專利名稱：一種乳酸球菌來(lái)源的x－脯氨酰－二肽氨肽酶及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和酶學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的X-脯氨酰-二肽氨肽酶[EC3.4.14.5]，該X-脯氨酰-二肽氨肽酶的氨基酸序列和DNA編碼序列，用于表達(dá)該X-脯氨酰-二肽氨肽酶的表達(dá)載體和工程菌，以及該X-脯氨酰-二肽氨肽酶的制備方法和用途。
X-脯氨酰-二肽氨肽酶(X-Prolyl-dipepXtidyl aminopeptidase，簡(jiǎn)稱pepX)[EC3.4.14.5]是一種能特異的識(shí)別多肽或蛋白質(zhì)氨基端第二位的脯氨酸，并將其碳端肽鍵水解，從而去除氨基端的X-脯氨酰二肽的絲氨酸蛋白酶。該酶廣泛存在于哺乳動(dòng)物、酵母菌和細(xì)菌中。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，共有四種酶具有二肽酶活性，它們都能切去多肽或蛋白質(zhì)氨基端的二肽，但在底物特異性和最適pH上存在差別。其中，二肽氨肽酶IV最適pH為8，能特異的水解底物Gly-Pro-βNA，是典型的X-脯氨酰-二肽氨肽酶。另一種典型的X-脯氨酰-二肽氨肽酶是酵母細(xì)胞中的二肽氨肽酶B，它位于酵母細(xì)胞液泡中，是一種內(nèi)膜糖蛋白。
X-脯氨酰-二肽氨肽酶也廣泛存在于乳酸菌中。乳酸菌在食品發(fā)酵工業(yè)中起著重要的作用。應(yīng)用于牛乳發(fā)酵中的乳桿菌屬與乳球菌屬均為挑剔的有機(jī)體，其生長(zhǎng)需要各種各樣的自由氨基酸。但是牛乳中小肽與氨基酸的含量卻不足以供應(yīng)乳酸菌生長(zhǎng)的需要。因此，乳酸菌需要一個(gè)復(fù)雜的蛋白水解體系，將牛乳中的蛋白質(zhì)降解為自由氨基酸。酪蛋白是主要的牛乳蛋白，它含有豐富的脯氨酸。因此，就需要特異的蛋白酶水解脯氨酸殘基相關(guān)的肽鍵。因此，對(duì)脯氨酸殘基特異的肽酶，如，X-脯氨酰-二肽氨肽酶、氨肽酶P、X-脯氨酰-二肽氨肽酶、脯氨酸亞氨基肽酶、脯氨酰氨基酸二肽酶和氨?；彼岫拿?，都是這一蛋白水解體系的重要組成部分。
Casey和Meyer(1985)首次在乳酸菌中發(fā)現(xiàn)了X-脯氨酰-二肽氨肽酶。目前，X-脯氨酰-二肽氨肽酶已在許多乳酸菌中得以純化，如，Streptococcus thermopbilu，Lactococcus lactissubsp.cremoris，Lactococcus lactis subsp.lactis，Lactobacillus delbruecki subsp.bμlgaricus and L.helveticus。此外，X-脯氨酰-二肽氨肽酶基因已從Lactococcus lactis subsp.cremoris，Lactococcuslactis subsp.，Lactobacillus delbruecki subsp.bμlgaricus and L.helveticus.的基因文庫(kù)中得以克隆和測(cè)序。
本發(fā)明的目的是提供一種新的X-脯氨酰-二肽氨肽酶，它是乳酸球菌的X-脯氨酰-二肽氨肽酶。
本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼該新型X-脯氨酰-二肽氨肽酶的DNA序列。
本發(fā)明的再一目的是提供生產(chǎn)該新型X-脯氨酰-二肽氨肽酶的方法和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的X-脯氨酰-二肽氨肽酶，該酶是乳酸球菌(Lactococcus lactis)的X-脯氨酰-二肽氨肽酶。較佳的，該酶包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的DNA序列，該DNA序列編碼具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽，較佳的，該DNA序列包括SEQ ID No.1中第1-2289位所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種表達(dá)載體，它含有上述的編碼本發(fā)明新型X-脯氨酰-二肽氨肽酶的DNA序列。此外，還提供所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。較佳的，該宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，更佳的是大腸桿菌。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種產(chǎn)生X-脯氨酰-二肽氨肽酶的方法，該方法包括(a)將編碼乳酸球菌的X-脯氨酰-二肽氨肽酶的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成乳酸球菌的X-脯氨酰-二肽氨肽酶表達(dá)載體，所述的核苷酸序列編碼具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成X-脯氨酰-二肽氨肽酶的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)該X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有乳酸球菌的X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種X-脯氨酰-二肽氨肽酶的應(yīng)用方法，該方法包括(a)大腸桿菌融合表達(dá)活性肽的融合蛋白，純化后用酸將其水解為N端多出兩個(gè)脯氨酸的多肽前體；(b)用X-脯氨酰-二肽氨肽酶水解去除多肽N端多余的兩個(gè)脯氨酸，釋放出具有生理活性的多肽。


