菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養(yǎng)方法，包括以下步驟：材料獲得、莖尖剝?nèi)?、蔗糖預培養(yǎng)、裝載液裝載、PVS2玻璃化保護液脫水處理、超低溫冷凍保存、解凍洗滌和恢復再生培養(yǎng)步驟。采用本發(fā)明的小滴玻璃化法超低溫保存技術，超低溫保存后的菊芋試管苗離體莖尖經(jīng)過化凍處理，恢復培養(yǎng)后直接再生成苗。表明該方法是一種長期安全、穩(wěn)定可靠、簡單有效的保存菊芋種質資源的方法，存活率可達90％以上，再生率可達80％以上，再生植株恢復生長良好。
【專利說明】菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物種質資源的超低溫保存方法，，具體地說，涉及菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]菊芋(Helianthus tuberous L.)又名‘洋姜’、‘鬼子姜’,為菊科向日葵屬多年生草本植物，因其地上似菊，地下似芋而得名。原產(chǎn)北美洲，在美國、加拿大、墨西哥等國均有廣泛分布。17世紀經(jīng)歐洲傳入我國，目前分布在東北三省、內(nèi)蒙古、北京、河北、河南、湖北、湖南、甘肅、青海、浙江、陜西、新疆、安徽、寧夏、江蘇、山東、山西等省市。菊芋具有很強的抗逆性，生態(tài)適應性很廣。菊芋為無性繁殖作物，其繁殖能力很強，地下塊莖繁殖速度可達每年20倍以上。菊芋是一種不可多得的生態(tài)經(jīng)濟型植物，喜溫暖、耐嚴寒、耐鹽堿，具有很高的經(jīng)濟價值、藥用價值、觀賞價值和生態(tài)價值。菊芋在工業(yè)上應用廣泛，利用其塊莖轉化成乙醇和生物燃料等生物能源，應用于化工、生物制藥、航天等領域。菊芋塊莖中含有豐富的菊粉，是理想的功能性食品配料，用作甜味增味劑，營養(yǎng)價值高。菊芋地上部分生物量很大，莖葉可直接用于家畜的青飼料，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織稱為“21世紀人畜共用作物”。菊芋可入藥，性甘味涼，有清熱解毒之功效，提取的菊糖對血糖具有雙向調(diào)節(jié)的作用，對糖尿病的治療具有很好的防治作用。菊芋含有的菊粉及低聚果糖還具有超強增殖人體雙歧桿菌的作用。
[0003]菊芋種質資源目前主要采用非原生境保存中的田間圃位保存和試管苗保存。田間圃位保存時，易受環(huán)境的影響而導致種質消失。如地下塊莖容易受到病毒的侵害，使病毒大量積累，導致品種退化，產(chǎn)量降低；另外，城市土地開發(fā)、環(huán)境惡化也嚴重威脅菊芋種質資源的安全保存。試管苗保存雖然具有占地面積小、不易受自然災害和病原菌影響以及人力、財力投入少、便于種質資源交換及運輸?shù)葍?yōu)點，但需要經(jīng)常繼代更新，且經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)后面臨發(fā)生退化現(xiàn)象或產(chǎn)生變異等威脅。
[0004]超低溫保存技術是可長期安全保存種質資源的可選擇的較佳途徑之一，不但節(jié)約空間，而且成本低廉?，F(xiàn)已開發(fā)出多種超低溫保存方法，然而針對不同物種甚至對于同一物種的不同品種，其適宜的超低溫保存方法及程序技術都有可能不同。迄今為止，國際上尚未建立起具有普適性的超低溫保存方法，這也是超低溫保存技術實際應用中的主要瓶頸之
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養(yǎng)方法。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明基于小滴玻璃化法超低溫保存技術，提供的一種菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養(yǎng)方法，包括以下步驟:材料獲得、莖尖剝?nèi)　⒄崽穷A培養(yǎng)、裝載液裝載、PVS2玻璃化保護液脫水處理、超低溫冷凍保存、解凍洗滌和恢復再生培養(yǎng)步驟。
[0007]材料獲得具體步驟如下:[0008]I)將菊芋塊莖種植到花盆中，待其生長到35_45cm(優(yōu)選40cm)，剪下生長健壯的枝條作為外植體，將其剪成2-3.5cm長(優(yōu)選3cm)的帶芽莖段，用水沖洗表面污潰，用10% NaClO溶液表面消毒8~9min(優(yōu)選8min)，無菌水沖洗3~5次后，將外植體接種到MS+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂培養(yǎng)基中進行試管苗培養(yǎng)；
[0009]2)試管苗生長穩(wěn)定后轉入MS+0.lmg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂培養(yǎng)基中進行試管苗擴繁培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為20±1°C，光照14h/d，光照強度2000~30001ux。
[0010]莖尖剝?nèi)【唧w方法如下:經(jīng)試管苗培養(yǎng)，選取生長4~5周的健康植株，在無菌條件下，剪取帶頂芽的莖段，去除包裹在外面的大葉片，然后在顯微鏡下剝?nèi)バ∪~片，切取大小2~3mm，帶2個葉原基的莖尖。
[0011]蔗糖預培養(yǎng)具體方法如下:將剝?nèi)∠聛淼那o尖放入盛有含0.2~0.4M(優(yōu)選
