專利名稱：小鼠原位左肺移植模型及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小鼠原位左肺移植模型及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，小鼠比大鼠有諸多優(yōu)點(diǎn)，不僅試劑資源豐富、可選品系眾多、實(shí)驗(yàn)消耗低，而且基因操控性更好，可以方便獲得多種轉(zhuǎn)基因和基因敲除品系。相對(duì)于其他小鼠肺病模型，例如呼吸機(jī)肺損傷、脂多糖吸入損傷，本模型所復(fù)制的急性肺損傷、慢性免疫損傷、肺纖維化過(guò)程具有起始點(diǎn)明確、背景噪聲更易控制等優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)可滿足一些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的特殊要求，使其在肺移植領(lǐng)域以及病理生理學(xué)和免疫學(xué)等的一些基礎(chǔ)研究領(lǐng)域具有更好的應(yīng)用前景[1-2]。1971年Asimacopoulos等報(bào)道了大鼠原位肺移植模型，Mizuta等1989年報(bào)道了套管法改良技術(shù)，將建模時(shí)間由4小時(shí)縮短到2小時(shí)之內(nèi)[3-4]。此后，套管法大鼠原位肺移植模型很快取代犬、豬肺移植模型，成為最常用的單肺移植模型。隨著基因敲除技術(shù)等新技術(shù)的成熟，小鼠原位肺移植模型有了現(xiàn)實(shí)而迫切的需求。大鼠和小鼠解剖結(jié)構(gòu)相似，但由于體重相差懸殊(250g 300g vs. 25g 30g)，小鼠原位肺移植對(duì)顯微外科技術(shù)的要求更高。美國(guó)Washington University的研究者于2007年首次報(bào)道了小鼠原位肺移植技術(shù)，并于2009年報(bào)道了改良方案[5-6]。2009年，瑞士 University Hospital ^irich的研究者報(bào)道了類似的模型制作方法[7]。截至2011年4月，僅此兩家實(shí)驗(yàn)室報(bào)道過(guò)這項(xiàng)技術(shù)。小鼠原位肺移植模型的技術(shù)流程與大鼠模型一致，技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)在于如何處理比大鼠更為細(xì)微的肺門結(jié)構(gòu)。盡管美國(guó)和瑞士的研究者都提出了各自的解決方案，但都沒(méi)有達(dá)到“簡(jiǎn)便、可重復(fù)性好”的建模要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好、效果優(yōu)異的小鼠原位左肺移植模型及其構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的小鼠原位左肺移植模型有下述方法構(gòu)建獲得。構(gòu)建方法的具體步驟如下
1、制備套管(CUff)
要求左肺支氣管、肺靜脈、肺動(dòng)脈所用套管分別由18/20G、20G、24G血管導(dǎo)管 (angiocatheter)制備；支氣管、肺靜脈套管體長(zhǎng)1. 0mm，肺動(dòng)脈套管體長(zhǎng)0. 5mm ；套管延伸柄長(zhǎng)1. Omm,寬度占1/4 1/3管壁周徑。操作血管導(dǎo)管用砂紙打磨后，24G導(dǎo)管切成1. 5mm小段，其余型號(hào)切成2. Omm小段；將顯微血管鑷的一個(gè)尖頭插入小段管腔，以其內(nèi)側(cè)面為切割平面，用刀片橫向和縱向切割，做出套管的延伸柄。2、建立供肺灌洗系統(tǒng)(perfusion system)要求穩(wěn)定提供與正常肺動(dòng)脈壓相當(dāng)?shù)墓嘞磯毫?。操作依次連接50ml針筒、輸液器、22G血管套管，針筒固定于15--25cm高度(例如為20cm)，注入肺保存溶液(例如為30ml)的冰水混合物，并使其充滿管路。3、小鼠麻醉、氣管內(nèi)插管與機(jī)械通氣
要求適度麻醉，經(jīng)口氣管插管，建立機(jī)械通氣；插管位置恰當(dāng)，不損傷供肺及所屬血管、支氣管。操作腹腔注射麻醉。用“兩端固定、中間拉開(kāi)”法快速經(jīng)口氣管插管，小鼠上顎用橡皮筋固定于泡沫塑料板，胸骨上部用左手環(huán)指抵住，左手拇指和食指牽拉舌頭，暴露聲門；右手持20G血管導(dǎo)管接近聲門，在其開(kāi)啟瞬間輕輕插入；連接呼吸機(jī)輸出管路，根據(jù)小鼠體重大小提供0. 5 1. 0 ml潮氣量，呼吸頻率120 140/min。4、供者手術(shù)，獲取供肺
