專利名稱：α－酮醇不飽和脂肪酸衍生物以及使用它的植物生長調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物以及利用該化合物所具特性的植物生長調(diào)節(jié)劑。更詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及作為新物質(zhì)的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物，以及含有該衍生物的植物成花促進劑、植物賦活劑以及包括上述用途的植物生長調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明特別適合于植物成花促進劑。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻1特開平9-295908號公報專利文獻2特開平11-29410號公報專利文獻3特開2002-226309號公報非專利文獻1Yokoyama et al.，Plant Cell Physiol.，41，110-113，2000開發(fā)植物生長調(diào)節(jié)劑，尤其是開發(fā)促進植物花芽形成的技術(shù)，在提高谷類植物或園藝植物的供給效率方面，具有重要的意義。眾所周知，作為決定植物成花的因素，包括晝長，低溫，植物的老化等。現(xiàn)已查明，植物中感應(yīng)晝長的部位是葉片，而花芽在生長點形成，葉片通過葉柄或莖向生長點輸送某種信號，成花過程開始。這種信號一般稱為成花素，如果能夠?qū)⑵浞蛛x，鑒定，則有可能與晝長無關(guān)地人為調(diào)節(jié)植物的開花時間，不言而喻，這將對與植物有關(guān)的多個領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響。
因此，長久以來人們就試圖通過進一步闡明植物的成花過程機理，人為地調(diào)節(jié)開花時間。例如，現(xiàn)已知，如果給植物施用一種植物生長激素赤霉素，則多種植物易于形成花芽。另外已經(jīng)確認(rèn)，給菠蘿施以一種合成植物生長激素α-萘乙酸，則可以促使菠蘿開花，該技術(shù)實際上已經(jīng)在產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用。
但是，以上記述的那些植物激素，其效果是受到限制的，人們希望將開花的技法更進一步提高，具體而言，即，期望分離、鑒定直接與成花相關(guān)的物質(zhì)，通過該物質(zhì)確立開花的方法。
因此，本發(fā)明人進行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過單獨使用具有下述式(2A)表示的特定結(jié)構(gòu)的α-酮醇不飽和脂肪酸，或者與作為一種兒茶酚胺的去甲腎上腺素組合使用等，對于眾多植物能夠活化出所期望的誘導(dǎo)成花作用(參見專利文獻1和2)。
另外，之后進行了更深入地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上述α-酮醇不飽和脂肪酸的羧基上通過酰胺鍵結(jié)合了氨基酸的α-酮醇不飽和脂肪酸酰胺，在更低的濃度下，具有同樣的活性(參見專利文獻3)。
式(2A)發(fā)明內(nèi)容但是，考慮到該α-酮醇不飽和脂肪酸酰胺的制備成本，以及減少在植物體上的使用量等問題，人們希望開發(fā)出在更低的濃度下，顯示同樣效果的化合物。
另外，式(2A)的α-酮醇不飽和脂肪酸以及上述的α-酮醇不飽和脂肪酸酰胺容易分解，所以，人們希望開發(fā)出穩(wěn)定性更優(yōu)異的具有促進植物成花以及賦予植物活性等的調(diào)節(jié)植物生長性能的物質(zhì)。
因此，本發(fā)明人以解決上述課題為目的，進行了研究開發(fā)，結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)除了含有α-酮醇和烯烴結(jié)構(gòu)之外，還具有在相鄰2個碳原子上存在OH基團的二醇結(jié)構(gòu)，即，具有鄰二醇結(jié)構(gòu)的特定結(jié)構(gòu)的新物質(zhì)，并合成了下述通式(1)表示的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)，并且發(fā)現(xiàn)，將其用于植物，具有植物生長調(diào)節(jié)性能。
