專利名稱：一種磷酯酶制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物制品領(lǐng)域，更具體涉及微生物胞外酶的制備方法。
磷酯酶C系由CW-W-90-3菌產(chǎn)生的胞外酶，用搖瓶培養(yǎng)，(NH4)2SO4沉淀，柱層析技術(shù)，它是作用于甘油磷酯C3磷酯酰鍵上的一種水解酶。國內(nèi)外雖有關(guān)于該酶的產(chǎn)生菌、純化制備等報道，但僅限于實驗室研究階段，經(jīng)檢索未見到一種磷酯酶制劑的制備技術(shù)。
本發(fā)明的目的是提供了一種磷酯酶制劑的制備方法，方法易行，制備簡便，酶凍干粉含量為2000～4000u/g，成本低，為研制開發(fā)磷酯酶C制成抗血小板聚集的生物制品開辟了途徑。
為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施用來生產(chǎn)本發(fā)明所述的磷酯酶C的菌種是本發(fā)明通過篩選獲得的，其具有高產(chǎn)磷酯酶C的能力，該菌株已于99年9月21日經(jīng)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號CCTCCM99011。并于1999年11月8日申請國家專利，申請?zhí)?9120046.2。
該菌株經(jīng)活化，菌種培養(yǎng)，再經(jīng)30L半自動發(fā)酵罐發(fā)酵，后經(jīng)4000L罐發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵周期18～24小時。發(fā)酵液經(jīng)管式高速離心，去菌體后，取上清，經(jīng)硫酸銨分級沉淀獲取粗酶泥，粗酶泥經(jīng)精制后，透析脫鹽，PEG-6000濃縮，再經(jīng)調(diào)制、冷凍干燥、粉碎即為凍干酶粉。酶活力單位達2000～4000u/g。
具體步驟如下菌種如前述，本發(fā)明使用的菌種系已于99年9月21日經(jīng)中國典型培養(yǎng)保藏中心篩選，編號為CCTCCM99011，磷酯酶C產(chǎn)生菌氣單胞菌層CW-W-90-3菌株。1.菌種活化將無菌水滴入菌種CW-W-90-3菌株的凍干管中，混勻。用接種環(huán)、將菌種接種在牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，葡萄糖0.5％，NaCl 0.5％的固體培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)，pH7.0-7.2，溫度30℃，時間24小時；2.種子液的培養(yǎng)將活化好的菌種接種在裝有牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，葡萄糖0.5％，NaCl 0.5％的液體培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)，pH值6.5-8.0，溫度25～37℃，時間8～10小時，攪拌速度200～240r/m；3.發(fā)酵液培養(yǎng)將種子液接入發(fā)酵罐中，其培養(yǎng)基同種子液培養(yǎng)基，接種量5％～10％，pH6.5～8.0，經(jīng)25～37℃，攪拌速度200～240r/m，通氣量1∶0.3～0.5，高壓0.05Mpa，發(fā)酵時間18～24hr，收集發(fā)酵液；4.純化將發(fā)酵液經(jīng)14000r/m管式高速離心機離心30分鐘棄去沉淀、收集上清液。經(jīng)30％～80％(NH4)2SO4分級沉淀獲得粗酶，再經(jīng)蒸餾水溶解，離心去雜質(zhì)，取酶泥經(jīng)透析脫鹽，PEG-6000濃縮，獲得精酶泥；5.冷凍干燥將精酶泥用蒸餾水調(diào)至適當濃度，保證含干物質(zhì)10％。在0.05Mpa以下真空環(huán)境，-40℃低溫預冷凍4小時，再升華到0℃維持10小時，最后緩慢升溫到25℃，干燥6小時，獲得磷酯酶C凍干粉。該粉白色至微黃白色、疏松、無異味，經(jīng)檢測其酶活力單位達2000～4000u/g。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果發(fā)酵時間短，方法易行、工藝簡便、成本低，制劑穩(wěn)定性好，白色至微黃白色、疏松、無異味，適合于大批量生產(chǎn)，酶凍干粉酶活力單位達2000～4000u/g。經(jīng)藥效試驗結(jié)果表明該制劑有抗血小板聚集的功能，毒理試驗表明其屬實際微毒物質(zhì)。將磷酯酶C研究開發(fā)新生物制品一類新藥，將有良好的市場前景。
實施例1用WS-P-B-30-L型半自動30升不銹鋼發(fā)酵罐發(fā)酵。
1.菌種活化將無菌水滴入菌種CW-W-90-3菌株的凍干管中混勻，用接種環(huán)將菌種接種在牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，葡萄糖0.5％，NaCl0.5％的固體培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)，pH7.0-7.2，溫度30℃，時間24小時；2.種子液的培養(yǎng)將菌種接種在裝有牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，葡萄糖0.5％，NaCl0.5％的液體培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，每瓶裝50ml共20瓶。pH7.0，溫度30℃，時間8小時，搖床轉(zhuǎn)速240r/m。3.發(fā)酵液的培養(yǎng)將種子液1L接入裝有20L料的30L發(fā)酵罐中，32℃，通氣量1∶0.5，高壓0.05Mpa，攪拌速度200r/m，發(fā)酵22小時，收集發(fā)酵液。4.純化將發(fā)酵液經(jīng)大容量冷凍離心機4000r/m離心30分鐘，棄去沉淀，收集上清液加30％(NH4)2SO4，沉淀12小時，再離心20分鐘，轉(zhuǎn)速4000r/m，棄去沉淀，收集上清液，再加80％(NH4)2SO4沉淀12小時，再經(jīng)4000r/m，離心20分鐘棄去上清液收集沉淀，該沉淀為粗酶泥，粗酶泥再經(jīng)離心，脫鹽，PEG-6000濃縮，即獲得精酶泥；5.冷凍干燥將精酶泥用蒸餾水調(diào)至適當濃度，保證含干料10％，加輔料脫脂奶粉3％，然后在0.05Mpa以下真空環(huán)境，-40℃低溫預冷凍4小時，再升華到0℃維持10小時，最后緩慢升溫到25℃，干燥6小時。獲得酶粉38g，酶活1086.9u/g，總酶活41302u。
