本發(fā)明屬于冷凍再生技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高擬南芥莖尖超低溫保存后再生率的方法。

背景技術(shù)：

植物超低溫保存(cryopreservation)是在液氮溫度下(-196℃)保存植物材料的方法。由于在液氮溫度下所有的細(xì)胞活動(dòng)都暫時(shí)停止，所以理論上植物材料可以在不發(fā)生變化的情況下無限期保存。植物莖尖分生組織具有再生完整植株的能力，是植物超低溫保存的主要對(duì)象。植物超低溫技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要瓶頸是對(duì)超低溫處理過程細(xì)胞水平的研究非常有限。超低溫處理的主要對(duì)象是離體莖尖(分生組織)等具有再生能力的植物組織。在處理過程中，離體莖尖將經(jīng)受預(yù)培養(yǎng)，滲透保護(hù)，脫水，液氮處理，解凍，復(fù)水和恢復(fù)培養(yǎng)等劇烈的人工處理。上述過程中，植物細(xì)胞膜系統(tǒng)和細(xì)胞骨架等將發(fā)生劇烈的變化和響應(yīng)，這些變化及其恢復(fù)是超低溫處理方案成敗的關(guān)鍵。但是，植物莖尖超低溫保存過程中細(xì)胞骨架的變化模式是怎樣的，微管結(jié)構(gòu)狀態(tài)與植物莖尖超低溫保存后的再生率的關(guān)系等問題尚不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是在于提供一種提高擬南芥莖尖超低溫保存后再生率的方法，旨在解決超低溫保存植物材料的問題。本發(fā)明以擬南芥莖尖為研究對(duì)象，解析了超低溫保存過程中細(xì)胞的微管變化模式，并通過加入微管穩(wěn)定劑紫杉醇和促進(jìn)微管解聚的藥物oryzalin來改變微管狀態(tài)，進(jìn)而驗(yàn)證微管結(jié)構(gòu)對(duì)超低溫保存后植株再生率的影響。本發(fā)明方法彌補(bǔ)了超低溫保存技術(shù)中有關(guān)細(xì)胞學(xué)變化方面的研究空白，同時(shí)為提高植物莖尖超低溫保存再生率提供了方法支持，對(duì)研究超低溫保存技術(shù)有重要意義。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

一種提高擬南芥莖尖超低溫保存后再生率的方法，該方法包括以下步驟：

(1)將消毒處理過的擬南芥種子播種在MS培養(yǎng)基上，經(jīng)4-6℃低溫處理之后在22-25℃12h/12h晝夜周期的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一周獲得擬南芥幼苗，隨后在解剖鏡下切割莖尖；

(2)選取90個(gè)莖尖，平均分成三組，每組30個(gè)莖尖，第一組加入20μmol/L的紫杉醇并處理20分鐘，標(biāo)記為T組；第二組加入20μmol/L的黃草消oryzalin處理20分鐘，標(biāo)記為O組；第三組的莖尖直接標(biāo)記為C組。

(3)加載處理，將T組、O組和C組莖尖同時(shí)放在加載溶液中，25℃下處理18-25分鐘；

(4)植物微滴玻璃化處理，在加載溶液處理結(jié)束以后，將三組莖尖同時(shí)轉(zhuǎn)入預(yù)冷的PVS2溶液，在冰上處理25-30分鐘；

(5)超低溫保存，將經(jīng)過PVS2處理的莖尖轉(zhuǎn)移到無菌鋁箔條上并插入液氮中，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)將鋁箔條轉(zhuǎn)入凍存管，并放置在液氮中保持30分鐘；

(6)解凍和卸載處理，將鋁箔條從液氮中移出并直接轉(zhuǎn)入卸載溶液中，并在25℃下處理20-30分鐘；

(7)恢復(fù)培養(yǎng)，將解凍后的莖尖轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，恢復(fù)培養(yǎng)的前7天為暗培養(yǎng)；暗培養(yǎng)之后，繼續(xù)在光照下培養(yǎng)，并定期統(tǒng)計(jì)南芥莖尖成活率。

進(jìn)一步地，所述步驟(3)中加載溶液是含有2M甘油和0.4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。

進(jìn)一步地，所述步驟(4)中PVS2溶液是含有30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)DMSO和0.4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。

進(jìn)一步地，所述步驟(6)中卸載溶液是含有1.2M蔗糖的MS培養(yǎng)液。

進(jìn)一步地，所述步驟(7)中恢復(fù)培養(yǎng)基是含有30g/L蔗糖、1.0mg/L BA和3g/L植物凝膠的MS固體培養(yǎng)基。

相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)解析了超低溫保存過程中細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)的變化，填補(bǔ)了超低溫保存過程中細(xì)胞學(xué)方面的研究空白；