即，本發(fā)明合成了具有α-酮醇、順雙鍵以及鄰二醇結(jié)構(gòu)的新物質(zhì)，即，下述α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)，并且發(fā)現(xiàn)將該物質(zhì)以極低濃度用于植物時，也具有調(diào)節(jié)植物生長的性能，尤其可以促進成花。
另外，還對上述α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)的制備方法進行了研究，結(jié)果成功地開發(fā)了低成本的制備方法。
進而，還判明該化合物很難分解，穩(wěn)定性更加優(yōu)異。
因此，本發(fā)明要解決的課題，即發(fā)明的目的在于，提供具有植物生長調(diào)節(jié)性能的新物質(zhì)，即，α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)，以及含有該物質(zhì)的植物成花促進劑等的植物生長調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明提供如上所述的具有植物生長調(diào)節(jié)性能的新物質(zhì)，即，α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)，以及含有該物質(zhì)的植物成花促進劑等的植物生長調(diào)節(jié)劑，上述的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)是下述通式(1)表示的物質(zhì)。
另外，后者的植物生長調(diào)節(jié)劑，是含有下述通式(1)表示的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)的物質(zhì)，它尤其適合被用作植物成花促進劑。
通式(1)(式中，R1表示碳原子數(shù)1～5的直鏈烷基，或者表示有1個或2個雙鍵的碳原子數(shù)3～5的直鏈不飽和烴基，R2表示碳原子數(shù)1～15的直鏈亞烷基，或者表示有1～3個雙鍵的碳原子數(shù)2～15直鏈不飽和烴基，但碳原子之間的雙鍵數(shù)最大是4。)另外，上述直鏈烷基，直鏈不飽和烴基，直鏈亞烷基，或者直鏈不飽和烴基中的「直鏈」的含義是指，碳鏈沒有分支，呈直線鍵合。例如，直鏈亞烷基是指，碳鏈沒有分支，呈直線連接，去掉脂肪烴中與2個不同的碳原子鍵合的2個氫原子，生成的兩價原子團，一般以通式-(CH2)n-表示。
本發(fā)明提供具有促進植物成花性能等的植物生長調(diào)節(jié)能力，除了含有α-酮醇和烯烴結(jié)構(gòu)之外，還含有鄰二醇結(jié)構(gòu)的新物質(zhì)，即上述通式(1)表示的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)，另外，本發(fā)明還提供利用了它的性能的植物成花促進劑，植物賦活劑，以及包括這些性能在內(nèi)的植物生長調(diào)節(jié)劑。
另外，作為植物賦活劑，α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)具有打破休眠，生根，促進開花，促進成花，促進草或莖生長等的性質(zhì)，所以通過利用這些性質(zhì)，具體地可被用作打破休眠劑，生根劑，開花促進劑，成花促進劑，草或莖生長促進劑等使用。
并且，該化合物在低濃度下也能顯示出這些性能，并且不易分解，穩(wěn)定性更加優(yōu)異，所以，本發(fā)明可以提供優(yōu)異的植物成花促進劑，植物賦活劑，植物生長調(diào)節(jié)劑。


以下，參考附圖對本發(fā)明進行說明。
圖1是表示由特定α-酮醇脂肪酸(1A)轉(zhuǎn)化成特定的α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的生成率圖，圖2是表示特定的α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)對牽牛花增加花芽活性的圖，圖3是表示評價特定的α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)和特定的α-酮醇脂肪酸(2A)的穩(wěn)定性的試驗結(jié)果圖。