實施例2菌種活化方法同上，將菌株接種于裝有70L料的種子罐中培養(yǎng)10小時，溫度30℃，攪拌速度240r/m，然后全部移入裝有2400L料的發(fā)酵罐中，30℃，通氣量1∶0.3～0.5，壓力0.05Mpa。攪拌速度240r/m，22小時放罐。發(fā)酵液經(jīng)管式離心機離心沉淀，轉(zhuǎn)速4000r/m，時間25m，棄去沉淀收集上清液，將上清液加30％(NH4)2SO4沉淀12小時；再經(jīng)管式離心機離心沉淀，轉(zhuǎn)速4000r/m，時間20m，棄去沉淀，收集上清液。該液加80％(NH4)2SO4沉淀12小時；最后經(jīng)管式離心機離心沉淀，轉(zhuǎn)速4000r/m，時間20m，棄去上清液，收集沉淀，該沉淀為粗酶泥，粗酶泥再經(jīng)離心，脫鹽，PEG-6000濃縮，即獲得精酶泥。用蒸餾水調(diào)至適當濃度，保證含干料10％，加輔料脫脂奶粉3％，然后在0.05Mpa以下真空環(huán)境，-40℃低溫預冷凍4小時，再升華到0℃維持10小時，最后緩慢升溫到25℃，干燥6小時。獲得磷酯酶C凍干粉8.4kg，酶活1639.5u/g粉，總酶活13771.8×103u。
實施例3菌種活化方法同上，將菌株接種于裝有240L料的種子罐中培養(yǎng)8hr，溫度30℃，攪拌速度240r/m。然后全部移入裝2400L料發(fā)酵罐中，同例2條件發(fā)酵，22hr放罐，發(fā)酵液經(jīng)4000r/m管式離心機離心，時間30m，棄去沉淀，收集上清液。將上清液加30％(NH4)2SO4沉淀12小時，再經(jīng)管式離心機離心，轉(zhuǎn)速4000r/m，時間20m，棄去沉淀，收集上清液。該液加80％(NH4)2SO4沉淀12小時，再經(jīng)管式離心機離心，轉(zhuǎn)速4000r/m，時間20m，棄去上清液，收集沉淀，該沉淀物為粗酶泥。粗酶泥再經(jīng)離心，脫鹽，PEG-6000濃縮，即獲得精酶泥，將其用蒸餾水調(diào)至適當濃度，保證含干料10％，加輔料3％脫脂奶粉。然后在0.05Mpa以下真空環(huán)境，-40℃低溫預冷凍4小時，再升華到0℃維持10小時，最后緩慢升溫到25℃，干燥6小時，獲得磷酯酶C凍干粉13.6kg，酶活1650.0u/g粉，總酶活22440×103u。
權(quán)利要求
1.一種磷酯酶制劑的制備方法，包括磷酯酶C單胞菌屬CW-W-90-3菌株，其特征是A、菌種活化，將無菌水滴入菌種的凍干管中，混勻，再將菌種接在牛肉膏、蛋白質(zhì)、葡萄糖、NaCl的固體培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)；B、種子液的培養(yǎng)，將菌種接裝有液體培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)，pH值6.5～8.0，溫度25～37℃，時間8～12小時，攪拌速度200～240r/m；C、發(fā)酵液的培養(yǎng)，將種子液接入發(fā)酵罐中，其培養(yǎng)基同種子液培養(yǎng)基，接種量5～10％，通氣量1∶0.3～0.5，高壓0.05Mpa；D、純化，將發(fā)酵液經(jīng)4000r/m離心，棄去沉淀，收集上清液，經(jīng)30～80％(NH4)2SO4分級沉淀，再經(jīng)蒸餾水溶解，離心去雜質(zhì)，脫鹽、濃縮；E、冷凍干燥，將精酶泥調(diào)至濃度，并加入輔料脫脂奶粉3％，在0.05Mpa以下真空環(huán)境，-40℃冷凍4小時，再升華到0℃維持10小時，最后升溫到25℃，干燥6小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磷酯酶制劑的制備方法,首先是菌種活化,將無菌水滴入菌體的凍干管中混勻,再將菌種接在固體培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng);其次是種子液的培養(yǎng),將菌種接在裝有液體培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng);再次是發(fā)酵液的培養(yǎng),將種子液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng),接種量5～10%,通氣量1∶0.3～0.5,高壓0.05MPa;第四是純化,將發(fā)酵液離心,棄去沉淀,收集上清液,分級沉淀;第五是冷凍干燥。本發(fā)明方法易行,工藝簡便,酶凍干粉活力單位2000～4000u/g,具有抗血小板聚集的功能,制劑穩(wěn)定性好,適合于大批量生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/20GK1362516SQ0110641
公開日2002年8月7日 申請日期2001年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月8日
發(fā)明者陳濤, 孫松柏, 宋建華 申請人:中國科學院武漢病毒研究所