0.4M)蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的小燒杯中，然后將其置于搖床中暗培養(yǎng)I~4d(優(yōu)選3d);預培養(yǎng)溫度為25°C,搖床轉速60rpm/min。
[0012]裝載液裝載具體方法如下:將預培養(yǎng)后的離體莖尖置于裝載液中于25°C裝載20 ~60min (優(yōu)選 30min)。
[0013]所述裝載液的配方為:MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。
[0014]PVS2玻璃化保護液脫水處理的具體方法如下:將裝載后的莖尖置于PVS2玻璃化保護液中，0°C處理10~40min(優(yōu)選15min)。
[0015]所述PVS2玻璃化保護液的配方為:MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L 鹿糖。
[0016]超低溫冷凍保存具體方法如下:將經(jīng)過PVS2玻璃化保護液脫水處理后的莖尖，放入含有15~25 μ I (優(yōu)選20μ 1)PVS2玻璃化保護液小滴的鋁箔條上，然后將鋁箔條直接浸入液氮中，待其與液氮充分接觸后再裝入盛滿液氮的冷凍管中，擰緊蓋子，投入液氮中進行保存。
[0017]解凍洗滌具體方法如下:將超低溫冷凍保存后的莖尖取出，投入卸載液中進行解凍和洗滌，洗滌2~3次(優(yōu)選2次)，每IOmin更換一次卸載液。
[0018]所述卸載液的配方為:MS+1.2mol/L蔗糖。
[0019]恢復再生培養(yǎng)具體方法如下:將解凍洗滌后的莖尖轉移到盛有恢復再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進行恢復培養(yǎng)，在25°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3~5d，然后轉入正常光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
[0020]所述恢復再生培養(yǎng)基的配方為:MS+0.lmg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂；所述正常光照條件為:光照強度15001uX，光照時間為16h/d。
[0021]本發(fā)明采用小滴玻璃化法超低溫保存技術，植物組織材料經(jīng)一系列的超低溫保存步驟后投入液氮保存，經(jīng)解凍洗滌后仍能在一定培養(yǎng)條件下再生出新的植株，并保持其遺傳穩(wěn)定性。它避免了田間圃位保存易受自然災害影響而導致種質丟失或毀滅，以及試管苗組織培養(yǎng)保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。
[0022]采用本發(fā)明的小滴玻璃化法超低溫保存技術，超低溫保存后的菊芋試管苗離體莖尖經(jīng)過化凍處理，恢復培養(yǎng)后直接再生成苗。表明該方法是一種長期安全、穩(wěn)定可靠、簡單有效的保存菊芋種質資源的方法，存活率可達90 %以上，再生率可達80%以上，再生植株恢復生長良好?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明實施例1中菊芋離體莖尖超低溫保存后形態(tài)觀察結果；其中，a為離體莖尖；b為存活莖尖；c為再生正常莖尖；d為再生植株。
[0024]圖2為本發(fā)明實施例2的預培養(yǎng)液中蔗糖濃度對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響。
[0025]圖3為本發(fā)明實施例3中預培養(yǎng)時間對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響。
[0026]圖4為本發(fā)明實施例4中裝載液裝載時間對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響。
[0027]圖5為本發(fā)明實施例5中PVS2玻璃化保護液處理時間對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響。
【具體實施方式】
[0028]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0029]實施例1菊芋試管苗離體莖尖小滴玻璃化法超低溫保存技術及植株再生培養(yǎng)方法
[0030]實驗材料:來自國家種質庫試管苗庫，種質編號為‘2009331028’。
[0031]實驗方法具體步驟如下:
[0032]1、材料獲得:
[0033]I)將菊芋塊莖種植到花盆中，待生長到40cm左右，剪下生長健壯的枝條作為外植體，將其剪成3cm左右的帶芽莖段，自來水沖洗表面污潰，用10% NaClO溶液表面消毒8min，無菌水沖洗3~5次后，將外植體接種到MS+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0034]2)試管苗生長穩(wěn)定后轉入MS+0.lmg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂的培養(yǎng)基中進行擴繁培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為20±1°C，光照14h/d，光照強度2000~30001ux。
[0035]2、莖尖剝?nèi)?經(jīng)試管苗培養(yǎng)，選取生長4~5周的健康植株，在無菌條件下，用剪刀剪取帶頂芽的莖段，去除包裹在外面的大葉片，然后在雙目顯微鏡下用剪刀和解剖針剝?nèi)バ∪~片，切取大小2~3mm，帶2個葉原基的莖尖。