要求完全灌洗清除供肺血管床內(nèi)血液，在雙肺半充氣狀態(tài)下完整取出心肺塊；不損傷供肺及所屬血管、支氣管。操作建立機(jī)械通氣后，胸腹正中切口開(kāi)胸；將100U/0. Iml肝素鈉稀釋液在供者心尖處注入右心室；左手持顯微蚊式鉗夾住心臟下1/3左右處、但不上齒，小指勾住供肺灌洗系統(tǒng)的輸液器下端、使22G導(dǎo)管尖端恰好抵在右心上；打開(kāi)輸液器控制裝置，將噴涌肺保存液的22G導(dǎo)管插入右心室；用眼科剪迅速剪開(kāi)膨脹的左右心耳、腹腔動(dòng)靜脈，使灌洗液和血液快速流出；兩肺數(shù)秒鐘之后變白，在半充氣狀態(tài)下用顯微蚊式鉗夾閉氣管，自上而下銳性解剖，將心肺塊完整取出，生理鹽水沖洗后置于鋪有紗布的培養(yǎng)皿中，肺保存液制成的冰塊恰使紗布浸透。保持灌洗流速和適當(dāng)?shù)碾p肺通氣幅度、灌洗液流出暢通是保證供肺灌洗質(zhì)量的三個(gè)要素。一旦灌洗初期未能將供肺血管床內(nèi)的血液沖洗干凈，則延長(zhǎng)灌洗無(wú)益于改善灌洗質(zhì)量。5、放置套管，準(zhǔn)備移植肺
要求切下左肺，保留盡可能長(zhǎng)的血管和支氣管，并為其分別放置套管；不損傷供肺及所屬血管、支氣管。操作在手術(shù)顯微鏡下，左肺靜脈、動(dòng)脈、支氣管全長(zhǎng)游離、在盡可能靠近總干處切斷；顯微鑷兩尖并攏穿過(guò)肺靜脈套管，牽拉肺靜脈殘端，在另一把顯微鑷的協(xié)助下將套管套上并推向左肺靜脈遠(yuǎn)端，延伸柄指向后肺門；左手顯微鑷夾住肺靜脈，盡可能靠近其遠(yuǎn)端， 右手用微血管夾把套管柄及肺靜脈一并夾住，蚊式鉗夾住微血管夾尾部并擱在培養(yǎng)皿邊沿上，以穩(wěn)定微血管夾；將肺靜脈殘端像卷袖口那樣翻轉(zhuǎn)，套在套管的外面，然后用10-0單纖尼龍線固定；用同樣方法給肺動(dòng)脈放置套管，然后心肺塊用紗布覆蓋后4°c冰箱保存；冷藏期間供肺保持半充氣狀態(tài)、整個(gè)氣道保持完全封閉狀態(tài)，以維持供氧、并防止保存液流入供肺；在吻合操作前，同樣方法放置支氣管套管。6、受者手術(shù)，胸腔內(nèi)左肺原位移植
要求快速、準(zhǔn)確吻合左肺血管及支氣管，不損傷供肺及所屬血管、支氣管。操作受者以同樣方法麻醉并建立機(jī)械通氣，左胸后外側(cè)切口，第3肋間進(jìn)胸，將受者左肺從切口后部牽出胸腔，在肺血管進(jìn)入肺實(shí)質(zhì)處用顯微蚊式鉗夾住，以作牽拉之用； 從肺門前入路，全程游離左肺門血管及支氣管，用3-0絲線打活結(jié)暫時(shí)阻斷血管、微血管夾阻斷支氣管，盡可能靠近根部；移植肺放入下胸腔，使供肺套管結(jié)構(gòu)在無(wú)張力狀態(tài)下貼近受者肺門；用10-0線環(huán)繞肺靜脈并預(yù)留一個(gè)線結(jié)，先切開(kāi)肺靜脈遠(yuǎn)端前壁1/3周徑、做橫切口，然后縱向切開(kāi)切口遠(yuǎn)端的肺靜脈前壁，做成“T”形切口 ；切口內(nèi)注入肝素稀釋液，用顯微鑷將“T”形切口的橫切緣牽開(kāi)、使之呈袋狀，用顯微鑷持住供者肺靜脈套管的延伸柄，沿著“T”形切口的縱切口輕輕滑入，將套管結(jié)構(gòu)送入一個(gè)合適的位置；在收緊線結(jié)之前，血管壁自身彈性可使肺靜脈套管保持原位；肺靜脈吻合成功后，依次吻合支氣管和肺動(dòng)脈；全部吻合成功后，剪掉套管延伸柄，依次開(kāi)放肺靜脈、肺動(dòng)脈和支氣管，然后切斷肺血管支氣管吻合時(shí)未剪斷的后壁，將移植肺納入胸腔；清理胸腔內(nèi)積液及組織碎屑，在深吸氣屏氣狀態(tài)下關(guān)閉胸腔。注意三個(gè)套管結(jié)構(gòu)的相對(duì)位置應(yīng)保持同一水平，以免相互交錯(cuò)而出現(xiàn)套管擠壓血管的現(xiàn)象；操作準(zhǔn)確、快速，避免誤傷，盡可能減少吻合時(shí)間(即熱缺血時(shí)間)。受者蘇醒后拔管，允許進(jìn)食進(jìn)水。觀察期結(jié)束后重新麻醉，獲取組織標(biāo)本。與現(xiàn)有方法的比較
小鼠和大鼠的解剖學(xué)差異僅在于大小有別，因此二者的手術(shù)流程完全一致，小鼠原位左肺移植模型的關(guān)鍵在于如何應(yīng)對(duì)更為嚴(yán)苛的顯微外科操作要求。除去基本類似的流程， 小鼠原位移植模型主要有4項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。我們提出的方法顯著優(yōu)于現(xiàn)有方法。(一)經(jīng)口氣管內(nèi)插管
