專利名稱：一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立方法，尤其涉及一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域或植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
棗(Ziziphus jujube Mill)是鼠李科棗屬植物，我國是棗樹的起源地和栽培中心，種質(zhì)資源非常豐富。棗是我國第七大果樹和第一大干果，耐干旱、耐瘠薄、耐鹽堿、適應(yīng)性強，在果樹的發(fā)展中起著重要的作用。冬棗是優(yōu)良的晚熟鮮食棗品種，風(fēng)味獨特，產(chǎn)量高，以其極優(yōu)的品質(zhì)，富含人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)而倍受消費者青睞，在果樹生產(chǎn)、銷售上具有重要價值。冬棗主產(chǎn)于山東沾化和河北的黃驊，山西、河南、北京、陜西、新疆等省區(qū)也有規(guī)模不等的引種。沾化冬棗是鮮食品質(zhì)最好的冬棗品種之一，主產(chǎn)于我省渤海灣地區(qū)，適合在低度鹽地生長。隨著市場經(jīng)濟的發(fā)展和果樹品種結(jié)構(gòu)的調(diào)整優(yōu)化，沾化冬棗以其獨特的品種特性，成為許多地區(qū)的首選品種，發(fā)展十分迅速。
然而，冬棗成熟期集中，貯藏期短，常溫下僅能保存6-7天，而且果實偏小、果核大、果皮薄、病害嚴(yán)重。若不能及時攻克這些難題，則會大大限制冬棗的發(fā)展，無法擴大栽培及銷售地域和大量進(jìn)入國際市場。由于冬棗花小，去雄困難，落花落果較嚴(yán)重，胚容易退化，目前冬棗育種僅僅限于田間選育優(yōu)良株系。此外，冬棗貯藏保鮮的研究始于90年代中期，先后從國外引進(jìn)多套設(shè)備進(jìn)行貯藏保鮮。但常規(guī)的速凍儲藏、氣調(diào)儲藏、減壓儲藏、輻射儲藏等方法，果實出庫后品質(zhì)不佳，貨架期也只有3-5天。看來采用現(xiàn)有的貯藏保鮮和育種方法，很難較好地解決這些難題。
冬棗屬于高呼吸強度的非躍變型果實，ABA對其后熟及貯期衰老起著非常重要的作用，影響著棗果后熟過程中各類酶活性和果實貯藏物質(zhì)的降解速率及硬度，是導(dǎo)致棗果變軟衰老的主要因素。因此通過反義基因技術(shù)組織特異性的降低ABA合成強度是延長棗果采收期和貯藏保鮮期的重要途徑。因而，利用植物基因工程技術(shù)是有效解決這些問題的首選，成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。
由于棗樹組織培養(yǎng)植株再生的難度較大，缺少合適的再生體系，與其他果樹遺傳轉(zhuǎn)化相比進(jìn)展緩慢，迄今僅有幾例相關(guān)的研究報道。胡桂兵(2001)研究了4種抗生素對臺灣青棗幼嫩莖段和疏松的愈傷組織生長的影響，初步確定進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中抑菌方法和轉(zhuǎn)化體的篩選方法。何業(yè)華等(2003，2004)以根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ACC合成酶反義基因轉(zhuǎn)入棗嫩梢段和下胚軸，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。相對于其它植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究，棗的轉(zhuǎn)基因工作仍處在探索階段，對于利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，經(jīng)檢索還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法。
本發(fā)明以冬棗組培苗的莖尖為遺傳轉(zhuǎn)化受體，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，經(jīng)選擇獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞及植株。在此基礎(chǔ)上，確立了適宜的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌濃度、浸染時間、暗培養(yǎng)時間，以及減壓處理等參數(shù)，有效提高了轉(zhuǎn)化頻率，建立起一個高效的基因型制約小的冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系。
