專利名稱：涉及二酮哌嗪衍生物合成的多核苷酸和由所述多核苷酸編碼的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二酮哌嗪衍生物合成中涉及的新的分離的天然或合成的多核苷酸和由所述多核苷酸編碼的多肽、含有所述多核苷酸的載體、用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化的微生物、所述多核苷酸和所述多肽的應用、以及合成二酮哌嗪衍生物的方法，所述二酮哌嗪衍生物包含環(huán)二肽和3-及6-位被α、β不飽和氨基酸側(cè)鏈取代的二酮哌嗪衍生物。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“二酮哌嗪衍生物”意指具有在3-和6-位被氨基酸取代的二酮哌嗪環(huán)(哌嗪-2，5-二酮或2，5-二氧代哌嗪或2，5-DKP)的分子。環(huán)狀二氨基酸(環(huán)二肽或環(huán)狀二肽)這一特殊情況下，3-和6-位的取代基為氨基酸側(cè)鏈。在雙脫氫環(huán)狀二氨基酸(雙脫氫環(huán)狀二肽)這一特殊情況下，3-和6-位的取代基為α，β-不飽和氨基酸側(cè)鏈(附

圖1)。
二酮哌嗪衍生物由一個化合物家族構(gòu)成，這些化合物主要由微生物例如細菌、酵母、絲狀真菌和地衣產(chǎn)生。也已從海洋生物，例如海綿和海星分離出了其它化合物。在人類中已經(jīng)證實了這些衍生物的一個例子環(huán)(L-His-L-Pro)。
二酮哌嗪衍生物具有從簡單環(huán)二肽到復雜得多的結(jié)構(gòu)的非常多變的結(jié)構(gòu)。
簡單環(huán)二肽僅構(gòu)成二酮哌嗪衍生物中的一小部分，絕大多數(shù)二酮哌嗪衍生物具有更為復雜的結(jié)構(gòu)，其中主環(huán)和/或側(cè)鏈包含多種修飾導入基于碳的、羥基、硝基、環(huán)氧基、乙?；蚣籽趸?，和形成二硫橋或雜環(huán)。在兩個碳原子間形成雙鍵也是非常普遍的。源自海洋的特定衍生物中摻入了鹵素原子。
下表I中給出了一些摻入環(huán)二肽的氨基酸例子
表I
關(guān)于二酮哌嗪衍生物的生理作用已知得非常少。已描述，由綠膿桿菌產(chǎn)生的環(huán)(ΔAla-L-Val)可能涉及細菌間的信號交流。其它化合物被描述成涉及病原微生物毒力或與鐵結(jié)合或具有神經(jīng)生物學特性。
二酮哌嗪衍生物自發(fā)現(xiàn)以來就已被證明是有益的，其中一些具有如，例如抗細菌、抗真菌、抗病毒、免疫抑制或抗腫瘤活性的生物學特性。
下表II給出了一些具有已知生物活性的二酮哌嗪衍生物的例子表II
盡管對這些分子已經(jīng)展開了廣泛的研究，但是有關(guān)它們的合成卻所知甚少。通常已知的是，在細菌和真菌中，這些分子經(jīng)非核糖體生物合成途徑產(chǎn)生。在某些情況中，有可能顯示在分子中發(fā)生二酮哌嗪環(huán)形成，該分子已由酶經(jīng)硫酯鍵預激活，而且對于該分子由于脯氨酸殘基的存在而促成了環(huán)化反應所必需的肽鍵順式構(gòu)象。在其它情況中，已經(jīng)證明氨基酸殘基的N-烷化，特別式N-甲基化，也促成肽鍵的順式構(gòu)象。
因此，截至目前完成的所有這些研究已經(jīng)證明，構(gòu)調(diào)節(jié)前體分子的構(gòu)象的該前體分子的一級結(jié)構(gòu)是二酮哌嗪環(huán)的形成得以發(fā)生、以及導致產(chǎn)生最終的二酮哌嗪衍生物的過程的基礎(chǔ)。
然而，存在不含脯氨酸殘基或N-烷基化殘基的二酮哌嗪衍生物。為對這樣的衍生物舉例，可以提及白諾斯菌素、或環(huán)(ΔPhe-ΔLeu)、由諾爾斯鏈霉菌(Streptomyces noursei)產(chǎn)生的抗生素。已知諾爾斯鏈霉菌中存在一種酶活性，它催化產(chǎn)生白諾斯菌素的最后步驟，也即α，β-不飽和殘基的形成(Gondry等，Eur.J.Biochem.，2001，268，1712-1721)。然而，這一酶活性需要環(huán)狀形式的底物，環(huán)[L-Phe-L-Leu]，該底物不含脯氨酸殘基或任何N-烷基化殘基，而且它的合成途徑是未知的。
因此，二酮哌嗪衍生物呈現(xiàn)極高的結(jié)構(gòu)多樣性和富于變化的生物活性，這使得它們成為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的藥物的有益分子。
為此，必需能得到大量這樣的分子。
誠然，已經(jīng)描述了二酮哌嗪衍生物的化學合成途徑，但是對于大多數(shù)復雜衍生物來說，產(chǎn)量很低且該過程并非總被能產(chǎn)業(yè)化。
對二酮哌嗪衍生物，尤其是環(huán)二肽，的天然合成途徑的理解可能會使在生產(chǎn)者生物中進行合理的遺傳改良成為可能，并可以開拓通過生產(chǎn)和純化產(chǎn)量的優(yōu)化來取代或改良已有合成方法(經(jīng)化學或生物技術(shù)途徑)的前景。此外，對涉及二酮哌嗪衍生物生物合成途徑的酶的本性和/或特異性的修飾可能創(chuàng)造出具有原始分子結(jié)構(gòu)以及優(yōu)化的生物特性的新衍生物。
本發(fā)明包含在此范圍內(nèi)。
在對白諾斯菌素合成途徑的研究中，本發(fā)明人證實了一條多核苷酸(下文稱作BamH1多核苷酸(SEQ ID NO.5))，該多核苷酸包含四個開放閱讀框，各閱讀框各自編碼負責在諾爾斯鏈霉菌和異源宿主例如變青鏈霉菌中從L-苯丙氨酸和L-亮氨酸合成白諾斯菌素以及運輸白諾斯菌素各步驟的多肽(參見附圖2和3)。
本發(fā)明人已能顯示-第一個開放閱讀框orf1(albA，SEQ ID NO.1)編碼一個涉及如在Gondry等，(Eur.J.Biochem.，2001，268，1712-1721(α，β-不飽和)中所描述的環(huán)二肽氧化酶(CDO)活性的多肽(AlbA，SEQ IDNO.6)；-第二個開放閱讀框orf2(albB，SEQ ID NO.2)編碼一個被翻譯成AlbA多肽活性所需的兩個同種型(AlbB1，SEQ ID NO.7和AlbB1、SEQ ID NO.8)的多肽。基本以等量表達的這兩個AlbB同種型彼此間的區(qū)別在于由于使用兩個不同的起始密碼子而產(chǎn)生的位于AlbB1N-末端的5個附加氨基酸。對于AlbB1，去除了起始甲硫氨酸；-第三個開放閱讀框orf3(albC，SEQ ID NO.3)編碼一個與肽合成酶無相似性并能催化兩個氨基酸殘基縮合以形成環(huán)狀二肽的多肽(AlbC，SEQ ID NO.9)。例如在諾爾斯鏈霉菌中，albC催化L-苯丙氨酸與L-亮氨酸或兩個苯丙氨酸的縮合從而形成環(huán)狀二肽(L-Phe-L-Leu)，該環(huán)狀二肽是形成白諾斯菌素和環(huán)狀二肽環(huán)(L-Phe-L-Phe)所需的前體。在這種特別情況中，albC催化既非脯氨酸也非N-烷基化殘基的氨基酸殘基的環(huán)化，和-第四個開放閱讀框orf4(albD，SEQ ID NO.4)編碼一個不直接涉及導致從氨基酸形成α，β-不飽和二酮哌嗪衍生物的反應過程的多肽(AlbD，SEQ ID NO.10)，但是該多肽可能涉及所述衍生物的運輸機制。
本發(fā)明人由此表明，對于α，β-不飽和二酮哌嗪衍生物的合成，特別是對于白諾斯菌素在諾爾斯鏈霉菌中的合成來說，僅有albA、albB和albC這三個開放閱讀框是絕對必需的。
因此，本發(fā)明的主題是一種分離的天然或合成的多核苷酸，其特征在于它包含至少分別對應于序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQID NO.3的albA、albB和albC這三個開放閱讀框。
該多核苷酸編碼合成α，β-不飽和二酮哌嗪衍生物所必需的酶。
根據(jù)本發(fā)明的有利實施方式，所述多核苷酸還包含對應于序列SEQ ID NO.4的開放閱讀框albD。
該多核苷酸編碼α，β-不飽和二酮哌嗪衍生物的合成、運輸及分泌所需的酶。
根據(jù)本發(fā)明的一種特定形式，該多核苷酸對應于序列SEQ IDNO.5。該多核苷酸(BamH1多核苷酸)含albA、albB、albC和albD這四個開放閱讀框，并由此編碼α，β-不飽和二酮哌嗪衍生物的合成、運輸及分泌所需的酶。
本發(fā)明的主題還是一種分離的天然或合成的多核苷酸，其特征在于它包含分別對應于序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的三個開放閱讀框albB、albC和albD中的至少一個。
因此，包含開放閱讀框albC(SEQ ID NO.3)的多核苷酸編碼一種允許兩個可以相同或不同的氨基酸發(fā)生環(huán)化以形成環(huán)狀二肽的酶。包含開放閱讀框albC和albD(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)的多核苷酸編碼一種首先允許兩個可以相同或不同的氨基酸發(fā)生環(huán)化以形成環(huán)狀二肽、其次允許所述多肽運輸?shù)拿浮?br> 本發(fā)明的主題還是一種對應于序列SEQ ID NO.2(albB，318核苷酸)、SEQ ID NO.3(albC，720核苷酸)或SEQ ID NO.4(albD，834核苷酸)中任一序列的分離的天然或合成的多核苷酸。
本發(fā)明的主題還是如上述定義的多核苷酸的片段。術(shù)語“片段”意指任一具有至少15個核酸的序列。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可以獲自DNA文庫，特別是微生物DNA文庫，更特別是諾爾斯鏈霉菌DNA文庫。本發(fā)明的多核苷酸還可通過對諾爾斯鏈霉菌總DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)獲得。本發(fā)明的多核苷酸可通過對諾爾斯鏈霉菌總RNA進行RT-PCR獲得。
本發(fā)明的主題也是其中插入了上述任一多核苷酸的載體。因此，本發(fā)明的載體可以包含含有三個或四個分別相應于序列SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4的開放閱讀框albA、albB、albC和/或albD的多核苷酸，含有分別對應于序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的這三個開放閱讀框albB、albC或albD中至少一個的多核苷酸，對應于至少分別對應于序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的這三個開放閱讀框albB、albC或albD中至少一個的任一多核苷酸，對應于序列SEQ ID NO.5的BamH1多核苷酸，或所述多核苷酸的片段。
所用載體可以是現(xiàn)有技術(shù)中已知的任一載體。作為可以在本發(fā)明中使用的載體，值得特別提及的是質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、放線菌的整合元件、病毒或噬菌體。
所述載體還可以含有任何對于載體復制和/或由多核苷酸編碼的多肽的表達所需的調(diào)控序列(啟動子、終止位點，等)。