這項(xiàng)操作雖小，卻是整個(gè)模型建立過(guò)程中第一個(gè)關(guān)鍵步驟。我們?cè)仍谧鐾鈾C(jī)肺損傷模型時(shí)采用的是蚊式鉗壓舌法暴露聲門，操作繁瑣，誤傷和失敗率較高。插管失誤可能導(dǎo)致整個(gè)移植手術(shù)連貫性的中斷，影響移植肺缺血時(shí)間的控制。我們改進(jìn)了經(jīng)口插管方法，通過(guò)“固定兩端”(上顎與上段胸骨)、“牽拉中點(diǎn)”(舌頭)的方法暴露聲門，符合解剖學(xué)原理， 所以暴露效果很好。同時(shí)，由于要領(lǐng)明確，該操作易于掌握、可重復(fù)性高、費(fèi)時(shí)少，單人操作一般能在5 IOs內(nèi)完成。根據(jù)美國(guó)Washington University的報(bào)道，他們?cè)诠┱呤中g(shù)中采用經(jīng)氣管造口插管，受者則在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)口插管[5-6]。瑞士 University Hospital ^lrich的報(bào)道未寫明方法[7]。經(jīng)氣管造口插管一般需要5min方可完成，如果不是他們所用的經(jīng)口插管法更費(fèi)事的話，則不會(huì)推薦使用氣管造口法。(二)供肺灌洗方法
供肺灌洗質(zhì)量嚴(yán)重影響再灌注損傷程度。供肺灌洗的壓力控制，傳統(tǒng)上一直沿用流體靜壓，例如大鼠采用的是20ml灌洗液以20cm H20的壓力灌洗[8]。瑞士 University Hospital ^lrich采用“2ml灌洗液、IOcm H20壓力”，應(yīng)該也是承接這種理念[7]。但是，灌洗時(shí)起作用的是流體動(dòng)壓，而非流體靜壓。小鼠心輸出量大致在22 32ml/min [9]，故我們選擇 BD 公司標(biāo)準(zhǔn)流速為 ^ml/min 的 22G 導(dǎo)管(BD Angio, Becton Dickinson Medical Devices Co Ltd., China)作為灌注管。我們用心輸出量來(lái)取代流體靜壓作為關(guān)系壓力控制的標(biāo)尺，理論基礎(chǔ)更合理。在操作上，我們的方法也更加簡(jiǎn)便、效果更好。我們的方法是，在直視下將22G導(dǎo)管插入小鼠右心室，操作簡(jiǎn)單，且因流速恒定而灌洗效果穩(wěn)定。瑞士 University Hospital ^lrich所采用的方法是，在肺動(dòng)脈根部做橫切口，然后經(jīng)該切口灌洗[7]。除操作復(fù)雜外， 該方法存在效果不穩(wěn)定的可能。水柱高度確定只能保證靜水壓恒定，灌洗壓力還受到管路長(zhǎng)度、走向和灌洗導(dǎo)管口徑等因素的影響。灌洗壓力過(guò)大、易損傷肺血管床，過(guò)小則影響灌洗效果。美國(guó)Washington University所采用的方法是，用3ml注射器經(jīng)27G針頭直接將 3ml肺保存液推注到心臟中[5-6]。這種方法很簡(jiǎn)單，但即使同一人操作，也無(wú)法保持推注壓力的大小與恒定，這可能是文獻(xiàn)所示照片中肺灌洗質(zhì)量差強(qiáng)人意的原因。至于全身肝素化，我們的方法是在心尖部直接注射到右心室中，隨后用顯微蚊式鉗夾住心臟下1/3，肝素化效果快速、直接，注射處也不會(huì)有很多出血。而文獻(xiàn)中所提的下腔靜脈內(nèi)注射、肝葉內(nèi)注射、甚至陰莖血管內(nèi)注射，操作都要復(fù)雜得多，全身肝素化效果也不及心內(nèi)注射好[5-7，10]。(三)套管放置
美國(guó)Washington University所采用的方法是，用血管夾先將套管延伸柄夾住，然后固定在自制的架子上；調(diào)整支架，使套管懸在血管上方3mm處，然后把血管塞進(jìn)套管中，從上端拉出[5-6]。瑞士 University Hospital ^lrich未詳細(xì)說(shuō)明其操作方法。我們?cè)囉蒙鲜龇椒?，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)問(wèn)題。首先，套管懸空高度很難調(diào)整。如果太低，影響下一步操作；如果太高，則在卷折血管袖時(shí)張力很大，不易成功。其次，如果先用血管夾夾住套管柄，則套管管腔常被遮擋，影響顯微鑷操作。因此，我們改變方案，套管先放置、后固定，其優(yōu)點(diǎn)在于①操作簡(jiǎn)單，操作時(shí)只要盡可能將套管推向外周端即可，不必精確調(diào)整相對(duì)距離；②成功率高，由于血管和套管柄被夾在一起，所以袖套卷折時(shí)血管的張力幾乎沒(méi)有，基本能一次成功。(四)吻合術(shù)的手術(shù)入路與吻合口制作