具體實施例方式
以下，對本發(fā)明，包括用于實施發(fā)明的最佳方案在內(nèi)的發(fā)明實施方案進行詳細(xì)說明。
本發(fā)明的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物是上述通式(1)表示的物質(zhì)，可以將該物質(zhì)用為植物成花促進劑，或者，植物生長調(diào)節(jié)劑，該植物生長調(diào)節(jié)劑具有能夠呈現(xiàn)打破休眠，生根、促進開花，促進著花，促進草或莖生長等性能的植物賦活劑等用途。
本發(fā)明的衍生物，只要含有上述通式(1)表示的結(jié)構(gòu)，就能呈現(xiàn)出適用于上述用途的性能。
關(guān)于其衍生物，具體而言是，上述通式(1)中，R1表示碳原子數(shù)1～5的直鏈烷基，或者表示有1個或2個雙鍵的碳原子數(shù)3～5的直鏈不飽和烴基。另外，R2表示碳原子數(shù)1～15的直鏈亞烷基，或者表示有1～3個雙鍵的碳原子數(shù)2～15的直鏈不飽和烴基。但碳原子之間的雙鍵數(shù)最大是4。如上所述，本發(fā)明的上述不飽和脂肪酸衍生物的碳原子數(shù)為11～29。
特別是，下述式(1A)表示的9，15，16-三羥基-10-氧代-12(Z)-十八碳烯酸是上述通式(1)中優(yōu)選的化合物，可以適用于上述各種用途。另外，下述式(1A)的化合物是上述通式(1)中的，R1是C2的直鏈烷基，R2是C7的直鏈亞烷基的化合物。
另外，上述分子式中的「Z」表示順·反異構(gòu)體中的順式異構(gòu)體的含義，其下方劃線表示本應(yīng)使用斜體記載。
式(1A)A.關(guān)于α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)的合成首先，對包含式(2A)的α-酮醇不飽和脂肪酸的下述通式(2)表示的α-酮醇不飽和脂肪酸的制備方法進行說明。
通式(2)(式中，R1表示碳原子數(shù)1～5的直鏈烷基，或者表示有1個或2個雙鍵的碳原子數(shù)3～5的直鏈不飽和烴基，R2表示碳原子數(shù)1～15的直鏈亞烷基，或者表示有1～3個雙鍵的碳原子數(shù)2～15的直鏈不飽和烴基，但碳原子之間的雙鍵數(shù)最大是4。)
眾所周知，天然物中含有上述通式(2)表示的α-酮醇不飽和脂肪酸所包括的上述式(2A)的α-酮醇不飽和脂肪酸，可以通過從該天然物中提取精制來制取α-酮醇不飽和脂肪酸(2A)。
另外，按照植物體內(nèi)的脂肪酸代謝途徑，使脂肪氧合酶等的酶作用于α-亞麻酸，也可以獲得，進而，運用通常公知的化學(xué)合成法也可以制備α-酮醇不飽和脂肪酸。
關(guān)于包含式(2A)的α-酮醇不飽和脂肪酸的上述通式(2)的α-酮醇不飽和脂肪酸(2)的制備，例如，還可以按照上述專利文獻1、專利文獻2或非專利文獻1中記載的方法進行。
另外，關(guān)于α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)的制備，可以通過使上述的α-酮醇不飽和脂肪酸(2)與產(chǎn)生活性氧或氯自由基的強氧化劑相接觸來進行。
此類強氧化劑，有例如次氯酸鈉或氯化三聚異氰酸。此時優(yōu)選在1小時之內(nèi)結(jié)束反應(yīng)，更優(yōu)選在30分鐘之內(nèi)結(jié)束反應(yīng)。
延長反應(yīng)時間使其超過所必要的反應(yīng)時間，會增加生成的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)再分解的危險性。另外，重要的是α-酮醇不飽和脂肪酸(2)與氧化劑的存在比。
例如，使用次氯酸鈉時，相對于100摩爾的α-酮醇不飽和脂肪酸(2)使用0.01～0.5摩爾的次氯酸鈉較好。該次氯酸鈉量在很大程度上受α-酮醇不飽和脂肪酸的純度的影響，高純度(純度90％以上)時，可以在上述范圍內(nèi)，純度較低時，氯酸鈉的配合量以0.01～10摩爾數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)。對于此時的反應(yīng)溫度不作特殊要求，但優(yōu)選冰冷卻至室溫之間。另外，關(guān)于反應(yīng)溶劑，即使與水共存80％以下的水以外的溶劑也沒有什么問題，可以使用例如，甲醇，乙醇，丙酮等的含水溶劑，優(yōu)選在水中進行反應(yīng)。
