一種用于創(chuàng)面修復(fù)的環(huán)二肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明所屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種用于創(chuàng)面修復(fù)的環(huán)二肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 2, 5-二酮哌嗪類化合物（DKP)，又稱環(huán)二肽。該類化合物是由兩個氨基酸通過肽 鍵縮合環(huán)合而形成的，是自然界中存在最小的環(huán)肽類化合物，并且廣泛存在于自然界，在 人、脊椎動物、無脊椎動物、細(xì)菌和真菌中均有發(fā)現(xiàn)。2, 5-二酮哌嗪類化合物擁有兩個氫鍵 給體和兩個氫鍵受體，因為氫鍵是受體與藥物相互作用的主要方式之一，因而DKP的六元 環(huán)在藥物化學(xué)中是一個重要的藥效團，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的許多有活性的天然產(chǎn)物中含有DKP的六 元環(huán)結(jié)構(gòu)，具有多種生物活性如廣譜抗菌活性、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)免疫能力（劉友濤.幾種 2, 5-二酮哌嗪類化合物的合成及其生物活性研究.2011)。本發(fā)明的發(fā)明人以丙氨酸、甘氨 酸、亮氨酸為原料合成的環(huán)二肽不僅具有廣譜的抗菌活性、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)免疫功能，還 發(fā)現(xiàn)了創(chuàng)面修復(fù)的功能。
[0003] 創(chuàng)面是正常皮膚組織在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫 以及機體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚組織完整性的 破壞以及一定量正常組織的丟失，同時，皮膚組織的正常功能受損。常見的創(chuàng)面有燒燙傷、 潰瘍、擦傷等。大范圍、深度的創(chuàng)面為外界的致病菌提供了一個類似營養(yǎng)基的場所，這也是 創(chuàng)面容易感染的原因。而環(huán)二肽是由兩個氨基酸殘基通過肽鍵連接形成的肽在經(jīng)過縮合成 環(huán)狀的最小的環(huán)肽，在體內(nèi)可被二肽酶水解而成兩個游離氨基酸。在體內(nèi)腸粘膜細(xì)胞上存 在著吸收二肽的耗能主動運轉(zhuǎn)體系，因此二肽比氨基酸更易于被吸收。將具有一定生理活 性的環(huán)二肽應(yīng)用到創(chuàng)面中，可以有目的的降低創(chuàng)面的感染，提高機體的自身免疫能力，在外 界與機體的雙重作用下對創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù)。
[0004] 未見以丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸為原料合成的環(huán)二肽在創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用的報道 出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于創(chuàng)面修復(fù)的環(huán)二肽。
[0006] 本發(fā)明所述的環(huán)二肽為環(huán)丙-甘二肽（ala-gly)、環(huán)丙-亮二肽（ala-leu)的中的 任意一種。
[0007] 本發(fā)明所述的環(huán)二肽的制備方法為：
[0008] 1.氨基酸的甲酯鹽酸鹽的制備：向適量甲醇與二氯亞砜的混合液中加入適量的 氨基酸，在室溫下攪拌。TLC跟蹤反應(yīng)完成，減壓旋干溶劑，得到氨基酸的甲酯鹽酸鹽。
