專利名稱：改進(jìn)的頭孢菌素的體內(nèi)生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)頭孢菌素的方法并且特別是生產(chǎn)7-ACA或其衍生物的方法，該方法包括以下步驟在有合適的?；鶄?cè)鏈前體或其鹽或其酯存在的條件下發(fā)酵一種產(chǎn)黃青霉菌株，因而產(chǎn)生N-?；?-ACA化合物，N-脫?；绱水a(chǎn)生的N-?；?-ACA化合物和，任選地，?；坞x氨基和/或采用適合形成頭孢菌素抗生素的側(cè)鏈取代3’乙酸基，其中產(chǎn)黃青霉菌株被含有編碼延伸酶(expandase)、羥化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化。
制備頭孢菌素的半合成途徑大多起始于發(fā)酵產(chǎn)物如青霉素G、青霉素V、頭孢菌素C，例如以K.Matsumoto，生物加工技術(shù)(Bioprocess.Techn.)，16，67-88(1993)，J.G.Shewale和H.Sivaraman，加工生物化學(xué)(ProcessBiochemistry)，1989年8月，146-154，T.A.Sayidge，工業(yè)抗生素生物技術(shù)(Ed.E.J.Vandamme)Marcel Dekker，紐約，1984，或J.G.Shewale等，ProcessBiochemistry International，1990年6月，97-103中公開的方法將所述發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的β-內(nèi)酰胺母核。獲得的β-內(nèi)酰胺母核隨后通過與一個(gè)合適的側(cè)鏈偶聯(lián)而被轉(zhuǎn)化為所需要的抗生素，這特別在EP0339751，JP53005185和CH640240中進(jìn)行了描述。通過進(jìn)行側(cè)鏈和β-內(nèi)酰胺母核的不同組合，可以獲得多種青霉素和頭孢菌素抗生素。
已知頭孢菌素母核7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(7-ADCA)和7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是生產(chǎn)用于醫(yī)藥工業(yè)的抗生素的重要中間體。
頭孢菌素C顯然是制備7-ACA以及其它治療用頭孢菌素的最重要的起始物。然而，頭孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，因此意味著需要通過利用繁瑣和昂貴的柱技術(shù)來進(jìn)行長時(shí)間和高成本的分離過程來除去產(chǎn)品中未被轉(zhuǎn)化的頭孢菌素C。另外，制備7-ACA所必需的酶促或化學(xué)裂解難以對頭孢菌素C的α-氨基己二酰側(cè)鏈起作用。
為了克服本文上述的一些缺陷，已公開了一種生產(chǎn)7-ACA的發(fā)酵方法，該方法包括發(fā)酵生產(chǎn)某些N-取代的頭孢菌素，該頭孢菌素的側(cè)鏈通過簡單的酶促或化學(xué)裂解反應(yīng)可容易地被去除。
通過一株能夠表達(dá)酶活性去乙酸基頭孢菌素合成酶(也被稱為“延伸酶”)、去乙酰基頭孢菌素C合成酶(“羥基化酶”)以及頭孢菌素C合成酶(“乙酰轉(zhuǎn)移酶”)(EP00540210)的重組產(chǎn)黃青霉菌株而實(shí)現(xiàn)了這些N-取代的頭孢菌素如己二酰7-ACA的發(fā)酵生產(chǎn)。
在利用重組產(chǎn)黃青霉菌株進(jìn)行己二酰7-ACA的體內(nèi)生產(chǎn)過程中，觀察到存在著和己二酰7-ACA相比大量的己二酰7-ACA，己二酰-7-氨基頭孢烷酸(己二酰-7-ADAC)的前體。顯然，乙酰轉(zhuǎn)移酶基因沒能以足以使己二酰-7-ADAC向己二酰-7-ACA大量轉(zhuǎn)化的量進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明公開了被設(shè)計(jì)用來獲得乙酰轉(zhuǎn)移酶高水平表達(dá)的乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)構(gòu)建體。這樣，增加了前體己二酰-7-ADAC轉(zhuǎn)化為己二酰-7-ACA的量。
描述源自產(chǎn)黃支頂孢(Acremonium chrysogenum)(cefG)的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的克隆和核苷酸序列的文獻(xiàn)公開了一個(gè)起始于乙酰轉(zhuǎn)移酶可讀框(ORF)的第一個(gè)(EP0437378；Gutierrez等，細(xì)菌學(xué)雜志.1743056-3064(1992))，或第二個(gè)(Mathison等，Curr Genet.2333-41(1992))或第三個(gè)ATG(EP0450758)的編碼序列。另外，在對不同啟動(dòng)子在產(chǎn)黃支頂孢(A.chrysogenum)中表達(dá)乙酰轉(zhuǎn)移酶的效率進(jìn)行的研究過程中，被測試的構(gòu)建體是一種含有起始于第二個(gè)ATG的乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼序列的融合構(gòu)建體(Gutierrez等，應(yīng)用微生物學(xué)生物技術(shù)48606-614(1997))。