本發(fā)明的主題還是至少一種如上述所定義的多核苷酸、或其片段作為在生物中探測對應序列的探針或作為擴增這些序列的引物的用途。
當所述多核苷酸或所述片段用作引物時，它們還包含反義序列。
上述探針或引物的一種優(yōu)選用途是在其它生物中調(diào)查與開放閱讀框albA、albB、albC或albD的序列同源的多核苷酸序列，尤其是為了證實二酮哌嗪衍生物的新合成途徑。
本發(fā)明的主題還是一種分離的天然或合成的多肽，其特征在于它包含分別對應于多肽AlbB1、albB2、albC或AlbD的序列SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10中的至少一個序列。
本發(fā)明的主題還是一種分離的天然或合成的多肽，其特征在于它對應于序列 SEQ ID NO.7(AlbB1)、SEQ ID NO.8(AlbB2)、SEQ ID NO.9(AlbC)或SEQ ID NO.10(AlbD)中的任一序列。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明任一多核苷酸，尤其是選自序列SEQ IDNO.2(albB)、SEQ ID NO.3(albC)或SEQ ID NO.4(albD)的任一多核苷酸，編碼的多肽。
有利的是，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以分離自例如微生物(諾爾斯鏈霉菌)，或通過化學合成或生物技術(shù)途徑從本發(fā)明的多核苷酸獲得，例如，從在正常條件下不表達所述多肽的經(jīng)修飾的微生物獲得。
本發(fā)明的主題還是一種分離的多肽，其序列與如上述所定義的序列SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10中至少一個序列基本同源。
在此，當多肽的氨基酸序列與序列SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.10中至少一個的氨基酸序列表現(xiàn)出80％的相似性時，則視該多肽為具有基本同源的序列。
“多肽P與序列SEQ ID NO.7至10間80％的相似性”這一表述意指，當將兩個多肽進行比對時，P中80％的氨基酸與序列SEQ ID NO.7至10中對應的氨基酸相同或由同組氨基酸替代。
“同組氨基酸”這一表述意指具有基本相同的化學特性的氨基酸。尤其是，該術(shù)語意指具有基本相同的電荷、和/或相同的大小、和/或相同的親水性或疏水性、和/或相同的芳香結(jié)構(gòu)的氨基酸。
這樣的氨基酸組尤其包含(i)甘氨酸，丙氨酸(ii)異亮氨酸，亮氨酸，纈氨酸(iii)色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸(iv)天冬氨酸，谷氨酸(v)精氨酸，賴氨酸，組氨酸(vi)絲氨酸，蘇氨酸。
可以預想其它的取代，其中氨基酸被其它可比的但非天然的氨基酸(羥基脯氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、環(huán)己氨酸、右旋氨基酸，等)取代。
本發(fā)明的主題還是上述本發(fā)明的多核苷酸或載體用于合成與序列SEQ ID NO.7至10對應的多肽的用途。
本發(fā)明的主題還包括根據(jù)本發(fā)明的多肽單獨或組合用于(特別是體外用于)制備環(huán)二肽和/或3-及6-位被α，β不飽和氨基酸側(cè)鏈取代的二酮哌嗪衍生物(特別是白諾斯菌素)的用途。
本發(fā)明的主題還包括本發(fā)明的多肽單獨或組合用于通過修飾生物分子的結(jié)構(gòu)來修飾其藥理學活性的用途，對生物分子結(jié)構(gòu)的修飾例如使側(cè)鏈(特別是氨基酸側(cè)鏈)脫氫或環(huán)化(特別是肽分子的環(huán)化)。
本發(fā)明的主題還是經(jīng)修飾的生物系統(tǒng)，其中導入了至少一種根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或至少一個根據(jù)本發(fā)明的載體。
這樣的生物系統(tǒng)可以是任何已知的用原核細胞或真核細胞作為宿主的異源表達系統(tǒng)。例如，可以提到的是微生物，例如大腸桿菌或變青鏈霉素這樣的細菌，或動物或昆蟲細胞。
本發(fā)明的主題還是經(jīng)修飾的體外非細胞系統(tǒng)，其中導入了至少一種根據(jù)本發(fā)本發(fā)明的多核苷酸或至少一種根據(jù)本發(fā)明的載體。
本發(fā)明的主題還是至少一種根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和/或至少一種根據(jù)本發(fā)明的載體用于制備經(jīng)修飾的生物系統(tǒng)的用途，對所述系統(tǒng)來說它可能是微生物，例如大腸桿菌或變青鏈霉菌這樣的細菌，或任何已知的用原核細胞或真核細胞作為宿主的異源表達系統(tǒng)，或經(jīng)修飾的體外非細胞系統(tǒng)。
可以用已知的任何方法將根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和/或載體導入宿主經(jīng)修飾的生物系統(tǒng)，例如，轉(zhuǎn)染、感染、融合、電穿孔、微注射或其它生物射彈技術(shù)。
本發(fā)明的主題還包括如上所述的至少一種經(jīng)修飾的生物系統(tǒng)或至少一種經(jīng)修飾的體外非細胞系統(tǒng)用于制備環(huán)二肽和/或3-及6-位被α，β不飽和氨基酸側(cè)鏈取代的二酮哌嗪衍生物(特別是白諾斯菌素)的用途。
該生物系統(tǒng)適于以高產(chǎn)量合成如上述所定義的環(huán)二肽α，β-不飽和二酮哌嗪衍生物。
當經(jīng)修飾的生物系統(tǒng)為微生物時，它可選地允許將本發(fā)明的二酮哌嗪衍生物分泌至培養(yǎng)基中，從而使其更易于提取和純化。在如微生物這樣的生物系統(tǒng)中存在AlbD使由此而分泌到培養(yǎng)基中的衍生物便于提取和純化，從而構(gòu)成了對工業(yè)過程有利的步驟。
本發(fā)明的主題還是一種體外合成環(huán)二肽的方法，其特征在于(1)在適宜條件下使兩種可以相同或不同的氨基酸與AlbC(SEQ ID NO.9)接觸，和(2)純化所得的環(huán)二肽。
本發(fā)明的主題還是一種體外合成3-及6-位被α，β不飽和氨基酸側(cè)鏈取代的二酮哌嗪衍生物的方法，其特征在于(1)在適宜條件下使兩種可以相同或不同的氨基酸與AlbC(SEQ ID NO.9)接觸，和(2)使步驟(1)中獲得的環(huán)二肽與AlbA(SEQ ID NO.6)、AlbB1(SEQ ID NO.7)和AlbB2(SEQ ID NO.8)接觸，并純化所得的α，β不飽和二酮哌嗪衍生物。該方法在步驟(2)中還包含AlbD(SEQID NO.10)。該方法可以可選地在步驟(1)和步驟(2)之間包含一個純化從步驟(1)獲得的環(huán)二肽的附加步驟。
當然，該方法也可以在一個步驟內(nèi)完成，其中在適宜條件下使兩種可以相同或不同的氨基酸與AlbA(SEQ ID NO.6)、albB1(SEQ IDNO.7)、albB2(SEQ ID NO.8)和AlbC(SEQ ID NO.9)、可選的AlbD(SEQ ID NO.10)進行接觸，并純化所得的α，β-不飽和二酮哌嗪衍生物。
術(shù)語“適宜條件”優(yōu)選意指孵育以下物質(zhì)時所處的條件-多肽(AlbA、albB、albC和/或AlbD)，其濃度介于0.1nM和10μM之間，優(yōu)選介于10nM和1μM之間；-存在濃度介于0.1mM和100mM之間、優(yōu)選介于1mM和10mM之間的氨基酸，所述氨基酸可以相同或不同；-于0.1M Tris-HCl緩沖液中，pH介于6.8和8.0，溫度介于28℃和40℃，時間介于2小時至48小時之間。
本發(fā)明的主題還是一種合成環(huán)二肽的方法，其特征在于(1) 在適宜培養(yǎng)所述已選擇的生物系統(tǒng)的條件下接觸含有至少多核苷酸SEQ ID NO.3(albC，編碼AlbC)的生物系統(tǒng)，和(2) 純化所得的環(huán)二肽。該生物系統(tǒng)還可以包含多核苷酸SEQID NO.4(編碼AlbD)。
本發(fā)明的主題還是一種合成3-及6-位被α，β不飽和氨基酸側(cè)鏈取代的二酮哌嗪衍生物的方法，其特征在于(1)在適宜培養(yǎng)所述已選擇的生物系統(tǒng)的條件下接觸含有對應于序列SEQ ID NO.1-3的多核苷酸(編碼AlbA、AlbB和AlbC)的生物系統(tǒng)，和(2)純化所得的α，β不飽和二酮哌嗪衍生物。該生物系統(tǒng)還可以包含對應于SEQ ID NO.4的多核苷酸(編碼AlbD)。
將“適于培養(yǎng)所述已選擇的生物系統(tǒng)的條件”這一表述理解為意指，在培養(yǎng)所述已選擇的生物系統(tǒng)的條件(包含含有大大過量的氨基酸的培養(yǎng)基)下實施該方法。例如，如果該生物系統(tǒng)是例如大腸桿菌這樣的微生物，那么適宜的條件就是通常用來培養(yǎng)該細菌的那些條件。對于變青鏈霉菌或當生物系統(tǒng)為真核細胞時也是如此。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以相同或不同的氨基酸以介于0.1mM和100mM之間、優(yōu)選介于1mM和10mM之間的量存在。
類似地，根據(jù)本發(fā)明的方法，多肽AlbA、albB、albC和albD以介于0.1nM和10μM之間、優(yōu)選介于10nM和1μM之間的量存在。
環(huán)二肽和α，β-不飽和二酮哌嗪衍生物的純化可以直接從體內(nèi)或體外合成物中通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的液相萃取技術(shù)或沉淀、或薄層或液相層析技術(shù)，特別是反相HPLC，或其它適宜純化肽的方法完成。
可以在適宜的生物系統(tǒng)中，尤其是在例如微生物(例如大腸桿菌或變青鏈霉菌這樣的細菌)這樣的宿主、或任何已知的用原核細胞和真核細胞作為宿主的異源表達系統(tǒng)、或甚至在體外非細胞系統(tǒng)中實施本發(fā)明的方法。
除了上述方案，本發(fā)明還包含其它可以從以下描述中顯現(xiàn)的方案，“以下描述”是指實施本發(fā)明的實施例以及附圖，其中-附圖1代表二酮哌嗪環(huán)(A)和白諾斯菌素(B)的化學結(jié)構(gòu)。
-附圖2代表諾爾斯鏈霉菌的包含白諾斯菌素合成所需基因簇的基因組區(qū)域的圖表，其中orfl對應于albA，orf2對應于albB，orf3對應于albC，以及orf4對應于albD。
-附圖3表示假設(shè)的諾爾斯鏈霉菌白諾斯菌素合成途徑。
-附圖4表示所制備的用于向大腸桿菌或變青鏈霉菌中導入各種開放閱讀框(或orf)的特定質(zhì)粒構(gòu)建體。
-附圖5表示對用質(zhì)粒pSL128(A)、pUWL201(B)和pSL129(C)轉(zhuǎn)化的變青鏈霉菌的培養(yǎng)基的分析結(jié)果。
-附圖6表示對用質(zhì)粒pSL168和pSL159轉(zhuǎn)化的變青鏈霉菌、或未經(jīng)轉(zhuǎn)化的變青鏈霉菌的培養(yǎng)基的分析結(jié)果A變青鏈霉菌[pSL168]，在CDO存在下培養(yǎng)；B變青鏈霉菌[pSL168]，在CDO不存在下培養(yǎng)；C變青鏈霉菌[pSL159]，不存在或存在CDO；D在CDO存在下培養(yǎng)的變青鏈霉菌TK21。
