專(zhuān)利名稱(chēng)：一種原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所涉及一種動(dòng)物肝癌模型的制備方法，尤其是涉及一種建立在普通小鼠具有正常免疫功能的生理?xiàng)l件下，經(jīng)異種原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌動(dòng)物模型的方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Primary Hepatocellular Carcinoma，PHC)是世界上惡性程度和死亡率最高的惡性腫瘤之一；建立理想的人類(lèi)肝癌動(dòng)物模型是研究肝癌、篩選抗腫瘤藥物及進(jìn)行肝癌實(shí)驗(yàn)性治療的重要基礎(chǔ)。在既往的研究中，曾有多種動(dòng)物肝癌荷瘤模型被發(fā)明，但是由于人與動(dòng)物之間的差異以及人類(lèi)肝癌形成過(guò)程中的諸多因素，建立一個(gè)完全反映在動(dòng)物肝臟內(nèi)具有人類(lèi)肝癌生物特性的動(dòng)物模型是一件極具挑戰(zhàn)的課題。
移植性肝癌模型，是指將肝癌組織塊或肝癌細(xì)胞株接種于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(常用鼠)而建立的模型，主要包括同種(鼠與鼠之間)移植和異種(人和裸鼠之間)移植兩種。瘤源可以是自發(fā)的、誘發(fā)的、切除的人肝癌標(biāo)本或肝癌細(xì)胞株。根據(jù)受體動(dòng)物不同，移植性肝癌模型可分為正常動(dòng)物移植性肝癌模型和免疫缺陷動(dòng)物移植性肝癌模型；前者受體動(dòng)物多為小鼠和大鼠，后者受體動(dòng)物多為裸鼠、裸大鼠；可將腫瘤移植于動(dòng)物的不同組織，如肝臟內(nèi)，也可植入皮下、腹腔等部位。
1、移植性鼠-鼠肝癌模型正常動(dòng)物移植性肝癌模型多為自發(fā)性肝外——肝同種移植性鼠肝癌模型，該模型多采用來(lái)源于大鼠肝癌的Walker2256細(xì)胞株，通過(guò)不同途徑移植入大鼠的肝臟，從而形成大鼠移植性肝癌模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般選用雄性Wistar大鼠，也有用SD雄性大鼠。而移植性小鼠肝癌模型遠(yuǎn)少于移植性大鼠肝癌模型，1982年遵義醫(yī)學(xué)院用615近交系小鼠建立了我國(guó)第1株小鼠移植性肝癌模型H615，H615肝癌為615系小鼠同基因型瘤株，也只能在615小鼠體內(nèi)移植。
此類(lèi)模型性質(zhì)穩(wěn)定、制作方法簡(jiǎn)單，成功率高(＞95％)、周期短(7～10d)，自然生存時(shí)間為3～4周，腫瘤生物學(xué)特性穩(wěn)定而均一，均為肝細(xì)胞癌及高濃度甲胎蛋白AFP的分泌；目前廣泛地應(yīng)用于肝癌影像學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)及肝癌局部治療。但是由于此種模型一般只能用于同種動(dòng)物間(鼠)的腫瘤移植，與裸鼠人肝癌移植模型相比，有一定的局限性。
2、移植性裸鼠—人肝癌模型將人肝癌細(xì)胞株或肝癌組織塊，直接移植到無(wú)免疫功能的裸鼠體內(nèi)建立移植性肝癌模型，屬于人—鼠異種移植。目前主要有三種人—裸小鼠異種移植肝癌模型、人—裸大鼠異種移植肝癌模型以及人肝癌裸鼠皮下—肝原位移值瘤模型。
自1976年Shimosato首次報(bào)道人肝癌組織在裸小鼠移植成功以來(lái)，我國(guó)于1979年引入裸小鼠，已建立5株裸小鼠人肝癌組織模型LTNM 1～5和1株裸小鼠人肝癌細(xì)胞株模型LCNM1。這些模型均保留原發(fā)人肝癌形態(tài)及功能(分泌人甲胎蛋白)的特征。1982年由湯釗猷院士等建立我國(guó)首例人體肝癌裸小鼠移植模型，使得在動(dòng)物身上研究人類(lèi)肝癌成為可能，自此裸鼠人肝癌移植模型在我國(guó)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。
此類(lèi)模型有較高的異種移植成功率，潛伏期短，但大部分轉(zhuǎn)移率低。同時(shí)，由于裸鼠缺乏以T細(xì)胞為主的免疫系統(tǒng)，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)要求條件高、壽命短，對(duì)實(shí)驗(yàn)處理因素耐受性低，尤其是移植如肝癌這樣的細(xì)胞，在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)迅速，短時(shí)間內(nèi)即產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)及致死性血性腹水，使裸鼠帶瘤生存時(shí)間短暫而影響實(shí)驗(yàn)研究，不適于藥物靶向性治療中所進(jìn)行的動(dòng)態(tài)性觀察，因而限制了對(duì)此肝癌模型的廣泛應(yīng)用。