本文以上引用的文獻(xiàn)沒有一篇公開了選擇特定cefG 0RF的起始密碼子來獲得在重組產(chǎn)黃青霉菌株中進(jìn)行乙酰轉(zhuǎn)移酶高效表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，該產(chǎn)黃青霉菌株用于生產(chǎn)7-ACA或其衍生物的發(fā)酵過程。
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)7-ACA或其衍生物的方法，該方法包括以下步驟在有合適的?；鶄?cè)鏈前體或其鹽或其酯存在的條件下，對用含有編碼延伸酶、羥基化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃青霉菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，由此產(chǎn)生N-?；?-ACA化合物，N-脫?；绱水a(chǎn)生的N-?；?-ACA化合物，和任選地，酰化游離氨基和/或采用適合形成頭孢菌素抗生素的側(cè)鏈取代3’乙酸基，其特征在于編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列源自于產(chǎn)黃支頂孢并且起始于所述核苷酸序列的第二個(gè)ATG。
通過本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，含有源自于產(chǎn)黃支頂孢的乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼序列的表達(dá)構(gòu)建體在該編碼序列起始于可讀框(ORF)的第二個(gè)ATG時(shí)的表達(dá)比起始于所述ORF的第一個(gè)或第三個(gè)ATG時(shí)的表達(dá)更高效。乙酰轉(zhuǎn)移酶更高效表達(dá)的其中一個(gè)效果是N-?；?-ADAC衍生物被更高效地轉(zhuǎn)化為N-?；?-ACA衍生物。
在本發(fā)明的方法中，轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃青霉菌株被用來表達(dá)導(dǎo)致3’-?；^孢菌素化合物產(chǎn)生的頭孢菌素生物合成途徑中的三種酶活性。
編碼所述三種酶活性的基因的合適來源是用于得到延伸酶基因cefE和羥基化酶基因cefF(有關(guān)cefE參見EP0341892和有關(guān)cefF參見EP0465189)的細(xì)菌帶小棒鏈霉菌或Nocardia lactamdurans，或用于得到雙功能延伸酶/羥基化酶基因cefEF和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cefG(有關(guān)cefEF參見EP0281391和Coque等，Mol.Gen.Genet.236453-458(1993)以及有關(guān)cefG參見EP0437378和EP0450758)的真菌產(chǎn)黃支頂孢。
根據(jù)本發(fā)明，乙酰轉(zhuǎn)移酶活性是通過從產(chǎn)黃支頂孢中獲得的cefG基因提供的。尤其是，本發(fā)明表明采用cefG ORF的第二個(gè)ATG作為起始密碼子是有利的。cefG ORF的第二個(gè)ATG作為起始密碼子的使用意味著用于本發(fā)明方法中的乙酰轉(zhuǎn)移酶具有以蛋氨酸-亮氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-絲氨酸開頭的N-端氨基酸序列。
在本發(fā)明的方法中，編碼三種酶活性延伸酶、羥基化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因可以帶有正處于計(jì)論之中的該基因本身具有的5’和3’調(diào)控序列或可以帶有與所述基因異源的調(diào)控序列。