本發(fā)明化合物的檢測可以使用UV檢測器，將之與HPLC等組合，可以確認(rèn)本發(fā)明化合物的生成。
進而，可以使用通常公知的方法從反應(yīng)液中分離精制本發(fā)明化合物，例如可以使用溶劑提取法或柱色譜法等。
B.關(guān)于α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)的植物生長調(diào)節(jié)作用作為本發(fā)明的植物生長調(diào)節(jié)劑有效成分的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)對植物的施用量的上限，沒有特別限定。即，即使大量地施用本發(fā)明的植物生長調(diào)節(jié)劑，即大量地施用α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)，也幾乎沒有發(fā)現(xiàn)對植物的生長阻礙等的不良影響。
這一點與以前使用的植物激素劑相比，可以說本發(fā)明的植物生長調(diào)節(jié)劑非常優(yōu)異，以往使用的植物激素劑，如果過量施用會明顯地出現(xiàn)對植物的不良影響，在使用這些植物激素時，要特別注意不能施用過量。
另外，上述的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)對植物的施用量的下限，根據(jù)植物個體的種類或大小的不同而變化，作為其濃度的大致標(biāo)準(zhǔn)是每株植物每次的施用量約為1μM以上。
作為本發(fā)明的植物生長調(diào)節(jié)劑的一種形態(tài)的成花促進劑，其中的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)的配合量，可以根據(jù)其使用狀態(tài)、成為對象植物的種類，進一步，根據(jù)該成花促進劑的具體劑型等進行選擇。
作為本發(fā)明的成花促進劑的形態(tài)，可以直接使用α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)，也可以制成如下所述的各種的劑型，此時，如果考慮到上述α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)的施用標(biāo)準(zhǔn)等，則相對于試劑總量，優(yōu)選含有0.1～100ppm左右，更優(yōu)選含有為1～50ppm左右。
如上所述，可以直接使用α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物(1)作為本發(fā)明的成花促進劑，也可以制成可適用于植物的所希望的劑型，例如可以制成液劑，固形劑，粉劑，乳劑，基底添加劑等，此時，在不損害本發(fā)明所期望的促進成花效果的范圍內(nèi)，可以根據(jù)劑型適當(dāng)?shù)嘏浜现苿W(xué)上適用的已知的載體成分、制劑用助劑等。
例如，作為上述載體成分，如果本發(fā)明的成花促進劑是基底添加劑或者固形劑時，大致可以使用滑石粉、粘土、蛭石、硅藻石、高嶺土、碳酸鈣、氫氧化鈣、白土、硅膠等的無機物或面粉、淀粉等的固體載體，另外，如果是液劑時，大致可以使用水，二甲苯等的芳香族烴類，乙醇、乙二醇等的醇類，丙酮等的酮類，二烷、四氫呋喃等的醚類，二甲基甲酰胺、二甲亞砜、乙腈等的液體載體作為上述載體成分。
另外，作為制劑用助劑，可以適當(dāng)?shù)嘏浜侠?，烷基硫酸酯類、烷基磺酸鹽、烷基芳基磺酸鹽、二烷基磺基琥珀酸鹽等的陰離子表面活性劑，高級脂肪族胺的鹽類等的陽離子表面活性劑，聚氧乙烯二醇烷基醚、聚氧乙烯二醇酰基酯、聚氧乙烯二醇多元醇?；ァ⒗w維素衍生物等非離子表面活性劑，明膠、酪蛋白、阿拉伯樹膠等的增稠劑，增量劑或接合劑等。
進一步，在不損害本發(fā)明所期望的效果的程度上，根據(jù)需要，可以在本發(fā)明的成花促進劑中配合植物生長調(diào)節(jié)劑、苯甲酸、煙酸、煙酸酰胺、哌可酸等。
上述本發(fā)明的成花促進劑可以按照劑型以各種方式施用于各種植物上。
例如，本發(fā)明中，作為液劑或乳劑，不但可以將其散布，滴加，或涂抹有望開花的植物的生長點，還可以將其散布，滴加，或涂抹在莖或葉為代表的植株的一部分或者整株上，作為固形劑或粉劑，可以施于土壤中被根部吸收。
另外，如果期望開花的植物是浮萍等的水草時，可用為基底添加劑使之從根部吸收，或可以將固形劑慢慢地溶解于水中等。