從以上的研究可以看出，現(xiàn)存的人肝癌鼠模型主要是利用裸小鼠、裸大鼠無(wú)胸腺、缺乏T淋巴細(xì)胞這樣的免疫缺陷動(dòng)物，進(jìn)行的跨物種的人肝癌的移植及模型的構(gòu)建，雖然保證了移植的成功率，但是不能真實(shí)的模擬肝癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中機(jī)體對(duì)腫瘤的細(xì)胞免疫應(yīng)答狀況，致使人體抗肝腫瘤免疫應(yīng)答的研究一直停頓于體外實(shí)驗(yàn)，從很大程度上限制了腫瘤生物學(xué)及抗腫瘤免疫藥物治療效果的研究和評(píng)估。因此，建立在具有正常免疫功能的鼠-人肝癌移植性模型已成為當(dāng)代生物醫(yī)藥學(xué)及腫瘤免疫研究中的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的狀況，本發(fā)明的目的是提供一種原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法。
本發(fā)明利用乳鼠肝內(nèi)高表達(dá)的甲胎蛋白(alpha-fetaprotein，AFP)可抑制機(jī)體抗腫瘤免疫的生物學(xué)活性及原位移植的原理，首次利用具有正常免疫功能的昆明種乳鼠，建立了人肝癌小鼠原位移植性模型。
本發(fā)明涉及的一種原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法，步驟是[1]人肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)選人肝癌細(xì)胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)，備用；[2]熒光染料DiI標(biāo)記的細(xì)胞懸液的制備選取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞株之一，與20μg/ml活體熒光染料DiI在37℃～38℃下共孵30min～60min，之后，0.25％無(wú)菌胰蛋白酶消化，以基本培養(yǎng)液收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至0.5×106個(gè)/ml～1.0×109個(gè)/ml；[3]原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型選用昆明種三日齡乳鼠，腹部皮膚消毒后，利用無(wú)菌30-gauge 50-μl玻璃微量進(jìn)樣器，將10μl～50μl上述DiI標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞懸液，直接移植入鼠肝葉內(nèi)，建立人肝癌小鼠原位移植性模型；[4]模型鑒定。
上述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法中，步驟[1]所述人肝癌細(xì)胞株優(yōu)選HepG-2(甲胎蛋白陽(yáng)性，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)、Bel-7402(甲胎蛋白陽(yáng)性，購(gòu)于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)、SK-Hep-1(甲胎蛋白陰性，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)之一，細(xì)胞株液氮保存，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代培養(yǎng)。
所述人肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)方法是胎牛血清濃度為10％的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，其中人肝癌細(xì)胞株HepG-2、SK-Hep-1選用DMEM-H基本培養(yǎng)液；Bel-7402選用RPMI1640基本培養(yǎng)液。
上述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法中，步驟[2]所述活體熒光染料DiI標(biāo)記人肝癌細(xì)胞的方法是活體熒光染料DiI使用前用無(wú)水乙醇溶解至2.0mg/ml，0.22μm的一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌后，室溫密閉避光保存，備用；10％血清細(xì)胞培養(yǎng)液將上述熒光染料DiI稀釋至20μg/ml的終濃度，與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁人肝癌細(xì)胞于37℃孵箱內(nèi)共孵50min～60min，每隔10min將熒光染液搖勻一次，肝癌細(xì)胞即被熒光染料DiI完全標(biāo)記。