文獻(xiàn)采用的手術(shù)入路是，將受者左肺拉向切口前方，供肺放在受者自體肺上，從肺門后方進(jìn)行吻合操作[5-6]。由于自體肺通常拉到胸腔外，置于其上的供肺通常距縱膈更遠(yuǎn)，吻合張力較大，所以文獻(xiàn)建議供者套管結(jié)構(gòu)插入受者血管/支氣管之后，先用血管夾夾住受者血管/支氣管和套管柄，再用結(jié)扎線固定。但在有張力情況下，將供者套管結(jié)構(gòu)插入受者結(jié)構(gòu)本身就有難度，而且在上血管夾之前供者套管結(jié)構(gòu)常常因彈性回縮力而自行跳出。有鑒于此，我們改后入路為前入路，把移植肺放入下胸腔，這樣使供受者肺門結(jié)構(gòu)緊密接觸， 吻合時(shí)幾乎沒(méi)有張力。吻合術(shù)的另一個(gè)關(guān)鍵是吻合口制作，切口太小不易插入供者套管結(jié)構(gòu)，而太大則不宜維持吻合口的張開(kāi)狀態(tài)。美國(guó)Washington University所采用的方法是，先在受者血管或支氣管上剪開(kāi)一個(gè)小口，然后用顯微鑷輕柔擴(kuò)張W]。這是一個(gè)模糊的描述，可操作性差，小切口往往在不希望的地方擴(kuò)大，結(jié)果往往靠運(yùn)氣。有鑒于此，我們將橫切口長(zhǎng)度限定在1/3周徑，以保證吻合口的張開(kāi)度；然后將橫切口遠(yuǎn)端縱行剪開(kāi)，形成一個(gè)“T”形切口，確保入口直徑足夠大。由于事先選定了切口延伸的方向，插入套管結(jié)構(gòu)時(shí)一般不會(huì)造成意外方向的撕裂?！癟”形切口使吻合口的口徑和張開(kāi)度都能最大化，效果優(yōu)于單純的橫切口。通過(guò)降低吻合張力和改良吻合口形態(tài)，吻合操作更容易。而且，如果操作順利，則每例實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間差異不大，人為因素造成的個(gè)體差異可降至最低。綜上所述，我們創(chuàng)立的方法具有操作方法簡(jiǎn)單、確切、合理等優(yōu)點(diǎn)，比現(xiàn)有方法更容易掌握、操作，受個(gè)人因素的影響也很低，更加接近動(dòng)物模型“操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好”的理想狀態(tài)。本發(fā)明作為一種研究工具，可復(fù)制急性肺損傷、慢性免疫損傷、肺纖維化等疾病過(guò)程，主要用于肺移植領(lǐng)域，也可用于免疫學(xué)、病理生理學(xué)等學(xué)科中涉及肺泡與肺血管的一些領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式(一)設(shè)備儀器
1、手術(shù)顯微鏡1臺(tái)，放大倍數(shù)5 45X
2、嚙齒類動(dòng)物呼吸機(jī)1臺(tái)
3、普通手術(shù)器械手術(shù)無(wú)影燈，眼科剪1把，彎頭眼科鑷2把。4、顯微外科手術(shù)器械顯微蚊式鉗(直)2把，顯微蚊式鉗(彎)1把；尖頭直徑
0.05mm 的顯微剪(Vannas spring scissors)l 把；頭寬 0. Imm 的顯微攝(micro forceps) 2把；頭寬0. 3mm的顯微結(jié)扎鑷(suture tying forceps) 2把
5、耗材
微血管夾(顎長(zhǎng)5mm、夾寬0. 75mm)，動(dòng)脈血管夾(顎長(zhǎng)15mm)；
10-0單纖尼龍線，3-0編織絲線；
Iml注射器，20ml注射器，50ml注射器，輸液器，輸液架；
18G,20G,22G,24G 血管導(dǎo)管(Angiocatheter)；
培養(yǎng)皿，紗布，橡皮筋，泡沫塑料板，刀片；