合適的5’和3’調(diào)控序列即為在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的重組基因表達(dá)提供的啟動(dòng)子和終止子的實(shí)例在Van den Hondel等(于More Gene Manipulationsin Fungi，Eds.Bennett和Lasure，396-427(1991))中或在絲狀真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)(Kinghorn，Turner(eds.)，Blackie，Glasgow，UK，1992)中提到。優(yōu)選的啟動(dòng)子是黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子或源自于編碼ACV合成酶、異青霉素N合酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸甘油酸激酶的基因的產(chǎn)黃青霉啟動(dòng)子或者基因Y。也可以從相同的基因中獲得轉(zhuǎn)錄終止子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所提供的一種發(fā)酵生產(chǎn)7-ACA或其衍生物的方法包括采用經(jīng)表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃青霉菌株，該表達(dá)構(gòu)建體中的編碼延伸酶、羥基化酶和/或乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的基因的編碼序列被融合到與所述編碼序列異源的啟動(dòng)子序列上。所述異源啟動(dòng)子序列例如是源自于產(chǎn)黃青霉的IPNS(pcbC)啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過采用PCR技術(shù)能便利地實(shí)現(xiàn)選擇的啟動(dòng)子序列和編碼延伸酶、羥基化酶和/或乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的編碼序列的起始密碼子之間的精確融合。
產(chǎn)黃青霉宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，通常能夠通過DNA傳遞的不同手段，象PEG-Ca介導(dǎo)的原生質(zhì)體攝取、電穿孔或粒子槍技術(shù)，和隨后轉(zhuǎn)化體的篩選來完成。例如見Van den Hondel en Punt，基因和轉(zhuǎn)移以及用于絲狀真菌的載體的研制，于真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)(Peberdy，Laten，Ogden，Bennett，eds.)，劍橋大學(xué)出版社(1991)。顯性和非顯性選擇標(biāo)記的應(yīng)用已有描述(Van den Hondel，見上文)。同源(來源于產(chǎn)黃青霉)和異源(非來源于產(chǎn)黃青霉)的選擇標(biāo)記也都已有描述(Gouka等，生物技術(shù)雜志(J.Biotechnol.)20 189-200(1991))。
在轉(zhuǎn)化體的選擇過程中，同源或異源的，有或無載體序列、與非選擇性DNA物理連接的或非物理連接的不同轉(zhuǎn)化體選擇標(biāo)記的應(yīng)用在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。
只要發(fā)酵是在有合適的側(cè)鏈前體存在的條件下進(jìn)行的，轉(zhuǎn)化了的產(chǎn)黃青霉菌株的發(fā)酵培養(yǎng)可以在本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行。在這方面，合適的側(cè)鏈前體被定義為一種能產(chǎn)生經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)的頭孢篩化合物的N-?；鶄?cè)鏈的N-酰基側(cè)鏈前體，所述N-?；鶄?cè)鏈能進(jìn)行簡單的化學(xué)或酶促去除。特別是，合適的側(cè)鏈前體是二羧酸，更特別地是如式(1)所示的二羧酸HOOC-X-(CH2)n-COOH (1)其中n是至少為2的偶數(shù)，和x是(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q每一個(gè)分別是0，1，2，3或4，和A是CH＝CH-CH＝CH，CH＝CH，C≡C，CHB，C＝O，O，S，NH，氮被選擇地取代或硫被選擇性也氧化，和B是氫、鹵素、C1-3烷氧基、羥基或選擇性取代的甲基，條件是當(dāng)A是CH＝CH-CH＝CH時(shí)p＋q應(yīng)為0或1，當(dāng)A是CH＝CH或C＝C時(shí)p＋q應(yīng)為2或3或當(dāng)A是CHB，C＝O，O，S或NH時(shí)p＋q應(yīng)為3或4，或其鹽或其酯。
如式(1)的合適側(cè)鏈前體的實(shí)例是己二酸、3’-羧甲基硫代丙酸(WO95/04148)、3，3’-硫代二丙酸(WO95/04149)或如WO98/48034或WO98/48035中提供的側(cè)鏈前體。優(yōu)選的側(cè)鏈前體是己二酸或反式-β-氫化粘康酸。