熒光染料DiI(1，1’’-Dioctadecyl-3，3，3’’，3’’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)是一種親脂性碳花青熒光染料，易嵌入生物質(zhì)膜內(nèi)并在膜內(nèi)作側(cè)向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，或者通過(guò)胞飲作用進(jìn)入胞質(zhì)，從而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞。DiI使用簡(jiǎn)便，對(duì)活體細(xì)胞無(wú)毒性，而且不從已標(biāo)記的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到未標(biāo)記的細(xì)胞，且熒光衰減慢，因此，DiI是一種可靠的熒光染料。1986年Honig等首先將DiI引入神經(jīng)系統(tǒng)的研究，成功地顯示了體外培養(yǎng)神經(jīng)元的胞體和突起。此后，DiI被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)通路的發(fā)育研究。Soriano等首先發(fā)現(xiàn)DiI亦可標(biāo)記肝細(xì)胞，從肝實(shí)質(zhì)中辨別出被移植的肝細(xì)胞。國(guó)內(nèi)較少使用熒光染料DiI標(biāo)記肝癌細(xì)胞進(jìn)行示蹤研究。
上述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法中，步驟[2]所述熒光染料DiI標(biāo)記的細(xì)胞懸液的制備方法是收集胰蛋白酶消化后的熒光染料DiI標(biāo)記的細(xì)胞，1000r/min離心3min，重復(fù)3次，每次均用37℃預(yù)溫基本培養(yǎng)液重懸；經(jīng)計(jì)數(shù)，存活率超過(guò)80％后，以基本培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×108個(gè)/ml；于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm下觀察，確定細(xì)胞被成功標(biāo)記后，待用。
上述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法中，步驟[3]所述直接移植人肝癌細(xì)胞懸液入鼠肝葉內(nèi)的方法是用食指與中指夾住乳鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，無(wú)名指與小指固定住小鼠尾部，此時(shí)小鼠腹部會(huì)完全曝露，可見(jiàn)位于小鼠胸廓下方的呈暗紅色的肝臟區(qū)域；無(wú)菌30-gauge 50-μl玻璃微量進(jìn)樣器吸取步驟[2]熒光標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞懸液30μl，以30度的入針角度刺入小鼠肝葉內(nèi)，入針深度2mm～2.5mm，將人肝癌細(xì)胞由小鼠體外直接移植入小鼠肝葉內(nèi)，注射時(shí)間為2min/只～3min/只，出針后用酒精棉球迅速輕按注射部位1min～2min，之后，歸還母鼠，以常規(guī)方式飼養(yǎng)。
上述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法中，步驟[4]所述模型鑒定采用如下鑒定手段(1)人肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況-----熒光染料DiI標(biāo)記技術(shù)結(jié)合活體成像系統(tǒng)；(2)人肝癌細(xì)胞的在荷瘤小鼠肝內(nèi)的定性，定位示蹤-----活體熒光染料DiI標(biāo)記人肝癌細(xì)胞，荷瘤小鼠肝組織冰凍切片，熒光顯微鏡觀察；此法可直接區(qū)分移植的肝癌細(xì)胞與受體肝細(xì)胞，直觀的示蹤了移植肝癌細(xì)胞在小鼠肝內(nèi)的分布與存活狀況；(3)荷瘤小鼠肝臟病理學(xué)變化-----石蠟切片HE染色觀察；此法是目前臨床診斷肝癌的最佳指標(biāo)，可直觀地反映肝臟病變狀態(tài)。；(4)荷瘤小鼠血清甲胎蛋白(AFP)表達(dá)變化的鑒定----定量ELISA檢測(cè)；血清AFP陽(yáng)性被確定為診斷和發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌(HCC)的黃金指標(biāo)。
本發(fā)明的有益效果針對(duì)現(xiàn)有小鼠肝癌模型存在的問(wèn)題，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的調(diào)研與實(shí)驗(yàn)摸索，申請(qǐng)人了解到，普通昆明種小鼠與人類(lèi)在遺傳學(xué)、病理學(xué)、生物學(xué)許多特性方面相似，而且適應(yīng)力很強(qiáng)，價(jià)格便宜且具有較高的繁殖率及存活率，己被廣泛應(yīng)用藥理學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究，以及藥品、生物制品的生產(chǎn)與檢定。