專利名稱：一種抗水稻稻曲病的青霉菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻稻曲病菌[Ustilaginoidea virens(Cke)Tak]的微生物防治，更具體涉及一株對(duì)水稻稻曲病菌具有拮抗作用的產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum), 同時(shí)還涉及該菌的制備方法，還涉及該菌的用途。該株青霉菌屬真菌，能抑制稻曲病菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，其抑菌活性物主要是分子量小于3500Da的小分子多肽或其衍生物。該菌株的發(fā)酵液對(duì)稻曲病菌具有較強(qiáng)的抑制活性，且具有較好的貯存穩(wěn)定性、酸堿和溫度耐受性，動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)表明，該菌發(fā)酵上清液對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠不具有明顯毒性，屬于微毒級(jí)，因此該菌株可以用于生產(chǎn)防治水稻稻曲病的微生物殺菌劑。
背景技術(shù)：
微生物殺菌劑是指微生物及其代謝產(chǎn)物以及由它們加工而成的具有抑制植物病害的生物活性物質(zhì)。微生物殺菌劑主要抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖、干擾生物合成和破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。微生物殺菌劑主要有農(nóng)用抗生素、細(xì)菌殺菌劑、真菌殺菌劑、病毒殺菌劑等類型(干旱環(huán)境監(jiān)測(cè)，2008，22 ) =236-242 ；生物農(nóng)藥[M],北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000 ；世界農(nóng)藥， 2001,23(1) 1-6)。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)農(nóng)作物的病蟲(chóng)害防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致農(nóng)藥污染成為世界上最嚴(yán)重的國(guó)家之一，食品中農(nóng)藥檢出率高達(dá)90%以上，嚴(yán)重危害廣大消費(fèi)者的生命健康， 同時(shí)也使我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口頻頻遭遇國(guó)外的"綠色堡壘"，嚴(yán)重影響我國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥污染成為糧食安全生產(chǎn)中急需解決的難題。相比化學(xué)農(nóng)藥，微生物農(nóng)藥具有安全、 環(huán)保、長(zhǎng)效、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，注重低毒、高效、選擇性強(qiáng)，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。水稻稻曲病是由稻曲病菌[Ustilaginoidea virens(Cke)Tak]引起的水稻穗部真菌性病害，該病害在世界水稻產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，亞洲、歐洲、美洲和非洲都有稻曲病嚴(yán)重爆發(fā)的報(bào)道(Plant Protection，1989,43 :311-314)。近年來(lái)，隨著優(yōu)質(zhì)雜交水稻的推廣和大面積種植，生產(chǎn)上常用的水稻品種普遍生育期延長(zhǎng)，對(duì)肥水要求提高，在產(chǎn)量提高的同時(shí)，也為稻曲病的發(fā)生流行創(chuàng)造了有利條件，稻曲病的發(fā)生也逐年加重，已成為水稻主產(chǎn)區(qū)影響產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。水稻稻曲病的發(fā)生和分布較為廣泛，早在1972年，在中國(guó)、日本、菲律賓、美國(guó)、巴西、澳大利亞、埃及、英國(guó)等五大洲40多個(gè)國(guó)家報(bào)道有稻曲病的發(fā)生。Chib. H.和 Sing. S (1992)報(bào)道了印度發(fā)生稻曲病的情況 Qndian J Mycol. PI. Patbol，1992，22 (3) 278-280)。20世紀(jì)50、60年代，稻曲病在我國(guó)局部稻區(qū)零星或嚴(yán)重發(fā)生，70年代以后，隨著雜交稻大面積推廣和施用氮肥水平的提高，導(dǎo)致該病較大面積的流行。1982年湖南省稻曲病嚴(yán)重發(fā)生，發(fā)病面積達(dá)666666. 7hm2，1984年遼寧省稻曲病發(fā)病面積超過(guò)20萬(wàn)hm2，占全省種植面積的43%，病穗率一般為5% -10%。2004年，湖南省中晚稻稻曲病情比較嚴(yán)重， 尤以中稻發(fā)生最為嚴(yán)重，發(fā)生面積達(dá)63. 