本發(fā)明所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，由以下步驟實現(xiàn)1)莖尖培養(yǎng)及誘導(dǎo)叢生芽再生，2)叢生芽的延伸培養(yǎng)，3)以莖尖為受體在抽真空施加負(fù)壓下進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，4)小苗生根和移栽，5)轉(zhuǎn)基因植株分子檢測；其特征在于步驟1)所述莖尖培養(yǎng)及誘導(dǎo)叢生芽再生是指冬棗休眠芽在25-27℃培養(yǎng)箱中水培萌發(fā)，萌發(fā)的幼枝剪成單芽莖段，70％酒精預(yù)殺菌30s，0.1％的升汞消毒8-15min，無菌水沖洗3-4次，然后接種在附加0.5-2mg L-1赤霉素和0.1-1mg L-16-芐基嘌呤的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度25-27℃、光照強度3000-4000Lx、光照12h/天條件下培養(yǎng)，35天繼代一次；步驟2)所述的叢生芽的延伸培養(yǎng)是指將步驟1)再生的小芽接種在添加有1-3mg L-1赤霉素、0.1-0.5mg L-16-芐基嘌呤和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS延伸培養(yǎng)基上以步驟2)所述條件培養(yǎng)，之后切取冬棗莖尖，備用；步驟3)所述的以莖尖為受體在抽真空施加負(fù)壓下進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化是指取2-8mm的冬棗莖尖為受體(莖尖受體指十到幾十微米的莖尖分生組織(shoot meristem)和大到幾毫米的莖端(shoot tip)，而莖尖分生組織是指頂端生長錐及其鄰近的葉原基)，用解剖針均勻劃傷莖尖頂端分生組織，同時將帶有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農(nóng)桿菌制成OD600值為0.2-1.2的梯度菌液，然后將劃傷莖尖分別浸入梯度菌液中，浸染5-20mins，其間浸染環(huán)境附以真空度為0.95×105Pa-0.3×105Pa的負(fù)壓條件，以提高農(nóng)桿菌的浸染效率；浸染結(jié)束后，用無菌濾紙將莖尖上剩余菌液吸干，轉(zhuǎn)至MS延伸培養(yǎng)基中，在20-21℃溫度條件下暗培養(yǎng)2-8天；暗培養(yǎng)結(jié)束后，將莖尖用無菌水洗2-3次，然后轉(zhuǎn)至含100mg L-1頭孢霉素MS延伸培養(yǎng)基上，抑菌培養(yǎng)7-14天，之后在含0.5-3mg L-1綠磺隆的MS延伸培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，連續(xù)篩選3-5代，每代7-10天；然后轉(zhuǎn)入含有1mg L-1赤霉素和0.5mg L-16-芐基嘌呤的MS延伸培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)；步驟4)所述的小苗生根和移栽是指將步驟3)所述恢復(fù)培養(yǎng)后存活的莖尖繼續(xù)培養(yǎng)，待長至株高為1.5-2cm后，轉(zhuǎn)入Nitsh生根培養(yǎng)基中生根，根生長至1.5-3cm后，移入砂與蛭石體積比為1∶1的基質(zhì)中繼續(xù)生長；步驟5)轉(zhuǎn)基因植株分子檢測是指利用PCR、Southern blot、RT-PCR方法對轉(zhuǎn)基因植株檢測，根據(jù)是否有目的基因條帶，確定冬棗轉(zhuǎn)基因植株。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法中所述冬棗是指鼠李科棗屬植物晚熟的栽培品種(因在寒露節(jié)后成熟而得名，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，適應(yīng)性強，是鮮食優(yōu)良棗品種)。
其中所述冬棗優(yōu)選沾化冬棗。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法中所述帶有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農(nóng)桿菌優(yōu)選LBA4404或AGLO。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法中所述升汞滅菌后的單芽莖段接種優(yōu)選附加0.8-1.5mg L-1赤霉素和0.2-0.8mg L-16-芐基嘌呤的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法中步驟3)所述農(nóng)桿菌菌液優(yōu)選是OD600值為0.4-1.0的梯度菌液，所述浸染時間優(yōu)選8-10mins，所述暗培養(yǎng)時間優(yōu)選4-6天。
不同農(nóng)桿菌菌株其較佳的轉(zhuǎn)化參數(shù)有差異。如選用LBA4404時，當(dāng)菌液濃度OD600值為0.6-0.8，較佳感染時間為8-10mins時，結(jié)果顯示莖尖在恢復(fù)培養(yǎng)中的存活率高，轉(zhuǎn)基因植株比例較高。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法中步驟3)所述負(fù)壓條件優(yōu)選0.8×105Pa-0.5×105Pa。
其中步驟3)所述負(fù)壓條件最優(yōu)選0.6×105Pa-0.5×105Pa。
本發(fā)明中，培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過濾滅菌，在培養(yǎng)基滅菌后加入。