Martin Olsson等在1977年對(duì)27個(gè)不同種系小鼠的肝臟甲胎蛋白的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，小鼠在出生后的一定時(shí)期內(nèi)肝臟仍有較高水平的AFP表達(dá)；研究表明AFP是維持肝癌惡性生長(zhǎng)，逃避免疫系統(tǒng)攻擊的分子基礎(chǔ)之一，是小鼠胚胎時(shí)期及肝癌發(fā)生過(guò)程中高表達(dá)的標(biāo)志性蛋白。因此推測(cè)，初生乳鼠的肝臟內(nèi)較高水平的AFP表達(dá)可能有利于小鼠肝臟移植的人肝癌細(xì)胞的存活，根據(jù)原位移植原理，構(gòu)建了人肝細(xì)胞癌小鼠原位移植性模型，它具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)制作過(guò)程簡(jiǎn)單易行，成功率高，動(dòng)物價(jià)格便宜，容易獲得，能廣泛推廣應(yīng)用；(2)本實(shí)驗(yàn)選用3日齡的昆明種乳鼠作為荷瘤的受體，此時(shí)小鼠皮膚透明，肝重/體重比較大，在不用實(shí)施外科手術(shù)的前提下，提高了荷瘤注射的準(zhǔn)確率，減少了以往因?yàn)槁樽砑笆中g(shù)對(duì)小鼠機(jī)體的損傷，保證了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在荷瘤期間健康的生理狀態(tài)；(3)活體成像系統(tǒng)結(jié)合活體熒光染料DiI標(biāo)記技術(shù)示蹤了移植入小鼠體內(nèi)的人肝癌細(xì)胞，對(duì)本發(fā)明的異種原位移植進(jìn)行定位，定性研究，直觀，簡(jiǎn)便，容易操作，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究極少；(4)肝癌細(xì)胞在小鼠中的移植率與裸鼠接近，且生長(zhǎng)期短，承受癌性腹水容量大，耐受力強(qiáng)，帶瘤生存時(shí)間較裸鼠延長(zhǎng)1倍以上，同時(shí)，隨著小鼠的免疫系統(tǒng)的發(fā)育，不僅可以對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)，而且也可研究肝癌細(xì)胞與小鼠免疫系統(tǒng)的相互作用，能夠非常真實(shí)地模擬人類(lèi)體內(nèi)免疫耐受及抗腫瘤免疫的全過(guò)程；(5)以一種實(shí)施簡(jiǎn)單，成功率高的方法，在正常的機(jī)體免疫環(huán)境下，構(gòu)建跨物種的小鼠原位移植性人肝癌模型，為免疫生物藥物的篩選及藥理的研究提供更為理想的操作平臺(tái)，至今尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，具有理論和實(shí)踐上的創(chuàng)新性。


圖1.小鼠荷瘤第7天，肝臟外觀圖，荷瘤小鼠腹腔解剖觀察，肝葉上出現(xiàn)明顯的灰色腫瘤結(jié)節(jié)一處(約3cm×2cm)；圖2.人肝癌細(xì)胞在荷瘤小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，活體成像系統(tǒng)結(jié)合熒光染料DiI標(biāo)記技術(shù)，示蹤小鼠活體內(nèi)的人肝癌細(xì)胞在的轉(zhuǎn)移情況；圖3.荷瘤后，活體熒光染料DiI示蹤人肝癌細(xì)胞在小鼠肝內(nèi)的占位情況(×40)，A\B荷瘤60h冰凍切片顯示肝癌細(xì)胞在肝內(nèi)的占位情況，C\D荷瘤5d，冰凍切片顯示肝癌細(xì)胞在肝內(nèi)的占位情況，E\F荷瘤14d冰凍切片顯示肝癌細(xì)胞在肝內(nèi)的占位情況；圖4.荷瘤小鼠肝組織病理學(xué)檢查，A.荷瘤5天腫瘤組織石蠟切片，H-E染色結(jié)果(×40)，B.荷瘤14天腫瘤組織石蠟切片，H-E染色結(jié)果(×40)，1.1腫瘤中心位置的細(xì)胞核消失(×400)，1.2細(xì)胞形態(tài)呈條索狀(×400)，1.3腫瘤邊緣明顯的多倍細(xì)胞核(×400)；圖5.ELISA檢測(cè)荷瘤小鼠血清甲胎蛋白變化，檢測(cè)結(jié)果顯示，荷瘤3日小鼠血清甲胎蛋白水平明顯升高。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例證，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，所述的實(shí)施例僅僅是用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1DiI熒光染料標(biāo)記人肝癌細(xì)胞HepG-2懸液的制備1、試驗(yàn)器材熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE TE2000-U)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，2300TC)；0.22μm針頭式過(guò)濾器(美國(guó)MILLIPORE)；2、試驗(yàn)試劑DMEM-H液體基本培養(yǎng)液(HyClone)；優(yōu)級(jí)胎牛血清(HyClone)；熒光染料DiI(AnaSpec，Inc.)；0.25％胰蛋白酶(SINGAMA)等。
