六個(gè)用于創(chuàng)面修復(fù)的環(huán)二肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明所屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種用于創(chuàng)面修復(fù)的環(huán)二肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 2, 5-二酮哌嗪類化合物（DKP)，又稱環(huán)二肽。該類化合物是由兩個(gè)氨基酸通過(guò)肽 鍵縮合環(huán)合而形成的，是自然界中存在最小的環(huán)肽類化合物，并且廣泛存在于自然界，在 人、脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、細(xì)菌和真菌中均有發(fā)現(xiàn)。2, 5-二酮哌嗪類化合物擁有兩個(gè)氫鍵 給體和兩個(gè)氫鍵受體，因?yàn)闅滏I是受體與藥物相互作用的主要方式之一，因而DKP的六元 環(huán)在藥物化學(xué)中是一個(gè)重要的藥效團(tuán)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的許多有活性的天然產(chǎn)物中含有DKP的六 元環(huán)結(jié)構(gòu)，具有多種生物活性如廣譜抗菌活性、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)免疫能力（劉友濤.幾種 2, 5-二酮哌嗪類化合物的合成及其生物活性研究.2011)。本發(fā)明的發(fā)明人以脯氨酸、苯丙 氨酸、纈氨酸、組氨酸、酪氨酸、甘氨酸為原料合成的環(huán)二肽不僅具有廣譜的抗菌活性、抗腫 瘤活性、調(diào)節(jié)免疫功能，還發(fā)現(xiàn)了創(chuàng)面修復(fù)的功能。
[0003] 創(chuàng)面是正常皮膚組織在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫 以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚組織完整性的 破壞以及一定量正常組織的丟失，同時(shí)，皮膚組織的正常功能受損。常見(jiàn)的創(chuàng)面有燒燙傷、 潰瘍、擦傷等。大范圍、深度的創(chuàng)面為外界的致病菌提供了一個(gè)類似營(yíng)養(yǎng)基的場(chǎng)所，這也是 創(chuàng)面容易感染的原因。而環(huán)二肽是由兩個(gè)氨基酸殘基通過(guò)肽鍵連接形成的肽在經(jīng)過(guò)縮合成 環(huán)狀的最小的環(huán)肽，在體內(nèi)可被二肽酶水解而成兩個(gè)游離氨基酸。在體內(nèi)腸粘膜細(xì)胞上存 在著吸收二肽的耗能主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)體系，因此二肽比氨基酸更易于被吸收。將具有一定生理活 性的環(huán)二肽應(yīng)用到創(chuàng)面中，可以有目的的降低創(chuàng)面的感染，提高機(jī)體的自身免疫能力，在外 界與機(jī)體的雙重作用下對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù)。
[0004] 未見(jiàn)以脯氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、組氨酸、酪氨酸、甘氨酸為原料合成的環(huán)二肽在 創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用的報(bào)道出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于創(chuàng)面修復(fù)的環(huán)二肽。
