專利名稱：一種新的產(chǎn)黃青霉菌株以及利用此菌株發(fā)酵制備青霉素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及青霉素生產(chǎn)領(lǐng)域，特別涉及一種新的產(chǎn)黃青霉菌及此菌在生產(chǎn)青霉素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-內(nèi)酰胺類抗生素是目前已知的抗生素中毒性最低，品種最多，臨床應(yīng)用最廣的一類抗生素。其中最重要的為青霉素和頭孢菌素C，以它們?yōu)樵辖?jīng)過化學(xué)或酶反應(yīng)得到中間體，可得到一系列半合成青霉素和半合成頭孢菌素，這些中間體主要包括6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基去乙酰頭孢烷酸(7-ADCA)和氯甲基頭孢芐酯(GCLE)、7-氨基頭孢烯酸(7-ACA)。6-APA、7-ADCA、GCLE都由青霉素制得，7-ACA由頭孢菌素C制得。這些中間體的獲得使得半合成抗生素，特別是半合成頭孢菌素的品種不斷增加。目前，全世界臨床應(yīng)用的半合成青霉素和半合成頭孢菌素品種已經(jīng)超過了120種，占世界抗感染藥物市場(chǎng)65％以上。
在工業(yè)生產(chǎn)中，青霉素和頭孢菌素C分別由產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)和產(chǎn)黃頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)產(chǎn)生，目前，它們的生物合成途徑已經(jīng)清楚由三個(gè)前體氨基酸(α-氨基己二酸、半胱氨酸、纈氨酸)開始，經(jīng)過縮合，環(huán)化反應(yīng)后形成異青霉素N，這一過程在兩種微生物中是一致的，然后由此分叉，再經(jīng)一系列反應(yīng)，最終分別得到青霉素和頭孢菌素C。與青霉素和頭孢菌素C生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因都已克隆(Ingolia & Queener，Med.Res.Rev.9245-264，1989；Aharonowitz，et al.，Ann.Rev.Microbiol.46461-495，1992；Ullán，et al.，J.Biol.Chem.27746216-46225，2002)。商業(yè)競(jìng)爭需要青霉素生產(chǎn)企業(yè)不斷提高青霉素生產(chǎn)菌種的發(fā)酵單位，優(yōu)化發(fā)酵工藝，降低動(dòng)力消耗，以有效降低青霉素的生產(chǎn)成本。幾十年來，基于隨機(jī)突變和分離篩選的育種方法，在產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)菌種的改良上取得了顯著的成績(Brakhage，Microbol.Mol.Biol.Rev.62547-585，1998)。隨著產(chǎn)量的提高，誘變的積累，應(yīng)用傳統(tǒng)方法進(jìn)一步提高生產(chǎn)水平已受到限制。在青霉素的工業(yè)生產(chǎn)中，菌體生長和青霉素的形成都需要氧氣，因此青霉素發(fā)酵是個(gè)高耗氧過程，隨著青霉素菌種生產(chǎn)能力的不斷提高，對(duì)氧的需求也越來越高，氧氣的供應(yīng)常成為青霉素發(fā)酵的限制因素。傳統(tǒng)的抗生素工業(yè)通常只能通過改變攪拌裝置的形狀、提高攪拌速率、通入富氧的加壓空氣來提高發(fā)酵液的溶氧水平，雖然有一定的效果，但常受到設(shè)備的限制，而且動(dòng)力消耗巨大。目前僅發(fā)酵動(dòng)力消耗一項(xiàng)即已占青霉素發(fā)酵成本的三分之一(郭宏秋、楊勝利，微生物學(xué)通報(bào)，23227-230，1996)。
透明顫菌(Vitreoscilla)是專性好氧的革蘭氏陰性菌，但能在貧氧環(huán)境中生長。美國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在該菌中存在一種血紅蛋白(Vitreoscillahemoglobin VHb)(Tyree & Webster，J.Biol.Chem.，2536988-6991，1978)，編碼該蛋白的基因受環(huán)境中氧濃度調(diào)控。在高氧環(huán)境下，VHb基因不表達(dá)；而在低氧環(huán)境下，VHb基因表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)中血紅蛋白含量大量增加，由VHb促進(jìn)氧擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并提高氧的利用效率，由此促進(jìn)菌體生長(Wakabayashi，Nature，332481-483，1986；Khosla，Bio/Technology，8849-853，1990；焦瑞身，生物工程學(xué)報(bào)，19381-386)。