[0036]3、蔗糖預培養(yǎng):將剝離下來的莖尖放入含有0.4M蔗糖的液體MS培養(yǎng)基的小燒杯中，然后將其置于搖床中暗培養(yǎng)3d。預培養(yǎng)溫度為25°C，搖床轉速60rpm/min。
[0037]4、裝載液裝載:將預培養(yǎng)后的離體莖尖置于裝載液中于25°C裝載30min。其中裝載液的配方為:MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。
[0038]5、PVS2玻璃化保護液脫水處理:將裝載后的莖尖置于PVS2中，(TC下處理15min。其中PVS2玻璃化保護液的配方為:MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖。
[0039]6、超低溫冷凍保存:將經(jīng)PVS2玻璃化保護液脫水處理后的莖尖，放入含有20 μ I新鮮PVS2玻璃化保護液小滴的鋁箔條上，然后將鋁箔條直接浸入液氮中，待其與液氮充分接觸后再裝入盛滿液氮的冷凍管中，擰緊蓋子，投入液氮中進行保存。
[0040]7、解凍洗滌:將超低溫冷凍保存后的莖尖取出，投入卸載液中進行解凍和洗滌，洗滌次數(shù)為2次，每IOmin更換一次卸載液。其中卸載液的配方為:MS+1.2mol/L蔗糖。
[0041]8、恢復再生培養(yǎng):將洗滌后的莖尖轉移到裝有恢復再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進行恢復培養(yǎng)，先在25°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3~5d,然后轉入正常光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)。其中恢復再生培養(yǎng)基的配方為:MS+0.lmg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂。所述正常光照條件:光照強度15001ux，光照時間為16h/d。
[0042]菊芋離體莖尖超低溫保存后形態(tài)觀察結果見圖1。其中，a為離體莖尖；b為存活莖尖；c為再生正常莖尖；d為再生植株。
[0043]實施例2預培養(yǎng)液中蔗糖濃度對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響
[0044]僅改變預培養(yǎng)液中的蔗糖濃度，其余步驟同實施例1，研究預培養(yǎng)液中蔗糖濃度對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響。結果如圖2所示。
[0045]從圖2可以看出，蔗糖濃度為0.2mol/L時，存活率和再生率均為50%左右。隨著蔗糖濃度的升高，在濃度為0.4mol/L時，存活率和再生率達到最高，分別為93%和83%。而過高的蔗糖濃度會使存活率和再生率降低。當蔗糖濃度為0.5mol/L時，存活率和再生率僅為10%左右。莖尖在蔗糖濃度為0.4mol/L預培養(yǎng)液中預培養(yǎng)，與在0.2mol/L和0.5mol/L蔗糖濃度下預培養(yǎng)相比，差異顯著(P〈0.05)。試驗結果表明，預培養(yǎng)蔗糖濃度過低或過高均會影響超低溫保存的效果。
[0046]實施例3預培養(yǎng)時間對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響
[0047]僅改變預培養(yǎng)時間，其余步驟同實施例1，研究預培養(yǎng)時間對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響。結果如圖3所示。
[0048]從圖3可以看出，預培養(yǎng)對提高菊芋離體莖尖超低溫保存后存活率和再生率作用顯著。隨著預培養(yǎng)時間的延長，存活率和再生率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。莖尖不經(jīng)過預培養(yǎng)，超低溫保存后存活率和再生率僅為6% ;預培養(yǎng)3d后存活率和再生率達到最大值，分別為93%和83%;預培養(yǎng)4d后，存活率和再生率僅為31 %和28%。試驗結果表明，預培養(yǎng)時間過短或過長均會影響超低溫保存的效果。
[0049]實施例4裝載液裝載時間對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響
[0050]僅改變裝載液裝載時間，其余步驟同實施例1，研究裝載液裝載時間對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響。結果如圖4所示。
[0051]從圖4可以看出，隨著裝載液裝載時間的延長，超低溫保存后存活率和再生率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。裝載30min，存活率和再生率最高，分別為93%和83%，且差異顯著(P〈0.05)。裝載時間達到30min以上后，存活率和再生率逐漸下降，裝載60min后存活率仍為83%，而再生率僅為40%?？梢?，過長或過短的裝載液裝載時間都會導致存活率和再生率的降低。
[0052]實施例5 PVS2玻璃化液處理時間對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響
[0053]僅改變PVS2玻璃化液處理時間，其余步驟同實施例1，研究PVS2玻璃化液處理時間對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響。結果如圖5所示。