-附圖7表示對在大腸桿菌BL21(DE3)-plysS中從多核苷酸albA-albB表達AlbA和AlbB1和AlbB2的十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分析。用考馬斯亮藍R-250染色。泳道S分子量標準，泳道1全細胞質(zhì)提取物(約10μg)，泳道2用Ni-瓊脂糖凝膠柱純化的酶級分(約10μg)。
以下實施例對本發(fā)明進行舉例說明但不限制本發(fā)明。
實施例1從諾爾斯鏈霉菌中分離本發(fā)明的多核苷酸用以PCR基因擴增為基礎(chǔ)的方法從諾爾斯鏈霉菌全基因組中分離出在諾爾斯鏈霉菌中生物合成白諾斯菌素所需的含有全部遺傳信息的多核苷酸。
-獲得環(huán)二肽氧化酶的部分肽序列根據(jù)M.Gondry等(Gondry等，2001，上述)中描述的方案，通過用Edman法對純化的環(huán)二肽氧化酶經(jīng)胰蛋白酶水解所得的多肽進行直接測序得到在諾爾斯鏈霉菌中催化環(huán)二肽環(huán)(L-Phe-L-Leu)向白諾斯菌素轉(zhuǎn)化的酶，即環(huán)二肽氧化酶(CDO)。經(jīng)15％聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍染色分離出酶級分組成后，切出一條含有分子量約為21000道爾頓的蛋白質(zhì)的凝膠帶，并將其在1ml 50mMTris-HCl緩沖液，pH 8，胰蛋白酶(相對胰蛋白酶/底物濃度＝1/50)存在下于37℃孵育20小時。之后用反相高效液相層析(HPLC)(μRPCC2/C18SC21/10柱，Pharmacia)以0％至76％乙氰的線性梯度在62分鐘內(nèi)對所得多肽進行分離(溶劑0.1％三氟乙酸；流速1ml/分鐘)。之后在已用含30％乙氰和0.1％三氟乙酸的緩沖液平衡的superdex肽PC32/30柱(Pharmacia)上進行凝膠滲透層析以純化各分離的肽。最后經(jīng)Edman法自動測序(型號477A測序儀，Applied Biosystems)和MALDI-TOF質(zhì)譜法分析所得的三種多肽。表1給出了所得的肽序列以及由其推導出的核苷酸序列。
表I肽序列 推導出的核苷酸序列
X未確定的氨基酸(R＝A或G；S＝C或G；Y＝C或T和W＝A或T)。
對對應于序列SEQ ID NO.13的多肽的試驗和理論質(zhì)量進行比較使得有可能鑒定3-位的色氨酸殘基。根據(jù)鏈霉菌中典型的密碼子使用，下劃線和粗體的序列用于表示6條有義(1f、2f和3f)和反義(1r、2r和3r)簡并寡核苷酸。由于缺少關(guān)于這些多肽各自在蛋白質(zhì)序列中的位置的信息，將這六個寡核苷酸組合用于克隆。由于所測試的PCR條件導致太大量的擴增核苷酸片段產(chǎn)生，因此開發(fā)了反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)策略。
-由RT-PCR擴增寡核苷酸片段從根據(jù)Kieser等(Practical Streptomyces Genetics.The JohnInnes Foundation Norwich，U.K.(2000))描述的方法在培養(yǎng)基5(ATCC培養(yǎng)基)中的培養(yǎng)24小時的培養(yǎng)物中提取諾爾斯鏈霉菌的總RNA。用DNase I進行附加處理以將DNA完全去除。由Sigma GenosysLtd合成簡并的寡核苷酸(有義和反義)，以及根據(jù)標準說明用TitanTMOne Tube RT-PCR試劑盒(Boehringer Mannheim)在各反應中使用1μg總RNA進行RT-PCR。反轉(zhuǎn)錄在50℃下進行30分鐘，之后的PCR條件如下初始97℃變性4分鐘，之后45循環(huán)的95℃ 1分鐘、50℃ 1分鐘和68℃ 1分鐘，和最后于68℃進行10分鐘聚合反應。反應產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，之后純化(DNA和Gel Band純化試劑盒，Pharmacia)。
用六個寡核苷酸組合進行的RT-PCR擴增出一個帶有寡核苷酸3f和2r的約400堿基對的片段。將該片段克隆進載體pGEM-T便利載體并進行測序，從而有可能確認在同一閱讀框中真正使用的寡核苷酸引物。將該核苷酸片段用作篩選在粘粒pWED1中制備的諾爾斯鏈霉菌基因組DNA文庫的探針。
-構(gòu)建諾爾斯鏈霉菌基因組DNA文庫用0.33U的BamHI對以標準程序(Kieser等，前述；J.Sambrook等，Molecular cloninga laboratory manual.Cold Spring HarborLaboratory Press.Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))從諾爾斯鏈霉菌提取的基因組DNA(2.5μg)進行部分消化，產(chǎn)生一個約35至45kb的DNA片段。通過連接將這些片段導入預先用BamHI消化并脫磷酸化的粘粒載體pWED1。在體外將連接產(chǎn)物包裝進λ噬菌體(Packagene Lambda DNA包裝系統(tǒng)，Promega)，并經(jīng)轉(zhuǎn)染導入大腸桿菌(SURE)菌株。
-篩選諾爾斯鏈霉菌基因組DNA文庫之后，由RT-PCR擴增獲得的核苷酸片段用T7 Quick Prime試劑盒(Pharmacia)通過隨機引發(fā)以[α-32P]-dCTP進行標記，并用作篩選文庫的探針。根據(jù)標準方法用菌落雜交測試了約2000個克隆(J.Sambrook等，前述)，并選擇出12個克隆。提取對應的粘粒(指pSL110至pSL121)，用BamHI消化并以RT-PCR片段為探針作DNA印跡技術(shù)分析。該探針使得有可能分離出對所有粘粒來說都相同、且存在于用BamHI消化的諾爾斯鏈霉菌基因組DNA中的約3.8kb的核苷酸片段。從粘粒pSL117中分離該片段，并將其克隆進載體pBC SK+，從而得到載體pSL122(所用載體的定義參見表II)。
實施例2對本發(fā)明多核苷酸序列的分析在ABI PRISM Genetic Analyzer(Perkin Elmer)上用DYEnamicET終止子循環(huán)試劑盒(Pharmacia)或由公司Genome Express完成對本發(fā)明多核苷酸的自動測序。用Frame(Bibb，M.J.等，Gene，30，157-166(1984))、BLAST和FASTA(Altschul，S.F.等，Nucleic AcidsRes.，25，3389-3402(1997)；Pearson，W.R.，Methods in Enzymology，183，63-98(1990))程序?qū)π蛄羞M行計算機分析并與數(shù)據(jù)庫進行比較。
用FRAME程序?qū)amHI多核苷酸(SEQ ID NO.5)所作的分析揭示了四個完整的開放閱讀框，即以相同方向轉(zhuǎn)錄的orf1至orf4(albA至albD，SEQ ID No.1至4)，和一個末端被截斷的開放閱讀框(1119bp)，即orf5(參見附圖2)。orf5的翻譯產(chǎn)物與源自藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的NADP-特異性谷氨酸脫氫酶N末端部分表現(xiàn)出高度相似性(根據(jù)BLAST程序為78％同一性和86％相似性)。
第一個開放閱讀框，orf1(albA，SEQ ID NO.1)，包含由RT-PCR擴增的片段的核苷酸序列，而且推導的肽序列確實包含最初分離的3個胰蛋白酶肽。因此，orf1產(chǎn)物對應于分離純化自諾爾斯鏈霉菌(M.Gondry等，前述)的、質(zhì)量約為21千道爾頓的酶蛋白。因此，該基于無疑涉及白諾斯菌素的生物合成，且將被稱為albA。
對albA(orf1)序列的分析表明，3個密碼子，兩個GUG和一個AUG，可被視為albA翻譯的起始密碼子，它們產(chǎn)生219、204或196個氨基酸的蛋白質(zhì)。由于存在對末端的轉(zhuǎn)錄后修飾而未能成功確定N-末端的肽序列，因此為albA(SEQ ID NO.6)選擇了最長的序列(657核苷酸)(第一個起始密碼子位于距BamHI片段末端20個核苷酸的位置，因此該BamHI片段不包含必需位于該基因更上游的啟動子區(qū))。
從albA推導的肽序列(AlbA、SEQ ID NO.6)與數(shù)據(jù)庫進行比較顯示了與來自Archaeoglobus fulgidus的NADH氧化酶最大程度的相似性(根據(jù)BLAST程序為32％同一性和52％相似性)，對保守結(jié)構(gòu)域的查詢顯示它具有一個大的硝基還原酶類型結(jié)構(gòu)域(pfam00881，151個氨基酸)。
與albA相鄰但閱讀框不同的Orf2(albB、SEQ ID NO.2)也表現(xiàn)出典型的鏈霉菌密碼子使用。根據(jù)起始密碼子AUG或GUG，考慮了orf2，albB翻譯成AlbA多肽活性所需的兩個同種型(AlbB1，SEQ ID NO.7和AlbB2，SEQ ID NO.8)?；疽缘攘勘磉_的這兩個AlbB同種型彼此間的區(qū)別在于由于使用兩個不同的起始密碼子而產(chǎn)生的位于AlbB1N-末端的5個附加氨基酸。對于AlbB1，去除了起始甲硫氨酸。
這兩種可能性與用FRAME程序?qū)π蛄羞M行分析是相容的。BLAST和FASTA程序未顯示由orf2推導的肽序列與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)有特別的同源性。
類似地，以分別推導自orf3(albC，SEQ ID NO.3)和orf4(albD，SEQ ID NO.4)的多肽序列為基礎(chǔ)進行數(shù)據(jù)庫查詢未顯示與功能已知的蛋白間的顯著同源性。orf3以ATG起始密碼子開始并編碼239個氨基酸的多肽albC(SEQ ID NO.9)，它與兩種功能未知的假定蛋白質(zhì)表現(xiàn)出具有低相似性來自結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的Rv2275(根據(jù)BLAST程序為34％同一性和53％相似性)和來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的YvmC(根據(jù)BLAST程序為29％同一性和46％相似性)。Orf4編碼277個氨基酸的蛋白質(zhì)Albe(SEQ IDNO.10)，它含有一個如同用TMHMM程序(Krogh，A.等，J.Mol.Biol.305，(2001))對其進行序列分析所示的跨膜結(jié)構(gòu)域，并與藍色鏈霉菌的一個功能未知的跨膜蛋白表現(xiàn)出弱同源性(根據(jù)BLAST程序為54％同一性和67％相似性)。
實施例3多核苷酸albA、albB、albC和albD的克隆和表達載體的構(gòu)建根據(jù)Sambrook等(前述)和Kieser等(前述)描述的標準程序完成提取和制備DNA、轉(zhuǎn)化大腸桿菌和變青鏈霉菌TK21菌株、以及制備原生質(zhì)體的方法。