圖1，重組質(zhì)粒pMD-pepX的構(gòu)建。圖2，重組質(zhì)粒pET-pepX的構(gòu)建。圖3，三種來(lái)源的X-脯氨酰-二肽氨肽酶氨基酸序列比較。圖4，重組X-脯氨酰-二肽氨肽酶表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖。圖5，重組X-脯氨酰-二肽氨肽酶純化的SDS-PAGE電泳圖。圖6，pH對(duì)X-脯氨酰-二肽氨肽酶活性影響的曲線圖。圖7，溫度對(duì)X-脯氨酰-二肽氨肽酶活性影響的曲線圖。圖8，pepX加工Pro-Pro-glucagon的毛細(xì)管電泳9，pepX加工Pro-Pro-glucagon產(chǎn)物對(duì)家兔的升血糖作用在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶(或多肽)編碼序列”指編碼具有乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.1中1-2289位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID No.1序列的編碼框1-2289位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID No.1中1-2289位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID No.2所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，較佳的在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID No.1中從核苷酸1-2289位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID No.1中從核苷酸1-2289位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳的至少80％，更佳的至少90％，最佳的至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶相同功能的蛋白質(zhì)的、SEQID No.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳的1-60個(gè)，更佳的1-20個(gè)，最佳的1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳的為30個(gè)以內(nèi)，更佳的為10個(gè)以內(nèi)，最佳的為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳的至少50％，更佳的至少80％，最佳的至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽”指具有乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶活性的SEQ ID No.2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶相同功能的、SEQ ID No.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳的1-30個(gè)，更佳的1-20個(gè)，最佳的1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳的為10個(gè)以內(nèi)，更佳的為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明還包括乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶的多肽變異形式，這些變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體。在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還提供了乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽的可溶性片段。通常，該片段具有乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳的至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳的至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳的至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還包括乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶或多肽的類似物。這些類似物與天然乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶保守性變異多肽”指與SEQ ID No.2的氨基酸序列相比有至多10個(gè)，較佳的至多8個(gè)，更佳的至多5個(gè)，最佳的至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的多肽。
本發(fā)明還包括乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽編碼序列及其片段的反義序列。
本發(fā)明還包括一種以SEQ ID No.1序列設(shè)計(jì)的可用作探針或引物的核苷酸分子，該分子通常具有乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶核苷酸序列的8-100個(gè)，較佳的15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳的，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳的，該宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，更佳的是大腸桿菌。
一旦表達(dá)了重組的本發(fā)明多肽之后，可用各種常規(guī)方法進(jìn)行分離純化。較佳的是通過(guò)如下步驟進(jìn)行分離滲透壓法破碎、硫酸銨分步沉淀和柱層析。其中，更佳的，柱層析是依次用Sephadex G-50柱進(jìn)行。