(2)在裝載處理前加入微管穩(wěn)定劑有利于提高植株的再生率，改進(jìn)了現(xiàn)有的植物莖尖超低溫保存技術(shù)；

(3)在裝載處理前加入微管解聚試劑降低了植物莖尖超低溫保存的再生率。

附圖說明

圖1為微管試劑對(duì)擬南芥莖尖超低溫保存后再生率的影響，其中：a、超低溫保存后擬南芥莖尖再生情況；b、再生后植株；

圖2為擬南芥莖尖超低溫保存后再生率統(tǒng)計(jì)情況；

圖3為超低溫保保存過程中微管結(jié)構(gòu)變化情況；

圖4為微管試劑對(duì)超低溫保存過程中微管結(jié)構(gòu)的影響；

具體實(shí)施例

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

(1)擬南芥莖尖的獲取

將表達(dá)α-tublin-GFP融合蛋白的擬南芥種子經(jīng)消毒處理之后播種在MS培養(yǎng)基上，經(jīng)4-6℃低溫處理，在22-25℃12h/12h晝夜周期的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一周獲得擬南芥幼苗，并在解剖鏡下切割莖尖；

(2)微滴玻璃化超低溫保存

取90個(gè)莖尖，平均分成三組，每組30個(gè)莖尖，第一組加入含有20μmol/L的紫杉醇的微管固定劑(微管固定劑含有50mmol/L Pipes、2mmol/L EGTA、2mmol/L 0.05％MgSO4)處理20分鐘，標(biāo)記為T組；第二組加入含有20μmol/L的黃草消oryzalin的微管固定劑(微管固定劑含有50mmol/L Pipes、2mmol/L EGTA、2mmol/L 0.05％MgSO4)處理20分鐘，標(biāo)記為O組；第三組的莖尖直接標(biāo)記為C組，等T組和O組處理完之后，三組莖尖同時(shí)做后續(xù)處理。

將三組莖尖轉(zhuǎn)入凍存管中加入1mL加載溶液，在25℃下處理20分鐘。加載溶液為含有2M甘油和0.4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。在加載溶液處理結(jié)束以后，用1mL冰上預(yù)冷的PVS2溶液替換加載溶液，并在冰上處理25-30分鐘。PVS2溶液是含有30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)DMSO和0.4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。在PVS2處理結(jié)束前1分鐘，將莖尖和一滴PVS2溶液(15μL)轉(zhuǎn)到一個(gè)8×25mm的無菌鋁箔條上。在PVS2處理結(jié)束后，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮中，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)(約5-20秒鐘)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮中30分鐘。解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6厘米直徑培養(yǎng)皿中的10mL卸載溶液里，并在25℃下處理20分鐘。卸載溶液是含有1.2M蔗糖的MS培養(yǎng)液。在卸載溶液處理結(jié)束后，將莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。恢復(fù)培養(yǎng)基為含有30g/L蔗糖、1.0mg/L BA和3g/L植物凝膠的MS培養(yǎng)基?；謴?fù)培養(yǎng)的前7天為暗培養(yǎng)。暗培養(yǎng)之后，繼續(xù)在光照下培養(yǎng)，并定期統(tǒng)計(jì)成活率。

(3)微滴玻璃化超低溫保存過程中微管結(jié)構(gòu)變化及微管試劑對(duì)超低溫保存過程中微管結(jié)構(gòu)的影響

通過激光掃描共聚焦顯微鏡來檢測(cè)擬南芥莖尖的GFP(綠色熒光蛋白)信號(hào)，進(jìn)而觀測(cè)不同處理?xiàng)l件下的擬南芥莖尖的微管結(jié)構(gòu)(488nm激發(fā)光和520nm發(fā)射光)。

鏡檢取樣點(diǎn)安排如下：

C組：裝載處理之前，裝載處理之后，PVS2處理之后，卸載處理之后，共計(jì)四個(gè)檢測(cè)點(diǎn)；

T組：裝載處理之后，PVS2處理之后，卸載處理之后，共計(jì)三個(gè)取樣點(diǎn)；

O組：裝載處理之后，PVS2處理之后，卸載處理之后，共計(jì)三個(gè)取樣點(diǎn)；

每個(gè)取樣點(diǎn)10個(gè)莖尖，放在載玻片上，鏡檢。

本發(fā)明中，測(cè)試了微滴玻璃化途徑中在裝載處理之前用微管穩(wěn)定劑紫杉醇和促進(jìn)微管解聚的藥物Oryzalin預(yù)處理莖尖20分鐘對(duì)超低溫保存莖尖的存活率和再生率的影響。結(jié)果表明：T組、O組和C組對(duì)應(yīng)的再生率為分別為77.2％、32.3％和39.5％(參照?qǐng)D1、圖2)?？梢?，相對(duì)于C組來說，T組的微管穩(wěn)定劑紫杉醇的加入有利于提高超低溫保存莖尖的存活率和再生率，而O組促進(jìn)微管解聚的藥物oryzalin的加入降低了超低溫保存莖尖的存活率和再生率。在超低溫保存過程中，在裝載處理和PVS2溶液處理之后，微管完全解聚，恢復(fù)培養(yǎng)之后微管又開始聚合(參照?qǐng)D3)；在超低溫保存過程中，在裝載處理之前加入微管穩(wěn)定劑紫杉醇之后微管解聚狀況較未加紫杉醇的處理明顯緩解；在超低溫保存過程中，在裝載處理之前加入促進(jìn)微管解聚試劑黃草消oryzalin之后微管解聚狀況較未加黃草消的處理明更為劇烈(參照?qǐng)D4)。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳案例，并不對(duì)本發(fā)明做出任何限制，凡是針對(duì)本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容對(duì)以上實(shí)施案例所做的任何簡單修改、變更、模仿均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。