表II給出了所制備的用于操作作為本發(fā)明主題的多核苷酸的所有質(zhì)粒和粘粒載體(也參見附圖4)。
表II所述的菌株和載體
pSL117是含諾爾斯鏈霉菌基因組DNA文庫的粘粒。
pSL122包含被克隆進克隆載體pBC SK+的、源自諾爾斯鏈霉菌的3.8kb BamHI多核苷酸(SEQ ID NO.5)，該多核苷酸是本發(fā)明一個主題。經(jīng)ApaI或EcoRI消化pSL122和再連接分別構(gòu)建了pSL127和pSL145。
BamHI多核苷酸還被以適于將所有基因置于ermE*啟動子控制下的方向(pSL128)或以相反方向(pSL129)克隆進了大腸桿菌/鏈霉菌穿梭載體pUWL201。
兩步構(gòu)建了pSL142和pSL144先用EcoRI和Klenow酶、或NdeI和Klenow酶消化pSL122，之后將這些片段與已用HindIII-Klenow消化的Ωaac盒連接從而產(chǎn)生質(zhì)粒pSL138和pSL140。之后將這些質(zhì)粒用Asp718、Klenow和BamHI消化，首先將所得的包含orfl(albA，SEQID NO.1)、orf2(albB，SEQ ID NO.2)和Ωaac盒的片段，以及其次將orf1至orf4(albA至albD)和Ωaac盒克隆進已用XbaI-Klenow-BamHI消化過的載體pUWL201。
用下列引物PCR擴增orf3(albC，SEQ ID NO.3)、orf4(albD，SEQ ID NO.4)和(orf3+orf4)對orf3sylv24(SEQ ID N°20)5′-CGGCTGCAGGAGAAGGGAGCGGACATATGCTTGCAGGCTTAGTTCCC-3′，(PstI位點有下劃線)；sylv22(SEQ ID N°21)5′-CGGTCCCGTGGATCCAAGCTTCTAGGCCGCGTCGGCCAGCTC-3′，(BamHI位點有下劃線)；對orf4sylv19(SEQ ID N°22)5′-GAGCGGGATCCTGCAGTGTCATGGGGAGGACAGGAC-3′，(PstI位點有下劃線)；sylv18(SEQ ID N°23)5′-CGATCACGTGGATCCAAGCTTGCCAATCCTGTACGCGATTT-3′，(BamHI位點有下劃線)；對(orf3+orf4)sylv24和sylv18。
僅由37個核苷酸分離orf2和orf3，sylv24中包含了一個合成的核糖體結(jié)合位點以確保orf3的正確翻譯。之后將PCR擴增的片段克隆進載體pGEM-Teasy(Promega)，以形成pSL165、pSL157和pSL166。之后將從這三個質(zhì)粒得到的PstI-BamHI片段克隆進已用PstI-BamHI消化的載體pUWL201，以形成pSL168、pSL159和pSL167。
實施例4在導入了BamHI多核苷酸(SEQ ID NO.5)的轉(zhuǎn)化異源宿主變青鏈霉菌中生產(chǎn)二酮哌嗪衍生物環(huán)(ΔPhe-ΔLeu)(白諾斯菌素)
根據(jù)Sambrook等(前述)和Kieser等(前述)描述的標準過程，用pSL128(含有BamHI多核苷酸(SEQ ID NO.5))、pSL129或pUWL201(對照)轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌TK21原生質(zhì)體。在28℃至30℃間的溫度下，將這三個菌株在M5培養(yǎng)基(ATCC培養(yǎng)基)中培養(yǎng)三天，該M5培養(yǎng)基是一種含有大大過量氨基酸的豐富培養(yǎng)基。在下列條件下用反相HPLC分析這三個轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)物上清液過濾培養(yǎng)物上清液(500μl)(ultrafree-MC 10 kDa，Millipore)并直接注入HPLC(Vydac C18柱(4.6×250mm)流速1ml/分鐘；洗脫在0.1％三氟乙酸中0至45％乙氰的線性梯度，45分鐘內(nèi))。用多波長探測器監(jiān)測200和600nm間的洗脫。
在變青鏈霉菌[pSL128]中檢測到了兩種立體異構(gòu)形式的白諾斯菌素的生產(chǎn)(出現(xiàn)在38.3分鐘和40.5分鐘的兩個峰；λmax＝318nm；m＝256.4Da)(附圖5A)。
在對照菌株變青鏈霉菌[pUWL201]和變青鏈霉菌[pSL129](附圖5B和5C)中，未檢測到白諾斯菌素的生產(chǎn)。
來自諾爾斯鏈霉菌的BamHI多核苷酸(SEQ ID NO.5)包含白諾斯菌素生產(chǎn)的遺傳信息。
實施例5用經(jīng)多核苷酸albA和albB插入轉(zhuǎn)化的異源宿主，大腸桿菌，將環(huán)(L-Trp-L-Trp)向環(huán)(ΔTrp-ΔTrp)的轉(zhuǎn)化在培養(yǎng)皿中可視化，以此證明多核苷酸albA和albB的功能。
為了直接在分離的克隆上探測由環(huán)二肽向雙脫氫環(huán)二肽的轉(zhuǎn)化，開發(fā)了一種在培養(yǎng)皿中的快速測試。該測試是以在溶液中無色的環(huán)二肽環(huán)(L-Trp-L-Trp)向黃色的不溶產(chǎn)物環(huán)(ΔTrp-ΔTrp)(λmax＝367nm和450nm)的轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的，它使得表現(xiàn)CDO活性的克隆呈現(xiàn)亮黃色。
直接在含有0.5mM環(huán){L-Trp-L-Trp}的LB培養(yǎng)基的平皿中測試已用根據(jù)實施例3詳細說明的程序制備的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。
37℃下培養(yǎng)16小時后，大腸桿菌[pSL122](包含BamHI多核苷酸)和大腸桿菌[pSL145](包含帶有orf3至orf5缺失的BamHI片段)菌株表現(xiàn)強黃色染色，而大腸桿菌[pBC SK+](包含完整的克隆載體)和大腸桿菌[pSL127](包含帶有orf2至orf5缺失的BamHI片段)不被染色。
結(jié)果證實，orf1(albA，SEQ ID NO.1)和orf2(albB，SEQ ID NO.2)這兩個基因涉及與白諾斯菌素生產(chǎn)相關(guān)的環(huán)二肽氧化酶活性。
實施例6環(huán)二肽氧化酶(CDO)酶活性在導入了orf1和orf2(albA和albB，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)的轉(zhuǎn)化異源宿主變青鏈霉菌中的表達。
在實施例4中所述的條件下培養(yǎng)經(jīng)含BamHI多核苷酸的質(zhì)粒pSL142轉(zhuǎn)化的變青鏈霉菌TK21菌株，該BamHI多核苷酸中刪除了orf3(albC，SEQ ID NO.3)、orf4(albD，SEQ ID NO.4)和orf5，對該菌株上清液所作的HPLC分析證實未出現(xiàn)白諾斯菌素的生產(chǎn)，并由此表明orf3和/或orf4在二酮哌嗪衍生物生中的相關(guān)性產(chǎn)。
然而，在Gondry等(前述)描述的標準條件下向上清液中加入環(huán)(L-Phe-L-Leu)，明顯導致白諾斯菌素的產(chǎn)生。這暗示著orf3和/或orf4在環(huán)二肽環(huán)(L-Phe-L-Leu)生物合成中的相關(guān)性。
實施例7證明環(huán)(L-Phe-L-Leu)和環(huán)(L-Phe-L-Phe)在經(jīng)orf3(albC，SEQ ID NO.3)的導入而轉(zhuǎn)化的異源宿主變青鏈霉菌中的體內(nèi)生產(chǎn)。
為確認實施例6中所描述的結(jié)果，將orf3(albC)和orf4(albD)分別克隆進穿梭質(zhì)粒pUWL201而分別產(chǎn)生pSL168(orf3)和pSL159(orf4)，根據(jù)Sambrook等(前述)和Kieser等(前述)描述的標準方法將它們導入變青鏈霉菌TK21。
變青鏈霉菌[pSL168]和變青鏈霉菌[pSL159]在實施例4中所述的條件下培養(yǎng)后，在實施例4中所述的標準條件下對其培養(yǎng)物上清液作HPLC分析，以證實環(huán)二肽環(huán)(L-Phe-L-Leu)的生產(chǎn)。由于該化合物的低摩爾吸收系數(shù)(254nm處εmol≈100M-1cm-1)和培養(yǎng)基的復雜性使得難以直接檢測該化合物，因此通過加入已根據(jù)Gondry等(前述)描述的方法純化的CDO酶在將環(huán)二肽轉(zhuǎn)化為白諾斯菌素(環(huán)(ΔPhe-ΔLeu)，318nm處εmol＝25120M-1.cm-1)后進行證實。
過濾培養(yǎng)物上清，之后與4.1×10-3酶單位的純化CDO于30℃孵育10至15小時。比較與CDO或未與CDO孵育的培養(yǎng)物上清液的HPLC分析。用質(zhì)譜法(Quattro II，Micromass)測定所產(chǎn)生的代謝物的分子量。
結(jié)果示于附圖6在與CDO孵育的變青鏈霉菌[pSL168]培養(yǎng)物上清液中檢測到，白諾斯菌素(環(huán)(ΔPhe-ΔLeu))(峰值出現(xiàn)在40.5分鐘；λmax＝318nm；m＝256.4Da)和環(huán)(ΔPhe-ΔPhe)(峰值出現(xiàn)在44.1分鐘；λmax＝338nm；m＝290.3)(圖版A)；未檢測到代謝物的-不含CDO時的變青鏈霉菌[psL168]培養(yǎng)物上清液(圖版B)；-含或不含CDO的變青鏈霉菌[pSL159]培養(yǎng)物上清液(圖版C)；-與CDO孵育的變青鏈霉菌TK21的培養(yǎng)物上清液(圖版D)。
該結(jié)果清楚地證實了orf3(albC)涉及白諾斯菌素的前體分子環(huán)二肽環(huán)(L-Phe-L-Leu)、和第二個代謝產(chǎn)物環(huán)(ΔPhe-ΔPhe)的前體分子環(huán)(l-Phe-L-Phe)最初一同在諾爾斯鏈霉菌中生產(chǎn)(Khokhlov A.S.等，Tetrahedron Lett.，27，1881(1963))。
實施例8證明環(huán)(L-Phe-L-Leu)和環(huán)(L-Phe-L-Phe)在經(jīng)多核苷酸orf3-orf4(albC-albD，SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4)的導入而轉(zhuǎn)化的異源宿主變青鏈霉菌中的體內(nèi)生產(chǎn)。
根據(jù)對實施例7的修改，將多核苷酸orf3-orf4(albC-albD)克隆進穿梭質(zhì)粒pUWL201，并根據(jù)Sambrook等(前述)和Kieser等(前述)描述的標準方法將所得的質(zhì)粒pSL167導變青鏈霉菌TK21。
對經(jīng)與實施例7所述相同的方式處理的培養(yǎng)物上清液所作的HPLC分析表明，在存在CDO時培養(yǎng)的變青鏈霉菌[pSL167]的上清液中檢測到了白諾斯菌素(環(huán)(ΔPhe-ΔLeu))和環(huán)(ΔPhe-ΔPhe)，在沒有CDO的變青鏈霉菌[pSL167]的培養(yǎng)物上清液中未檢測到代謝物，在存在CDO時培養(yǎng)的變青鏈霉菌TK21的培養(yǎng)物上清液中也沒有檢測到代謝物。