[0009] 2.中和縮合：取進(jìn)行Boc氨基保護(hù)的丙氨酸與氨基酸的甲酯鹽酸鹽在含有 THF(四氫呋喃）、吡陡、（Boc)20、DMAP (催化劑）的條件下進(jìn)行中和縮合反應(yīng)得到N-叔丁 氧羰基-丙氨酰氨基酸甲酯；
[0010] 3.脫保護(hù)：在EtoAc (乙酸乙酯）和HC1的飽和溶液的作用下對步驟2中得到的 N-叔丁氧羰基-丙氨酰氨基酸甲酯進(jìn)行氨基脫保護(hù)處理，得到丙氨酰氨基酸甲酯；
[0011] 4.環(huán)化：將步驟3中得到的丙氨酰氨基酸甲酯與甲醇混合，用NaHC03調(diào)節(jié)pH后， 加熱回流18-22小時，過濾，柱層析純化，得到所述的環(huán)二肽。
[0012] 本發(fā)明所述的環(huán)二肽的制備方法，其中步驟1中所述的氨基酸為甘氨酸、亮氨酸 中的任意一種。
[0013] 有益效果：本發(fā)明所述的環(huán)二肽通過小鼠燒燙傷實驗與小鼠潰瘍實驗，結(jié)果顯示 本發(fā)明所述的環(huán)二肽具有良好的創(chuàng)面修復(fù)作用，且具有治療效果明顯，創(chuàng)面愈合速度快、疤 痕淺等優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0014] 以下是結(jié)合具體試驗對本發(fā)明的說明，并不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0015] 實施例1本發(fā)明中所述的環(huán)二肽（環(huán)丙-甘二肽）的制備方法
[0016] 主要藥品試劑：甘氨酸、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的丙氨酸
[0017] 制備環(huán)ala-gly二肽的過程：
[0018] (1)甘氨酸甲酯鹽酸鹽的制備：向適量甲醇與二氯亞砜的混合液中加入甘氨酸 l〇g，在室溫下攪拌20h。TLC跟蹤反應(yīng)完成，減壓旋干溶劑，得到甘氨酸甲酯鹽酸鹽13. 91g。
[0019] (2)中和縮合反應(yīng)：向100ml無水四氫呋喃中加入步驟⑴中得到的甘氨酸甲酯 鹽酸鹽、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的丙氨酸20g、吡啶20ml、DMAP (4-二甲氨基吡啶），待全部混合后， 在氬氣的保護(hù)下加入無水四氫呋喃的（Boc)20,室溫下攪拌10小時。TLC跟蹤反應(yīng)完成，柱 層析純化（石油醚：乙酸乙酯=4:1)，旋干溶劑得到N-叔丁氧羰基-丙氨酰甘氨酸甲酯固 體 22. 97g。
[0020] (3)Boc保護(hù)氨基脫保護(hù)處理：取步驟（2)中得到的N-叔丁氧羰基-丙氨酰甘氨 酸甲酯，加入乙酸乙酯鹽酸（HCl/EtOAc)的飽和溶液2. 5L，冰水浴下攪拌1. 5h，冰水浴中減 壓蒸掉溶劑，以甲醇-乙醚重結(jié)晶得丙氨酰甘氨酸甲酯固體20. 78g。
[0021] (4)環(huán)丙-甘二肽的制備：將步驟（3)中得到的丙氨酰甘氨酸甲酯加入到0. 9L甲 醇中，用NaHC03調(diào)節(jié)pH為7-8,加熱回流18h，過濾，柱層析純化（乙酸乙酯：甲醇=2:1)， 最后得到環(huán)丙-甘二肽固體13. 88g。
[0022] 實施例2本發(fā)明中所述的環(huán)二肽（環(huán)丙-亮二肽）的制備方法
[0023] 主要藥品試劑：亮氨酸、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的丙氨酸
[0024] 制備環(huán)ala-leu二肽的過程：
[0025] (1)亮氨酸甲酯鹽酸鹽的制備：向適量甲醇與二氯亞砜的混合液中加入亮氨酸 l〇g，在室溫下攪拌24h。TLC跟蹤反應(yīng)完成，減壓旋干溶劑，得到亮氨酸甲酯鹽酸鹽14. 34g。