[0006] 本發(fā)明所述的環(huán)二肽為環(huán)脯-苯丙二肽（pro-phe)、環(huán)脯-脯二肽（pro-pro)、環(huán) 脯-繳二肽（pro-val)、環(huán)脯-組二肽（pro-his)、環(huán)脯-釀二肽（pro-tyr)、環(huán)脯-甘二肽 (pro-gly)中的任意一種。
[0007] 本發(fā)明所述的環(huán)二肽的制備方法為：
[0008] 1.氨基酸的甲酯鹽酸鹽的制備：向適量甲醇與二氯亞砜的混合液中加入適量的 氨基酸，在室溫下攪拌。TLC跟蹤反應(yīng)完成，減壓旋干溶劑，得到氨基酸的甲酯鹽酸鹽。
[0009] 2.中和縮合：取進(jìn)行Boc氨基保護(hù)的脯氨酸與氨基酸的甲酯鹽酸鹽在含有 THF(四氫呋喃）、吡陡、（Boc)20、DMAP (催化劑）的條件下進(jìn)行中和縮合反應(yīng)得到N-叔丁 氧羰基-脯氨酰氨基酸甲酯；
[0010] 3.脫保護(hù)：在EtoAc (乙酸乙酯）和HC1的飽和溶液的作用下對(duì)步驟2中得到的 N-叔丁氧羰基-脯氨酰氨基酸甲酯進(jìn)行氨基脫保護(hù)處理，得到脯氨酰氨基酸甲酯；
[0011] 4.環(huán)化：將步驟3中得到的脯氨酰氨基酸甲酯與甲醇混合，用NaHC03調(diào)節(jié)pH后， 加熱回流18-22小時(shí)，過(guò)濾，柱層析純化，得到所述的環(huán)二肽。
[0012] 本發(fā)明所述的環(huán)二肽的制備方法，其中步驟1中所述的氨基酸為苯丙氨酸、脯氨 酸、纈氨酸、組氨酸、酪氨酸、甘氨酸中的任意一種。
[0013] 有益效果：本發(fā)明所述的環(huán)二肽通過(guò)小鼠燒燙傷實(shí)驗(yàn)與小鼠潰瘍實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示 本發(fā)明所述的環(huán)二肽具有良好的創(chuàng)面修復(fù)作用，且具有治療效果明顯，創(chuàng)面愈合速度快、疤 痕淺等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下是結(jié)合具體試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，并不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0015] 實(shí)施例1本發(fā)明中所述的環(huán)二肽（環(huán)脯-苯丙二肽）的制備方法
[0016] 主要藥品試劑：苯丙氨酸、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的脯氨酸
[0017] 制備環(huán)pro-phe二肽的過(guò)程：
[0018] (1)苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽的制備：向適量甲醇與二氯亞砜的混合液中加入苯丙氨 酸l〇g，在室溫下攪拌24h。TLC跟蹤反應(yīng)完成，減壓旋干溶劑，得到苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽 14. 5g〇
[0019] (2)中和縮合反應(yīng)：向100ml無(wú)水四氫呋喃中加入步驟⑴中得到的苯丙氨酸甲 酯鹽酸鹽、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的脯氨酸20g、吡啶20ml、DMAP (4-二甲氨基吡啶），待全部混合 后，在氬氣的保護(hù)下加入無(wú)水四氫呋喃的（Boc)20,室溫下攪拌10小時(shí)。TLC跟蹤反應(yīng)完成， 柱層析純化（石油醚：乙酸乙酯=4:1)，旋干溶劑得到N-叔丁氧羰基-脯氨酰苯丙氨酸甲 酯固體23.65g。
[0020] (3)Boc保護(hù)氨基脫保護(hù)處理：取步驟（2)中得到的N-叔丁氧羰基-脯氨酰苯丙 氨酸甲酯，加入乙酸乙酯鹽酸（HCl/EtOAc)的飽和溶液2. 5L，冰水浴下攪拌1. 5h，冰水浴中 減壓蒸掉溶劑，以甲醇-乙醚重結(jié)晶得脯氨酰苯丙氨酸甲酯固體21. 55g。