3hm2，損失稻谷1. 37億kg，直接經(jīng)濟(jì)損失約2億元 (中國(guó)植保導(dǎo)刊，2005，25 (8) :14-15)。稻曲病不僅嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量，更嚴(yán)重的是稻曲病菌可以產(chǎn)生一類環(huán)肽類毒素——稻曲菌素，直接影響水稻的食用安全性。稻曲菌素能夠抑制真核生物微管蛋白的組裝與細(xì)胞骨架的形成，繼而抑制細(xì)胞有絲分裂，從而表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，對(duì)動(dòng)物和植物產(chǎn)生毒害作用(J Antibiot (Tokyo)，1994，47 (7) :765-773)。稻曲病菌可以產(chǎn)生至少6 種毒素(Ustiloxin A-F)，目前，這6種毒素的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被分析出來(lái)，它們都是含有13個(gè)環(huán)心和一個(gè)手性的叔-烷基-芳香基-乙醚鍵結(jié)構(gòu)的多肽(JAm Chem Soc, 2008，130 (7) 2351-2364 ；Biochemical pharmacology,1995,49(10) :1367-1372)。Nakamurak 等報(bào)道， 稻曲病谷粒對(duì)老鼠有毒性，可引起其心臟、腎臟的病變(Proceedings of the Japanese Association of Mycotoxicology, 1992,35 41-43)。據(jù)黃世文研究報(bào)道，用稻曲病粒拌飼料喂家兔、白洛克小公雞和當(dāng)?shù)啬鸽u，經(jīng)35-84天喂飼，可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡和心、肝、肺等內(nèi)臟器官病變，致死量為每克體重每日進(jìn)食稻曲病谷0. 14-0. 17粒。用帶稻曲病菌的谷糠喂豬，母豬出現(xiàn)產(chǎn)死胎、干尸胎和畸形胎等(江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，14 O) :45-51)。季宏平報(bào)道，水稻稻曲病隨著每穗稻曲球數(shù)增加，每穗實(shí)粒數(shù)、實(shí)粒重下降，而秕谷率逐漸上升，此病不僅毀掉有病子粒，而且還消耗整個(gè)病穗及植株的營(yíng)養(yǎng)，使病穗上的其它子粒不飽滿，造成水稻產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失(黑龍江收業(yè)科學(xué)，2000，(4) :18-19)。水稻稻曲病的發(fā)生和病情與多種因素有關(guān)，其中主要包括水稻品種、施肥水平、栽培技術(shù)管理技術(shù)及氣候條件等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，人們針對(duì)這些方面有計(jì)劃地采取相關(guān)措施， 以減輕稻曲病的危害。例如，鏟除菌源，將病殘?bào)w清除出稻田；選用相對(duì)抗病性強(qiáng)的水稻品種；合理密植，這樣不但能起到防病增產(chǎn)的作用，而且便于施藥施肥等栽培管理；選用恰當(dāng)?shù)氖┓始夹g(shù)，合理配方施肥，不過(guò)多使用氮肥，避免后期氮肥用量過(guò)多造成水稻貪青晚熟； 加強(qiáng)水漿管理，采取淺水勤灌。選用適量的化學(xué)農(nóng)藥是目前最主要的防治措施。目前生產(chǎn)中使用的藥劑很多，例如20%瘟曲克星、30%愛(ài)苗、30%稻病寧、35%苯乙錫酮、酮氧亞銅WP等。使用化學(xué)藥劑噴灑，用藥時(shí)間的選擇非常關(guān)鍵。根據(jù)天氣預(yù)報(bào)情況，如果破口期前后陰雨天氣多，一般于水稻破口前1 10d，在無(wú)雨的天氣，孕穗中期和孕穗末期各施1次藥劑(農(nóng)業(yè)裝備技術(shù)， 2002,106(4) :17-18) 0化學(xué)農(nóng)藥的使用在一定程度上減輕了稻曲病的病情，但由于目前還沒(méi)有研發(fā)出專一性強(qiáng)的特效化學(xué)藥劑，所以稻曲病的危害依然非常嚴(yán)重。同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境污染嚴(yán)重，易殘留在谷物中，對(duì)人類生命健康也有極大的威脅，許多國(guó)家紛紛禁止一些劇毒化學(xué)農(nóng)藥的使用，這就呼吁人們尋找更高效，更環(huán)保的防治方式。采用對(duì)稻曲病菌有拮抗作用的拮抗微生物制劑防治稻曲病，是目前的研究熱點(diǎn)之一，目前已開(kāi)發(fā)出相應(yīng)劑型應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，如紋曲寧(四川農(nóng)業(yè)科技，2006(5) :39)。