專利名稱：：黃青霉酰胺的制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用產(chǎn)黃青霉No.005戶訓'c朋柳c/!，oge"腦制備黃青霉酰胺的方法，該菌株已于2007年11月29日保藏在(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號是CCTCCM207186);本發(fā)明還涉及該化合物在保護由&02損傷的SH-SY5Y細胞方面的用途。
背景技術：
：含有[2,2，2]二環(huán)二氮雜辛烷片斷的氧化吲哚生物堿已有一些文獻報道，如Baiiks，R.M.，Blanchflower,S.E.,EverettJ.R.，Manger,B.R.，andReading,C.,NovelanthelminticmetabolitesfromanA戸g/腸species;theaspergillimides.>/.Jw版of.，1997，50,840-846;Polonsky,J.,Merrien,M.A.，Prange,T.，Pascard，C.andMoreau，S..Isolationandstructure(x-rayanalysis)ofmarcfortineA，anewalkaloidfromjPe/w.d///w/wro《we々W/.GCTie附.C*o;w/m.'1980，13，601-602;Wilson,B.J.,Yang,D.T.C.andHarris,T.M.，Production,isolation,andpreliminarytoxicitystudiesofbrevianamideAfromculturesof尸ewz'c!7/z'w加Vz>7'c!'caft//m.^P//.Af/cro6/o/.，1973，26，633-635;該類化合物最主要的結(jié)構特征是有一個吲哚片斷組成的螺環(huán)片斷和一個[2,2，2]二環(huán)的二氮雜辛垸片斷。吲哚部分常有一個異戊烯基都是通過氧原子與其相連，或者是環(huán)合在吲哚的苯環(huán)片斷上。這類化合物顯示了許多生物活性，如抗寄生蟲活性，抑制腫瘤生長活性和細胞毒性等。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉(/>em'c////"/c/w^ogemw/)No.005液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后的粗提物對H202引起的神經(jīng)細胞(SH-SY5Y)損傷具有保護活性，遂對其活性成分進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個新的具有神經(jīng)細胞保護活性的黃青霉酰胺化合物(ChrysogenamideA)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一個結(jié)構獨特的具有神經(jīng)細胞保護活性的新化合物。本發(fā)明的目的還在于提供一個化合物的制備方法及其在經(jīng)細胞保護活性或抗老年癡呆癥方面的用途。本發(fā)明首次從產(chǎn)黃青霉No.005c/w;ywge""附)發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了一個新的黃青霉酰胺(ChrysogenamideA),如式I所示其結(jié)構特征是含有[2，2，2]二環(huán)二氮雜辛垸片斷的氧化吲哚生物堿上述發(fā)明中的化合物是由中藥肉蓯蓉內(nèi)生真菌產(chǎn)黃青霉No.005(Pe"&!7//"/c/y"oge""/w)的液體發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進行梯度洗脫，石油醚-丙酮3:2洗脫物，再經(jīng)反相硅膠柱層析，進一步經(jīng)HPLC，以甲醇-水80:20洗脫得式I化合物。本發(fā)明釆用MTT法測試了式I化合物拮抗H202引起的神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡活性。實驗證實，式I化合物對SH-SY5Y細胞具有保護作用。因此本發(fā)明的式I化合物可用作神經(jīng)細胞保護劑。式I化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗老年癡呆癥藥物,用于老年癡呆癥的治療。本發(fā)明的式I化合物可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵物中分離純化而得到；也可由上述優(yōu)選化合物經(jīng)本領域技術人員熟知的化學修飾方法合成獲得。需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)該類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可作為生產(chǎn)菌用于制備式I化合物。具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物1的化學結(jié)構分別是(結(jié)構式中的阿拉伯數(shù)字是化學結(jié)構中碳原子的標位)實施例1化合物1的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1發(fā)酵生產(chǎn)生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取產(chǎn)黃青霉No.005(Pe"z'cz7//M/nc/^犯ge"薩)(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號是CCTCCM207186))適量，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。取斜面培養(yǎng)4天的產(chǎn)黃青霉No.005(Pem'a7/!'柳c/iowgew廳)適量，接種到35個裝有300mL培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)麥芽糖20.0，甘露醇20.0,葡萄糖10.0，味精5.0，蛋白胨5.0，酵母膏3.0,pH7.0]的lOOOmL錐型瓶中，在24'C條件下靜止培養(yǎng)30天，獲得產(chǎn)黃青霉No.005(Pe"/ci7/i'wnc/w^ogem/附)的菌絲體和發(fā)酵液。2浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發(fā)酵液減壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發(fā)酵液的浸膏，共9.5克。3化合物的分離精制浸膏(9.5克)用氯仿-甲醇(9:l)混合溶劑溶解后，加20克200-300目硅膠(青島海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進行梯度洗脫，分為15個流份。Fr-4(26mg，石油醚-丙酮3:2洗脫物)，經(jīng)多次反相硅膠柱層析(甲醇-水)，再經(jīng)制備HPLC,以甲醇-水80:20洗脫得ChrysogenamideA(2.6mg)。ChrysogenamideA,淡黃色粉末，分子式為C28H37N302。&及13CNMR數(shù)據(jù)見表1。表1NMRDataforChrysogenamideA(ppminNo.13C1-NH10.36s——2—183.1,qC3一62.3，qC47.18d(7.3)123.6,CH56.90dd(7.3，7.3)120.8，CH66.94d(7.3)127.7,CH7—122.1，qC8—140.4，qC9一129.9,qC10a2.20ma39.9，CH210b2.09ma11—60.4qC12a3.32d(8.7)64.9，CH212b2.22ma—13—58.7,qC14a1.44ma20.7，CH214b1.15ma15a2.08m31.8,CH215b10.36s16a1.52m34.3，CH216b1.08m172.02m58.7，CH18—172.3,qC<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2抗老年癡呆活性的測試1實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的純品化合物ChrysogenamideA。準確稱取適量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供活性測試。細胞系及細胞的繼代培養(yǎng)活性測試采用SH-SY5Y細胞系。用含10%PBS的DMEM培養(yǎng)基，在37°<:通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。細胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)本發(fā)明采用MTT法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性?；罴毎€粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑為藍紫色的不溶于水的甲簪(formazan)，甲簪的多少可通過酶標儀測定其吸收度求得。由于formazan的量與活細胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)吸收度求出活細胞的數(shù)目，從而了解藥物對細胞的影響?；钚詼y試時，取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，用新鮮的DMEM培養(yǎng)基配制成密度為每毫升5><104個細胞的細胞懸液，按每孔180uL接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入藥液20uL/孔，對每個濃度均設三個復孔，另設空白對照組和模型組。細胞在37。C、5。/。C02條件下培養(yǎng)4小時后，除空白對照組外，每孔加入H2O2(終濃度200yM)損傷細胞，37。C、5。/。C02條件下培養(yǎng)4小時后，每孔加入MTT溶液20//KPBS配置，5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，仔細去上清，加入DMSO200;/l/孑L，然后用酶標儀測00570/630值。按下列公式計算被測物對細胞的保護作用<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>結(jié)果評價給藥組的成活率越高，樣品對細胞的保護作用越強。2實驗結(jié)果化合物ChrysogenamideA的神經(jīng)細胞保護活性結(jié)果見說明書附圖1:化合物ChrysogenamideA對H202引起的SH-SY5Y細胞的保護作用。3結(jié)論化合物ChrysogenamideA在低濃度下對神經(jīng)母細胞瘤細胞具有明顯的保護作用。因此,本發(fā)明的式I化合物可作為抗老年癡呆癥的治療。權利要求1.式I化合物式I2.權利要求1所述式I化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉No.005Pem'"7/z'wwc/20^oge/i"/n(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號是CCTCCM207186),獲取含有上述式I化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出式I化合物。3.權利要求2所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進行梯度洗脫，石油醚-丙酮3:2的洗脫物，再經(jīng)反相硅膠柱層析，進一步經(jīng)制備HPLC，以甲醇-水80:20洗脫得式I化合物。4.權利要求1所述的式I化合物在保護經(jīng)11202損傷的SH-SY5Y細胞中的用途。5.權利要求1所述的式I化合物在制備抗老年癡呆癥藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及黃青霉酰胺的制備方法和用途。本發(fā)明用從新鮮中藥肉蓯蓉肉質(zhì)鱗莖中分離得到的產(chǎn)黃青霉No.005Penicilliumchrysogenum生產(chǎn)出黃青霉酰胺(ChrysogenamideA)。經(jīng)實驗證實，該化合物對H₂O₂損傷的SH-SY5Y細胞具有顯著的保護作用，有望開發(fā)成為抗老年癡呆癥藥物。文檔編號C07D487/00GK101463036SQ20071030217公開日2009年6月24日申請日期2007年12月18日優(yōu)先權日2007年12月18日發(fā)明者方玉春,朱偉明,朱天驕,林貞建,顧謙群申請人:中國海洋大學