[0021] (4)環(huán)脯-苯丙二肽的制備：將步驟（3)中得到的脯氨酰苯丙氨酸甲酯加入到 1. 0L甲醇中，用NaHC03調(diào)節(jié)pH為7-8,加熱回流20h，過(guò)濾，柱層析純化（乙酸乙酯：甲醇 =2:1)，最后得到固體環(huán)脯-苯丙二肽14. 21g。
[0022] 實(shí)施例2本發(fā)明中所述的環(huán)二肽（環(huán)脯-脯二肽）的制備方法
[0023] 主要藥品試劑：脯氨酸、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的脯氨酸
[0024] 制備環(huán)pro-pro二肽的過(guò)程：
[0025] (1)脯氨酸甲酯鹽酸鹽的制備：向適量甲醇與二氯亞砜的混合液中加入脯氨酸 1 lg，在室溫下攪拌20h。TLC跟蹤反應(yīng)完成，減壓旋干溶劑，得到脯氨酸甲酯鹽酸鹽15. 19g。
[0026] (2)中和縮合反應(yīng)：向110ml無(wú)水四氫呋喃中加入步驟（1)中得到的脯氨酸甲酯 鹽酸鹽、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的脯氨酸22g、吡啶20ml、DMAP (4-二甲氨基吡啶），待全部混合后， 在氬氣的保護(hù)下加入無(wú)水四氫呋喃的（Boc)20,室溫下攪拌12小時(shí)。TLC跟蹤反應(yīng)完成，柱 層析純化（石油醚：乙酸乙酯=4:1)，旋干溶劑得到N-叔丁氧羰基-脯氨酰脯氨酸甲酯固 體 26. 78g〇
[0027] (3)Boc保護(hù)氨基脫保護(hù)處理：取步驟（2)中得到的N-叔丁氧羰基-脯氨酰脯氨 酸甲酯，加入乙酸乙酯鹽酸（HCl/EtOAc)的飽和溶液2. 5L，冰水浴下攪拌2h，冰水浴中減壓 蒸掉溶劑，以甲醇-乙醚重結(jié)晶得脯氨酰脯氨酸甲酯固體24. 12g。
[0028] (4)環(huán)脯-脯二肽的制備：將步驟（3)中得到的脯氨酰脯氨酸甲酯加入到1. 2L甲 醇中，用NaHC03調(diào)節(jié)pH為7-8,加熱回流18h，過(guò)濾，柱層析純化（乙酸乙酯：甲醇=2:1)， 最后得到固體環(huán)脯-脯二肽16. 91g。
[0029] 實(shí)施例3本發(fā)明中所述的環(huán)二肽（環(huán)脯-纈二肽）的制備方法 [0030] 主要藥品試劑：纈氨酸、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的脯氨酸
[0031] 制備環(huán)pro-val二肽的過(guò)程：
[0032] (1)纈氨酸甲酯鹽酸鹽的制備：向適量甲醇與二氯亞砜的混合液中加入纈氨酸 l〇g，在室溫下攪拌18h。TLC跟蹤反應(yīng)完成，減壓旋干溶劑，得到纈氨酸甲酯鹽酸鹽16. 81g。
[0033] (2)中和縮合反應(yīng)：向100ml無(wú)水四氫呋喃中加入步驟（1)中得到的纈氨酸甲酯 鹽酸鹽、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的脯氨酸20g、吡啶20ml、DMAP (4-二甲氨基吡啶），待全部混合后， 在氬氣的保護(hù)下加入無(wú)水四氫呋喃的（Boc)20,室溫下攪拌10小時(shí)。TLC跟蹤反應(yīng)完成，柱 層析純化（石油醚：乙酸乙酯=4:1)，旋干溶劑得到N-叔丁氧羰基-脯氨酰纈氨酸甲酯固 體 25. 99g。
[0034] (3)Boc保護(hù)氨基脫保護(hù)處理：取步驟（2)中得到的N-叔丁氧羰基-脯氨酰纈氨 酸甲酯，加入乙酸乙酯鹽酸（HCl/EtOAc)的飽和溶液2. 5L，冰水浴下攪拌2. 5h，冰水浴中減 壓蒸掉溶劑，以甲醇-乙醚重結(jié)晶得脯氨酰纈氨酸甲酯固體25. 01g。
[0035] (4)環(huán)脯-纈二肽的制備：將步驟（3)中得到的脯氨酰纈氨酸甲酯加入到0. 9L甲 醇中，用NaHC03調(diào)節(jié)pH為7-8,加熱回流20h，過(guò)濾，柱層析純化（乙酸乙酯：甲醇=2:1)， 最后得到固體環(huán)脯-纈二肽17. 13g。