紋曲寧是由枯草芽孢桿菌與井R霉素進(jìn)行復(fù)配而成的微生物農(nóng)藥，這種復(fù)配農(nóng)藥不僅能發(fā)揮井岡霉素殺菌速度快，防效穩(wěn)定地優(yōu)勢(shì)，同時(shí)保持了枯草芽孢桿菌能定植于水稻根周圍， 分泌抗生素及誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生抗病性等特點(diǎn)，達(dá)到兩藥優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、用量減少、防效提高的目的。紋曲寧殺菌劑持續(xù)期長(zhǎng)、無(wú)毒無(wú)殘留，不污染環(huán)境，是理想的農(nóng)藥品種。雖然目前使用紋曲寧防治稻曲病取得了一定的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，但紋曲寧中的井R霉素只是水稻紋枯病菌的高效殺菌劑，對(duì)稻曲病菌的防效欠佳；而枯草芽孢桿菌雖然對(duì)多種植物病原菌有抑制作用，同樣對(duì)稻曲病菌殺菌效果不強(qiáng)。鑒于生物農(nóng)藥多方面的優(yōu)點(diǎn)，迫切需要尋找更加高效的對(duì)稻曲病菌具有防治作用的生物農(nóng)藥。微生物殺菌劑主要包括農(nóng)用抗生素、活體殺菌劑以及以微生物代謝產(chǎn)物為基礎(chǔ)，由此衍生而出的化學(xué)殺菌劑。 農(nóng)用抗生素是微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在一定濃度時(shí)能夠抑制或殺滅病原微生物。目前，有許多種類的農(nóng)用抗生素已應(yīng)用于水稻、蔬菜、水果的真菌病害防治。在農(nóng)用抗生素研制方面，日本走在世界的前列。1961年，日本最先將殺稻瘟菌素S應(yīng)用于水稻稻瘟病的防治，取代了以往依靠有機(jī)汞防治稻瘟病方法。繼殺稻瘟菌素S之后，日本又相繼研發(fā)出了春雷霉素、多氧霉素、有效霉素等一系列的農(nóng)用抗菌劑。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1988年總計(jì)發(fā)現(xiàn)了約8000種抗生素，其中約43%是由日本學(xué) 者發(fā)現(xiàn)的。殺稻瘟菌素(Blasticidin S)是第一個(gè)用于防治水稻稻瘟病的微生物殺菌劑，它是一種核苷類抗生素，是鏈霉菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，能夠顯著地抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)。據(jù)報(bào)道，每公頃稻田噴灑10-30克殺稻瘟菌素，能夠有效地抑制稻瘟病害(Crop Protection Agents from Nature :Natural Products and Analogues, Cambridge, UK, Royal Soc Chem,1996, 27)。由于殺稻瘟菌素中含有芐氨基磺酸結(jié)構(gòu)，其對(duì)一些種類的農(nóng)作物，例如葡萄、西紅柿、 馬鈴薯具有一定的毒害性，但該結(jié)構(gòu)的存在與否對(duì)殺稻瘟菌素的殺菌活性并沒(méi)有影響，因此，在工業(yè)生產(chǎn)中，常制成滅瘟素的硫酯鹽和月桂酸硫酸鹽，可以在一定程度上減小其對(duì)植物的毒害性。由于殺稻瘟菌素對(duì)植物的毒性及對(duì)哺乳動(dòng)物具有一定的副作用，這種殺菌劑在市場(chǎng)上逐漸被其它產(chǎn)品，如春雷霉素所取代。春雷霉素(Kasugamycin)是一種從 Streptomyces kasugaensisa 禾口 Streptomyces kasugaspinus 白勺代Hi產(chǎn)物中分離得至Ij 的氨基-糖類化合物(Journal of Antibiot，1965，18 104)。春雷霉素可以顯著地抑制稻瘟病菌菌絲的生長(zhǎng)，在田間試驗(yàn)中，使用低于20ug/ml的有效濃度可以較好的防治稻瘟??；使用2%春雷霉素水溶液浸泡水稻種子，可以有效地較少稻瘟病的發(fā)生(Journal of Antibiot, 1965,18 115-119 ；British Crop Protection Council, 1994)。Umezawa 等報(bào)道，春雷霉素對(duì)植株無(wú)毒害作用，并且對(duì)哺乳動(dòng)物和魚(yú)類毒性也較小，因此是一種良好的抗菌劑(Journal of Antibiot，1965，18 101-103)。但是，春雷霉素最大的缺點(diǎn)是其導(dǎo)致病原菌抗性問(wèn)題非常嚴(yán)重，在稻田中使用數(shù)年后，會(huì)導(dǎo)致許多抗性菌株的產(chǎn)生(Pest Manag Sci, 2000, 56 :651-676)。為了解決這一問(wèn)題，目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中將春雷霉素與化學(xué)合成的殺菌劑制成復(fù)配試劑后再噴灑于農(nóng)田。多氧霉素(Polyoxins)是由Sti^ptomyces cacaoi var. asoensis發(fā)酵產(chǎn)生的一類肽嘧啶核苷類抗生素，對(duì)小麥白粉病、黃瓜霜霉病、甜菜褐斑病、水稻紋枯病等多種植物真菌性病害具有良好的防治效果，并且能夠刺激植物的生長(zhǎng)。