專利名稱：γ－聚谷氨酸及其鹽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法。
γ-聚谷氨酸可通過傳統(tǒng)的多肽合成的方法將谷氨酸單體連接而成，然而，這種方法是沒有工業(yè)應(yīng)用價值的，因為聚合谷氨酸過程要經(jīng)過許多步復(fù)雜反應(yīng)。
另一方面，早在1937年，Ivanovics等人就發(fā)現(xiàn)γ-聚谷氨酸是炭疽芽孢桿菌的莢膜成分(Ivanovics G，Erdos Z.Immunt tsforsch，1937，905)，1942年Bovarnick等人開始研究采用能在培養(yǎng)基中蓄積γ-聚谷氨酸的微生物來發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸(Bovarnick M.J Biol Chem.1942，145415)，自此以后，發(fā)酵法生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的研究一直在進(jìn)行(Ito Y et al.Biosci.Biotech.Biochem.96，601239-42)，人們相信微生物發(fā)酵法較化學(xué)合成法更有優(yōu)勢。然而，γ-聚谷氨酸在培養(yǎng)液中的蓄積量很低，工業(yè)上大規(guī)模廉價生產(chǎn)γ-聚谷氨酸尚有困難，為此希望開發(fā)出高效的γ-聚谷氨酸制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種高效的γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過下列措施來達(dá)到本發(fā)明采用的微生物為芽孢桿菌屬菌株，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，這類菌株具有共同的特點，即在含碳源、氮源、谷氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生成高活力的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GTP)，酶活力為1-10U/ml，從而可生成高濃度的γ-聚谷氨酸發(fā)酵液，進(jìn)而用溶劑沉淀或化學(xué)沉淀法得γ-聚谷氨酸或其鹽。菌株的性狀如下1、形態(tài)特征在肉膏瓊脂培養(yǎng)基上營養(yǎng)細(xì)胞為0.7-1.0×1.3-2.0μm大小的桿菌，30℃培養(yǎng)2-3天形成芽孢，芽孢大小為0.7-0.9×1.0-1.5μm，為長圓形或圓柱形。2、培養(yǎng)性質(zhì)(1) 肉膏瓊脂平板培養(yǎng)25-45℃培養(yǎng)1-3天可大量生長。菌落呈污白色，粗糙有皺褶，不透明，不閃光，蔓延，邊緣不規(guī)則。(2) 肉膏瓊脂斜面培養(yǎng)同(1)(3) 肉膏液體培養(yǎng)在液體表面形成菌膜，液體內(nèi)部透明。(4) 肉膏穿刺培養(yǎng)菌體在表面生長，底部不生長。3、生理性質(zhì)(1) 革蘭氏染色陽性(2) 硝酸鹽還原陽性(3) 甲基紅實驗陰性(4) VP試驗陽性(5) 檸檬酸鹽利用陽性(6) 吲哚生成陰性(7) H2S生成陰性(8) 無機(jī)鹽利用能以銨鹽為唯一氮源生長(9) 耐NaCl濃度7％濃度上可以生長歸納上述，本發(fā)明使用的是好氣性芽孢桿菌，具體為Bacillus subtilis NX-2和Bacillus licheniformis B-2。
本發(fā)明使用的培養(yǎng)基含碳源、氮源、無機(jī)鹽、谷氨酸或其鹽等營養(yǎng)。
本發(fā)明對碳源并沒有特別的限定，可以使用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、淀粉水解糖、糖蜜等，其中以葡萄糖、麥芽糖較合適。
氮源包括有機(jī)氮源如酵母膏、蛋白胨、玉米漿、尿素，也可采用無機(jī)氮源如(NH4)2SO4、NaNO3、NH4Cl，上述氮源可單獨使用，也可混合使用。
本發(fā)明的培養(yǎng)基中使用谷氨酸，濃度為0.5-7％，最好在2-5％，加入量過少，γ-聚谷氨酸生成量減少，甚至完全不產(chǎn)生，但加入量過多，菌體生長變差，發(fā)酵液中剩余谷氨酸多，造成浪費(fèi)。使用的谷氨酸也可以是鹽的形式。
本發(fā)明采用的γ-聚谷氨酸分離純化方法包括有機(jī)溶劑沉淀法和化學(xué)沉淀法。利用離心或絮凝菌體的方法除去發(fā)酵液中的菌體，在上清液中加入低級醇類，如乙醇、甲醇，也可以是丙酮，加入量為溶液的2-5倍，沉淀得到γ-聚谷氨酸。沉淀物用水溶解除去不溶物，透析去除小分子物質(zhì)，濾液冷凍干燥得白色粉末結(jié)晶。也可以用飽和CuSO4，(NH4)2SO4，NaCl沉淀γ-聚谷氨酸。