自VHb發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)在多種異源宿主中進(jìn)行了表達(dá)和應(yīng)用研究。在抗生素生產(chǎn)菌育種方面，也取得了一些有益的結(jié)果。Brünker等以PmerR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)vhb基因在紅霉素工業(yè)生產(chǎn)菌，紅霉素糖多孢菌中有效表達(dá)，可使該菌的紅霉素生產(chǎn)能力在搖瓶發(fā)酵水平提高60％(Brünker，et al.，Microbiology，1442441-2448，1998)。Minas等在10-15L的發(fā)酵罐中試驗(yàn)，可將紅霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株產(chǎn)量提高70％，而且單位菌體產(chǎn)紅霉素能力提高幅度更是高達(dá)2.3倍(Minas et al.，Biotechnol Prog，14561-566，1998)。DeModena等將以PTR-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的vhb基因在頭孢菌素C工業(yè)生產(chǎn)菌，產(chǎn)黃頂頭孢中有效表達(dá)，可使該菌的頭孢菌素C生產(chǎn)能力在搖瓶發(fā)酵水平提高50％以上，最高的提高幅度能達(dá)到3.2倍，即4g/l的生產(chǎn)水平(DeModena，et al.，Bio/Technology，11926-929，1993)。DeModena等同時(shí)也將PTR-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的vhb基因在青霉素工業(yè)生產(chǎn)菌，產(chǎn)黃青霉菌中有效表達(dá)，但沒有提高產(chǎn)量的報(bào)道。孫傳保等將vhb基因轉(zhuǎn)入青霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株，產(chǎn)黃青霉P-9時(shí)，共獲得了53株轉(zhuǎn)化子，但只有一株有產(chǎn)青霉素能力，不僅沒有提高生產(chǎn)菌株的青霉素生產(chǎn)能力，而且必須在含有高濃度KCl的培養(yǎng)基中才能生長，給后續(xù)的工作帶來了很多的麻煩。(孫傳寶等，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，3364-67，2002)因此，如何將vhb基因成功轉(zhuǎn)入青霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株并使其可控表達(dá)，有效地提高工業(yè)生產(chǎn)菌株的青霉素生產(chǎn)能力，降低青霉素生產(chǎn)過程對(duì)低氧的耐受性，從而低價(jià)、高效地生產(chǎn)青霉素一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員著力解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種生產(chǎn)青霉素的產(chǎn)黃青霉菌；本發(fā)明所提供的生產(chǎn)青霉素的產(chǎn)黃青霉菌是產(chǎn)黃青霉NCPC 4336該菌株已經(jīng)于2004年11月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)的普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)CGMCC No.1248。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供生產(chǎn)青霉素的產(chǎn)黃青霉菌的選育方法，包括1.在產(chǎn)黃青霉菌表達(dá)信號(hào)序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控下，用透明顫菌氧結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉菌；2.在培養(yǎng)基中發(fā)酵所述的菌株可以提高青霉素的產(chǎn)量。
本發(fā)明利用vhb基因成功構(gòu)建了一種產(chǎn)黃青霉菌有效的基因工程重組質(zhì)粒，將vhb基因受產(chǎn)黃青霉菌中青霉素生物合成的關(guān)鍵酶，異青霉素N合成酶(IPNS)基因的啟動(dòng)子Pipns和構(gòu)巢曲霉色氨酸生物合成基因trpC的終止子TtrpC的調(diào)控，轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉菌后可有效表達(dá)vhb基因，增加單位發(fā)酵液中的菌體量，并有效提高青霉素的產(chǎn)量。
本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉菌的高效的透明顫菌氧結(jié)合蛋白基因(vhb)的重組質(zhì)粒。通過轉(zhuǎn)化青霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株，在產(chǎn)黃青霉菌中有效可控表達(dá)透明顫菌vhb基因，利用透明顫菌氧結(jié)合蛋白的特性篩選青霉素高產(chǎn)的工業(yè)生產(chǎn)菌種，使得產(chǎn)黃青霉菌細(xì)胞中可利用的氧增加，提高細(xì)胞能量生成的效率，增加細(xì)胞生成和青霉素合成，從而提高最終產(chǎn)量。通過本方法得到的青霉素高產(chǎn)菌種生長快，菌體量大，青霉素生產(chǎn)能力強(qiáng)。由此有效提高青霉素的工業(yè)生產(chǎn)水平。
利用透明顫菌氧結(jié)合蛋白基因重組得到的產(chǎn)黃青霉基因工程菌在固體培養(yǎng)基上菌落直徑為1.1厘米至1.4厘米；菌落呈圓饅頭狀，中間凹陷；菌落顏色為淡黃綠色，放射線少。在液體培養(yǎng)條件下菌絲變細(xì)長。


圖1為質(zhì)粒pPIPKA的物理圖譜
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。除非特別說明，本發(fā)明實(shí)施例中所用的百分比為重量體積百分比。