肺保存液，生理鹽水，肝素鈉。(二)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇小鼠品系。一般情況下，小鼠在清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。除非特別要求， 術(shù)前正常供給食水。小鼠體重一般應(yīng)> 25g，供、受者體重大致相當(dāng)。小鼠的飼養(yǎng)、使用遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物權(quán)益。實(shí)驗(yàn)中，供受者采用8周齡雄性ICR小鼠(體重約30 32g)，購(gòu)自上海史萊克公司，飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中。制備支氣管、肺靜脈、肺動(dòng)脈套管的材料分別選用BD公司的18G、 20G和 24G血管導(dǎo)管(BD Angio, Becton Dickinson Medical Devices Co Ltd. , China)。皆用腹腔注射戊巴比妥鈉(0. 2 mg/kg)麻醉，經(jīng)口氣管內(nèi)插管(20G)，連接小鼠呼吸機(jī)(Model 683 Harvard Rodent Ventilator, Harvard Apparatus, South Natick, MA), Bf ^ ^ 潮氣量1.0 ml、呼吸頻率120/min。肺保存液采用低價(jià)右旋糖酐液(Perfadex solution, Vitrolife, Sweden)。(三)操作方法 1、制備套管
要點(diǎn)支氣管、肺靜脈、肺動(dòng)脈所用套管分別由18/20G、20G、24G血管導(dǎo)管制備。支氣管、肺靜脈套管體長(zhǎng)1. 0mm，肺動(dòng)脈套管體長(zhǎng)0. 5mm。套管延伸柄長(zhǎng)1. 0mm，約占1/3周徑。 套管表面打磨粗糙(必要時(shí)可加淺切痕)、以增加摩擦力，套管邊緣切割整齊、以防尖端刺破
血管壁。血管套管用砂紙打磨后，24G導(dǎo)管切成1. 5mm小段、其余型號(hào)導(dǎo)管切成2. Omm小段。將顯微血管鑷的一個(gè)尖頭插入導(dǎo)管小段的管腔中，內(nèi)表面朝上、尖端露出。在距離遠(yuǎn)端
1.Omm處橫切，直到刀片碰到顯微血管鑷分枝的內(nèi)表面。刀片抵在顯微血管鑷分枝的尖端， 緊貼其內(nèi)表面，縱向切割，直至橫切口處。2、建立供肺灌注系統(tǒng)
要點(diǎn)提供穩(wěn)定的、壓力與正常肺動(dòng)脈壓相當(dāng)?shù)姆窝h(huán)灌流。
拔去50ml針筒的內(nèi)芯，置于高度約20-30cm的輸液架上。剪去輸液器的金屬針頭， 與50ml針筒對(duì)接，另一頭接駁22G血管套管。在50ml針筒內(nèi)注入30ml肺保存溶液，并添加由肺保存溶液制備的冰塊1塊。打開(kāi)輸液器閥門排氣，使管路內(nèi)充滿溶液。3、小鼠麻醉與機(jī)械通氣
要點(diǎn)適度麻醉，不損傷口腔組織條件下快速經(jīng)口氣管內(nèi)插管，維持穩(wěn)定人工機(jī)械通氣。小鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(0. 2 mg/kg)麻醉。泡沫塑料板(2X IOX 15cm) —端箍上橡皮筋，將小鼠置于其上，橡皮筋拉起后勒住小鼠上顎。豎起泡沫塑料板，將無(wú)影燈燈光從前上方投射至其頸部。術(shù)者左手環(huán)指抵住小鼠胸骨上段，與橡皮筋固定的上顎形成兩個(gè)固定點(diǎn)，然后用左手拇指和食指捏住小鼠舌頭輕拉，暴露咽喉部。此時(shí)可見(jiàn)聲門隨呼吸做 “關(guān)閉-張開(kāi)”運(yùn)動(dòng)，右手持20G血管導(dǎo)管(無(wú)針芯)，緩慢接近聲門，在其開(kāi)啟瞬間輕輕插入。 連接呼吸機(jī)輸出管路，根據(jù)小鼠體重大小提供0. 5 1. 0 ml潮氣量，呼吸頻率120 140/
mirio4、供者手術(shù)(獲取供肺)
要點(diǎn)供肺徹底灌洗、血管床無(wú)血液殘留，供肺及所屬血管、支氣管無(wú)損傷。建立機(jī)械通氣后，供者小鼠取仰臥位，從劍突下開(kāi)始做胸腹正中聯(lián)合切口，用2把顯微蚊式鉗(直)分別鉗夾胸骨兩邊，起到止血和協(xié)助暴露的作用。用動(dòng)脈血管夾拉起胸腺， 暴露右心室流出道及主動(dòng)脈起始部。用Iml針筒將100U/0. Iml肝素鈉稀釋液在心尖處注入右心室。左手用1把顯微蚊式鉗(彎)夾住心臟下1/3處、但不上齒，左手小指勾住供肺灌注系統(tǒng)的輸液器下端，并使22G血管導(dǎo)管的尖端恰好抵在右心上。打開(kāi)輸液器控制裝置，迅速將噴涌肺保存液的22G血管導(dǎo)管插入右心室。此時(shí)可見(jiàn)左右心耳立即膨脹。輕輕抬起左手，使左右心耳暴露更好，然后用眼科剪迅速剪開(kāi)左右心耳、剪斷腹腔動(dòng)靜脈。灌洗液和殘留血液快速流出，兩肺數(shù)秒鐘之后變白。在充氣狀態(tài)下用顯微蚊式鉗(彎)夾閉氣管，自上而下剪開(kāi)，將心肺塊整塊取出，生理鹽水沖洗后放置在鋪有紗布的培養(yǎng)皿內(nèi)。紗布浸透肺保存液，并放置肺保存液制成的冰塊以保持低溫。保持灌洗流速和適當(dāng)?shù)碾p肺通氣幅度、灌洗液流出暢通是保證供肺灌洗質(zhì)量的三個(gè)要素。一旦灌洗初期未能將供肺血管床內(nèi)的血液沖洗干凈，則延長(zhǎng)灌洗無(wú)益于改善灌洗質(zhì)量。5、放置套管(移植肺準(zhǔn)備)