本發(fā)明的乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。
對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的乳酸球菌菌株作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，選用的原始菌是具有X-脯氨酰-二肽氨肽酶活性的乳酸球菌。抽提乳酸球菌的細(xì)菌染色體DNA。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)X-脯氨酰-二肽氨肽酶基因序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，在引物的兩頭加入酶切位點(diǎn)。以提取的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD-18T載體連接。載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，原位雜交篩選出一株陽(yáng)性克隆。對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列的測(cè)定，獲得X-脯氨酰-二肽氨肽酶基因長(zhǎng)度為2289bp的完整開(kāi)放閱讀框架，其氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)與已克隆的X-脯氨酰-二肽氨肽酶具有很高的同源性。隨后構(gòu)建了一株組成型高效表達(dá)X-脯氨酰-二肽氨肽酶的基因工程菌BL21/pET-pepX。經(jīng)DNA序列分析證實(shí)了表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。
BL21/pET-pepX在玉米漿培養(yǎng)基中X-脯氨酰-二肽氨肽酶的表達(dá)量占菌體總蛋白的50％左右，活力是野生菌的87倍，表達(dá)產(chǎn)物主要為可溶性的胞內(nèi)蛋白，僅有少量的產(chǎn)物分泌到胞外。搖瓶培養(yǎng)后純化得到了純度為85％的重組X-脯氨酰-二肽氨肽酶，比活力為23.1U/mg。酶的最適溫度為40℃、最適pH值為8。脯氨酸-脯氨酸-胰高血糖素31肽的酶切實(shí)驗(yàn)表明該酶能特異性地水解多肽氨基端第二個(gè)脯氨酸羧基端肽鍵。
工程菌株BL21/pET-pepX可以組成型表達(dá)重組的乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶，但培養(yǎng)條件極大地影響著酶的表達(dá)量和活性，為了獲得該酶的高效表達(dá)，對(duì)工程菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。
通常，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)條件為玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。搖床轉(zhuǎn)速為100-400 rpm，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h。
本發(fā)明新型X-脯氨酰-二肽氨肽酶具有以下等方面的應(yīng)用(1)作為分子生物學(xué)的試劑酶；(2)應(yīng)用于多肽工業(yè)利用X-脯氨酰-二肽氨肽酶特異性的Pro酶切位點(diǎn)，用大腸桿菌表達(dá)活性多肽，設(shè)計(jì)多肽的Pro連接位點(diǎn)，大量制備活性多肽。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了一套能夠高效表達(dá)和加工長(zhǎng)度為20-80個(gè)氨基酸殘基多肽的新系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，融合伙伴與目的活性肽在基因水平由氨基酸序列Asp-Pro-Pro連接，其中，Asp-Pro是酸水解位點(diǎn)。因此，融合蛋白在酸性條件下，Asp-Pro之間的肽鍵斷開(kāi)，形成N端多兩個(gè)Pro的多肽片段。用X-脯氨酰-二肽氨肽酶切除了N端的Pro-Pro后，就能釋放出具有活性的目的多肽。因此，X-脯氨酰-二肽氨肽酶在多肽基因工程生產(chǎn)和肽類激素工業(yè)生產(chǎn)中有重大意義。
(3)應(yīng)用于蛋白質(zhì)工業(yè)X-脯氨酰-二肽氨肽酶除了用于活性肽加工系統(tǒng)之外，還可用于加工重組的蛋白質(zhì)。如，用大腸桿菌表達(dá)真核基因時(shí)，可以在基因水平上于目標(biāo)蛋白質(zhì)序列的N端加上一個(gè)脯氨酸，在大腸桿菌表達(dá)中N端將被自動(dòng)加上一個(gè)蛋氨酸，形成Met-Pro-Protein，再用X-脯氨酰-二肽氨肽酶酶切，水解掉Met-Pro，形成天然序列的蛋白質(zhì)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中末注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，比如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例材料(1)菌株與質(zhì)粒乳酸球菌(Lactococcus lactis)由本實(shí)驗(yàn)室保存。
宿主菌E.coliDH5、E.coliBL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pET17b購(gòu)自novagen公司。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細(xì)菌基因組、質(zhì)粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產(chǎn)品；PepX特異性底物H-Ala-Pro-pNA.HCl為Bachem公司產(chǎn)品；純化蛋白用樹(shù)脂Sephadex G-50上海試劑廠產(chǎn)品。