另外，本發(fā)明的脂肪酸衍生物(1)，與多巴胺或去甲腎上腺素等的兒茶酚胺進行反應(yīng)后，可以作為成花促進劑使用。
在該場合時，本發(fā)明的脂肪酸衍生物(1)與兒茶酚胺的配合比率，可以根據(jù)其目的，進而根據(jù)作為對象植物的性質(zhì)以及本發(fā)明的脂肪酸衍生物的具體形態(tài)適宜地調(diào)制，對此不作特殊限制。
另外，本發(fā)明的成花促進劑對植物的施用頻率，基本上只施用一次就可以獲得所希望的效果，但是根據(jù)植物個體的種類或施用目的等的不同而變化，必要時，可以反復(fù)多次施用，此時，施用間隔在1周以上是有效的。
進而，在很多情況下，根據(jù)使用本發(fā)明的成花促進劑的對象植物的性質(zhì)，對對象植物進行處理的同時，施用本發(fā)明的成花促進劑是有效的。
例如，在后述實施例中的牽?；ǖ那闆r下，在對牽?；ㄟM行一定程度的暗處理的同時使用本發(fā)明的成花促進劑是有效的。
關(guān)于可以適用本發(fā)明的成花促進劑的對象植物的種類沒有特殊限定，對雙子葉植物和單子葉植物兩類植物都有效。
在被子植物中，作為雙子葉植物可以列舉，包括牽牛屬植物(牽?；?、打碗花屬植物(日本打碗花、打碗花、腎葉打碗花)、甘薯屬植物(厚藤、甘薯)、菟絲子屬植物(五角菟絲子、南方菟絲子)的旋花科植物，包括石竹屬植物、繁縷屬植物、米努草屬植物、卷耳屬植物、漆姑草屬植物、蚤綴屬植物、莫石竹屬植物、異葉假繁縷屬植物、濱繁縷屬植物、牛漆姑草屬植物、潮爪草屬植物、麥瓶草屬植物、剪秋羅屬植物、粗壯女婁菜屬植物、狗筋蔓屬植物等的石竹科植物，以石竹科植物為首，還可以列舉木麻黃科植物、三百草科植物、胡椒科植物、金粟蘭科植物、楊柳科植物、楊梅科植物、胡桃科植物、樺木科植物、山毛櫸科植物、榆科植物、?？浦参?、蕁麻科植物、川苔草科植物、山龍眼科植物、鐵青樹科植物、檀香科植物。
另外，還可以列舉，桑寄生科植物、馬兜鈴科植物、大花草科植物、蛇菰科植物、蓼科植物、藜科植物、莧科植物、紫茉莉科植物、假繁縷科植物、商陸科植物、番杏科植物、馬齒莧科植物、木蘭科植物、昆欄樹科植物、連香樹科植物、睡蓮科植物、金魚藻科植物、毛茛科植物、野木瓜科植物、小蘗科植物、防己科植物、臘梅科植物、樟科植物、罌粟科植物、白花菜科植物、十字花科植物、茅膏菜科植物、豬籠草科植物、景天科植物、虎耳草科植物、海桐科植物、金縷梅科植物、懸鈴木科植物、薔薇科植物、豆科植物、酢漿草科植物、攏牛兒苗科植物、亞麻科植物、蒺藜科植物、蕓香科植物、苦木科植物、楝科植物、遠志科植物、大戟科植物、水馬齒科植物。
還可以列舉，黃楊科植物、巖高蘭科植物、馬?？浦参?、漆樹科、冬青科植物、衛(wèi)矛科植物、省沽油科植物、茶茱萸科植物、槭樹科植物、七葉樹科植物、無患子科植物、清風(fēng)藤科植物、鳳仙花科植物、鼠李科植物、葡萄科植物、杜英科植物、椴樹科植物、錦葵科植物、梧桐科植物、獼猴桃科植物、山茶科植物、小連翹科植物、溝繁縷科植物、檉柳科植物、堇菜科植物、大風(fēng)子科植物、旌節(jié)花科植物、西番蓮科植物、秋海棠科植物、仙人掌科植物、瑞香科植物、胡頹子科植物、千屈菜科植物、石榴科植物、紅樹科植物、八角楓科植物、野牡丹科植物、菱科植物、柳葉菜科植物、小二仙草科植物、杉葉藻科植物、五加科植物、傘形科植物。
除上述的以外，還可以列舉山茱萸科植物、巖梅科植物、山柳科植物、鹿蹄草科植物、杜鵑花科植物、紫金?？浦参?、報春花科植物、藍雪科植物、柿樹科植物、山礬科植物、野茉莉科植物、木犀科植物、醉魚草科植物、龍膽科植物、夾竹桃科植物、蘿藦科植物、花荵科植物、紫草科植物、馬鞭草科植物、唇形科植物、茄科植物(茄子、番茄等)、玄參科植物、菱霄花科植物、胡麻科植物、列當(dāng)科植物、苦苣苔科植物、貍藻科植物、爵床科植物、苦檻藍科植物、透骨草科植物、車前科植物、茜草科植物、忍冬科植物、五?；浦参铩♂u科植物、川續(xù)斷科植物、葫蘆科植物、桔梗科植物、菊科植物等。
同樣，作為單子葉植物，可以列舉，包括紫萍屬植物(紫萍)以及青萍屬植物(青萍、品藻)在內(nèi)的浮萍科植物、包括卡特蘭屬植物、“辛枇吉”蘭屬植物、石斛屬植物、蝴蝶蘭屬植物、萬帶蘭屬植物、兜蘭屬植物、金蝶蘭屬植物等的蘭科植物、香蒲科植物、黑三棱科植物、眼子菜科植物、茨藻科植物、芝菜科植物、澤瀉科植物、水鱉科植物、霉草科植物、禾本科植物(稻子、大麥、小麥、黑麥、玉米等)、莎草科植物、棕櫚科植物、天南星科植物、谷精草科植物、鴨跖草科植物、雨久花科植物、燈心草科植物、百部科植物、百合科植物(蘆筍等)、石蒜科植物、薯蕷科植物、鳶尾科植物、芭蕉科植物、姜科植物、美人蕉科植物、水玉簪科植物等。