這些結(jié)果證實，在變青鏈霉菌中如同在諾爾斯鏈霉菌中，orf5基因的產(chǎn)物不直接參與白諾斯菌素的合成，而orf4(albC)對于生產(chǎn)前體環(huán)二肽環(huán)(L-Phe-L-Leu)和環(huán)(L-Phe-L-Phe)時必需且充分的。
實施例9AlbA和AlbB從多核苷酸albA-albB(SEQ ID NO.1-SEQID NO.2)的過表達用含有N-末端和C-末端聚組氨酸序列(His標簽)的載體pET-28a(+)構(gòu)建一個含有多核苷酸albA-albB的表達載體，以便于純化重組蛋白。選擇最短的albA序列，它編碼196個氨基酸殘基的多肽。用設(shè)計成含有NdeI(有義)和XhoI(反義)克隆位點的寡核苷酸引物PCR擴增該多核苷酸。
PCR條件如下94℃初始變性4分鐘，之后進行10個循環(huán)94℃1分鐘、45℃ 1分鐘和72℃ 1.5分鐘，之后20個循環(huán)的94℃ 1分鐘、50℃ 1分鐘和72℃ 1.5分鐘，以及最后在72℃下進行10分鐘的聚合反應。用NdeI和XhoI消化反應產(chǎn)物，并將片段亞克隆進載體pET-28a以得到pSL150。用DYEnamic ET終止子循環(huán)試劑盒(AmershamPharmacia Biotech)經(jīng)自動測序(ABI PRISM Genetic analyzer，Perkin Elmer)核實插入序列。
使用了標準表達條件-生長溫度20℃，-表達的誘導0.6mM IPTG，-誘導時間16小時。
將pSL150導入大腸桿菌BL21(DE3)-plysS。菌株于20℃培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基直至吸收為0.6，之后誘導表達。之后于4℃在4190g下離心培養(yǎng)物15分鐘。之后將細胞重懸于抽提緩沖液(100mMTris-HCl，pH 8.0，1μM膦酰二肽，1mM PMSF和5％丙三醇)，并用Eaton press研磨。30℃下在benzonase(25U/ml)存在下孵育蛋白質(zhì)提取物10分鐘，之后于4℃在11300g離心15分鐘。根據(jù)Gondry等(前述)描述的標準檢測方法測定酶活性。將一個單位的酶活性定義為，每分鐘催化產(chǎn)生1μmol產(chǎn)物的酶量，且特異酶活性以每毫克蛋白質(zhì)的酶單位表示。親和層析(柱螯合了HP(1ml)的HiTrap，Amersham Pharmacia Biotech；Ni2+離子平衡于含有0.5M NaCl和10mM咪唑、pH為8.0的100mM Tris-HCl緩沖液中；洗脫35分鐘內(nèi)在0.3至1M咪唑梯度中；流速1ml/min)純化后，酶提取物的特異酶活性提高了50倍(As＝2U/mg)。
對大腸桿菌[pSL150]的純化級分所作的十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)(12％)分析證實AlbA和AlbB以非化學計量比例同時出現(xiàn)，并證實AlbB表達為兩個同種型(SDS-PAGE中的兩個條帶)。用質(zhì)譜法對純化的AlbB所作的分析和對多肽序列的N-末端測序顯示，這兩個同種型對應于源自其序列中鑒定的兩個起始密碼子的產(chǎn)物AlbB1和AlbB2(參見上述)。
實施例10由重組AlbA-AlbB對環(huán)(L-Phe-L-His)和環(huán)(L-Phe-L-Leu)的體外轉(zhuǎn)化在Gondry等(前述)描述的標準條件下孵育根據(jù)實施例9中描述的方法純化的酶制品，催化環(huán)肽向單脫氫和雙脫氫環(huán)二肽的轉(zhuǎn)化。
于30℃在環(huán)(L-Phe-L-His)底物存在下孵育純化的酶制品72小時。反應產(chǎn)物在實施例4中描述的條件下作反相HPLC分析，并根據(jù)它們由質(zhì)譜分析確定的光譜特征和分子量進行鑒定。反應產(chǎn)物如下-源自環(huán)(L-Phe-L-His)環(huán)(ΔPhe-L-His)(λmax＝297nm和m＝282Da)和環(huán)(ΔPhe-Δ-His)(λmax＝338nm和m＝280Da)，-源自環(huán)(L-Phe-L-Leu)環(huán)(ΔPhe-L-Leu)(λmax＝297nm和m＝258Da)和環(huán)(ΔPhe-Δ-Leu)(λmax＝316nm和m＝256Da)。
這些結(jié)果證實，由將多核苷酸albA-albB克隆進表達載體、并將該表達載體導入異源宿主而得到的酶制品在體外催化環(huán)二肽向α，β-脫氫的二酮哌嗪衍生物的轉(zhuǎn)化。
序列表<110>Commissariat à l′Energie AtomiqueCentre National de la Recherche ScientifiqueGONDRY MurielGENET RogerLAUTRU SylviePERNODET Jean-Luc<120>涉及二酮哌嗪衍生物合成的多核苷酸和由所述多核苷酸編碼的多肽<130>CGA263/83FR<140>
<141>
<160> 23<170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 657<212> ADN<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 1gtgaggcgcc acccatcgca ttcgccgtac cgcggcgggt gtgaggtgcg cccaaaaaga 60aggggattga tgttagctca cagttcatct gaatcgccgc cggaatcctt gccggacgcg 120tggacggtcc tcaaaacccg taccgccgtc cgcaattacg cgaaagagcc ggtcgacgac 180gcgctgatcg agcagctgtt ggaggccatg ctcgccgcgc cgaccgcctc caaccggcag 240gcgtggtcgt tcatggtggt gcgcaggccc gccgcggtcc gccggctgcg cgcgttctcg 300cccggggtgc tgggaacccc cgccttcttc gtcgtggcct gcgtcgaccg cagtctgacc 360gacaacctct ccccgaagct ctcgcagaag atctacgaca ccagcaagct ctgtgtcgcc 420atggcggtgg agaacctgct gctcgcggcg cacgcggccg gcctgggcgg atgcccggtg 480ggcagcttca ggtccgacat cgtcaccagc atgctcggta tcccggaaca catcgagccg 540atgctcgtgg tcccgatcgg ccgtcccgcg acagccctcg tcccctccca gcgccgcgcc 600aagaatgagg tcgtcaacta tgaatcctgg ggaaaccgtg ctgccgcccc aactgcg657<210> 2<211> 318<212> ADN<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 2atgaatcctg gggaaaccgt gctgccgccc caactgcgtg aggagatcgc gctcctcgcc 60gtctatctgc tcagcagcgg ccgcggactc ctggaggagc cggccgacta cggaatttac 120cgctgtaccg acggggcccg tcgggcgctc caactcctcg acgaacacgg cgggagcacg 180gcacggctga ccgccgtccg cgagcgtctc gacgaggtca tgttcgcgcc gatgggcgag 240gaccgggaca tgggcgcgat tctggacgac ctgtgtcgcc aaatggcaga cgctcttccg 300gaaattgaaa ccccctga 318
<210> 3<211> 720<212> ADN<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 3atgcttgcag gcttagttcc cgcgccggac cacggaatgc gggaagaaat acttggcgac 60cgcagccgat tgatccggca acgcggtgag cacgccctca tcggaatcag tgcgggcaac 120agttatttca gccagaagaa caccgtcatg ctgctgcaat gggccgggca gcgtttcgag 180cgcaccgatg tcgtctatgt cgacacccac atcgacgaga tgctgatcgc cgacggccgc 240agcgcgcagg aggccgagcg gtcggtcaaa cgcacgctca aggatctgcg gcgcagactc 300cggcgctcgc tggagagcgt gggcgaccac gccgagcggt tccgtgtccg gtccctgtcc 360gagctccagg agacccctga gtaccgggcc gtacgcgagc gcaccgaccg ggccttcgag 420gaggacgccg aattcgccac cgcctgcgag gacatggtgc gggccgtggt gatgaaccgg 480cccggtgacg gcgtcggcat ctccgcggaa cacctgcggg ccggtctgaa ctacgtgctg 540gccgaggccc cgctcttcgc ggactcgccc ggagtcttct ccgtcccctc ctcggtgctc 600tgctaccaca tcgacacccc gatcacggcg ttcctgtccc ggcgcgagac cggtttccgg 660gcggccgagg gacaggcgta cgtcgtcgtc aggccccagg agctggccga cgcggcctag 720<210> 4<211> 834<212> ADN<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 4atgtcatggg gaggacagga cacttgctca tggtgcggaa cggggcccct cggcgaagct 60gaagacgtag gaagacagca cacgtcgcac gccgggggac ccgtcatgac tcaagccgcc 120accgtcaccg ccaccacgag ccagggcagg gcactcctgc ggagcctgac gccgctgttc 180gtggacgccg cgatcccgct cggctcgtac ttcctcctcg ccgagggctt cggcatgagc 240acggtcgccg cgctggcctg