(3)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)Sambrook J，F(xiàn)ristsh EF，Maniatis T. Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spuing Harbor Laboratory Press，1989。
玉米漿培養(yǎng)基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
方法分子生物學(xué)操作方法質(zhì)粒提取、內(nèi)切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌操作方法參見(jiàn)SambrookJ，F(xiàn)ristsh EF，Maniatis T. Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold SpringHarbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達(dá)量的測(cè)定參見(jiàn)Sambrook J，F(xiàn)ristsh EF，Maniatis T. Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold SpringHarbor Laboratory Press，1989，方法進(jìn)行。
實(shí)施例1 pepX基因的克隆乳酸球菌pepX基因的PCR擴(kuò)增與陽(yáng)性克隆的篩選用普洛麥格試劑盒，抽提乳酸球菌(Lactococcus lactis)的細(xì)菌染色體DNA。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)pepX基因序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，在引物的兩頭加入酶切位點(diǎn)。上游引物5’-GGA CTC CAT ATG CGC TTA ACC ATT TTT C-3’；下游引物5’-GTG CGG ATC CTTAAT TTT TCA CAC TTT CAA TAG G-3’。以提取的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD-18T載體連接。載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coil BL21(DE3)LysS，轉(zhuǎn)化子涂布于含有Amp的LB平板上培養(yǎng)16小時(shí)。以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物合成地高辛標(biāo)記的探針，原位雜交篩選陽(yáng)性克隆。在約400個(gè)重組子中，有27個(gè)陽(yáng)性克隆。以pepX基因特異引物與PUC-18普適引物配對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)以確定了幾株陽(yáng)性克隆的插入方向，選擇了一株有利于下一步酶切出目的基因的克隆，將其命名為pMD-pepX。
PepX基因的克隆重組質(zhì)粒的鑒定用BamHI、NdeI、PvuI酶切該質(zhì)粒后，在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，得到2.3kb、1.7kb、0.8kb三條DNA片段，與預(yù)測(cè)相符，證明克隆重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
實(shí)施例2乳酸球菌pepX基因核苷酸序列的測(cè)定用核苷酸自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)定。在所測(cè)定的2.4Kb核苷酸序列中，經(jīng)同源性比較發(fā)現(xiàn)存在pepX基因的完整開(kāi)放閱讀框架(ORF)，pepX ORF的長(zhǎng)度為2289bp。核苷酸序列和編碼的氨基酸序列分別為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，此外還示于圖1和2。
實(shí)施例3乳酸球菌pepX的同源性比較采用PC/GENE軟件，將pepX氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)與其它來(lái)源pepX的已報(bào)道氨基酸序列進(jìn)行同源性比較(圖6)。如圖所示，本發(fā)明的乳酸球菌與已克隆的不同亞種乳酸球菌Lactococcuslactis subsp.cremoris和Lactococcus lactis subsp.lactis的氨基酸同源性分別為94％、93％?；钚灾行腟er-348附近也具有G-K-S-Y-L-G保守結(jié)構(gòu)。因此證實(shí)了分離得到的是一種新來(lái)源的pepX基因。
實(shí)施例4工程茵B(yǎng)L21/pET-pepX的構(gòu)建如圖7所示，質(zhì)粒pMD-pepX經(jīng)Nde I和BamHI酶切，回收2.3kb左右的DNA片斷，連接到經(jīng)酶切的pET-17b上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-pepX(見(jiàn)圖7)。
將重組質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coil BL21(DE3)LysS中，構(gòu)建了工程菌BL21/pET-pepX，它能高效表達(dá)重組的pepX。
在玉米漿培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果在胞內(nèi)檢測(cè)到了pepX活性，活力是野生菌的87倍。SDS-PAGE電泳顯示，pepX主要存在于胞內(nèi)，胞內(nèi)的pepX占菌體總蛋白的50％左右，而破菌后離心的沉淀中不含有pepX，說(shuō)明pepX是以可溶狀態(tài)存在的，沒(méi)有形成包涵體。