實(shí)施例1基因克隆和基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建產(chǎn)黃青霉的轉(zhuǎn)化載體pPIPKA按照申請(qǐng)?zhí)枮?00410012139.4的中國發(fā)明專利描述構(gòu)建而成。pDH25的質(zhì)粒載體購自美國真菌遺傳庫(FungalGenetics Stock Center，University of Kansas Medical Center)?；蜣D(zhuǎn)化用宿主菌產(chǎn)黃青霉菌ATCC 28953購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。pGEM-T為美國Promega公司的產(chǎn)品。
本發(fā)明中所用的分子克隆技術(shù)，包括DNA的分離純化、DNA合成、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、DNA的限制性內(nèi)切酶酶切，DNA的連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化篩選、序列分析等都是本領(lǐng)域中非常熟悉的，在Sambrook等著的Molecular Cloning，a laboratory manual一書中有充分地描述。
根據(jù)文選中公開的透明顫菌氧結(jié)合蛋白基因(vhb)序列(Khosla&Bailey，Mol.Gen.Genet.214158-161，1988)我們進(jìn)行了基因序列設(shè)計(jì)并進(jìn)行了基因全合成。合成的含有453個(gè)堿基對(duì)的vhb基因序列見序列表中序列NO1。
在合成的vhb基因序列中，其5’端引入了Nco I內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端引入了Bam HI內(nèi)切酶位點(diǎn)。
為了克隆構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶C的基因的終止子TtrpC，根據(jù)文選(Punt，et al.，Gene 56117-124，1987)報(bào)道的序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物ptrl5’-ggatccacttaacgttactga--3’見序列表NO2、prt25’-aagcttcgagtggagatgtggagtg-3’見序列表NO3。以pDH25的質(zhì)粒DNA為模板，克隆769bp的TtrpC序列，兩端分別引入BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)，連接到pGEM-T載體上，得到質(zhì)粒pGEMT/TtrpC。雙脫氧核苷酸測(cè)序法測(cè)序結(jié)果表明，該序列和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致(Punt，et al.，Gene 56117-124，1987)。
在pPIPKA質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，為了將vhb基因轉(zhuǎn)入產(chǎn)黃青霉中并得以表達(dá)，我們將克隆的vhb(包括ORF及其本身的終止序列)連上ipns的啟動(dòng)子(pIPNS)和trpC的終止子TtrpC，將此表達(dá)盒(pIVT)克隆于pPIPKA的BamHI/HindIII位點(diǎn)，定名為pBIVT，其物理圖譜如圖1所示。
實(shí)施例2產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化與陽性克隆篩選1.微生物的培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉菌NCPC10086生長在YPD培養(yǎng)基中(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。該菌的染色體DNA用于分離Pipns序列。同時(shí)該菌也用作cefE基因轉(zhuǎn)化宿主。用于制備原生質(zhì)體的菌體培養(yǎng)也用YPD培養(yǎng)基。
2.產(chǎn)黃青霉菌的轉(zhuǎn)化采用Ca-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，按王富強(qiáng)等的方法(菌物學(xué)報(bào)，2366-72，2004)，將pBIVT載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉。陽性克隆在含有博來霉素的YPD選擇性培養(yǎng)基篩選。
3.轉(zhuǎn)化子檢測(cè)通過在選擇性培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2ug/ml博來霉素)上傳代培養(yǎng)兩次來純化產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化子。單一的穩(wěn)定菌落用于制備孢子并篩選含有vhb表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化子。博來霉素抗性菌落的菌體以Novozyme234消化，苯酚抽提后作為PCR模板篩選含有vhb表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化子。Vhb擴(kuò)增用引物序列為pxv15’-ATC gAT ATg TTA gAC CAg CAA-3’見序列表序列NO4，pxv25’-ggA TCC TTA TTC AAC CgC TTg-3’見序列表序列NO5。Vhb基因陽性的菌株進(jìn)行發(fā)酵(實(shí)施例2)，發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析評(píng)價(jià)vhb基因陽性轉(zhuǎn)化子青霉素生產(chǎn)能力的高低。