gagcagcgtg gtcccggcgc tgcgcacgat ctggggcctg 300gtccgggagc ggacggtcaa cggcctcgcg ctgctgatcc tcgtcgtcaa cgtggtgggg 360ctggcgacga gcaccctgac cggcgatgcc cggctgatga tggccaagga cagcggcgtc 420agcagcgtcg tcgggatcgc gatcctgctc tcggtgcgcg gccggcgccc gctgatgacc 480gccggactcc ggccctgggt gaccaaggga agcccggagg ggaacgccgc atgggaccgg 540ctgtgggcgc gcagcgcgcg gttccggcaa ctggagcggc gattctcgac ggtctggggg 600agcgccctgc tgatcgagtg cgtggtcaag gtcgtcggtg cgtacgtcct gccggtgcac 660accatggtgt ggctgggcac ggtgctgacg gtggtggcga tcctgctggc catggtggtc 720gcgggcggcg gcagcgccga gccgatggag cggatggtca aggccgaggt cggggccgcc 780ggcgaggccg ccacggcggg gaacgccgag ccggcgccgg ccgccgcggc ctga 834<210> 5<211> 3839<212> ADN<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 5ggatccgtcc cgacgggcgg gaaccggtga ggcgccaccc atcgcattcg ccgtaccgcg 60gcgggtgtga ggtgcgccca aaaagaaggg gattgatgtt agctcacagt tcatctgaat 120cgccgccgga atccttgccg gacgcgtgga cggtcctcaa aacccgtacc gccgtccgca 180attacgcgaa agagccggtc gacgacgcgc tgatcgagca gctgttggag gccatgctcg 240ccgcgccgac cgcctccaac cggcaggcgt ggtcgttcat ggtggtgcgc aggcccgccg 300cggtccgccg gctgcgcgcg ttctcgcccg gggtgctggg aacccccgcc ttcttcgtcg 360tggcctgcgt cgaccgcagt ctgaccgaca acctctcccc gaagctctcg cagaagatct 420acgacaccag caagctctgt gtcgccatgg cggtggagaa cctgctgctc gcggcgcacg 480
cggccggcct gggcggatgc ccggtgggca gcttcaggtc cgacatcgtc accagcatgc 540tcggtatccc ggaacacatc gagccgatgc tcgtggtccc gatcggccgt cccgcgacag 600ccctcgtccc ctcccagcgc cgcgccaaga atgaggtcgt caactatgaa tcctggggaa 660accgtgctgc cgccccaact gcgtgaggag atcgcgctcc tcgccgtcta tctgctcagc 720agcggccgcg gactcctgga ggagccggcc gactacggaa tttaccgctg taccgacggg 780gcccgtcggg cgctccaact cctcgacgaa cacggcggga gcacggcacg gctgaccgcc 840gtccgcgagc gtctcgacga ggtcatgttc gcgccgatgg gcgaggaccg ggacatgggc 900gcgattctgg acgacctgtg tcgccaaatg gcagacgctc ttccggaaat tgaaaccccc 960tgacggctgt ccggggcaac cccaaaagga cttcttagca tgcttgcagg cttagttccc 1020gcgccggacc acggaatgcg ggaagaaata cttggcgacc gcagccgatt gatccggcaa 1080cgcggtgagc acgccctcat cggaatcagt gcgggcaaca gttatttcag ccagaagaac 1140accgtcatgc tgctgcaatg ggccgggcag cgtttcgagc gcaccgatgt cgtctatgtc 1200gacacccaca tcgacgagat gctgatcgcc gacggccgca gcgcgcagga ggccgagcgg 1260tcggtcaaac gcacgctcaa ggatctgcgg cgcagactcc ggcgctcgct ggagagcgtg 1320ggcgaccacg ccgagcggtt ccgtgtccgg tccctgtccg agctccagga gacccctgag 1380taccgggccg tacgcgagcg caccgaccgg gccttcgagg aggacgccga attcgccacc 1440gcctgcgagg acatggtgcg ggccgtggtg atgaaccggc ccggtgacgg cgtcggcatc 1500tccgcggaac acctgcgggc cggtctgaac tacgtgctgg ccgaggcccc gctcttcgcg 1560gactcgcccg gagtcttctc cgtcccctcc tcggtgctct gctaccacat cgacaccccg 1620atcacggcgt tcctgtcccg gcgcgagacc ggtttccggg cggccgaggg acaggcgtac 1680gtcgtcgtca ggccccagga gctggccgac gcggcctagt tgggggcgtc cgcgggcgga 1740cctgcctccc cacccgctcc cggtgccggc gccgggcatg acaaatgtca tggggaggac 1800aggacacttg ctcatggtgc ggaacggggc ccctcggcga agctgaagac gtaggaagac 1860agcacacgtc gcacgccggg ggacccgtca tgactcaagc cgccaccgtc accgccacca 1920cgagccaggg cagggcactc ctgcggagcc tgacgccgct gttcgtggac gccgcgatcc 1980cgctcggctc gtacttcctc ctcgccgagg gcttcggcat gagcacggtc gccgcgctgg 2040cctggagcag cgtggtcccg gcgctgcgca cgatctgggg cctggtccgg gagcggacgg 2100tcaacggcct cgcgctgctg atcctcgtcg tcaacgtggt ggggctggcg acgagcaccc 2160tgaccggcga tgcccggctg atgatggcca aggacagcgg cgtcagcagc gtcgtcggga 2220tcgcgatcct gctctcggtg cgcggccggc gcccgctgat gaccgccgga ctccggccct 2280gggtgaccaa gggaagcccg gaggggaacg ccgcatggga ccggctgtgg gcgcgcagcg 2340cgcggttccg gcaactggag cggcgattct cgacggtctg ggggagcgcc ctgctgatcg 2400agtgcgtggt caaggtcgtc ggtgcgtacg tcctgccggt gcacaccatg gtgtggctgg 2460gcacggtgct gacggtggtg gcgatcctgc tggccatggt ggtcgcgggc ggcggcagcg 2520ccgagccgat ggagcggatg gtcaaggccg aggtcggggc cgccggcgag gccgccacgg 2580cggggaacgc cgagccggcg ccggccgccg cggcctgaga ccgcgcggcg ggggagttgg 2640ggaaatcgcg tacaggattg gcgcgtcgag cacccccgcc ctcgataggg cgggcccccg 2700gcgcatatgg tcggcgatgc gacgggacat cggagccccg cgtcgacggt tcaacggcga 2760tccggacggc acgcggcttt cgtcggccac gaagggaacg gaagtcatgt cgactgttca 2820cactggggtc acgcagagcg gtctcaccgc cgagctggcc tccctgcacg ccgagctcgt 2880ccgtcggaat cccggtgaag cggagttcca ccaggcggcc ctggaggtcc tcgaaacgct 2940ggcaccggtg ctcaccgccc ggccggagtt cgccgacgcc aaggtcctgg agcggatcgt 3000cgagccggag cggcagatca tgttccgcgt gccctggcag gacgactccg gcacgatccg 3060ggtcaaccgc ggcttccggg tggagttcaa cagcgcgctc ggcccctaca agggcggcct 3120gcggttccac gcgtccgtca acctcggcat cgtgaagttc ctcggcttcg agcagatctt 3180caagaacgcc ctgaccgggc tgaacatcgg cggcggcaag ggcggcagcg acttcgaccc 3240gcacggcagg tcggacgccg aggtgatgcg cttctgccag tccttcatga ccgagctgca 3300ccgtcacctg ggcgagcaca ccgacgtgcc ggctggcgac atcggcgtcg gcggccggga 3360gatcggctac ctcttcggcc agtaccggcg gatcaccaac cgctgggagg ccggcgtcct 3420gaccggcaag ggcctggcgt ggggcggctc caaggcccgt acggaggcca ccggttacgg 3480caatgtgctg ttcaccgagg agatgctcaa gcagcgcggc gaggagctgg acggccagca 3540ggtggtggtc tccgggtccg gcaacgtcgc catctacacc atcgagaagg cccaggcgct 3600cggcgccaac gtcctgaccg tctcggactc cggcggctac gtcgtcgacg agaagggcat 3660cgacctggcg ctgctcaagc aggtcaagga ggtcgagcgc ggccgggtcg gcgactacgc 3720ccagcggcgc ggcagttcgg cgaagtacgt cgccggcggg agcgtgtggg acgtcgcctg 3780tgacgtggcg ctgccgtcgg ccacccagaa cgagctcgac gcggacgccg cccggatcc 3839