實(shí)施例5乳酸球菌pepX多肽的制備工程茵的培養(yǎng)工程菌的培養(yǎng)在500ml搖瓶中進(jìn)行。需要重組質(zhì)粒新鮮轉(zhuǎn)化的菌株，從平皿中挑取單菌落接入LB試管37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期作為一級(jí)種子，以2％接種量接入到含200ml玉米漿培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，37℃，260rpm培養(yǎng)4h后，加入2％乳糖誘導(dǎo)，4h后收集菌體。
重組蛋白的分離純化菌體的滲透壓法破碎與硫酸銨分步沉淀發(fā)酵結(jié)束后5000rpm離心25min收集菌體，每1g濕菌體懸浮在1ml破壁液(45％蔗糖，10mmol EDTA，0.1％溶菌酶)中，在30℃攪拌90分鐘，將菌懸浮液快速傾入10ml水中，快速攪拌30分鐘。隨后邊攪拌，邊分批加入碾細(xì)的MnCl2直至溶液不粘稠為止，繼續(xù)攪拌30分鐘。5000rpm離心15min，上清中加入硫酸銨至30％飽和度，同樣離心上清中在加入硫酸胺至80％飽和度，離心的沉淀用PBS緩沖液溶解后進(jìn)行柱分離。
柱層析分離樣品溶解后用透析法脫鹽，收集樣品后上Sephadex G-50(2×60cm)，用PBS洗脫，對(duì)應(yīng)活力測(cè)定收集pepX活性峰，即可得到產(chǎn)物純品。
實(shí)施例6乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽的性質(zhì)對(duì)于實(shí)施例5中獲得的純化pepX，如下進(jìn)行鑒定和性質(zhì)研究。
(a)重組pepX比活力的測(cè)定PepX的活力可通過(guò)水解專一性底物H-Ala-Pro-pNA.HCl(Bachem)后釋放的pNA在410nm有吸收而測(cè)定。反應(yīng)體系為1.2 mMH-Ala-Pro-pNA.HCl，100 mM Tris/HCl，pH 8.0，總體積430μl，反應(yīng)溫度為37℃。加入30％(v/v)乙酸終止反應(yīng)。在410nm，pNA在0-1.2范圍內(nèi)呈線性。一個(gè)活力單位代表每分鐘釋放1μmol pNA，摩爾吸光系數(shù)為8800 M-lcm-1。蛋白質(zhì)濃度由考馬氏亮藍(lán)法蛋白定量試劑盒測(cè)定。
最終測(cè)定結(jié)果，pepX的比活力為23.1U/mg。
(b)重組pepX的最適溫度和pH值在pH 4-11范圍內(nèi)決定最適pH。將20μl稀釋的酶溶液與20μl底物溶液加入400μl一定pH下的50mM磷酸緩沖液中。37℃反應(yīng)8分鐘，在410nm下測(cè)定吸收值。結(jié)果表明，pH6-9時(shí)酶活力較高，最適pH為8.0左右。
在15-70℃測(cè)定最適溫度。反應(yīng)體系為20μl底物溶液，400μl 100mM Tris-HCl，pH 8.0，20μl稀釋的酶溶液。方法同前。結(jié)果表明，在37-45℃范圍內(nèi)，重組X-脯氨酰-二肽氨肽酶的酶活力較高，高于45℃后，酶活力顯著下降。
實(shí)施例7乳酸球菌X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽的應(yīng)用(a)X-脯氨酰-二肽氨肽酶加工Pro-Pro-glucagon本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了一套活性肽融合表達(dá)和加工新系統(tǒng)。融合伙伴與glucagon在基因水平由氨基酸序列Asp-Pro-Pro連接，其中Asp-Pro是酸水解位點(diǎn)。融合蛋白在酸性條件下，Asp-Pro之間的肽鍵斷開(kāi)，形成N-端多兩個(gè)Pro的多肽片段Pro-Pro-glucagon。
將純化的重組X-脯氨酰-二肽氨肽酶按1∶2000的酶∶底物比例加入純化的Pro-Pro-glucagon中，在pH7.0的50 mM磷酸緩沖液中于37℃孵育24小時(shí)。
(b)加工產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)毛細(xì)管電泳在HP 3D CE系統(tǒng)上進(jìn)行。該系統(tǒng)裝備一根長(zhǎng)48.5cm直徑50lμm的毛細(xì)管。樣品多肽濃度控制在1mg/ml。采用電進(jìn)樣的方法(200mbar.s)，流動(dòng)相為50moL/L磷酸緩沖液pH7.9，在電壓為30kv溫度為25℃下電泳30分鐘，200nm波長(zhǎng)檢測(cè)。對(duì)未酶切多肽、酶切產(chǎn)物多肽和二者的等體積混合物進(jìn)行了毛細(xì)管電泳。從電泳結(jié)果可以判斷，Pro-Pro-glucagon已被pepX水解為glucagon。
(c)加工產(chǎn)物的初步藥效實(shí)驗(yàn)三組家兔分別自腹腔注射預(yù)先配置好的酶切產(chǎn)物稀釋液、未酶切產(chǎn)物稀釋液和生理鹽水。在注射藥物后20分鐘、40分鐘、1小時(shí)和兩小時(shí)，自耳緣靜脈取血0.5ml，供測(cè)定血糖濃度。在注射酶切產(chǎn)物組，血糖在注射后40分鐘后顯著升高。而未酶切產(chǎn)物和空白對(duì)照組的血糖在注射前后無(wú)顯著變化。這證明重組X-脯氨酰-二肽氨肽酶對(duì)Pro-Pro-glucagon的酶切是成功的。