多氧霉素可以選擇性抑制敏感病原真菌幾丁質(zhì)細(xì)胞壁的形成，而對(duì)不含有幾丁質(zhì)壁的生物沒(méi)有作用，因此其對(duì)植物、牲畜及魚(yú)類不表現(xiàn)出明顯的毒性(Biochem Biophys Res Commun, 1969，37 :718-722)。多氧霉素包含A-N14種不同的同系物，不同的同系物作用于特異的對(duì)象，其中的polyoxin B和polyoxin L對(duì)梨黑斑病和由鏈格孢霉菌導(dǎo)致的蘋果木栓樣斑病具有良好的防治效果，而polyoxin D常用來(lái)防治由立枯絲核菌引起的水稻紋枯病。有效霉素(Validamycin A)是由Str印tomyces hygroscopicus產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素,具有較強(qiáng)的內(nèi)吸性，已被敏感菌體細(xì)胞吸收并在其內(nèi)迅速傳導(dǎo)。有效霉素能強(qiáng)烈抑制菌體細(xì)胞內(nèi)海藻糖酶的活性，因此可導(dǎo)致某些種類菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育受到抑制，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育并不依賴海藻糖的水解，故其對(duì)人類是安全的。實(shí)驗(yàn)證明，有效霉素對(duì)立枯絲核菌具有良好的抑制作用，而不能很好抑制其它種類的真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此在生產(chǎn)中，主要用來(lái)防治水稻紋枯病(Rev Plant Protec Res，1975，8 :81_92)。有效霉素可以被土壤中假單孢菌屬的一些細(xì)菌分解為葡萄糖和井岡胺(Journal of Antibiot, 1975, 28 298-306)，同時(shí)也可以被動(dòng)物腸道內(nèi)的一些細(xì)菌分解，從而排除體外，因此有效霉素被認(rèn)為是比較理想的環(huán)境友好型殺菌劑。由于農(nóng)用抗生素在植物病菌防治方面的良好應(yīng)用前景，我國(guó)在20世紀(jì)50年代，國(guó)家開(kāi)始重視此類研究，20世紀(jì)70年代以后，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，國(guó)家的投入也大幅增長(zhǎng)，農(nóng)用抗生素的研制取得了較大的突破，目前我國(guó)研制成功并在生產(chǎn)中大規(guī)模推廣應(yīng)用的主要產(chǎn)品有井R霉素、武夷霉素、慶豐霉素、多氧霉素、農(nóng)抗120等品種。其中，商品化應(yīng)用最為成功的是井R霉素，近10年來(lái)，我國(guó)井R霉素年產(chǎn)量不斷增長(zhǎng)，對(duì)我國(guó)的水稻生產(chǎn)做出了較大的貢獻(xiàn)。井R霉素是上海農(nóng)藥所在中國(guó)井R山地區(qū)土壤中分離得到的吸水鏈霉菌井岡變禾中(S. hygroscopicus var jinggangensis yen)產(chǎn)生的一禾中氛基糖昔類抗生素，對(duì)水稻紋枯病防治效果極佳。井R霉素具有較強(qiáng)的內(nèi)吸性，能迅速被立枯絲核菌菌絲吸收并在體內(nèi)傳導(dǎo)，一般每667m2用藥3-5g可達(dá)到較好的防治效果，并且如果用藥時(shí)間恰當(dāng)，整個(gè)水稻生育期用藥一次就可達(dá)到防治效果。由于井網(wǎng)霉素的作用機(jī)制并不是殺死病原菌，而只是影響病原菌的致病力，因此，到目前為止基本沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病原菌抗性的產(chǎn)生。武夷霉素是由中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所從福建省武夷山地區(qū)分離的一株不吸水鏈霉菌武夷變種 (Streptomyces hygroscopicus var wuyiens) itlMr^^^MUM^J^MU^W^MM. 合物。對(duì)革蘭氏陰性菌和一些種類的病原真菌具有良好的抑制作用，尤其在蔬菜的真菌病害防治中效果突出。農(nóng)抗120是刺孢吸水鏈霉菌北京變種(Sti^ptomyces hygrospinosus var.beijingensis)產(chǎn)生的一類嘧啶核苷類抗菌素，這種抗菌素抗菌譜廣，對(duì)多種作物病害，如枯萎病、紋枯病、白粉病等具有很好的防效。進(jìn)入植物體內(nèi)后，可以阻礙病原菌蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到抗病的效果。同時(shí)，它可以提高作物的抗病能力和免疫能力，可以有效地減少病害的發(fā)生。隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)，農(nóng)用抗生素的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，在目前的農(nóng)用抗生素研究工作中，人們除了繼續(xù)篩選新的種類的農(nóng)用抗生素，利用物理化學(xué)方法對(duì)產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變，提高其發(fā)酵產(chǎn)量外，還利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，在分子水平上對(duì)產(chǎn)生菌進(jìn)行基因改造，提高其發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本?