3、試驗(yàn)方法AFP陽(yáng)性人肝癌細(xì)胞株HepG-2，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，液氮保存，DMEM-H基本培養(yǎng)液，10％胎牛血清，37℃5％CO2恒溫培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)；0.25％無(wú)菌胰蛋白酶消化傳代。
無(wú)水乙醇溶解熒光染料DiI至2.0mg/ml；0.22μm的一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌后，室溫密閉避光保存；使用前用10％胎牛血清DMEM基本培養(yǎng)液稀釋熒光染料至20μg/ml的終濃度，與貼壁的人肝癌細(xì)胞37℃孵箱內(nèi)共孵45min，每隔10min混勻一次。0.25％無(wú)菌胰蛋白酶消化，收集標(biāo)記后的人肝癌細(xì)胞，1000r/min×3min離心3次，每次均用37℃預(yù)溫基本培養(yǎng)液重懸；經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，存活率超過(guò)80％后，基本培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×108個(gè)/ml；于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm觀察下，確定細(xì)胞被成功標(biāo)記后，待用。
實(shí)施例2原位移植性人肝癌細(xì)胞HepG-2小鼠模型的構(gòu)建1、試驗(yàn)材料30-gauge 50-μl玻璃微量進(jìn)樣器(上海高欣玻璃儀器廠)；DiI熒光染料標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞HepG-2懸液，冰凍切片機(jī)(MICROM HM 550)；AO 820切片機(jī)(American OpticalCorporration)；石蠟(sangon)等；2、試驗(yàn)動(dòng)物昆明種孕鼠，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于SPF清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)飼養(yǎng)，并待其生產(chǎn)，取出生后3日齡乳鼠為荷瘤受體，雌雄均有，平均體重為1.9g。
3、試驗(yàn)方法1)取3日齡昆明種乳鼠，腹部皮膚用酒精消毒。
2)用食指與中指夾住小鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，用力要輕，以防小鼠窒息，無(wú)名指與小指固定住小鼠尾部，使小鼠身體輕微后彎，此時(shí)小鼠腹部會(huì)完全曝露，可見(jiàn)位于小鼠胸廓下方的大部分呈暗紅色的肝臟區(qū)域。
3)取無(wú)菌30-gauge 50-μl玻璃微量進(jìn)樣器吸取熒光標(biāo)記的HepG-2細(xì)胞懸液30μ1，以30度的入針角度刺入小鼠肝葉內(nèi)，入針深度2mm，此時(shí)小鼠肝臟稚嫩，容易扎穿，而導(dǎo)致細(xì)胞懸液的損失。
4)將人肝癌細(xì)胞懸液緩慢的注射入小鼠肝葉內(nèi)，注射時(shí)間為2min/只，出針后用無(wú)菌酒精棉球迅速輕按注射部位1min，以防止細(xì)胞懸液的滲出，如果注射位置準(zhǔn)確的定位于肝葉，乳鼠不會(huì)劇烈掙扎，基本上無(wú)血液滲出。
5)整個(gè)操作過(guò)程，須確保操作人員不要直接用手觸碰乳鼠皮膚，以確保母鼠對(duì)荷瘤后幼鼠的識(shí)別。
6)歸還母鼠哺育，保證飼養(yǎng)環(huán)境的清潔，隨時(shí)觀察荷瘤乳鼠的生存狀態(tài)。
7)荷瘤60h后，每隔48h，活體成像檢測(cè)一次；尾靜脈取血，4℃靜置，隔日分離血清，-80℃保存待用；取荷瘤小鼠以10g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，解剖觀察；取癌灶及癌周組織做冰凍切片，于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm下觀察；部分組織用40g/L中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下常規(guī)病理組織學(xué)觀察。
4、試驗(yàn)結(jié)果1)荷瘤期間，腫瘤的生長(zhǎng)對(duì)荷瘤小鼠的生存狀態(tài)無(wú)顯著影響，無(wú)自然死亡現(xiàn)象。
2)解剖觀察，可見(jiàn)小鼠肝葉有1～2個(gè)明顯的形似赤豆的結(jié)節(jié)(見(jiàn)圖1)，與周邊組織界面清晰，呈灰白色；腫瘤周?chē)M織正常，成瘤率近100％。
3)活體成像顯示人肝癌細(xì)胞在小鼠肝內(nèi)位置，無(wú)自發(fā)轉(zhuǎn)移及消退現(xiàn)象發(fā)生(見(jiàn)圖2)。