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人中國(guó)藥科大學(xué)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司(ii)發(fā)明名稱一種乳酸球菌來(lái)源的X-脯氨酰-二肽氨肽酶及其制法和用途(iii)序列數(shù)目2(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2292 bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.1ATGCGCTTTA ACCATTTTTC AATTGTTGAT AAAAACTTTG ATGAACAACT AGCAGAACTT 60GATCAGCTTG GGTTTCGTTG GTCTGTTTTT TGGGATGAAA AGAAAATTTT AAAAGATTTT 120CTCATTCAAA GTCCTACTGA TATGACTGTT TTACAAGCAA ATACTGAGCT AGATGTCATT 180GAATTCTTAA AATCCTCTAT TGAATTAGAT TGGGAAATTT TCTGGAATAT TGCTTTGCAA 240CTTCTTGACT TTGTTCCAAA TTTTGATTTT GAAATAGGAA AAGCAACTGA ATTTGCTAAA 300AAACTTAATC TTCCACAAAG GGATGTTGAA ATGACAACTG AAACTATCAT CTCTGCTTTT 360TACTATTTAC TTTGTAGCCG TCGTAAAAGC GGGATGATTC TTGTTGAACA TTGGGTTTCA 420GAAGGTCTTC TTCCTTTGGA TAATCACTAT CACTTTTTCA ATGACAAATC ATTGGCAACT 480TTTGATTCTT CGCTCCTTGA ACGTGAGGTA GTTTGGGTTG AAAGTCCAGT TGATACTGAG 540CAAAAAGGAA AAAATGACTT AATTAAAATT CAAATTATCC GTCCAAAAAG TACAGAAAAG 600CTTCCGGTTG TGATGACCGC AAGCCCTTAT CATTTGGGAA TCAATGAGAA AGCAAATGAT 660TTAGCGCTTC ATGAAATGAA TGTTGATTTG GAAAAAAAGG ACAGTCACAA AATTCATGTC 720CAAGGAAAGC TTCCACAAAA ACGTCCATCT GAAACCAAAG AACTTCCTAT TGTAGATAAA 780GCACCTTATC GCTTTACTCA TGGTTGGACT TATTCTTTAA ATGACTACTT TTTGACGCGT 840GGTTTTGCTT CTATTTATGT GGCTGGTGTT GGAACGCGTG GCTCAAATGG CTTCCAAACT 900TCAGGCGATT ATCAGCAAAT TTACAGTATG ACTGCTGTTA TTGATTGGTT AAATGGCCGA 960ACTCGTGCCT ATACTTCTCG TAAAAAGACG CATGAAATTA AGGCCACTTG GGCAAACGGA 1020AAAGTAGCCA TGACAGGAAA GTCATATTTA GGAACGATGG CTTATGGTGC TGCTACTACT 1080GGAGTCGATG GACTTGAAGT CATCTTAGCT GAAGCTGGAA TTTCTTCTTG GTATAATTAC 1140TATCGTGAGA ATGGTCTTGT CCGTTCTCCT GGTGGCTTTC CTGGTGAAGA TTTAGATGTG 1200CTTGCTGCAC TGACTTACTC ACGAAATCTT GATGGTGCTG ATTATTTAAA AGGAAATGCT 1260GAATACGAAA AACGCTTAGC AGAAATGACC ACTGCTTTAG ACCGTAAGTC TGGTGATTAT 1320AATCAATTTT GGCATGACCG AAATTATTTA ATCAATTCTG ACCAAGTTAA AGCTGACGTC 1380CTAATTGTTC ACGGCTTACA AGACTGGAAT GTTACACCCG AACAAGCTTA TAATTTTTGG 1440CAGGCTCTGC CAGAAGGTCA TGCCAAGCAT GCCTTTCTAC ATCGTGGGGC TCATATTTAT 1500ATGAATTCTT GGCAATCCAT TGATTTTTCT GAGACAATCA ATGCTTATTT CTCTGCCAAA 1560TTATTAGATA GAGATTTAAA TTTAAATCTT CCACCCGTTA TTTTACAGGA AAATTCTAAA 1620GAACAAGTTT GGTCAGCTGT CAGTAAATTT GGGGGCGATG ACCAGCTCAA ACTCCCTCTT 1680GGGAAAACGG CGGTTTCTTT TGCTCAATTT GATAACCACT ATGATGATGA AAGCTTCAAA 1740AAGTATTCTA AAGATTTCAA TGTCTTTAAA AAAGATTTAT TTGAAAATAA AGCTAACGAA 1800GCTGTCATTG ATTTAGAACT TCCTTCTGAG TTAACAATTA ATGGTCCAAT TGAACTAGAA 1860ATCAGACTAA AATTAAATGA TAGTAAAGGG CTCTTATCTG CTCAAATTAT TGATTTTGGT 1920CCCAAAAAAC GGCTGGAAGA TAAAGCAAGA GTAAAAGATT TTAAAGTTCT TGACCGTGGC 1980CGAAACTTCA TGTTAGATGA TTTGGTTGAA CTTCCTCTTG TCGAAAGTCC TTATCAGTTG 2040GTCACTAAAG GATTTACCAA TCTCCAAAAC AAAGATTTAC TGACGGTCAG TGATTTAAAA 2100GCTGACGAAT GGTTTACGCT CAAATTTGAA CTACAACCAA CGATTTATCA TTTAGAAAAA 2160GCGGATAAAC TTCGGGTCAT ACTCTATAGT ACTGACTTTG AACATACGGT TCGTGATAAT 2220CGTAAAGTGA CTTACGAGAT TGATTTATCT CAATCCAAAC TCATTATTCC TATTGAAAGT 2280GTGAAAAATT AA 