通過在有合適?；鶄?cè)鏈前體例如己二酸存在的條件下進(jìn)行發(fā)酵所獲得的N-酰化7-ACA化合物，例如己二酰-7-ACA可通過采用常規(guī)的回收技術(shù)，例如下述簡單的溶劑萃取方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中高效地回收過濾培養(yǎng)液并將與水不溶混的有機(jī)溶劑加到濾液中。調(diào)節(jié)pH以便從水層中萃取頭孢菌素。pH范圍必須低于4.5；優(yōu)選地在4至1之間，更優(yōu)選地在2至1之間。這樣使頭孢菌素與存在于發(fā)酵培養(yǎng)液中的許多其它雜質(zhì)中分離。優(yōu)選使用少量有機(jī)溶劑，結(jié)果得到更濃縮的頭孢菌素溶液，因而使體積流速減小。第二個(gè)可能性是在pH為4或更低的pH下進(jìn)行全部培養(yǎng)液的萃取。優(yōu)選地是培養(yǎng)液在pH范圍為4至1的條件下用與水不混溶的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。
任何不影響頭孢菌素分子的溶劑都可以使用。合適的溶劑是，例如，乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基異丁酮、醇如丁醇等。
此后頭孢菌素在pH4至pH10之間，優(yōu)選地在pH6至pH9之間用水反萃取。終體積能再次被減小?？稍?℃至50℃的溫度下，優(yōu)選地在0℃至10℃的溫度下，進(jìn)行回收。
由于7-氨基通過合適的?；鶄?cè)鏈的存在被進(jìn)行了適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)，所以通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的N-酰化頭孢菌素衍生物能被方便地用作化學(xué)合成半合成的頭孢菌素的中間體。
或者，為了去除N-?；缂憾?，側(cè)鏈和獲得所需的7-ACA，用合適的酶處理由此獲得的N-?；^孢菌素的水溶液。
優(yōu)選地，使用固定化酶以便能重復(fù)使用酶。用于這種粒子的制備和酶的固定化的方法已在EP0222462中進(jìn)行了大量描述。水溶液的pH值是，例如pH4至pH9，在這個(gè)范圍內(nèi)頭孢菌素的降解反應(yīng)被減少到最低并且所需的酶轉(zhuǎn)化被優(yōu)化。將酶加到頭孢菌素的水溶液中同時(shí)通過例如加入無機(jī)堿如氫氧化鉀溶液或采用陽離子交換樹脂將pH維持在適當(dāng)水平。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，過濾除去固定化酶。另一種可能是，以一種固定化或流化床柱的形式應(yīng)用固定化酶，或者以溶液的形式使用酶并且通過膜過濾除去產(chǎn)物。接著，將水溶液的pH調(diào)到2和5之間的值，優(yōu)選地3和4之間。然后晶體7-ACA被濾掉。
合適的酶是，例如源自于在位置62、177、178和179的一個(gè)或多個(gè)位置上具有突變的假單胞菌SY77微生物。也可以使用來源于其它假單胞菌微生物，優(yōu)選地假單胞菌SE83的酶，選擇性地在相應(yīng)于假單胞菌SY77的62、177、178和179位置的一個(gè)或多個(gè)位置上具有突變。
脫?；材芤员炯夹g(shù)領(lǐng)域已知的化學(xué)方法進(jìn)行，例如，通過在低于10℃的溫度下加入五氯化磷并接著在室溫或低于室溫的溫度下加入醇如異丁醇來形成偕氯代亞胺側(cè)鏈的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，含有N-酰化7-ACA衍生物或脫?；蟮玫降?-ACA的水溶液可以采用合適的?；瘎┻M(jìn)行處理以便將可能存在于所述水溶液中的任何(?；?-7-ADAC轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的(?；?-7-ACA衍生物。所述的?；磻?yīng)例如能通過采用乙酸酐，例如通過US5221739中公開的方法，或采用合適的脂酶或酯酶，例如EP667396中公開的方法來完成。
在進(jìn)一步的步驟中，通過本發(fā)明方法獲得的7-ACA化合物被用作制備多種頭孢菌素抗生素的起始物，終產(chǎn)物以及中間體。通過采用公知的化學(xué)或酶促偶聯(lián)方法，7-ACA的游離氨基例如可被任何合適的側(cè)鏈所酰化，結(jié)果產(chǎn)生N-?；?-ACA的衍生物。另外，在3’位置上可能發(fā)生取代反應(yīng)。如此制備的頭孢菌素化合物的實(shí)例是頭孢氨噻、頭孢唑琳、頭孢曲松、頭孢氨呋肟、頭孢羅齊、頭孢他定和頭孢氯。
實(shí)施例1用于在產(chǎn)黃青霉中表達(dá)乙酰轉(zhuǎn)移酶的pICG1WA、pICG2WA和pICG3WA構(gòu)建體含有包括產(chǎn)黃青霉pcbC啟動(dòng)子和penDE終止子的野生型產(chǎn)黃支頂孢cefG基因的脫乙酰頭孢菌素C乙酰轉(zhuǎn)移酶(cefG)表達(dá)盒pICG1WA按照以下方法進(jìn)行構(gòu)建。cefG基因的N-末端部分，即ORF的第一個(gè)ATG的開端，是通過采用引物#1和#2(分別是SEQ ID NO1和2)的PCR反應(yīng)從產(chǎn)黃支頂孢的染色體DNA中得到的。cefG基因的C-末端部分是通過采用引物#3和#4(分別是SEQ ID NO3和4)的PCR反應(yīng)從相同的模板得到的。采用引物#1和#4以及上述片段作為模板進(jìn)行融合PCR后，產(chǎn)生了一個(gè)完整的cefG基因(這里進(jìn)一步表示為cefG1基因)，該cefG基因中缺失了內(nèi)。SfiI和HimdIII位點(diǎn)而建立了一個(gè)新MsiI位點(diǎn)。