4)DiI染色的陽(yáng)性細(xì)胞在激發(fā)光549nm下顯示紅色熒光，細(xì)胞均勻著色，不能區(qū)分胞核與胞質(zhì)，冰凍切片結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞在肝內(nèi)的占位比較穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度未見(jiàn)明顯減弱(見(jiàn)圖3)。
5)H-E病理切片檢查顯示，腫瘤組織有完整薄膜包被，與正常肝組織之間界限分明，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈長(zhǎng)條狀，有腫瘤結(jié)節(jié)，于荷瘤后第7d開(kāi)始，腫瘤中間出現(xiàn)干酪樣壞死，隨著小鼠的生長(zhǎng)，壞死區(qū)域無(wú)明顯增大，其生長(zhǎng)行為與肝癌相似，適于人肝癌相關(guān)的醫(yī)學(xué)及生物學(xué)實(shí)驗(yàn)性研究(見(jiàn)圖4)。
6)荷瘤3d后，小鼠血清的甲胎蛋白水平出現(xiàn)明顯升高(見(jiàn)圖5)，符合人肝癌發(fā)生過(guò)程中的常規(guī)病理檢查指標(biāo)及特點(diǎn)(檢測(cè)詳見(jiàn)實(shí)施例3)。
試驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明所述方法可以成功的構(gòu)建人肝癌小鼠原位移植性模型。
該模型建立在正常的免疫系統(tǒng)之上，利用動(dòng)物體內(nèi)AFP的免疫抑制作用，基本避免了免疫排斥的發(fā)生，理想地重現(xiàn)了肝癌細(xì)胞在肝內(nèi)的生物學(xué)特性。
實(shí)施例3ELISA檢測(cè)荷瘤小鼠血清甲胎蛋白濃度變化1.試驗(yàn)材料荷瘤小鼠血清；甲胎蛋白酶免試劑盒(BioCheck，Inc)；甲胎蛋白抗體(LABVISON)2.試驗(yàn)方法(1)配制工作用洗滌液濃縮洗滌液20ml/瓶，用蒸餾水1∶20稀釋后使用；(2)加樣設(shè)空白對(duì)照1孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照各2孔，分別加陰、陽(yáng)性對(duì)照各50μl和50μl待測(cè)樣本于相應(yīng)孔內(nèi)；(3)加酶除空白對(duì)照孔外，每孔加1滴(50μl)酶標(biāo)記物，輕輕振蕩，用透明膠條將板孔封好；(4)溫育37℃水浴30min；(5)洗滌扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿(mǎn)各孔，靜置20s，除去洗滌液，重復(fù)4次后在吸水紙上拍干；(6)顯色每孔加入底物液A、B各1滴，輕輕振蕩封板后，置37℃水浴15分鐘；(7)結(jié)果判定每孔加終止液1滴，用酶標(biāo)儀檢測(cè)(波長(zhǎng)450nm)各孔OD值(空白孔調(diào)零)。
3.試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)到荷瘤后第3d小鼠血清甲胎蛋白表達(dá)水平明顯升高(見(jiàn)圖6)。
實(shí)施例4原位移植性人肝癌細(xì)胞SK-Hep-1小鼠模型的構(gòu)建1、試驗(yàn)材料30-gauge 50-μl玻璃微量進(jìn)樣器(上海高欣玻璃儀器廠)； DiI熒光染料標(biāo)記SK-Hep-1肝癌細(xì)胞懸液(0.5×106個(gè)/ml)2、試驗(yàn)動(dòng)物昆明種孕鼠，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于SPF清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)飼養(yǎng)，待其生產(chǎn)。
3、試驗(yàn)方法1)取3日齡的昆明種乳鼠，腹部皮膚用酒精消毒。
2)用食指與中指夾住小鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，用力要輕，以防小鼠窒息，無(wú)名指與小指固定住小鼠尾部，使小鼠身體輕微后彎，此時(shí)小鼠腹部會(huì)完全曝露，可見(jiàn)位于小鼠胸廓下方的大部分肝臟區(qū)域，呈暗紅色。
3)取無(wú)菌30-gauge 50-μl玻璃微量進(jìn)樣器吸取DiI熒光染料標(biāo)記人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞懸液20μl，以30度的入針角度刺入，從皮膚外部直接扎入小鼠肝葉，入針深度2.5ml即可，此時(shí)小鼠肝臟稚嫩，容易扎穿，而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞懸液的損失。
4)將熒光染料標(biāo)記后的人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞懸液緩慢的注射入小鼠肝內(nèi)，注射時(shí)間為2min/只，出針后用無(wú)菌酒精棉球迅速輕按注射部位1min，以防止細(xì)胞懸液的滲出，注如果注射位置準(zhǔn)確的定位于肝葉，乳鼠不會(huì)劇烈掙扎，基本上無(wú)血液滲出。
5)歸還母鼠哺育，保證飼養(yǎng)環(huán)境的清潔。
6)整個(gè)操作過(guò)程，請(qǐng)確保操作人員不要直接用手觸碰乳鼠皮膚，以確保母鼠對(duì)荷瘤后幼鼠的識(shí)別。