上述的MS基本培養(yǎng)基是指改良MS培養(yǎng)基(KNO31900mgL-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mgL-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mgL-1，ZnSO4·7H2O 10mgL-1，MnSO4·4H2O 22.3mgL-1，H3BO310mgL-1，KI 0.83mgL-1，Na2MoO4·2 H2O 0.5mgL-1，CuSO4·5H2O 0.025mgL-1，CoCl2·6H2O 0.025mgL-1，鹽酸硫胺素10.0mgL-1，鹽酸吡哆醇1.0mgL-1，煙酸1.0mgL-1，甘氨酸2.0mgL-1，肌醇100.0mgL-1，生物素0.05mgL-1，酪蛋白水解物500mgL-1)，蔗糖30gL-1，瓊脂粉6.5gL-1，pH5.8-6.0。
上述MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指添加有0.5-2mgL-1赤霉素(GA3)、0.1-1mgL-16-芐基嘌呤(6-BA)和100-500mgL-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基；上述MS延伸培養(yǎng)基是指添加有1-3mgL-1赤霉素(GA3)、0.1-0.5mgL-16-芐基嘌呤(6-BA)和100-500mgL-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基則去掉瓊脂粉。
上述Nitsh生根培養(yǎng)基是指添加有0.1-0.5mgL-1吲哚乙酸(IAA)，0.2-1mgL-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養(yǎng)基；上述的農(nóng)桿菌菌株為分子生物學(xué)領(lǐng)域常用菌株，可購自上海坤肯生物化工有限公司，在劉君等(CMO與BADH雙基因表達(dá)載體構(gòu)建及在煙草中的表達(dá)，中國生物工程雜志，2006，26(8)5-9)和王先艷等(植物表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因煙草抗除草劑及耐鹽性的分析，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2003，11(6)554-560)研究中有應(yīng)用的報道。本發(fā)明試驗中采用的載體構(gòu)建根據(jù)王先艷等(植物表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因煙草抗除草劑及耐鹽性的分析，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2003，11(6)554-560)的報道及美國冷泉港實驗室出版的《分子克隆實驗指南》(科學(xué)出版社，2003)的相關(guān)方法進(jìn)行。
利用本發(fā)明建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法能獲得大量的具有很強植株再生能力的冬棗莖尖，再生植株體細(xì)胞無性系變異小，轉(zhuǎn)基因植株多數(shù)生長發(fā)育正常。
本發(fā)明的特點在于1)大幅度減少基因型障礙，2)培養(yǎng)的莖尖轉(zhuǎn)化頻率較高，3)取材不受季節(jié)限制，4)轉(zhuǎn)基因植株絕大多數(shù)保持原基因型的優(yōu)良特性。


圖1農(nóng)桿菌菌液濃度對冬棗莖尖遺傳轉(zhuǎn)化率影響的折線圖其中a，b，c，d代表農(nóng)桿菌菌液濃度對冬棗莖尖遺傳轉(zhuǎn)化率的差異顯著性分析標(biāo)示，相同字母表示在P＝0.05水平上差異不顯著，不同字母表示在P＝0.05水平上差異顯著。
圖2農(nóng)桿菌浸染時間對冬棗莖尖遺傳轉(zhuǎn)化率影響的折線圖其中a，b代表農(nóng)桿菌菌液濃度對冬棗莖尖遺傳轉(zhuǎn)化率的差異顯著性分析標(biāo)示，相同字母表示在P＝0.05水平上差異不顯著，不同字母表示在P＝0.05水平上差異顯著。
圖3冬棗轉(zhuǎn)化植株betA基因的PCR檢測圖具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實施例1叢生芽的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)冬棗休眠芽在25-27℃培養(yǎng)箱中水培萌發(fā)，萌發(fā)的幼枝剪成單芽莖段，70％酒精預(yù)殺菌30s，0.1％的升汞消毒12-15min，無菌水沖洗3次，然后接種在附加0.5mgL-1、1mgL-1、2mgL-1赤霉素和0.1mgL-1、0.5mgL-1、1mgL-16-芐基嘌呤的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在溫度25-27℃、光照強度3000-4000Lx、光照12h/天條件下培養(yǎng)，35天繼代一次；篩選劑濃度的確定將除草劑綠黃隆(沈陽農(nóng)藥廠生產(chǎn)，有效成分25％)水溶液過濾滅菌后，加入(培養(yǎng)基溫度低于50℃時)去掉酪蛋白水解物的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。綠黃隆濃度分別為0，0.5mgL-1、1mgL-1、1.5mgL-1、2mgL-1、2.5mgL-1、3mgL-17個濃度。