[0054]從圖5可以看出，PVS2玻璃化液處理時間過長或過短，均會導致莖尖超低溫保存后存活率和再生率降低。其中PVS2玻璃化液處理15min時，存活率和再生率最高，分別為93%和 83%。
[0055]實施例6恢復培養(yǎng)基對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響[0056]僅改變恢復培養(yǎng)基，其余步驟同實施例1，研究恢復培養(yǎng)基對菊芋離體莖尖超低溫保存的影響。結果見表1。
[0057]表1恢復培養(yǎng)基對菊芋離體莖尖超低溫保存后存活率和再生率的影響
[0058]
【權利要求】
1.菊芋離體莖尖超低溫保存及再生培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟:材料獲得、莖尖剝?nèi)　⒄崽穷A培養(yǎng)、裝載液裝載、PVS2玻璃化保護液脫水處理、超低溫冷凍保存、解凍洗滌和恢復再生培養(yǎng)步驟。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，材料獲得具體步驟如下: 1)將菊芋塊莖種植到花盆中，待其生長到35~45cm，剪下生長健壯的枝條作為外植體，將其剪成2~3.5cm長的帶芽莖段，用水沖洗表面污潰，用10 % NaClO溶液表面消毒8~9min,無菌水沖洗3~5次后，將外植體接種到MS+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂培養(yǎng)基中進行試管苗培養(yǎng)； 2)試管苗生長穩(wěn)定后轉入MS+0.lmg/L GA3+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂培養(yǎng)基中進行試管苗擴繁培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為20±1°C，光照14h/d，光照強度2000~30001ux。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，莖尖剝?nèi)【唧w方法如下:經(jīng)試管苗培養(yǎng)，選取生長4~5周的健康植株，在無菌條件下，剪取帶頂芽的莖段，去除包裹在外面的大葉片，然后在顯微鏡下剝?nèi)バ∪~片，切取大小2~3mm，帶2個葉原基的莖尖。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，蔗糖預培養(yǎng)具體方法如下:將剝?nèi)∠聛淼那o尖放入盛有含0.2~0.4M蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的小燒杯中，然后將其置于搖床中暗培養(yǎng)I~4d ;預培養(yǎng)溫度為25°C,搖床轉速60rpm/min。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，裝載液裝載具體方法如下:將預培養(yǎng)后的離體莖尖置于裝載液中于25°C裝載20~60min ;所述裝載液的配方為:MS+2mol/L甘油+0.4mol/L 鹿糖。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，PVS2玻璃化保護液脫水處理的具體方法如下:將裝載后的莖尖置于PVS2玻璃化保護液中，(TC處理10~40min ;所述PVS2玻璃化保護液的配方為:MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，超低溫冷凍保存具體方法如下:將經(jīng)過PVS2玻璃化保護液脫水處理后的莖尖，放入含有15~25 μ I PVS2玻璃化保護液小滴的鋁箔條上，然后將鋁箔條直接浸入液氮中，待其與液氮充分接觸后再裝入盛滿液氮的冷凍管中，擰緊蓋子，投入液氮中進行保存。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，解凍洗滌具體方法如下:將超低溫冷凍保存后的莖尖取出，投入卸載液中進行解凍和洗滌，洗滌2~3次，每IOmin更換一次卸載液；所述卸載液的配方為:MS+1.2mol/L蔗糖。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，恢復再生培養(yǎng)具體方法如下:將解凍洗滌后的莖尖轉移到盛有恢復再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進行恢復培養(yǎng)，在25°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3~5d，然后轉入正常光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)； 所述恢復再生培養(yǎng)基的配方為:MS+0.lmg/LGA3+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂；所述正常光照條件為:光照強度15001ux,光照時間為16h/d。
【文檔編號】A01N3/00GK104012524SQ201410273221
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權日:2014年6月18日
【發(fā)明者】陳曉玲, 韓麗, 張金梅, 盧新雄, 辛霞, 尹廣鹍, 何娟娟 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所