7)荷瘤60h后，每隔48h，活體成像檢測(cè)一次；尾靜脈取血，4℃靜置，隔日分離血清，-80℃保存待用；取荷瘤小鼠以10g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，解剖觀察；取癌灶及癌周組織做冰凍切片，于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm下觀察；部分組織用40g幾中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下常規(guī)病理組織學(xué)觀察。
4、試驗(yàn)結(jié)果荷瘤48h后，解剖觀察，由于荷瘤細(xì)胞濃度過(guò)低，荷瘤成功率明顯降低至0.5％，荷瘤成功的小鼠，基本狀況同實(shí)施例2。
實(shí)施例5原位移植性人肝癌Bel-7402小鼠模型的構(gòu)建1、試驗(yàn)材料30-gauge 50-μl玻璃微量進(jìn)樣器(上海高欣玻璃儀器廠)；DiI熒光染料標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞Bel-7402懸液(1.0×107個(gè)/ml)；2、試驗(yàn)動(dòng)物昆明種孕鼠，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于SPF清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)飼養(yǎng)，取出生后3d小鼠為荷瘤受體，雌雄均有，平均體重為1.9g。
3、試驗(yàn)方法1)取3日齡昆明種乳鼠，腹部皮膚用酒精消毒。
2)用食指與中指夾住小鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，用力要輕，以防小鼠窒息，無(wú)名指與小指固定住小鼠尾部，使小鼠身體輕微后彎，此時(shí)小鼠腹部會(huì)完全曝露，可見(jiàn)位于小鼠胸廓下方的大部分呈暗紅色的肝臟區(qū)域。
3)取無(wú)菌30-gauge 50-μl玻璃微量進(jìn)樣器吸取HepG-2細(xì)胞懸液10μl，以30度的進(jìn)針角度，從皮膚外部直接扎入小鼠肝葉，入針深度2ml即可，此時(shí)小鼠肝臟稚嫩，容易扎穿，而導(dǎo)致細(xì)胞懸液的損失。
4)將細(xì)胞懸液緩慢的注射入小鼠肝內(nèi)，注射時(shí)間為2min/只，出針后用無(wú)菌酒精棉球迅速輕按注射部位1min，以防止細(xì)胞懸液的滲出，如果注射位置準(zhǔn)確的定位于肝葉，乳鼠不會(huì)劇烈掙扎，基本上無(wú)血液滲出。
5)整個(gè)操作過(guò)程，請(qǐng)確保操作人員不要直接用手觸碰乳鼠皮膚，以確保母鼠對(duì)荷瘤后幼鼠的識(shí)別。
6)歸還母鼠哺育，保證飼養(yǎng)環(huán)境的清潔，隨時(shí)觀察乳鼠的生存狀態(tài)。
7)荷瘤60h后，每隔48h，活體成像檢測(cè)一次；尾靜脈取血，4℃靜置，隔日分離血清，-80℃保存待用；取荷瘤小鼠以10g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，解剖觀察；取肉眼可見(jiàn)癌灶及癌周組織冰凍切片，于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm觀察下；部分組織用40g/L中性福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下常規(guī)病理組織學(xué)觀察。
4、試驗(yàn)結(jié)果由于荷瘤細(xì)胞懸液體積過(guò)低，荷瘤成功率明顯降低至1％，荷瘤成功的小鼠基本狀況同實(shí)施例2。
權(quán)利要求
1.一種原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法，步驟是[1]人肝癌細(xì)胞株的培養(yǎng)選人肝癌細(xì)胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)，備用；[2]熒光染料DiI標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞懸液的制備選取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞株之一，與20μg/ml活體熒光染料DiI在37℃～38℃下共孵30min～60min，之后，0.25％無(wú)菌胰蛋白酶消化，以基本培養(yǎng)液收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至0.5×106個(gè)/ml～1.0×109個(gè)/ml；[3]原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型選用昆明種三日齡乳鼠，腹部皮膚消毒后，利用無(wú)菌30-gauge50-μl玻璃微量進(jìn)樣器，將10μl～50μl上述DiI標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞懸液，直接移植入乳鼠肝葉內(nèi)，建立人肝癌小鼠原位移植性模型；[4]模型鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[1]所述人肝癌細(xì)胞是HepG-2、Bel-7402、SK-Hep-1之一；培養(yǎng)方法是胎牛血清濃度為10％的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，其中人肝癌細(xì)胞株HepG-2、SK-Hep-1選用DMEM-H基本培養(yǎng)液；Bel-7402選用RPMI1640基本培養(yǎng)液。