將誘導(dǎo)產(chǎn)生的冬棗莖尖接種在含有上述濃度綠黃隆的MS延伸培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每10天繼代培養(yǎng)一次，連續(xù)篩選三代。根據(jù)篩選后冬棗莖尖的存活率，確定冬棗遺傳轉(zhuǎn)化過程中抗性篩選適宜的綠黃隆濃度為2mgL-1。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將帶有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農(nóng)桿菌(如LBA4404)取單克隆，接種到含有50mg L-1利福平和50mgL-1卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基(酵母提取物10gL-1，蛋白胨10gL-1，NaCl 5gL-1，pH7.0)中，于28℃，180-190r/min振蕩培養(yǎng)。菌液濃度達(dá)到1.2(OD600)時以4000rpm離心15min，倒掉上清液，細(xì)菌沉淀用液體MS延伸培養(yǎng)基重懸，浸染前向此細(xì)菌懸液加入100μm的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。
為研究農(nóng)桿菌菌液濃度對冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率的影響，將延伸培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的冬棗莖尖作為遺傳轉(zhuǎn)化受體，剝?nèi)デo端的幼葉，用解剖針均勻劃傷莖尖頂端分生組織，同時將帶有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農(nóng)桿菌分別制成OD600值為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2的梯度菌液，然后將劃傷莖尖分別浸入不同OD600值菌液中，浸染10min。浸染結(jié)束后，用無菌濾紙將莖尖上剩余菌液吸干，轉(zhuǎn)至MS延伸培養(yǎng)基中，在20-21℃溫度條件下暗培養(yǎng)4天。暗培養(yǎng)結(jié)束后，將莖尖用無菌水洗2-3次，然后轉(zhuǎn)至含100mgL-1頭孢霉素MS延伸培養(yǎng)基上，抑菌培養(yǎng)7天，之后在含2mg L-1綠磺隆的MS延伸培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，連續(xù)篩選3代，每代7天；然后轉(zhuǎn)入含有1mgL-1赤霉素和0.3mgL-16-芐基嘌呤的MS延伸培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)(見圖1)。
為研究農(nóng)桿菌浸染時間對冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率的影響，用OD600值為0.8的農(nóng)桿菌菌液分別浸染處理好的冬棗莖尖5mins、10mins、15mins、20mins，浸染結(jié)束后，用無菌濾紙將莖尖上剩余菌液吸干，轉(zhuǎn)至MS延伸培養(yǎng)基中，在20-21℃溫度條件下暗培養(yǎng)4天。暗培養(yǎng)結(jié)束后，將莖尖用無菌水洗2-3次，然后轉(zhuǎn)至含100mg L-1頭孢霉素MS延伸培養(yǎng)基上，抑菌培養(yǎng)7天，之后在含2mg L-1綠磺隆的MS延伸培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，連續(xù)篩選3代，每代7天；然后轉(zhuǎn)入含有1mg L-1赤霉素和0.3mg L-16-芐基嘌呤的MS延伸培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)(見圖2)。
為研究農(nóng)桿菌浸染后暗培養(yǎng)時間對冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率的影響，用OD600為0.8的農(nóng)桿菌菌液浸染處理好的冬棗莖尖10mins，浸染結(jié)束后，用無菌濾紙將莖尖上剩余菌液吸干，轉(zhuǎn)至MS延伸培養(yǎng)基中，在20-21℃溫度條件分別暗培養(yǎng)2天，4天，6天，暗培養(yǎng)結(jié)束后，將莖尖用無菌水洗2-3次，然后轉(zhuǎn)至含100mg L-1頭孢霉素延伸培養(yǎng)基上，抑菌培養(yǎng)7天，之后在含2mg L-1綠磺隆的MS延伸培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，連續(xù)篩選3代，每代7天；然后轉(zhuǎn)入含有1mg L-1赤霉素和0.3mg L-16-芐基嘌呤的MS延伸培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)。