要點(diǎn)套管位置恰當(dāng)，不損傷供肺及所屬血管、支氣管。在5 45X手術(shù)顯微鏡下，解剖左肺門，全長(zhǎng)游離左肺靜脈、動(dòng)脈、支氣管。必須清除這些結(jié)構(gòu)上附著的脂肪與結(jié)締組織，否則線結(jié)容易滑脫。在左肺靜脈與左心房、左肺動(dòng)脈與肺動(dòng)脈干交界處切斷，保留盡可能長(zhǎng)的血管用于放置套管。顯微鑷先穿過(guò)肺靜脈套管， 再提住肺靜脈殘端，在另一把顯微鑷的協(xié)助下將套管套在左肺靜脈上，套管的延伸柄指向后肺門。左手所持顯微鑷夾住盡可能長(zhǎng)的肺靜脈殘端，右手持彎頭眼科鑷、把微血管夾夾在套管的延伸柄及肺靜脈上。1把顯微蚊式鉗(彎)夾住微血管夾尾部，擱在培養(yǎng)皿邊沿上，通過(guò)自身重力使微血管夾相對(duì)固定。用2把顯微鑷交替，將肺靜脈殘端像卷袖口那樣翻轉(zhuǎn)，套在套管的外面，然后用10-0單纖尼龍線固定。返折后的肺靜脈殘端必須超越結(jié)扎線固定的位置，否則吻合之后漏血。用同樣方法給肺動(dòng)脈放置套管，然后心肺塊用紗布覆蓋后4°C冰箱保存。冷藏期間供肺保持半充氣狀態(tài)、整個(gè)氣道保持完全封閉狀態(tài)，以維持供氧，并防止保存液流入供肺。在移植操作前，放置支氣管套管。6、受者手術(shù)(三套管法左單肺移植)
要點(diǎn)準(zhǔn)確、快速操作，避免誤傷，盡可能減少吻合時(shí)間(即熱缺血時(shí)間)。建立機(jī)械通氣后，受者小鼠取右側(cè)臥位，左后外側(cè)開(kāi)胸切口，經(jīng)第3肋間進(jìn)胸。切口上下緣肋骨各縫1根3-0絲線，用于牽開(kāi)切口。將受者左肺從切口后部牽出胸腔，在肺血管進(jìn)入肺實(shí)質(zhì)處用纖維蚊式鉗(彎)夾住，從肺門前入路，全程游離左肺門血管及支氣管。用 3-0絲線套在肺靜脈、肺動(dòng)脈基底部，打一滑結(jié)并收緊，暫時(shí)阻斷血管。用微血管夾在盡可能靠近隆突處夾住左肺支氣管。把移植肺放入下胸腔內(nèi)，使供肺肺門套管結(jié)構(gòu)在無(wú)張力狀態(tài)下貼近受者肺門。用10-0線環(huán)繞肺靜脈并預(yù)留一個(gè)線結(jié)，先切開(kāi)肺靜脈遠(yuǎn)端前壁1/3周徑、做橫切口，然后縱向切開(kāi)切口遠(yuǎn)端的肺靜脈前壁，做成“T”形切口。切口內(nèi)注入肝素稀釋液，左手持1把顯微鑷將“T”形切口的橫切緣輕輕牽開(kāi)、使之呈袋狀，右手顯微鑷持住供者肺靜脈套管的延伸柄，沿著“T”形切口的縱切口輕輕滑入，將套管結(jié)構(gòu)送入一個(gè)合適的位置。在收緊線結(jié)之前，血管壁自身彈性可使肺靜脈套管保持原位。肺靜脈吻合成功后，依次吻合支氣管和肺動(dòng)脈。不同的一點(diǎn)是，吻合支氣管時(shí)不注射肝素，而是清理其中的積液與組織碎屑。注意三個(gè)套管結(jié)構(gòu)的相對(duì)位置應(yīng)保持同一水平，以免相互交錯(cuò)而出現(xiàn)套管擠壓血管的現(xiàn)象。全部吻合成功后，剪掉套管延伸柄，依次開(kāi)放肺靜脈、肺動(dòng)脈和支氣管，然后切斷肺血管支氣管吻合時(shí)未剪斷的后壁，將移植肺納入胸腔。清理胸腔內(nèi)積液及組織碎屑，在深吸氣屏氣狀態(tài)下關(guān)閉胸腔。受者蘇醒后拔管，允許進(jìn)食進(jìn)水。觀察期結(jié)束后重新麻醉，獲取組織標(biāo)本。參考文獻(xiàn),Gelman AE, Okazaki M, Lai J, Kornfeld CG, Kreisel FH, et al. CD4+ T lymphocytes are not necessary for the acute rejection of vascularized mouse lung transplants. J Immunol. 2008 Apr 1;180(7):4754-62. PMID: 18354199.Kreisel D, Sugimoto S, Tietjens J, Zhu J, Yamamoto S, et al. Bcl3 prevents acute inflammatory lung injury in mice by restraining emergency granulopoiesis. J Clin Invest. 