3.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[2]所述活體熒光染料DiI標(biāo)記人肝癌細(xì)胞的方法是活體熒光染料DiI使用前用無(wú)水乙醇溶解至2.0mg/ml，0.22μm的一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌后，室溫密閉避光保存，備用；10％血清培養(yǎng)液將上述熒光染料DiI稀釋至20μg/ml的終濃度，與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁人肝癌細(xì)胞于37℃孵箱內(nèi)共孵45min，每隔10min將熒光染液搖勻一次，肝癌細(xì)胞即被熒光染料DiI完全標(biāo)記。
4.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[2]所述熒光染料DiI標(biāo)記的細(xì)胞懸液的制備方法是收集胰蛋白酶消化后的熒光染料DiI標(biāo)記的細(xì)胞，1000r/min離心3min，重復(fù)3次，每次均用37℃預(yù)溫基本培養(yǎng)液重懸；經(jīng)計(jì)數(shù)，存活率超過(guò)80％后，以基本培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×108個(gè)/ml；于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm下觀察，確定細(xì)胞被成功標(biāo)記后，待用。
5.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[3]所述直接移植人肝癌細(xì)胞懸液入乳鼠肝葉的方法是用食指與中指夾住乳鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，無(wú)名指與小指固定住小鼠尾部，此時(shí)小鼠腹部會(huì)完全曝露，可見(jiàn)位于小鼠胸廓下方的呈暗紅色的肝臟區(qū)域；無(wú)菌30-gauge 50-μl玻璃微量進(jìn)樣器吸取步驟[2]熒光標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞懸液30μl，以30度的入針角度刺入小鼠肝葉內(nèi)，入針深度2mm～2.5mm，將人肝癌細(xì)胞由小鼠體外直接移植入小鼠肝葉內(nèi)，注射時(shí)間為2min/只～3min/只，出針后用酒精棉球迅速輕按注射部位1min～2min，之后歸還母鼠，以常規(guī)方式飼養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[4]所述模型鑒定采用如下手段(1)人肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況-----熒光染料DiI標(biāo)記技術(shù)結(jié)合活體成像系統(tǒng)；(2)人肝癌細(xì)胞的在荷瘤小鼠肝內(nèi)的定性，定位示蹤-----活體熒光染料DiI標(biāo)記人肝癌細(xì)胞，冰凍切片，熒光顯微鏡觀察；(3)荷瘤小鼠肝臟病理學(xué)變化-----石蠟切片HE染色觀察；(4)荷瘤小鼠血清甲胎蛋白表達(dá)變化的鑒定----定量ELISA測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種原位移植構(gòu)建人類(lèi)肝癌小鼠模型的方法，即利用具有正常免疫功能的昆明種乳鼠作為荷瘤受體，于小鼠體外向鼠肝葉內(nèi)直接注射人肝癌細(xì)胞懸液，建立人肝癌細(xì)胞原位移植性荷瘤模型。本發(fā)明方法實(shí)施簡(jiǎn)單，成功率高，基于本發(fā)明，可以在小鼠正常的機(jī)體免疫環(huán)境下，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肝癌細(xì)胞與小鼠免疫系統(tǒng)的相互作用，能夠非常真實(shí)地模擬人類(lèi)體內(nèi)免疫耐受及抗腫瘤免疫的全過(guò)程，為免疫生物學(xué)藥物的篩選及藥理的研究提供更為理想的操作平臺(tái)。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101020066SQ200710013248
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日
發(fā)明者白增亮, 王澤 , 張敬平 申請(qǐng)人:山東大學(xué)