為研究農(nóng)桿菌浸染環(huán)境附以的負(fù)壓條件對冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率的影響，用OD600值為0.8的農(nóng)桿菌菌液浸染處理好的冬棗莖尖10mins，在浸染過程中輔以0.95×105Pa，0.5×105Pa，0.3×105Pa的負(fù)壓處理。浸染結(jié)束后，用無菌濾紙將莖尖上剩余菌液吸干，轉(zhuǎn)至MS延伸培養(yǎng)基中，在20-21℃溫度條件下暗培養(yǎng)4天；暗培養(yǎng)結(jié)束后，將幼芽用無菌水洗2-3次，然后轉(zhuǎn)至含100mg L-1頭孢霉素MS延伸培養(yǎng)基上，抑菌培養(yǎng)7天，之后在含2mg L-1綠磺隆的MS延伸培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，連續(xù)篩選3代，每代7天；然后轉(zhuǎn)入含有1mg L-1赤霉素和0.3mg L-16-芐基嘌呤的MS延伸培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)。
上述不同處理恢復(fù)培養(yǎng)的冬棗莖尖長至1.5-2cm高后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基生根，根生長至1.5-3cm后，移入砂與蛭石體積比為1∶1的基質(zhì)中繼續(xù)生長，開始一周用封口膜將容器口封好保持濕度。每隔3天澆適量的1/2MS營養(yǎng)液，環(huán)境溫度控制在25℃，相對濕度60-70％。上述環(huán)境條件下生長15-20天后移至土壤中，室外條件下生長。移栽成活的小苗取幼嫩葉片用于分子生物學(xué)檢測。經(jīng)PCR等檢測(引物1CGCTACAGGGTAAAC GCTACA AC，引物2CCTCACGGCTGCGAATAAATCC)，較佳的農(nóng)桿菌菌液濃度為0.8(OD600)，較佳的農(nóng)桿菌浸染時間為10mins，較佳的農(nóng)桿菌浸染后暗培養(yǎng)時間為4天，較佳的負(fù)壓條件為0.5×105Pa，冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率較高的可達(dá)4.3％～5.2％(見圖3)。
本發(fā)明中轉(zhuǎn)化率為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株數(shù)/農(nóng)桿菌感染的莖尖數(shù)×100％。
上述的MS基本培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基(KNO31900mg L-1，NH4NO31650mg L-1，CaCl2·2H2O 440mg L-1，MgSO4·7H2O 370mg L-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg L-1，H3BO310mg L-1，KI 0.83mg L-1，Na2MoO4·2 H2O 0.5mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，鹽酸硫胺素10.0mg L-1，鹽酸吡哆醇1.0mg L-1，煙酸1.0mg L-1，甘氨酸2.0mg L-1，肌醇100.0mg L-1，生物素0.05mg L-1，酪蛋白水解物500mg L-1)，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6.5g L-1，pH5.8-6.0。
上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指添加有1.5mg L-1赤霉素(GA3)、0.5mg L-16-芐基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基則去掉瓊脂粉。
上述延伸培養(yǎng)基是指添加有2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2mg L-16-芐基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基則去掉瓊脂粉。
上述生根培養(yǎng)基是指添加有0.3mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.2mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養(yǎng)基；實施例2叢生芽的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)冬棗休眠芽在25-27℃培養(yǎng)箱中水培萌發(fā)，萌發(fā)的幼枝剪成單芽莖段，70％酒精預(yù)殺菌30s，0.1％的升汞消毒8-10min，無菌水沖洗4次，然后接種在附加1.5mg L-1GA3和0.2mg L-16-芐基嘌呤的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度25-27℃、光照強度3000-4000Lx、光照12h/天條件下培養(yǎng)，35天繼代一次；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將帶有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農(nóng)桿菌(如LBA4404)取單克隆，接種到含有50mg L-1利福平和50mg L-1卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基(酵母提取物10g L-1，蛋白胨10g L-1，NaCl 5g L-1，pH7.0)中，于28℃，180-190r/min振蕩培養(yǎng)。菌液濃度達(dá)到0.8(OD600)時以4000rpm離心15min，倒掉上清液，細(xì)菌沉淀用液體MS延伸培養(yǎng)基重懸，浸染前向此細(xì)菌懸液加入100μm的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。