[0026] (2)中和縮合反應(yīng)：向100ml無水四氫呋喃中加入步驟（1)中得到的亮氨酸甲酯 鹽酸鹽、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的丙氨酸20g、吡啶20ml、DMAP (4-二甲氨基吡啶），待全部混合后， 在氬氣的保護(hù)下加入無水四氫呋喃的（Boc)20,室溫下攪拌12小時。TLC跟蹤反應(yīng)完成，柱 層析純化（石油醚：乙酸乙酯=4:1)，旋干溶劑得到N-叔丁氧羰基-丙氨酰亮氨酸甲酯固 體 24. 55g。
[0027] (3)Boc保護(hù)氨基脫保護(hù)處理：取步驟（2)中得到的N-叔丁氧羰基-丙氨酰亮氨 酸甲酯，加入乙酸乙酯鹽酸（HCl/EtOAc)的飽和溶液2. 5L，冰水浴下攪拌2h，冰水浴中減壓 蒸掉溶劑，以甲醇-乙醚重結(jié)晶得丙氨酰亮氨酸甲酯固體22. 15g。
[0028] (4)環(huán)丙-亮二肽的制備：將步驟（3)中得到的丙氨酰亮氨酸甲酯加入到1. 2L甲 醇中，用NaHC03調(diào)節(jié)pH為7-8,加熱回流18h，過濾，柱層析純化（乙酸乙酯：甲醇=2:1)， 最后得到固體環(huán)丙-亮二肽（ala-leu) 15. 19g。
[0029] 以下通過實驗對上述實施例1-2制備的環(huán)二肽做進(jìn)一步的應(yīng)用說明。
[0030] 實施例3本發(fā)明所述的環(huán)二肽在潰瘍中的應(yīng)用
[0031] 1、實驗材料
[0032] 1. 1樣品：按實施例1-2制得樣品：環(huán)丙-甘二肽（ala-gly)、環(huán)丙-亮二肽 (ala-leu)
[0033] 1. 2實驗動物：KM小鼠，18~22g，120只，雌雄各半。SD大鼠，200~220g，180只， 雌雄各半。
[0034] 1. 3實驗試劑：鹽酸雷尼替丁膠囊、達(dá)喜（鋁碳酸鎂片）
[0035] 2、樣品對胃潰瘍粘膜的保護(hù)功能評價方法
[0036] 2. 1無水乙醇致小鼠胃粘膜損傷模型試驗
[0037] 40只KM小鼠按性別與體重隨機分組（詳見表1)，各組給予相應(yīng)的藥物，各組小鼠 給藥連續(xù)10天，第9天給藥后禁食24h，自由飲水。每組的小鼠在末次給藥3h后，所有小鼠 給予0. 2ml無水乙醇進(jìn)行灌胃，1小時后處死動物，結(jié)扎幽門，1%甲醛固定，觀察并評定潰 瘍指數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)：條索狀損傷的長度大于1mm者，測定其長度，每毫米計1分，其寬度大于1mm 者計分加倍，長度與寬度均小于1mm，計0.5分，將計分相加即為該鼠的潰瘍指數(shù)）并計算潰 瘍抑制百分率。重復(fù)試驗3次。
[0038] 2. 2乙酸致大鼠慢性胃潰瘍模型試驗
[0039] 除假手術(shù)組（12只），其余大鼠采用10 %醋酸按0. 05ml/只平刺于胃漿膜下 0. 4-0. 5_造模。術(shù)后造模大鼠進(jìn)一步分組（詳見表2)，并于第2日開始給藥，每日1次， 各組給藥14天，末日給藥后禁食禁水一夜后處死動物。以游標(biāo)卡尺測定潰瘍最大長徑及垂 直于最大長徑的最大寬徑。計算潰瘍指數(shù)（潰瘍指數(shù)=潰瘍最大長徑X垂直于最大長徑 的最大寬徑）及潰瘍抑制率。重復(fù)試驗3次。
[0040] 3、樣品對胃潰瘍粘膜的保護(hù)功能評價結(jié)果
[0041] 3. 1樣品對無水乙醇致小鼠胃粘膜損傷的影響
[0042] 表1樣品對無水乙醇致小鼠胃粘膜損傷的影響（f 土S)(第一次）
[0043]
[0044] 注：*:P〈0. 001與對照組比較；# :P〈0. 05與陽性組比較
[0045] 結(jié)果顯示，與對照組比較，實施例1-2制備的環(huán)二肽均可使無水乙醇致小鼠胃粘 膜損傷的潰瘍指數(shù)明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（p〈0.001);與陽性組（雷尼替?。┍容^，實 施例1-2制備的環(huán)二肽在潰瘍指數(shù)的抑制效果上明顯高于雷尼替丁的