實(shí)施例3搖瓶發(fā)酵與目的產(chǎn)物檢測(cè)產(chǎn)黃青霉ATCC 28953用實(shí)施例1中所述的轉(zhuǎn)基因載體pBIVT進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到陽性克隆272個(gè)。轉(zhuǎn)基因陽性菌株以2×106分生孢子/ml接種種子培養(yǎng)基(g/l)葡萄糖，30；乳糖，10；綿子餅粉，10；酵母粉，10；玉米漿，10；(NH4)2SO4，2；KH2PO4，1；CaCO3，5。pH 5.8。26℃，48小時(shí)。種子培養(yǎng)物以5％接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)乳糖，120；綿子餅粉，30；玉米漿，20；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；K2SO4，5；CaCO3，10；pH 6.5，26℃，144小時(shí)培養(yǎng)。
發(fā)酵結(jié)束后，離心發(fā)酵液以8000g離心力離心15分鐘除去菌絲體，得到發(fā)酵上清液用于青霉素產(chǎn)量檢測(cè)。檢測(cè)按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Brownlee et al.，J Gen Microbiol，1949)進(jìn)行。通過272株菌的試驗(yàn)結(jié)果，與出發(fā)菌株相比，轉(zhuǎn)基因菌株的青霉素產(chǎn)量明顯提高，提高幅度超過了26.1％。
序列表NO1<110>華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司<120>一種新的產(chǎn)黃青霉菌株以及利用此菌株發(fā)酵制備青霉素<130>refered<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>453<212>DNA<213>Penicillium chrysogenum<400>1ccatggatgt tagaccagca aaccattaac atcatcaaag ccactgttcc tgtattgaag60gagcatggcg ttaccattac cacgactttt tataaaaact tgtttgccaa acaccctgaa120gtacgtcctt tgtttgatat gggtcgccaa gaatctttgg agcagcctaa ggctttggcg180atgacggtat tggcggcagc gcaaaacatt gaaaatttgc cagctatttt gcctgcggtc240aaaaaaattg cagtcaaaca ttgtcaagca ggcgtggcag cagcgcatta tccgattgtc300ggtcaagaat tgttgggtgc gattaaagaa gtattgggcg atgccgcaac cgatgacatt360ttggacgcgt ggggcaaggc ttatggcgtg attgcagatg tgtttattca agtggaagca420gatttgtacg ctcaagcggt tgaataagga tcc 453
NO2<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2ggatccacttaacgttactga21NO3<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3aagcttcgagtggagatgtggagtg25NO4<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4atcgatatgttagaccagcaa21
NO5<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5ggatccttattcaaccgcttg2權(quán)利要求
1.產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)CGMCC No.1248。
2.一種表達(dá)透明顫菌氧結(jié)合蛋白基因的產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)基因載體pBIVT。
3.權(quán)利要求2所述的載體，其中驅(qū)動(dòng)透明顫菌氧結(jié)合蛋白基因的啟動(dòng)子序列為Pipns。
4.權(quán)利要求2所述的載體，其中控制透明顫菌氧結(jié)合蛋白基因的終止子序列為cyclTT。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)黃青霉菌株及其在生產(chǎn)青霉素的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的菌株是產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)CGMCC No1248。本發(fā)明公開的菌株培養(yǎng)條件簡單，表達(dá)量高。本發(fā)明公開了利用上述菌株生產(chǎn)青霉素方法。
文檔編號(hào)C12N15/80GK1796537SQ200410092430
公開日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者徐平, 任志紅, 王富強(qiáng), 豐玫玫, 張佳, 戴夢(mèng), 韋春玲, 穆岷, 賈茜, 賀建功 申請(qǐng)人:華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司