在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的冬棗幼芽作為浸染用外植體，剝?nèi)デo端的幼葉，用解剖針均勻劃傷莖尖頂端分生組織。處理后的冬棗莖尖在OD600值為0.8的農(nóng)桿菌懸浮液中浸染10mins，并附以0.5×105Pa的負(fù)壓環(huán)境。浸染結(jié)束后，用無菌濾紙將莖尖上剩余菌液吸干，轉(zhuǎn)至MS延伸培養(yǎng)基中，在20-21℃溫度條件下暗培養(yǎng)4天。之后在含有100mg L-1頭孢霉素的莖延伸培養(yǎng)基中抑菌7天，然后在含有2mg/L綠黃隆的MS延伸培養(yǎng)基中篩選3代，每代7天。篩選后存活的幼芽進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，長至1.5-2cm高后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基。生根后，移入砂與蛭石體積比為1∶1的基質(zhì)中繼續(xù)生長，開始一周用封口膜將容器口封好保持濕度。每隔3天澆適量的1/2MS營養(yǎng)液，環(huán)境溫度控制在25℃，相對濕度60-70％。上述環(huán)境條件下生長15-20天后移至土壤中，室外條件下生長。移栽成活的小苗取幼嫩葉片用于分子生物學(xué)檢測。經(jīng)PCR等分子方法檢測(引物1CGCTACAGGGTAAAC GCTACAAC，引物2CCTCACGGCTGCGAATAAATCC)，冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率為可達(dá)5.2％。
實施例3基本方法如實施例2，其中農(nóng)桿菌菌液濃度為0.2(OD600)，浸染10min，負(fù)壓條件0.95×105Pa。暗培養(yǎng)4d后在含有100mg L-1頭孢霉素的MS延伸培養(yǎng)基中抑菌7天，然后在含有2mg L-1綠黃隆的MS延伸培養(yǎng)基中篩選3代，每代7天。移栽成活的小苗取葉片用于分子生物學(xué)檢測。經(jīng)PCR等分子方法檢測，冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率為0.6％左右。
實施例4基本方法如實施例2，其中農(nóng)桿菌菌液濃度為1.2(OD600)，浸染10mins，負(fù)壓條件0.80×105Pa。暗培養(yǎng)4d后在含有100mg L-1頭孢霉素的MS延伸培養(yǎng)基中抑菌7天，然后在含有2mg L-1綠黃隆的MS延伸培養(yǎng)基中篩選3代，每代7天。移栽成活的小苗取葉片用于分子生物學(xué)檢測。經(jīng)PCR等分子方法檢測，冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率為1％左右。
實施例5基本方法如實施例2，其中農(nóng)桿菌菌液濃度為0.8(OD600)，浸染15mins，負(fù)壓條件0.85×105Pa。暗培養(yǎng)6d后在含有100mg L-1頭孢霉素的MS延伸培養(yǎng)基中抑菌7天，然后在含有2mg L-1綠黃隆的MS延伸培養(yǎng)基中篩選3代，每代7天。移栽成活的小苗取葉片用于分子生物學(xué)檢測。經(jīng)PCR等分子方法檢測，冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率為2.2％左右。
實施例6基本方法如實施例2，其中農(nóng)桿菌菌液濃度為1.2(OD600)，浸染5mins，負(fù)壓條件0.3×105Pa。暗培養(yǎng)2d后在含有100mg L-1頭孢霉素的MS延伸培養(yǎng)基中抑菌7天，然后在含有2mg L-1綠黃隆的MS延伸培養(yǎng)基中篩選3代，每代7天。移栽成活的小苗取葉片用于分子生物學(xué)檢測。經(jīng)PCR等分子方法檢測，冬棗遺傳轉(zhuǎn)化率為2.1％左右。
權(quán)利要求
1.一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，由以下步驟實現(xiàn)1)莖尖培養(yǎng)及誘導(dǎo)叢生芽再生，2)叢生芽的延伸培養(yǎng)，3)以莖尖為受體在抽真空施加負(fù)壓下進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，4)小苗生根和移栽，5)轉(zhuǎn)基因植株分子檢測；其特征在于步驟1)所述莖尖培養(yǎng)及誘導(dǎo)叢生芽再生是指冬棗休眠芽在25-27℃培養(yǎng)箱中水培萌發(fā)，萌發(fā)的幼枝剪成單芽莖段，70％酒精預(yù)殺菌30s，0.1％的升汞消毒8-15min，無菌水沖洗3-4次后，接種在附加0.5-2mg L-1赤霉素和0.1-1mg L-16-芐基嘌呤的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度25-27℃、光照強度3000-4000 