；铙w微生物殺菌劑的研制在過(guò)去取得了極大的進(jìn)展，被用作研究的活體微生物既有細(xì)菌，也有真菌和放線菌。由于細(xì)菌的種類多，數(shù)量大，繁殖速度快，因此細(xì)菌微生物殺菌劑的研究具有廣泛的前景。目前用于生防的細(xì)菌以芽孢桿菌為主，主要有枯草芽孢桿菌、 解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌等(Biosci Bioeng, 2000, 89(6) =515-521) 0芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，對(duì)人畜無(wú)害，不會(huì)污染環(huán)境，同時(shí)對(duì)多種植物病原菌具有抑制效果，因此是一種比較理想的生物制劑(Plant Dis Reptr, 1970, 54 446-448，Can Bot, 1984,62 :1032-1035 ；Plant Disease，1985，69 :770-775)。國(guó)內(nèi)研制成功并在生產(chǎn)中投入使用的有紋曲寧、百抗等。其中微生物農(nóng)藥百抗(10億個(gè)/g活枯草芽孢桿菌可濕性粉劑)是由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)共同研制，并獲得農(nóng)業(yè)部登記注冊(cè)， 目前已在多個(gè)省份推廣使用，主要防治水稻紋枯病、煙草黑脛病，其抑菌機(jī)制主要是營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用。從苜蓿根際周圍的分離得到的蠟質(zhì)芽孢桿菌UQ85，對(duì)苜蓿猝倒病防效良好，經(jīng)過(guò)田間試驗(yàn)證明，其對(duì)大多猝倒病和根腐病有良好的防效，現(xiàn)已被美國(guó)登記作為生物農(nóng)藥，用于種子的處理(FEMS Microbiolo Lett, 1999,171 :1_9)。用于防治植物病害的真菌制劑不多，木霉菌(Trichoderma spp.)是目前研究和應(yīng)用最廣泛的一種植病生防制劑。例如哈茨木霉(T.harzianum)對(duì)立枯病、菌核病、腐霉病、灰霉病等多種植物病害有較好的防效(European J of Plant Patholo，1999，105 177-189)。鏈孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)主要 用于防治土壤里的腐霉菌和絲核菌(J Phytopatholo，2001，149 :171-178.)。目前，此類制劑商品化生產(chǎn)的較少，其應(yīng)用有待于進(jìn)一步的研究。目前已發(fā)現(xiàn)的抗生素中，絕大部分是從放線菌中獲得的，人們對(duì)其研究也較為深入。除了利用其代謝產(chǎn)物進(jìn)行植物病害防治外，人們也推出了相應(yīng)的放線菌活體生物殺菌齊[J，例如1989年Kemica開(kāi)發(fā)的放線菌生物殺菌劑Str印tomycesgriseovirdis，商品名為 Mycostop，主要用于觀賞植物和溫室蔬菜上的鐮刀菌。20世紀(jì)末，隨看海洋生物技術(shù)及先進(jìn)米樣手段的發(fā)展，人們陸陸續(xù)續(xù)從海洋中篩選到一些具有抗菌活性的新型化合物。從我國(guó)深圳近海紅樹(shù)林上分離獲得了一株海洋真菌Hypoxylon oceanicum LL215G256，其代謝產(chǎn)物中存在一種脂肽類抗菌物質(zhì) 15G256 γ，能夠抑制真菌細(xì)胞壁的合成，并且其作用位點(diǎn)與一般脂肽不同，其對(duì)子囊菌綱、 擔(dān)子菌綱、半知菌綱的植物病原菌具有一定的抑制作用(JAntibiot (Tokyo)，1998，51 (3) 317-322)。從海洋真菌Hypoxylon oceanicum的培養(yǎng)液中分離得到了 3種新的脂肪縮酚肽LL-15G256、γ⑶、δ (9)、ε (10)，它們均具有良好的抗真菌活性(J Antibiot(Tokyo), 1998,51(3) :303-316)。從海洋真菌Fusarium sp. FH-146中分離得到含有吡喃酮環(huán)的3 個(gè)新白勺聚Sll化合物 neofusapyrone> fusapyrone> deoxyfusapyrone, X^t Botrytis cinerea, Aspergillus parasiticus 顯示較強(qiáng)的抗真菌活性(J Antibiot (Tokyo)，2006，59 (11) 704-709)。 /入 Kuril colonial ascidiumHumicola fuscoatra (Traaen) KMM4629中獲得了 1個(gè)新的屬于石竹烯系列的倍半萜烯fuscoatra A，它能夠抑制葡萄球菌 Staphylococcus aureus 禾口IfBacillus subtilis 白勺生^禾口MM (尺ussian Chemical Bulletin, International Edition,2004,53(11) :2643_2646.)