在下一個(gè)步驟中，pcbC啟動(dòng)子的第一部分是采用引物#5和#6(分別是SEQ IDNO5和6)PCR-擴(kuò)增的，并且在采用引物#5和#4融合PCR后，被直接引入cefG1基因的前面。用PstI/NsiI消化后，一個(gè)1592bp片段被連接到一個(gè)4.3kb的pISEWA-N(以前在WO98/46772中描述的載體)的PstI/NsiI載體片段上從而產(chǎn)生青霉屬轉(zhuǎn)化載體pICG1WA。
構(gòu)建pICG2WA所需要的cefG2基因的N-末端部分，即ORF的第二個(gè)ATG的開端，來源于采用引物#5和#7(SEQ ID NO7)的PCR反應(yīng)中的pICG1WA。CefG2基因的C-末端部分來源于采用引物#8和#9(分別是SEQ ID NO8和9)的PCR反應(yīng)中的相同模板。采用引物#5和#9和上述片段作為模板進(jìn)行融合PCR后，就產(chǎn)生了完整的cefG2基因。
為了構(gòu)建pICG3WA，其中cefG基因起始于第三個(gè)ATG，采用了與所述pICG2WA的構(gòu)建相同的步驟。為了完成這一構(gòu)建，采用了引物#5/#10(分別是SEQ ID NO5/10)和#11/#9(分別是SEQ ID NO 11/9)。
進(jìn)行了內(nèi)PstI/NcoI位點(diǎn)的消化后，cefG2/cefG3融合片段被連接到pICG1WA的PstI/NcoI載體片段上，產(chǎn)生了青霉屬轉(zhuǎn)化載體pICG2WA和pICG3WA。
實(shí)施例2不同ATG起始密碼子選擇對乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)的影響不同pICGWA構(gòu)建體進(jìn)行了NotI消化后，通過EP635574中描述的Ca-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，將分離的cefG片段引進(jìn)產(chǎn)黃青霉中。
所使用的產(chǎn)黃青霉菌株預(yù)先已用源自于產(chǎn)黃支頂孢的含有雙功能延伸酶/羥基化酶編碼序列(cefEF)的表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)化是在產(chǎn)黃青霉pcbC啟動(dòng)子和penDE終止子的調(diào)控下進(jìn)行的。
所述片段用amdS共轉(zhuǎn)化(EP635574)，其能夠使產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化體在含有作為唯一氮源的乙酰胺的選擇培養(yǎng)基上生長。轉(zhuǎn)化體通過在選擇培養(yǎng)基上反復(fù)培養(yǎng)而得到純化。單個(gè)穩(wěn)定菌落被用于進(jìn)一步篩查由PCR得到的cefG基因的存在通過測定轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生己二酰-7-ACA的能力，cefG陽性菌落被用于進(jìn)一步篩查cefG的表達(dá)。
為此，轉(zhuǎn)化體被接種到如WO95/04149所述的液體培養(yǎng)基中，補(bǔ)充了0.5-3mg/ml的己二酸鈉作為制備試驗(yàn)的側(cè)鏈前體。通過HPLC和NMR對生長良好的培養(yǎng)物濾液進(jìn)行己二酰-7-ACA產(chǎn)量的分析。表1顯示的結(jié)果清楚地表明，與含有起始于第一個(gè)ATG(表示為“ATG1”)或第三個(gè)ATG(表示為“ATG3”)的cefG的轉(zhuǎn)化體相比，含有起始于ORF的第二個(gè)ATG(表示為“ATG2”)的cefG的轉(zhuǎn)化體的己二酰-7-ACA產(chǎn)量有所增加。
表1結(jié)合了起始于第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)ATG的cefG編碼序列的產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化體的己二酰-7-ACA產(chǎn)率。