<210> 6<211> 219<212> PRT<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 6Met Arg Arg His Pro Ser His Ser Pro Tyr Arg Gly Gly Cys Glu Val1 5 10 15Arg Pro Lys Arg Arg Gly Leu Met Leu Ala His Ser Ser Ser Glu Ser20 25 30Pro Pro Glu Ser Leu Pro Asp Ala Trp Thr Val Leu Lys Thr Arg Thr35 40 45Ala Val Arg Asn Tyr Ala Lys Glu Pro Val Asp Asp Ala Leu Ile Glu50 55 60Gln Leu Leu Glu Ala Met Leu Ala Ala Pro Thr Ala Ser Asn Arg Gln65 70 75 80Ala Trp Ser Phe Met Val Val Arg Arg Pro Ala Ala Val Arg Arg Leu85 90 95Arg Ala Phe Ser Pro Gly Val Leu Gly Thr Pro Ala Phe Phe Val Val100 105 110Ala Cys Val Asp Arg Ser Leu Thr Asp Asn Leu Ser Pro Lys Leu Ser115 120 125Gln Lys Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Cys Val Ala Met Ala Val Glu130 135 140Asn Leu Leu Leu Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Gly Gly Cys Pro Val145 150 155 160Gly Ser Phe Arg Ser Asp Ile Val Thr Ser Met Leu Gly Ile Pro Glu165 170 175His Ile Glu Pro Met Leu Val Val Pro Ile Gly Arg Pro Ala Thr Ala180 185 190Leu Val Pro Ser Gln Arg Arg Ala Lys Asn Glu Val Val Asn Tyr Glu195 200 205Ser Trp Gly Asn Arg Ala Ala Ala Pro Thr Ala210 215<210> 7<211> 104<212> PRT<213> 諾爾斯鏈酶菌
<400>7Asn Pro Gly Glu Thr Val Leu Pro Pro Gln Leu Arg Glu Glu Ile Ala1 5 10 15Leu Leu Ala Val Tyr Leu Leu Ser Ser Gly Arg Gly Leu Leu Glu Glu20 25 30Pro Ala Asp Tyr Gly Ile Tyr Arg Cys Thr Asp Gly Ala Arg Arg Ala35 40 45Leu Gln Leu Leu Asp Glu His Gly Gly Ser Thr Ala Arg Leu Thr Ala50 55 60Val Arg Glu Arg Leu Asp Glu Val Met Phe Ala Pro Met Gly Glu Asp65 70 75 80Arg Asp Met Gly Ala Ile Leu Asp Asp Leu Cys Arg Gln Met Ala Asp85 90 95Ala Leu Pro Glu Ile Glu Thr Pro100<210> 8<211> 99<212> PRT<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 8Met Leu Pro Pro Gln Leu Arg Glu Glu Ile Ala Leu Leu Ala Val Tyr1 5 10 15Leu Leu Ser Ser Gly Arg Gly Leu Leu Glu Glu Pro Ala Asp Tyr Gly20 25 30Ile Tyr Arg Cys Thr Asp Gly Ala Arg Arg Ala Leu Gln Leu Leu Asp35 40 45Glu His Gly Gly Ser Thr Ala Arg Leu Thr Ala Val Arg Glu Arg Leu50 55 60Asp Glu Val Met Phe Ala Pro Met Gly Glu Asp Arg Asp Met Gly Ala65 70 75 80Ile Leu Asp Asp Leu Cys Arg Gln Met Ala Asp Ala Leu Pro Glu Ile85 90 95Glu Thr Pro<210> 9<211> 239<212> PRT<213> 諾爾斯鏈酶菌
<400> 9Met Leu Ala Gly Leu Val Pro Ala Pro Asp His Gly Met Arg Glu Glu1 5 10 15Ile Leu Gly Asp Arg Ser Arg Leu Ile Arg Gln Arg Gly Glu His Ala20 25 30Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gly Asn Ser Tyr Phe Ser Gln Lys Asn Thr35 40 45Val Met Leu Leu Gln Trp Ala Gly Gln Arg Phe Glu Arg Thr Asp Val50 55 60Val Tyr Val Asp Thr His Ile Asp Glu Met Leu Ile Ala Asp Gly Arg65 70 75 80Ser Ala Gln Glu Ala Glu Arg Ser Val Lys Arg Thr Leu Lys Asp Leu85 90 95Arg Arg Arg Leu Arg Arg Ser Leu Glu Ser Val Gly Asp His Ala Glu100 105 110Arg Phe Arg Val Arg Ser Leu Ser Glu Leu Gln Glu Thr Pro Glu Tyr115 120 125Arg Ala Val Arg Glu Arg Thr Asp Arg Ala Phe Glu Glu Asp Ala Glu130 135 140Phe Ala Thr Ala Cys Glu Asp Met Val Arg Ala Val Val Met Asn Arg145 150 155 160Pro Gly Asp Gly Val Gly Ile Ser Ala Glu His Leu Arg Ala Gly Leu165 170 175Asn Tyr Val Leu Ala Glu Ala Pro Leu Phe Ala Asp Ser Pro Gly Val180 185 190Phe Ser Val Pro Ser Ser Val Leu Cys Tyr His Ile Asp Thr Pro Ile195 200 205Thr Ala Phe Leu Ser Arg Arg Glu Thr Gly Phe Arg Ala Ala Glu Gly210 215 220Gln Ala Tyr Val Val Val Arg Pro Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala225 230 235<210> 10<211> 277<212> PRT<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 10Met Ser Trp Gly Gly Gln Asp Thr Cys Ser Trp Cys Gly Thr Gly Pro1 5 10 15
Leu Gly Glu Ala Glu Asp Val Gly Arg Gln His Thr Ser His Ala Gly20 25 30Gly Pro Val Met Thr Gln Ala Ala Thr Val Thr Ala Thr Thr Ser Gln35 40 45Gly Arg Ala Leu Leu Arg Ser Leu Thr Pro Leu Phe Val Asp Ala Ala50 55 60Ile Pro Leu Gly Ser Tyr Phe Leu Leu Ala Glu Gly Phe Gly Met Ser65 70 75 80Thr Val Ala Ala Leu Ala Trp Ser Ser Val Val Pro Ala Leu Arg Thr85 90 95Ile Trp Gly Leu Val Arg Glu Arg Thr Val Asn Gly Leu Ala Leu Leu100 105 110Ile Leu Val Val Asn Val Val Gly Leu Ala Thr Ser Thr Leu Thr Gly115 120 125Asp Ala Arg Leu Met Met Ala Lys Asp Ser Gly Val Ser Ser Val Val130 135 140Gly Ile Ala Ile Leu Leu Ser Val Arg Gly Arg Arg Pro Leu Met Thr145 150 155 160Ala Gly Leu Arg Pro Trp Val Thr Lys Gly Ser Pro Glu Gly Asn Ala165 170 175Ala Trp Asp Arg Leu Trp Ala Arg Ser Ala Arg Phe Arg Gln Leu Glu180 185 190Arg Arg Phe Ser Thr Val Trp Gly Ser Ala Leu Leu Ile Glu Cys Val195 200 205Val Lys Val Val Gly Ala Tyr Val Leu Pro Val His Thr Met Val Trp210 215 220Leu Gly Thr Val Leu Thr Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Met Val Val225 230 235 240Ala Gly Gly Gly Ser Ala Glu Pro Met Glu Arg Met Val Lys Ala Glu245 250 255Val Gly Ala Ala Gly Glu Ala Ala Thr Ala Gly Asn Ala Glu Pro Ala260265 270Pro Ala Ala Ala Ala275<210> 11<211> 20<212> PRT<213> 諾爾斯鏈酶菌