。中科院沈陽(yáng)應(yīng)用與生態(tài)研究所從海洋中分離得到一株Bacillus amyloliquefaciensSH-ΒΙΟ,利用酸沉淀和半制備HPLC從中分離得到兩種抗真菌的脂肽類物質(zhì)。通過(guò)Q-TOF質(zhì)譜鑒定，兩種脂肽均為C16 fengycin A，這種抗菌物質(zhì)是一種新類型的fengcin，在多肽鏈的6號(hào)位上含有一個(gè)氨基丁酸。通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法生測(cè)顯示，這兩種脂月太對(duì) 5 禾中植物病原真菌 Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, Fusarium graminearum, F. oxysporum f. sp. vasinfectum, F. oxysporum f. sp. cucumis melo L 禾口 F. graminearum f. sp. zea mays L具有顯著的抑制效果(Bioresource Technology, 2010,101 :8822_8827)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種抗水稻稻曲病的青霉菌，該青霉菌對(duì)水稻稻曲病菌具有拮抗作用。該青霉菌能抑制稻曲病菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，其發(fā)酵液對(duì)稻曲病具有較強(qiáng)的抑制活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種抗水稻稻曲病的青霉菌AF-25在制備防治或預(yù)防水稻稻曲病的生物農(nóng)藥中的應(yīng)用，用該真菌的發(fā)酵液，能有效地抑制稻曲病菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施青霉菌屬(Penicillium)真菌KF-25是一株由本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)土壤樣品中分離、 并以稻曲病菌為拮抗對(duì)象，采用瓊脂擴(kuò)散法中的牛津杯法(Appl Microbiol Biotechnol, 2010,86 :535-543.)，經(jīng)過(guò)觀測(cè)抑菌圈而篩選出來(lái)的對(duì)水稻稻曲病菌具有明顯抑制作用的真菌菌株。根據(jù)分離該菌株的土壤樣品序列號(hào)，并加上抗真菌(Antifimgus)的英文幾簡(jiǎn)寫 AF，將該菌株命名為產(chǎn)黃青霉菌 AF-25 (Penicillium chrysogenum AF-25，CCTCC N0: M 2011309)，該菌株已保藏，保藏單位中國(guó)典型微生物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2011年9月9日，保藏編號(hào)CCTCC NO :M2011309，分類命名產(chǎn)黃青霉 AF-25PeniciIlium chrysogenum AF-25 基本的技術(shù)原理是通過(guò)彈土法，在PDA培養(yǎng)基 (馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)中分離土壤樣品中的真菌，將這些分離的真菌接種在PS(馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液)中培養(yǎng)，28°c，180rpm，恒溫振蕩培養(yǎng)96h。收集發(fā)酵液，使用濾紙過(guò)濾去除菌絲，10000rpm，4°C離心20min ；收集離心后上清液通過(guò)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，得到無(wú)菌上清液，4°C保存待用。取150 μ 1稻曲病菌分生孢子懸液均勻涂布在PSA(馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基)平板(60mm)表面，在每個(gè)平板中央輕輕放置1個(gè)無(wú)菌牛津杯(6mmX8mmX 10mm)，待牛津杯自然沉降10分鐘后，往每個(gè)牛津杯中加入200 μ 1上述所制備的無(wú)菌上清液樣品，然后將平板置入培養(yǎng)箱中，280C，黑暗培養(yǎng)7d后，測(cè)量各個(gè)樣品的抑菌圈直徑。篩選到對(duì)稻曲病菌抑制效果最好的真菌菌株AF-25。一種抗水稻稻曲病的青霉菌的制備方法，其步驟是A、稻曲病菌分離從海南省水稻田中采取患稻曲病的水稻病穗，采用厚垣孢子懸液法分離稻曲病菌。所用的培養(yǎng)基為含氯霉素(50yg/ml)的脅本哲式培養(yǎng)基(馬鈴薯 300g、蛋白胨 5g、蔗糖 15g、Ca(NO3)2 · 4H20 0. 5g、Na2HPO4 · 12H202. 0g、瓊脂 16g、蒸餾水 1000ml)。