本發(fā)明制備的γ-聚谷氨酸具有如下理化性質(zhì)(1) 本產(chǎn)品溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑；(2) 對茚三酮反應(yīng)呈陰性，用6NHCl水解后對茚三酮反應(yīng)呈陽性；(3) 6NHCl水解后，用HPLC、氨基酸分析儀或紙層析檢測，發(fā)現(xiàn)水解液中生成單一的氨基酸——谷氨酸，本產(chǎn)品為谷氨酸的高分子聚合物；(4) 將γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶加入到本產(chǎn)品溶液液中40℃保溫數(shù)分鐘或更長時間，可檢測出谷氨酸的生成，這點輔證了本產(chǎn)品結(jié)構(gòu)為一個分子谷氨酸的γ-COOH和另一分子α-NH2結(jié)合而聚合成的高分子γ-聚谷氨酸；(5) 分子量經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、凝膠過濾色譜柱等方法檢測為50-100萬；本發(fā)明制備的γ-聚谷氨酸分子上有大量的游離羧基存在，因而具有良好的吸濕保濕性，用作食品的增稠劑，淀粉防老化劑，延長面包、糕點的貨架期；在化妝品中可用作保濕因子。
本發(fā)明制備的γ-聚谷氨酸經(jīng)輻射交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)后可制得高吸水性材料，吸水性按交聯(lián)條件不同，可吸收自身重量的500-5000倍水，可望在衛(wèi)生用品、農(nóng)林園藝、醫(yī)療、土木建筑等多個行業(yè)中使用。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點本發(fā)明因篩選到優(yōu)良的微生物菌株，可以高產(chǎn)率地發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸；菌種的培養(yǎng)條件十分粗放，可使用任意一種氮源如無機(jī)氮源，使用這種氮源，培養(yǎng)基色澤淺，對產(chǎn)物的后提取十分有利，另一方面，由于它十分廉價，加之用量低，使γ-聚谷氨酸生產(chǎn)成本大幅度下降。本發(fā)明對培養(yǎng)基進(jìn)行合理優(yōu)化，尤其是添加谷氨酸或其鹽，使發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸濃度高達(dá)28g/L，從而提供了一種高效廉價制備γ-聚谷氨酸的方法。
實施例1斜面培養(yǎng)基蛋白胨1-2％，牛肉膏0.5-1％，NaCl0.5-1％，瓊脂2％，pH7.0搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖1.5％，酵母膏1％，谷氨酸2％，KH2PO40.5％，MgSO4.7H2O0.05％，pH7.0。500ml容積的三角瓶中裝液50ml，121℃滅菌20分種。
將純化的枯草芽孢桿菌NX-2在斜面培養(yǎng)基上25-37℃培養(yǎng)24-48h，然后接一環(huán)此菌苔于搖瓶培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，搖瓶轉(zhuǎn)速180r/ml。最后得到發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸含量為15g/L。
實施例2同實施例1的培養(yǎng)條件，采用地衣芽孢桿菌B-2，得到發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸含量為10g/L。
實施例3同實施例1，搖瓶培養(yǎng)基中葡萄糖用麥芽糖代替，結(jié)果得到發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸含量為20g/L。
實施例4同實施例1，用無機(jī)氮源(NH4)2SO4、NaNO3替代搖瓶培養(yǎng)基中酵母膏，結(jié)果如表1表1無機(jī)氮源對γ-聚谷氨酸生成的影響氮源 濃度(％)生長A660γ-GTP(U/ml) γ-PGA生成量(g/L)(NH4)2SO40.2 0.31 1.6 130.5 0.36 1.6 120.2 0.44 1.8 14NaNO30.5 0.48 1.8 13實施例5在葡萄糖1.5％，酵母膏1％，KH2PO40.5％，MgSO4.7H2O 0.05％組成的培養(yǎng)基中，加入谷氨酸鈉1-7％，調(diào)整pH7.0，于容積為500ml的三角瓶中裝液50ml，121℃滅菌20分種。接入B.subtilis NX-2菌苔，同實施例1培養(yǎng)，結(jié)果見表1所示。不加谷氨酸鈉的對照瓶中γ-聚谷氨酸不生成，添加3％谷氨酸鈉的培養(yǎng)液中生成24g/L聚谷氨酸。