2011 Jan 4;121(1):265-76. PMID: 21157041.Asimacopoulos PJ, Molokhia FA, Pegg CA, Norman JC. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 1971 Mar;3(1):583-5. PMID: 4937944.MizutaT, Kawaguchi A, Nakahara K, Kawashima Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J Thorac Cardiovasc Surg 1989; 97 (4) :578 - 81..Okazaki M, Krupnick AS, Kornfeld CG, Lai JM, Ritter JH, et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 2007 Jun；7(6):1672-9..Krupnick AS, Lin X, Li W, Okazaki M, Lai J, et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 2009;4(1):86-93. PMID: 19131960.Jungraithmayr WM, Korom S, Hillinger S, Weder W. A mouse model oforthotopic, single-lung transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. 2009 Feb; 137(2) :486-91..Sugimoto Rj Nakao A，Nagahiro I，Kohmoto J，Sugimoto S，Okazaki M， Yamane M，Inokawa H，Oto T，Tahara K，Zhan J，Sano Y，McCurry KR. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surg Today. 2009;39 (7):641-5. PMID: 19562458..Zanotti-CavazzoniSLj Guglielmi M， Parrillo JEj Walker T， Dellinger RPj Hollenberg SM. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 2009 Apr; 35 (4) :748-54.
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權(quán)利要求
1. 一種小鼠原位左肺移植模型構(gòu)建方法，其特征在于具體步驟如下(1)、制備套管左肺支氣管、肺靜脈、肺動(dòng)脈所用套管分別由18/20G、20G、24G血管導(dǎo)管制備；支氣管、 肺靜脈套管體長(zhǎng)1. 0mm，肺動(dòng)脈套管體長(zhǎng)0. 5mm ；套管延伸柄長(zhǎng)1. Omm,寬度占1/4 1/3管壁周徑；具體操作是血管導(dǎo)管用砂紙打磨后，24G導(dǎo)管切成1. 5mm小段，其余型號(hào)切成2. Omm 小段；將顯微血管鑷的一個(gè)尖頭插入小段管腔，以其內(nèi)側(cè)面為切割平面，用刀片橫向和縱向切割，做出套管的延伸柄；(2)、建立供肺灌洗系統(tǒng)穩(wěn)定提供與正常肺動(dòng)脈壓相當(dāng)?shù)墓嘞磯毫Γ痪唧w操作是依次連接50ml針筒、輸液器、22G血管套管，針筒固定于15--25cm高度， 注入肺保存溶液的冰水混合物，并使其充滿管路；(3)、小鼠麻醉、氣管內(nèi)插管與機(jī)械通氣適度麻醉，用“兩端固定、中間拉開(kāi)”法快速經(jīng)口氣管插管，建立機(jī)械通氣；具體操作是腹腔注射麻醉；小鼠上顎用橡皮筋固定于泡沫塑料板，胸骨上部用左手環(huán)指抵住，左手拇指和食指牽拉舌頭，暴露聲門；右手持20G血管導(dǎo)管接近聲門，在其開(kāi)啟瞬間輕輕插入；連接呼吸機(jī)輸出管路，根據(jù)小鼠體重大小提供0.5 1.0 ml潮氣量，呼吸頻率 120 140/min ；(4)、供者手術(shù)，獲取供肺采用獨(dú)特的供肺灌洗系統(tǒng)，借助簡(jiǎn)單操作完全清除供肺血管床內(nèi)血液；具體操作是建立機(jī)械通氣后，胸腹正中切口開(kāi)胸；將100U/0. Iml肝素鈉稀釋液在供者心尖處注入右心室；左手持顯微蚊式鉗夾住心臟下1/3處、但不上齒，小指勾住供肺灌洗系統(tǒng)的輸液器下端、使22G導(dǎo)管尖端恰好抵在右心上；打開(kāi)輸液器控制裝置，將噴涌肺保存液的22G導(dǎo)管插入右心室；用眼科剪迅速剪開(kāi)膨脹的左右心耳、腹腔動(dòng)靜脈，使灌洗液和血液快速流出；兩肺數(shù)秒鐘之后變白，在半充氣狀態(tài)下用顯微蚊式鉗夾閉氣管，自上而下銳性解剖，將心肺塊完整取出，生理鹽水沖洗后置于鋪有紗布的培養(yǎng)皿中，肺保存液制成的冰塊恰使紗布浸透；(5)、放置套管，準(zhǔn)備移植肺游離、切斷血管和支氣管，用“先套管、后固定”法為其分別放置套管；具體操作是在手術(shù)顯微鏡下，左肺靜脈、動(dòng)脈、支氣管全長(zhǎng)游離、在盡可能靠近總干處切斷；顯微鑷兩尖并攏穿過(guò)肺靜脈套管，牽拉肺靜脈殘端，在另一把顯微鑷的協(xié)助下將套管套上并推向左肺靜脈遠(yuǎn)端，延伸柄指向后肺門；左手顯微鑷夾住肺靜脈，盡可能靠近其遠(yuǎn)端，右手用微血管夾把套管柄及肺靜脈一并夾住，蚊式鉗夾住微血管夾尾部并擱在培養(yǎng)皿邊沿上，以穩(wěn)定微血管夾；將肺靜脈殘端像卷袖口那樣翻轉(zhuǎn)，套在套管的外面，然后用10-0 單纖尼龍線固定；用同樣方法給肺動(dòng)脈放置套管，然后心肺塊用紗布覆蓋后4°C冰箱保存； 冷藏期間供肺保持半充氣狀態(tài)、整個(gè)氣道保持完全封閉狀態(tài)，以維持供氧、并防止保存液流入供肺；在吻合操作前，同樣方法放置支氣管套管；(6 )、受者手術(shù)，胸腔內(nèi)左肺原位移植采用吻合張力最低的前肺門入路、吻合口的口徑和張開(kāi)度俱佳的“T”形吻合口，依次吻合左肺靜脈、動(dòng)脈和支氣管；具體操作是受者以同樣方法麻醉并建立機(jī)械通氣，左胸后外側(cè)切口，第3肋間進(jìn)胸， 將受者左肺從切口后部牽出胸腔，在肺血管進(jìn)入肺實(shí)質(zhì)處用顯微蚊式鉗夾住，以作牽拉之用；從肺門前入路，全程游離左肺門血管及支氣管，用3-0絲線打活結(jié)暫時(shí)阻斷血管、微血管夾阻斷支氣管，盡可能靠近根部；移植肺放入下胸腔，使供肺套管結(jié)構(gòu)在無(wú)張力狀態(tài)下貼近受者肺門；用10-0線環(huán)繞肺靜脈并預(yù)留一個(gè)線結(jié)，先切開(kāi)肺靜脈遠(yuǎn)端前壁1/3周徑、做橫切口，然后縱向切開(kāi)切口遠(yuǎn)端的肺靜脈前壁，做成“T”形切口 ；切口內(nèi)注入肝素稀釋液，用顯微鑷將“T”形切口的橫切緣牽開(kāi)、使之呈袋狀，用顯微鑷持住供者肺靜脈套管的延伸柄， 沿著“T”形切口的縱切口輕輕滑入，將套管結(jié)構(gòu)送入一個(gè)合適的位置；在收緊線結(jié)之前，血管壁自身彈性可使肺靜脈套管保持原位；肺靜脈吻合成功后，依次吻合支氣管和肺動(dòng)脈； 全部吻合成功后，剪掉套管延伸柄，依次開(kāi)放肺靜脈、肺動(dòng)脈和支氣管，然后切斷肺血管支氣管吻合時(shí)未剪斷的后壁，將移植肺納入胸腔；清理胸腔內(nèi)積液及組織碎屑，在深吸氣屏氣狀態(tài)下關(guān)閉胸腔。
2. 一種由權(quán)利要求所述方法構(gòu)建的小鼠原位左肺移植模型。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種小鼠原位左肺移植模型及其構(gòu)建方法。作為一種研究工具，該模型復(fù)制急性肺損傷、慢性免疫損傷、肺纖維化等疾病過(guò)程，主要用于肺移植領(lǐng)域，也可用于免疫學(xué)、病理生理學(xué)等學(xué)科中的一些領(lǐng)域。該模型的構(gòu)建步驟包括制備套管；建立供肺灌注系統(tǒng)；小鼠麻醉、氣管內(nèi)插管與機(jī)械通氣；供者手術(shù)，獲取供肺；供肺放置套管；受者手術(shù)，胸腔內(nèi)左肺原位移植。本發(fā)明在建立供肺灌洗系統(tǒng)，在小鼠氣管內(nèi)插管、供肺灌洗、放置套管、套管法吻合肺血管支氣管等方面均進(jìn)行重要改進(jìn)。實(shí)踐表明，本發(fā)明比現(xiàn)有方法更容易掌握、操作，受個(gè)人因素的影響也更低，更接近動(dòng)物模型“操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好”的理想狀態(tài)。
文檔編號(hào)A61D1/00GK102247219SQ201110104989
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者王興安, 白春學(xué), 高文 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院