具體操作步驟用75% (質(zhì)量/體積)乙醇將稻曲球消毒5_10s，用無(wú)菌水沖洗 2-5次，然后置于離心管中加入無(wú)菌水振蕩配置成厚垣孢子懸浮液，取100 μ 1滴加在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷卻至44-46°C時(shí)，每100ml培養(yǎng)基中加入5mg氯霉素，然后倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖動(dòng)使之與孢子懸浮液混合均勻。待培養(yǎng)基凝固后置于恒溫箱中，黑暗條件下培養(yǎng)，逐日觀察分離結(jié)果。將分離的稻曲病菌接種到馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液(PS)中，28°C， ISOrpm振蕩培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)液中即可產(chǎn)生大量分生孢子。用2層紗布過(guò)濾去除菌絲，將過(guò)濾液5000rpm離心15min，沉淀物即為稻曲病菌分生孢子，使用無(wú)菌水洗滌分生孢子3遍，最終溶解在無(wú)菌水中，利用稀釋平板計(jì)數(shù)法，調(diào)節(jié)其終濃度為IO8孢子/ml，4°C保存待用。該馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液(PQ的組成為20%馬鈴薯煮汁(重量/體積)，2%蔗糖(重量/體積)， ρΗ6· 0。B、稻曲病菌拮抗菌分離與培養(yǎng)將土壤樣品碾細(xì)，大約5克樣品置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入33-37°C的PDA培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)5_7天，分離真菌單菌落。該P(yáng)DA培養(yǎng)基的組成為20%馬鈴薯煮汁(重量/體積)，2%葡萄糖(重量/體積)，ρΗ6·0。將分離的真菌菌株接種在PS (馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液)中，28°C，180rpm，恒溫振蕩培養(yǎng)96h。收集發(fā)酵液，使用濾紙過(guò)濾去除菌絲，IOOOOrpm, 4°C離心20min ；收集離心后上清液通過(guò)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，得到無(wú)菌上清液，4°C保存待用。該P(yáng)S培養(yǎng)基的組成為20%馬鈴薯煮汁(重量/體積)，2%蔗糖(重量/體積)，ρΗ6· 0。
C、稻曲病菌拮抗菌篩選取150μ 1稻曲病菌分生孢子懸液均勻涂布在 PSA(馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基)平板(60mm)表面，在每個(gè)平板中央輕輕放置1個(gè)無(wú)菌牛津杯(6mmX8mmX10mm)，待牛津杯自然沉降10分鐘后，往每個(gè)牛津杯中加入2001上述所制備的無(wú)菌上清液樣品，然后將平板置入培養(yǎng)箱中二8°C，黑暗培養(yǎng)7d后，測(cè)量各個(gè)樣品的抑菌圈直徑，篩選到對(duì)稻曲病菌抑制效果最好的真菌菌株，根據(jù)分離該菌株的土壤樣品序列號(hào)，并加上抗真菌(Antifimgus)的英文幾簡(jiǎn)寫AF，將該菌株命名為產(chǎn)黃青霉菌 AF-25 (Penicillium chrysogenum AF-25，CCTCC NO :M 2011309)。該 PSA 培養(yǎng)基組成為 20 %馬鈴薯煮汁(重量/體積)，2 %蔗糖(重量/體積)，1 · 5 %瓊脂(重量/體積)，ρΗ6· 0。 獲得了一種抗水稻稻曲病的青霉菌AF-25。一種青霉菌AF-25在制備防治或預(yù)防稻曲病生物農(nóng)藥中的應(yīng)用，其應(yīng)用基本過(guò)程是分別在PSA 培養(yǎng)基加入 2ml，Iml，0. 5ml，0. 33ml，0. 25ml，0. 2ml 青霉菌 AF-25 無(wú)菌上清液，定容至20ml，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分別制成稀釋10，20，40，60，80，100倍的平板。每個(gè)平板中央接入1片直徑為8mm的稻曲病菌菌落圓片，每種稀釋度重復(fù)3個(gè)平板，以沒(méi)有加入無(wú)菌上清液的PSA平板作為對(duì)照。將平板置于恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)，分別于3d， 4d，5d，7d測(cè)量各平板菌落直徑大小。挑取培養(yǎng)7d后無(wú)任何生長(zhǎng)的稻曲病菌菌落，轉(zhuǎn)接到未加入拮抗菌上清液的平板中培養(yǎng)5d，觀察其生長(zhǎng)狀況，判斷菌絲是否已死亡或者僅僅被抑制生長(zhǎng)(Biological Control, 2008,44 :24-31)。菌絲的生長(zhǎng)抑制率采用如下公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率=1_(處理菌落直徑D / (對(duì)照菌落直徑- X 100 %。