表2、培養(yǎng)基中谷氨酸添加量對γ-聚谷氨酸生成的影響Glu濃度(％) pHA660γ-GTP(U/ml) γ-PGA生成量(g/L)不添加 6.0 0.26 0.5 -0.57.5 0.26 1.7 41 8.0 0.29 1.8 102 8.0 0.28 2.4 153 8.0 0.24 2.5 244 8.0 0.22 2.6 185 7.5 0.21 2.0 126 7.5 0.21 1.7 127 7.5 0.17 1.5 12實施例6將葡萄糖30g，酵母膏20g，谷氨酸鈉60g，尿素6g，KH2PO44g，MgSO4.7H2O1g，用NaOH調(diào)pH7.0，裝入一個5升玻璃攪拌發(fā)酵罐，121℃蒸汽滅菌15分種。將枯草芽孢桿菌NX-2用種子培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16h，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.0％，酵母膏0.5％，谷氨酸鈉1％，KH2PO40.5％，MgSO4.7H2O 0.05％，pH7.0。將種子液100ml接入到發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)，(通風(fēng)比為1∶1vvm，攪拌速度為300r/ml)，隨著培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)液中的γ-聚谷氨酸不斷增多，到24h后，發(fā)酵液中含γ-聚谷氨酸28g/L。
將發(fā)酵液離心去除細(xì)胞，緩慢加入無水乙醇，形成粘性沉淀，收集沉淀物，溶于水，對蒸餾水透析，冷凍干燥，共得44.8g γ-聚谷氨酸鈉。產(chǎn)品的紅外光譜圖見

圖1。
權(quán)利要求
1.一種γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法，其特征在于采用芽孢桿菌屬菌株，在含碳源、氮源、谷氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生成高活力的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶并獲得γ-聚谷氨酸發(fā)酵液，用溶劑沉淀或化學(xué)沉淀法得γ-聚谷氨酸或其鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法，其特征在于采用的菌株為枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、淀粉水解糖、糖蜜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基的氮源可采用有機(jī)氮源酵母膏、蛋白胨、玉米漿、尿素；也可采用無機(jī)氮源(NH4)2SO4，NaNO3，上述氮源可單獨使用也可混合使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基中添加谷氨酸或其鹽，其濃度為0.5-7％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法，其特征在于采用的溶劑可以是低級醇類也可以是丙酮，加入量為溶液的2-5倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法，其特征在于采用的沉淀劑為CuSO4，(NH4)2SO4，NaCl。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備γ－聚谷氨酸及其鹽的方法。通過采用芽孢桿菌屬菌株,如枯草芽孢桿菌,地衣芽孢桿菌,在含碳源、氮源、谷氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng),生成高活力的γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶,酶活力為1－10U/ml,從而可生成高濃度的γ－聚谷氨酸發(fā)酵液,進(jìn)而用溶劑沉淀或化學(xué)沉淀法得γ－聚谷氨酸或其鹽。
文檔編號C12P21/02GK1346891SQ0112728
公開日2002年5月1日 申請日期2001年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月29日
發(fā)明者歐陽平凱, 徐虹 申請人:南京工業(yè)大學(xué)