序列表<110>DSM N.V.<120>改進(jìn)的頭孢菌素的體內(nèi)生產(chǎn)方法<130>乙酰轉(zhuǎn)移酶<140><141><150>EP98204469.5<151>1998-12-22<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#1；5′5′cefG1，delta SfiI<400>1tgctgccgtc cgcccaagtg gcccgtctaa ag 32<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#2；3＇5′cefG1，delta HindIII<400>2aggcgacata tgggtgtcta gaaaaataat ggt 33<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #3；5′3＇cefG1，delta HindIII<400>3gacacccata tgtcgcctca gatcgcc 27<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#4；3′3′cefG1，引入NsiI<400>4cttttggaca cggatagctt agcctggatt gtc 33<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#5； 5′通用Pipns引物<400>5ccaggctaag ctatccgtgt ccaaaagtat tc32<210>6<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #6；3′5′cefG1引物<400>6tgcattggct cgtcatgaag agcctatcac attaatgact gatcgaggaa tcc53<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #7；3′5′cefG2引物<400>7cacacaggaa gagagctcag20<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#8；5′3′cefG2引物<400>8ggacggcagc atatgggtgt ctagaaaaat aatggt 36<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #9；3′通用cefG引物<400>9ccgcagcata tgggtgtcta gaaaaataat ggtg34<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220<223人工序列的描述引物 #10；3′5′cefG3引物<400>10gacacccata tgctgcggga tagcctcac 29<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #11；5＇3′cefG3引物<400>11aggcccattc cagagtgtgc 20
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)7-ACA或其衍生物的方法，包括步驟在有合適的?；鶄?cè)鏈前體或其鹽或其酯存在的條件下，對用含有編碼延伸酶、羥基化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃青霉菌株進(jìn)行發(fā)酵，由此產(chǎn)生N-?；?-ACA化合物，N-脫?；绱水a(chǎn)生的N-酰化7-ACA化合物，和任選地，酰化游離氨基和/或采用適合形成頭孢菌素抗生素的側(cè)鏈取代3’乙酸基，其特征在于編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列源自于產(chǎn)黃支頂孢并且起始于出現(xiàn)在所述核苷酸序列中的可讀框的第二個(gè)ATC。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述側(cè)鏈前體選自由己二酸、3’-羧甲基硫代丙酸、3，3’-硫代二丙酸和反式-β-氫化粘康酸組成的一組物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述側(cè)鏈前體是己二酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)7－ACA或其衍生物的方法,包括步驟:在有合適的酰基側(cè)鏈前體或其鹽或其酯存在的條件下,對用含有編碼延伸酶、羥基化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃青霉菌株進(jìn)行發(fā)酵,由此產(chǎn)生N－酰化7－ACA化合物,N－脫?；绱水a(chǎn)生的N－酰化7－ACA化合物,和任選地,酰化游離氨基和/或采用適合形成頭孢菌素抗生素的側(cè)鏈取代3’乙酸基,其特征在于編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列源自于產(chǎn)黃支頂孢并且起始于出現(xiàn)在所述核苷酸序列中的可讀框的第二個(gè)ATG。
文檔編號C12R1/82GK1331751SQ99814782
公開日2002年1月16日 申請日期1999年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者R·A·L·博文博格, R·科克曼, E·科漢 申請人:Dsm公司