產(chǎn)黃青霉AF-25發(fā)酵上清液的實(shí)驗(yàn)濃度分別為原液、10倍稀釋液，利用牛津杯法測(cè)定對(duì)意大利青霉(Pencillium i tali cum)，指狀青霉(Pencillium digitacum)，棉花枯萎病菌(Fusarium oxyporium f. sp. Vasinfectum)，棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae), 小麥赤霉菌(Fusarium graminearum),/K禾酉紋枯病菌(Rhizoctonia solani),古月蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)等植物病原菌的抑制作用。其中病原真菌以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為生測(cè)平板，胡蘿卜軟腐歐文氏菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行生測(cè)。發(fā)明優(yōu)點(diǎn)和效果產(chǎn)黃青霉AF-25發(fā)酵液對(duì)稻曲病菌具有較強(qiáng)的抑制活性，且具有較好的貯存穩(wěn)定性、酸堿和溫度耐受性，動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)表明，該菌發(fā)酵液對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠不具有明顯毒性，屬于微毒級(jí)，因此該菌株可以用于生產(chǎn)防治水稻稻曲病的微生物殺菌劑，從而達(dá)到有效防治水稻稻曲病，減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染，保證水稻穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的目的，因此該菌株具有良好的應(yīng)用前景。(l)KF-25發(fā)酵液對(duì)稻曲病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用在含有不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵上清液的PSA平板上，稻曲病菌菌絲的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，隨著稀釋倍數(shù)的增大，抑制菌絲生長(zhǎng)的效果越來(lái)越差，在稀釋100倍的PSA平板上，培養(yǎng)到第5天時(shí)，菌落的直徑大小與對(duì)照菌落(在不含KF-25發(fā)酵上清液的PSA平板上生長(zhǎng)的菌落)相等。在發(fā)酵上清液10倍稀釋的PSA平板上接種稻曲病菌落圓片后，一直培養(yǎng)到第7天，菌落直徑仍為8mm，說(shuō)明該菌落菌絲沒(méi)有任何生長(zhǎng)。為了判斷該平板上稻曲病菌菌絲不生長(zhǎng)的原因是因?yàn)槠渖L(zhǎng)受到抑制或者菌絲已死亡，將其轉(zhuǎn)移到不含發(fā)酵上清液的PSA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)5天培養(yǎng)后，仍未見(jiàn)菌絲的生長(zhǎng)，可初步判斷菌絲已被發(fā)酵上清液中的活性物質(zhì)殺死。
權(quán)利要求
1.一種青霉菌 AF-25，其特征在于青霉菌 Penicillium chrysogenum AF-25 CCTCCNO M 2011309。
2.權(quán)利要求1所述的一種抗水稻稻曲病的青霉菌AF-25在制備防治或預(yù)防水稻稻曲病的生物農(nóng)藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗水稻稻曲病的青霉菌及應(yīng)用，其步驟A、稻曲病菌分離采集稻曲病病穗，采用厚垣孢子懸液法分離稻曲病菌。B、稻曲病菌拮抗菌分離與培養(yǎng)土壤樣品碾細(xì)，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)分離真菌單菌落；將分離獲得的真菌菌株接種于PSA培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)。發(fā)酵液過(guò)濾除菌，得無(wú)菌上清液樣品。C、稻曲病菌拮抗菌篩選取稻曲病菌分生孢子懸液涂布在PSA平板上，于平板中放置無(wú)菌牛津杯并加入無(wú)菌上清液樣品，培養(yǎng)后獲得青霉菌。一種拮抗青霉菌AF-25在制備防治或預(yù)防水稻稻曲病的生物農(nóng)藥中的應(yīng)用。該青霉菌對(duì)水稻稻曲病菌具有拮抗作用。該青霉菌能抑制稻曲病菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，其發(fā)酵液對(duì)稻曲病具有較強(qiáng)的抑制活性。
文檔編號(hào)C12R1/80GK102344891SQ20111030220
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者劉朋明, 劉標(biāo), 吳燕, 高梅影 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所