<400> 11Glu Pro Val Asp Asp Ala Leu Ile Glu Gln Leu Leu Glu Ala Met Leu1 5 10 15Ala Ala Pro Thr20<210> 12<211> 12<212> PRT<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 12Asn Glu Val Val Asn Tyr Glu Xaa Trp Gly Asn Arg1 5 10<210> 13<211> 9<212> PRT<213> 諾爾斯鏈酶菌<400> 13Gln Ala Xaa Ser Phe Met Val Val Arg1 5<210> 14<211> 17<212> ADN<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 14garccsgtsg acgacgc 17<210> 15<211> 17<212> ADN<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 15gcgtcgtcsa csggytc17<210> 16<211> 20<212> ADN
<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 16aacgargtsg tsaactacga 20<210> 17<211> 20<212> ADN<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 17tcgtagttsa csacytcgtt 20<210> 18<211> 20<212> ADN<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 18caggcstggw ssttcatggt 20<210> 19<211> 20<212> ADN<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 19accatgaass wccasgcctg 20<210> 20<211> 47<212> ADN<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 20cggctgcagg agaagggagc ggacatatgc ttgcaggctt agttccc47
<210> 21<211> 42<212> ADN<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 21cggtcccgtg gatccaagct tctaggccgc gtcggccagc tc 42<210> 22<211> 36<212> ADN<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 22gagcgggatc ctgcagtgtc atggggagga caggac36<210> 23<211> 41<212> ADN<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 23cgatcacgtg gatccaagct tgccaatcct gtacgcgatt t 4權(quán)利要求
1.分離的天然或合成的多核苷酸，其特征在于它包含至少對應于序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的三個開放閱讀框。
2.如權(quán)利要求1所請求保護的多核苷酸，其特征在于它還包含對應于序列SEQ ID NO.4的開放閱讀框。
3.分離的天然或合成的多核苷酸，其特征在于它對應于序列SEQ ID NO.5。
4.分離的天然或合成的多核苷酸，其特征在于它包含對應于序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的三個開放閱讀框中的至少一個。
5.對應于序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4之中任一個的分離的天然或合成的多核苷酸。
6.載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1至5中任一項所請求保護的多核苷酸。
7.如權(quán)利要求6所請求保護的載體，其特征在于它是質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、放線菌的整合元件、病毒或噬菌體。
8.至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項所請求保護的多核苷酸、或其具有至少15個核苷酸的片段之一、或如權(quán)利要求6或7任一項所請求保護的載體作為探針的用途。
9.至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項所請求保護的多核苷酸、或其具有至少15個核苷酸的片段之一、或如權(quán)利要求6或7任一項所請求保護的載體之一作為擴增核苷酸序列的引物的用途。
10.分離的天然或合成的多肽，其特征在于它包含至少序列SEQID NO.7至SEQ ID NO.10之中的任一序列。
11.分離的天然或合成的多肽，其特征在于它對應于序列SEQ IDNO.7至SEQ ID NO.10之中的任一序列。
12.分離的天然或合成的多肽，其特征在于它由如權(quán)利要求1至5中任一項所請求保護的多核苷酸之一、或如權(quán)利要求6或7任一項所請求保護的載體之一編碼。
13.如權(quán)利要求1至5中任一項所請求保護的多核苷酸、或如權(quán)利要求6或7任一項中所述的載體用于制備如權(quán)利要求10至12之中任一項所述的多肽的用途。
14.至少一種如權(quán)利要求10至12之中任一項所請求保護的多肽單獨或組合用于(特別是體外用于)制備環(huán)二肽和/或在3-及6-位被α，β不飽和氨基酸側(cè)鏈取代的二酮哌嗪衍生物(特別是白諾斯菌素)的用途。
15.至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項所請求保護的多核苷酸、或如權(quán)利要求6或7任一項所述的載體用于制備經(jīng)修飾的生物系統(tǒng)或經(jīng)修飾的體外非細胞系統(tǒng)的用途。
16.如權(quán)利要求15所請求保護的用途，其特征在于該經(jīng)修飾的生物系統(tǒng)是一種微生物或是以原核細胞或真核細胞為宿主的異源表達系統(tǒng)。
17.經(jīng)修飾的生物系統(tǒng)，其特征在于它包含至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項所述的多核苷酸和/或至少一種如權(quán)利要求6或7任一項所述的載體。
18.如權(quán)利要求17中所述的生物系統(tǒng)，其特征在于它由微生物、或以原核細胞或真核細胞為宿主的異源表達系統(tǒng)、或體外非細胞系統(tǒng)構(gòu)成。
19.如權(quán)利要求18中所述的生物系統(tǒng)，其特征在于所述微生物是例如大腸桿菌或變青鏈霉菌的細菌。
20.經(jīng)修飾的體外非細胞系統(tǒng)，其特征在于它包含至少一種如權(quán)利要求1至5中任一項所述的多核苷酸和/或至少一種如權(quán)利要求6或7任一項所述的載體。
21.至少一種如權(quán)利要求17至19中任一項所請求保護的經(jīng)修飾的生物系統(tǒng)或如權(quán)利要求20所請求保護的經(jīng)修飾的體外非細胞系統(tǒng)用于制備環(huán)二肽和/或在3-及6-位被α，β不飽和氨基酸側(cè)鏈取代的二酮哌嗪衍生物(特別是白諾斯菌素)的用途。
22.體外合成環(huán)二肽的方法，其特征在于(1)在適宜條件下使兩種可以相同或不同的氨基酸與多肽AlbC(SEQ ID NO.9)接觸，和(2)純化所得的環(huán)二肽。
23.體外合成3-及6-位被氨基酸側(cè)鏈取代的α，β不飽和二酮哌嗪衍生物的方法，其特征在于(1)在適宜條件下使兩種可以相同或不同的氨基酸與多肽AlbC(SEQ ID NO.9)接觸并純化所得的環(huán)二肽，和(2)使步驟(1)中獲得的環(huán)二肽與AlbA(SEQ ID NO.6)、AlbB1(SEQ ID NO.7)和AlbB2(SEQ ID NO.8)接觸，并純化所得的α，β不飽和二酮哌嗪衍生物。
24.如權(quán)利要求23所請求保護的方法，其特征在于該方法在步驟(2)中還包含多肽AlbD(SEQ ID NO.10)。
25.如權(quán)利要求22至24之中任一項所請求保護的方法，其特征在于多肽的量介于0.1nM和10μM之間，優(yōu)選介于10nM和1μM之間。
26.合成環(huán)二肽的方法，其特征在于(1)在適宜培養(yǎng)所述已選擇的生物系統(tǒng)的條件下接觸至少含有多核苷酸albC(SEQ ID NO.3)的生物系統(tǒng)，和(2)純化所得的環(huán)二肽。
27.如權(quán)利要求26所請求保護的方法，其特征在于該生物系統(tǒng)還包含多核苷酸albD(SEQ ID NO.4)。
28.合成3-及6-位被α，β不飽和氨基酸側(cè)鏈取代的二酮哌嗪衍生物的方法，其特征在于(1)在適宜培養(yǎng)所述已選擇的生物系統(tǒng)的條件下接觸包含一種至少含有albA、albB和albC(SEQ ID NO.1-3)的多核苷酸的生物系統(tǒng)，和(2)純化所得的α，β不飽和二酮哌嗪衍生物。
29.如權(quán)利要求28所請求保護的方法，其特征在于該生物系統(tǒng)還包含多核苷酸albD(SEQ ID NO.4)。
30.如權(quán)利要求26至29之中任一項所請求保護的方法，其特征在于該生物系統(tǒng)是一種微生物，例如如大腸桿菌或變青鏈霉菌的細菌，或任一已知的以原核細胞或真核細胞為宿主的異源表達系統(tǒng)，或者甚至是體外非細胞系統(tǒng)。
31.如權(quán)利要求22至30之中任一項所請求保護的方法，其特征在于氨基酸的量介于0.1mM和100mM之間，優(yōu)選介于1mM和10mM之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及二酮哌嗪衍生物合成中涉及的新的分離的天然或合成的多核苷酸和由所述多核苷酸編碼的多肽、含有所述多核苷酸的載體、用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化的微生物、所述多核苷酸和所述多肽的用途、以及合成二酮哌嗪衍生物的方法，所述二酮哌嗪衍生物包含環(huán)二肽和3－及6－位被α，β不飽和氨基酸側(cè)鏈取代的二酮哌嗪衍生物。
文檔編號C12P21/04GK1668639SQ03817132
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月21日
發(fā)明者M·貢德里, R·熱內(nèi), S·洛特呂, J-L·佩爾諾代 申請人:原子能委員會, 國家科研中心