2292(3)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度763個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.2Met Arg Phe Asn His Phe Ser Ile Val Asp Lys Asn Phe Asp Glu 15Gln Leu Ala Glu Leu Asp Gln Leu Gly Phe Arg Trp Ser Val Phe 30Trp Asp Glu Lys Lys Ile Leu Lys Asp Phe Leu Ile Gln Ser Pro 45Thr Asp Met Thr Val Leu Gln Ala Asn Thr Glu Leu Asp Val Ile 60Glu Phe Leu Lys Ser Ser Ile Glu Leu Asp Trp Glu Ile Phe Trp 75Asn Ile Ala Leu Gln Leu Leu Asp Phe Val Pro Asn Phe Asp Phe 90Glu Ile Gly Lys Ala Thr Glu Phe Ala Lys Lys Leu Asn Leu Pro 105Gln Arg Asp Val Glu Met Thr Thr Glu Thr Ile Ile Ser Ala Phe 120Tyr Tyr Leu Leu Cys Ser Arg Arg Lys Ser Gly Met Ile Leu Val 135Glu His Trp Val Ser Glu Gly Leu Leu Pro Leu Asp Asn His Tyr 150His Phe Phe Asn Asp Lys Ser Leu Ala Thr Phe Asp Ser Ser Leu 165Leu Glu Arg Glu Val Val Trp Val Glu Ser Pro Val Asp Thr Glu 180Gln Lys Gly Lys Asn Asp Leu Ile Lys Ile Gln Ile Ile Arg Pro 195Lys Ser Thr Glu Lys Leu Pro Val Val Met Thr Ala Ser Pro Tyr 210His Leu Gly Ile Asn Glu Lys Ala Asn Asp Leu Ala Leu His Glu 225Met Asn Val Asp Leu Glu Lys Lys Asp Ser His Lys Ile His Val 240Gln Gly Lys Leu Pro Gln Lys Arg Pro Ser Glu Thr Lys Glu Leu 255Pro Ile Val Asp Lys Ala Pro Tyr Arg Phe Thr His Gly Trp Thr 270Tyr Ser Leu Asn Asp Tyr Phe Leu Thr Arg Gly Phe Ala Ser Ile 285Tyr Val Ala Gly Val Gly Thr Arg Gly Ser Asn Gly Phe Gln Thr 300Ser Gly Asp Tyr Gln Gln Ile Tyr Ser Met Thr Ala Val Ile Asp 315Trp Leu Asn Gly Arg Thr Arg Ala Tyr Thr Ser Arg Lys Lys Thr 330His Glu Ile Lys Ala Thr Trp Ala Asn Gly Lys Val Ala Met Thr 345Gly Lys Ser Tyr Leu Gly Thr Met Ala Tyr Gly Ala Ala Thr Thr 360Gly Val Asp Gly Leu Glu Val Ile Leu Ala Glu Ala Gly Ile Ser 375Ser Trp Tyr Asn Tyr Tyr Arg Glu Asn Gly Leu Val Arg Ser Pro 390Gly Gly Phe Pro Gly Glu Asp Leu Asp Val Leu Ala Ala Leu Thr 405Tyr Ser Arg Asn Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ala 420Glu Tyr Glu Lys Arg Leu Ala Glu Met Thr Thr Ala Leu Asp Arg 435Lys Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Phe Trp His Asp Arg Asn Tyr Leu 450Ile Asn Ser Asp Gln Val Lys Ala Asp Val Leu Ile Val His Gly 465Leu Gln Asp Trp Asn Val Thr Pro Glu Gln Ala Tyr Asn Phe Trp 480Gln Ala Leu Pro Glu Gly His Ala Lys His Ala Phe Leu His Arg 495Gly Ala His Ile Tyr Met Asn Ser Trp Gln Ser Ile Asp Phe Ser 510Glu Thr Ile Asn Ala Tyr Phe Ser Ala Lys Leu Leu Asp Arg Asp 525Leu Asn Leu Asn Leu Pro Pro Val Ile Leu Gln Glu Asn Ser Lys 540Glu Gln Val Trp Ser Ala Val Ser Lys Phe Gly Gly Asp Asp Gln 555Leu Lys Leu Pro Leu Gly Lys Thr Ala Val Ser Phe Ala Gln Phe 570Asp Asn His Tyr Asp Asp Glu Ser Phe Lys Lys Tyr Ser Lys Asp 585Phe Asn Val Phe Lys Lys Asp Leu Phe Glu Asn Lys Ala Asn Glu 600Ala Val Ile Asp Leu Glu Leu Pro Ser Glu Leu Thr Ile Asn Gly 615Pro Ile Glu Leu Glu Ile Arg Leu Lys Leu Asn Asp Ser Lys