR產(chǎn)物在純化后與pLPCX 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體使用限制性內(nèi)切酶Bgl II和Cla I消化，(Takara, Dalian, China).GFP 基因通過T4連接酶(Takara, Dalian, China).與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體被 轉(zhuǎn)染至PT67包裝細(xì)胞(Takara， Japan),使用G418 (Gibico, USA)選擇表達(dá)GFP的包裝 細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24小時裂解，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞濃度為20-40%。包裝細(xì)胞培養(yǎng)在 含有10X小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，當(dāng)濃度達(dá)到70_80%時候，使用0.4544n 細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，然后向HT-29細(xì)胞中加入病毒并培養(yǎng)在含有800 ug/ml ofG418的選 擇液中。.
4、裸鼠皮下接種模型的建立裸鼠頸部右側(cè)皮膚消毒，用一次性lmL注射器 將腫瘤細(xì)胞懸液注入皮下0.2mL/只。注射完畢后，對注射部位進(jìn)行觀察，約4周成瘤， 腫瘤生長至5mm,可以觀察到綠色熒光后開始進(jìn)行原位移植。
5、結(jié)腸皮下轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌熒光原位移植模型建立氯胺酮(0.17mg/)裸鼠腹腔 注射麻醉，左腹部碘酊消毒，將皮膚及腹膜剪一小口，將裸鼠需要建立模型的臟器 部分提出腹膜外約lcm，縫合臟器與腹膜間隙，將臟器轉(zhuǎn)移至皮下；讓切開漿膜，以 8 — 0縫線2塊直徑約為lmm的攜帶熒光的腫瘤移植在臟器處(這句能否再解釋一下)， 關(guān)閉皮膚。
結(jié)論10只移植的結(jié)腸癌和5只胰腺癌的裸鼠均生存，腫瘤移植后3-5天即可看 到移植的腫瘤發(fā)出熒光，2周后腫瘤生長至5mm， 8周后腫瘤生長至20mm，處死動 物，發(fā)現(xiàn)有系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，采用肝癌和胃癌的裸鼠也是比較適合的，采用本 發(fā)明的方法，能夠有效的促進(jìn)腫瘤生物科技的研究。
權(quán)利要求
1、皮下轉(zhuǎn)移的臟器癌熒光原位移植模型建立的方法，其特征是選用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株或相應(yīng)臟器的癌細(xì)胞株綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白GFP質(zhì)粒通過逆轉(zhuǎn)錄病毒pLPCX對臟器的癌細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染使臟器的癌細(xì)胞株含有GFP的表達(dá)質(zhì)粒，.GFP基因通過T4連接酶與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體被轉(zhuǎn)染至PT67包裝細(xì)胞，得到Lovo細(xì)胞；選用裸鼠并在其皮下接種Lovo細(xì)胞懸液注入皮下，注射完畢后，對注射部位進(jìn)行觀察，約4周成瘤，腫瘤生長至5mm，觀察到綠色熒光后開始進(jìn)行原位移植；裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘酊消毒，將皮肽及腹膜剪一小口，將裸鼠肓腸提出腹膜外約1cm，縫合盲腸與腹膜間隙，將盲腸轉(zhuǎn)移至皮下；讓切開盲腸漿膜，縫線2塊直徑約為1mm的攜帶熒光的腫瘤移植在盲腸處，關(guān)閉皮膚。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮下轉(zhuǎn)移的臟器癌熒光原位移植模型建立的方法，其 特征是腫瘤細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)基，10%小牛血清，在37。C， 5XC02培養(yǎng)，0.25% 胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度制成1 X 106的細(xì)胞懸液。
3、 、根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮下轉(zhuǎn)移的臟器癌熒光原位移植模型建立的方法，其 特征是逆轉(zhuǎn)錄病毒pLPCX.使用含有限制性內(nèi)切酶Bgl II和Cla I位點的引物擴(kuò)增 GFP片段，PCR產(chǎn)物在純化后與pLPCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體使用限制性內(nèi)切酶BglII和 Clal消化，GFP基因通過T4連接酶與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體被轉(zhuǎn)染 至PT67包裝細(xì)胞，使用G418選擇表達(dá)GFP的包裝細(xì)胞；HT_29細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24 小時裂解，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞濃度為20-40%。包裝細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液中，當(dāng)濃度達(dá)到70 — 80%時候，使用0.45+m細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，然 后向HT-29細(xì)胞中加入病毒并培養(yǎng)在含有800ug/mlofG418的選擇液中。.
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮下轉(zhuǎn)移的臟器癌熒光原位移植模型建立的方法， 其特征是裸鼠皮下接種模型的建立時，對裸鼠頸部右側(cè)皮膚消毒，用一次性lmL注 射器將Lovo細(xì)胞懸液注入皮下0.2mL/只。
全文摘要
皮下轉(zhuǎn)移的臟器癌熒光原位移植模型建立的方法，選用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株或相應(yīng)臟器的癌細(xì)胞株綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白GFP質(zhì)粒通過逆轉(zhuǎn)錄病毒pLPCX對臟器的癌細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染使臟器的癌細(xì)胞株含有GFP的表達(dá)質(zhì)粒，.GFP基因通過T4連接酶與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體被轉(zhuǎn)染至PT67包裝細(xì)胞，得到Lovo細(xì)胞；選用裸鼠并在其皮下接種Lovo細(xì)胞懸液，約4周成瘤，觀察到綠色熒光后開始進(jìn)行原位移植；將皮膚及腹膜剪一小口，將裸鼠肓腸提出腹膜外約1cm，縫合盲腸與腹膜間隙，將盲腸轉(zhuǎn)移至皮下；讓切開盲腸漿膜，縫線2塊直徑約為1mm的攜帶熒光的腫瘤移植在盲腸處，關(guān)閉皮膚。
文檔編號G01N21/64GK101502444SQ20081024261
公開日2009年8月12日 申請日期2008年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日
發(fā)明者楊志堅, 金黑鷹 申請人:南京源端生物科技有限公司