Lx、光照12h/天條件下培養(yǎng)，35天繼代一次；步驟2)所述的叢生芽的延伸培養(yǎng)是指將步驟1)再生的小芽接種在添加有1-3mg L-1赤霉素、0.1-0.5mg L-16-芐基嘌呤和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS延伸培養(yǎng)基上以步驟2)所述條件培養(yǎng)，之后切取冬棗莖尖，備用；步驟3)所述的以莖尖為受體在抽真空施加負(fù)壓下進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化是指取2-8mm的冬棗莖尖為受體，用解剖針均勻劃傷莖尖頂端分生組織，同時將帶有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農(nóng)桿菌制成OD600值為0.2-1.2的梯度菌液，然后將劃傷莖尖分別浸入梯度菌液中，浸染5-20mins，其間浸染環(huán)境附以真空度為0.95×105Pa-0.3×105Pa的負(fù)壓條件，以提高農(nóng)桿菌的浸染效率；浸染結(jié)束后，用無菌濾紙將莖尖上剩余菌液吸干，轉(zhuǎn)至MS延伸培養(yǎng)基中，在20-21℃溫度條件下暗培養(yǎng)2-8天；暗培養(yǎng)結(jié)束后，將莖尖用無菌水洗2-3次，然后轉(zhuǎn)至含100mg L-1頭孢霉素MS延伸培養(yǎng)基上，抑菌培養(yǎng)7-14天，之后在含0.5-3mg L-1綠磺隆的MS延伸培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，連續(xù)篩選3-5代，每代7-10天；然后轉(zhuǎn)入含有1mg L-1赤霉素和0.3mg L-16-芐基嘌呤的MS延伸培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)；步驟4)所述的小苗生根和移栽是指將步驟3)所述恢復(fù)培養(yǎng)后存活的莖尖繼續(xù)培養(yǎng)，待長至株高為1.5-2cm后，轉(zhuǎn)入Nitsh生根培養(yǎng)基中生根，根生長至1.5-3cm后，移入砂與蛭石體積比為1∶1的基質(zhì)中繼續(xù)生長；步驟5)轉(zhuǎn)基因植株分子檢測是指利用PCR、Southern blot、RT-PCR方法對轉(zhuǎn)基因植株檢測，根據(jù)是否有目的基因條帶，確定冬棗轉(zhuǎn)基因植株。
2.按照權(quán)利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于所述冬棗是指鼠李科棗屬植物晚熟的栽培品種。
3.按照權(quán)利要求2所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于所述冬棗是沾化冬棗。
4.按照權(quán)利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于所述帶有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-als-bet4的根瘤農(nóng)桿菌是LBA4404或AGL0。
5.如權(quán)利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于所述升汞滅菌后的單芽莖段接種在附加0.8-1.5mg L-1赤霉素和0.2-0.8mg L-16-芐基嘌呤的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
6.按照權(quán)利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于步驟3)所述農(nóng)桿菌菌液是OD600值為0.4-1.0的梯度菌液，所述浸染時間為8-10mins，所述暗培養(yǎng)時間為4-6天。
7.按照權(quán)利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于步驟3)所述負(fù)壓條件是0.8×105Pa-0.5×105Pa。
8.按照權(quán)利要求7所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于步驟3)所述負(fù)壓條件是0.6×105Pa-0.5×105Pa。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，主要步驟包括以冬棗休眠芽水培萌發(fā)的幼嫩枝條為材料，離體培養(yǎng)誘導(dǎo)莖尖叢生芽的再生，切取莖尖在延伸培養(yǎng)上生長，以莖尖為受體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在抽真空施加負(fù)壓下進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得冬棗轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明方法中，浸染環(huán)境附以真空度為0.95×10
文檔編號C12N15/82GK101016544SQ200710013249
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日
發(fā)明者谷曉峰, 張舉仁, 楊愛芳, 張可煒, 尹小燕 申請人:山東大學(xué)