Gly 630Leu Leu Ser Ala Gln Ile Ile Asp Phe Gly Pro Lys Lys Arg Leu 645Glu Asp Lys Ala Arg Val Lys Asp Phe Lys Val Leu Asp Arg Gly 660Arg Asn Phe Met Leu Asp Asp Leu Val Glu Leu Pro Leu Val Glu 675Ser Pro Tyr Gln Leu Val Thr Lys Gly Phe Thr Asn Leu Gln Asn 690Lys Asp Leu Leu Thr Val Ser Asp Leu Lys Ala Asp Glu Trp Phe 705Thr Leu Lys Phe Glu Leu Gln Pro Thr Ile Tyr His Leu Glu Lys 720Ala Asp Lys Leu Arg Val Ile Leu Tyr Ser Thr Asp Phe Glu His 735Thr Val Arg Asp Asn Arg Lys Val Thr Tyr Glu Ile Asp Leu Ser 750Gln Ser Lys Leu Ile Ile Pro Ile Glu Ser Val Lys Asn 76權(quán)利要求
1.一種分離的X-脯氨酰-二肽氨肽酶，其特征在于，該酶是乳酸球菌(Lactococcus lactis)來(lái)源的X-脯氨酰-二肽氨肽酶。
2.如權(quán)利要求1所述X-脯氨酰-二肽氨肽酶，其特征在于，它包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一種分離的DNA序列，其特征在于，該DNA序列編碼具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA序列，其特征在于，該DNA序列包括SEQ ID No.1中第1-2289位所示的核苷酸序列。
5.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述DNA序列。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它被權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
7.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是大腸桿菌BL21/pET-pepX。
8.一種產(chǎn)生X-脯氨酰-二肽氨肽酶的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼乳酸球菌的X-脯氨酰-二肽氨肽酶的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成乳酸球菌的X-脯氨酰-二肽氨肽酶表達(dá)載體，所述的核苷酸序列編碼具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成X-脯氨酰-二肽氨肽酶的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)該X-脯氨酰-二肽氨肽酶多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有乳酸球菌的X-脯氨酰-二肽氨肽酶活性的多肽。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，培養(yǎng)條件為玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。搖床轉(zhuǎn)速為100-400rpm，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟(d)中，還包括以下步驟滲透壓法破碎、硫酸銨沉淀，然后用SephadexG-150柱進(jìn)行柱層析。
11.一種X-脯氨酰-二肽氨肽酶的應(yīng)用方法，其特征在于，該方法包括(a)大腸桿菌融合表達(dá)活性肽的融合蛋白，純化后用酸將其水解為N端多出兩個(gè)脯氨酸的多肽前體；(b)用X-脯氨酰-二肽氨肽酶水解去除步驟(a)中的多肽前體N端多余的兩個(gè)脯氨酸，釋放出具有生理活性的多肽。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，酶切反應(yīng)的條件為純化的重組X-脯氨酰-二肽氨肽酶按1∶2000的酶∶底物比例與多肽前體在pH7.0的50mM磷酸緩沖液中于37℃孵育24小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)克隆到乳酸球菌(Lactococcus lactis)的X－脯氨酰－二肽氨肽酶，該酶能能特異的識(shí)別多肽或蛋白質(zhì)氨基端第二位的脯氨酸，并將其碳端肽鍵水解，從而去除氨基端的X－脯氨酸二肽。將該酶基因置于表達(dá)質(zhì)粒pET17b的T7啟動(dòng)子下游，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中表達(dá)，X－脯氨酰－二肽氨肽酶的表達(dá)量占菌體總蛋白的50％。酶經(jīng)滲透壓法破碎、硫酸銨沉淀和柱層析純化。脯氨酸－脯氨酸－胰高血糖素31肽的酶切實(shí)驗(yàn)表明純化的酶能特異性地水解多肽氨基端第二個(gè)脯氨酸羧基端肽鍵，生成有活性的胰高血糖素。
文檔編號(hào)C12N15/57GK1408856SQ0112715
公開(kāi)日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2001年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月28日
發(fā)明者劉景晶, 明欣, 肖偉, 戴翔翎, 李明慧, 凌婭, 揚(yáng)立, 丁敏, 林潔, 廖正根 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué), 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司