以上的內(nèi)容對本發(fā)明化合物作為成花促進劑使用時的各種形態(tài)進行了具體且詳細(xì)地說明，除以上記載的以外，本發(fā)明的化合物還可以作為打破休眠劑，生根劑，開花促進劑，著花促進劑，草·莖生長促進劑等的各種植物賦活劑使用，此時，也可以采用如上所述的各種形態(tài)。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的化合物的制備例以及該化合物的使用例進行具體說明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制，不言而喻，只根據(jù)權(quán)利要求中的記載確定本發(fā)明。
另外，雖然本發(fā)明的化合物因存在多個不對稱碳原子而存在立體異構(gòu)體，但本發(fā)明的化合物可以是各單獨光學(xué)異構(gòu)體，也可以是這些光學(xué)異構(gòu)體的混合物。
制備例1特定α-酮醇脂肪酸(2A)的制備如下所述，通過酶催化法制備式(2A)表示的特定α-酮醇脂肪酸(9-羥基-10-氧代-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸)。
1.從米胚芽得到的脂肪氧合酶的制備將由350g的米胚芽經(jīng)石油醚洗滌、脫脂以及干燥得到的物質(zhì)(250g)放入1.25L的0.1M的乙酸緩沖液(pH4.5)中懸浮，并均化該懸浮物。
將上述均化的提取液以16000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離15分鐘，得到上清(0.8L)。
接著，在上述上清中加入140.8g的硫酸銨(30％飽和)，4℃下放置1夜。
之后，同樣以9500rpm轉(zhuǎn)速離心分離30分鐘，在得到的上清(0.85L)中加入232g的硫酸銨(70％飽和)，4℃下放置5小時。
進而，再同樣地以9500rpm轉(zhuǎn)速離心分離30分鐘，將由此得到的沉淀物(米胚芽提取液經(jīng)30～70％硫酸銨飽和分離的組分)溶解于pH4.5的300mL的乙酸緩沖液中，63℃下加熱處理5分鐘。
之后，除去生成的沉淀物從而得到上清，使用RC透析管(Spectrum公司制備的ポア4MWCO 12000～14000)以及3L的緩沖液，進行3次透析，由此脫鹽后，即可得到所期望的從米胚芽得到的脂肪氧合酶的粗酶液。
2.來自亞麻種子的丙二烯氧化合成酶的制備將250mL的丙酮添加到200g的亞麻種子(從一丸フアルコス社購入)中，分3次每次20秒間歇性地進行均化(20s×3)，用多孔板漏斗過濾所得沉淀物，除去溶劑。
將該沉淀物再一次懸浮于250mL的丙酮之中，進行均化(10s×3)，得到沉淀物。
將該沉淀物用丙酮以及乙醚洗滌后，干燥，即可得到亞麻種子的丙酮粉末(150g)。
取該亞麻種子的丙酮粉末中的20g，使其懸浮在400mL的冰冷下的50mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中，將之在4℃下用攪拌子攪拌1小時進行提取。
將得到的提取物以11000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，在由此得到的上清(380mL)中加入105.3g的硫酸銨(0～45％飽和)，冰冷下放置1小時，進而以11000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，將得到的沉淀物溶解于150mL的50mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中，進行透析脫鹽(3L×3)，得到所期望的來自亞麻種子的丙二烯氧化合成酶的粗酶液。
3.α-亞油酸的鈉鹽的制備因為作為起始原料的α-亞油酸在水中的溶解性非常低，所以為了容易發(fā)揮作為酶基質(zhì)的功效，因而將α-亞油酸進行鈉鹽化。即，將530mg的碳酸鈉溶解于10mL的精制水中，加溫至55℃，向其中滴加278mg的α-亞油酸(ナカライテスク社)，攪拌3小時。
反應(yīng)結(jié)束后，使用離子交換樹脂[Dowe×50W-X8(H+型)(ダウケミカル社制)]中和，生成沉淀物。對其過濾，除去樹脂，用MeOH溶解，減壓蒸餾除去溶劑。
將由此得到的生成物用異丙醇重結(jié)晶，得到所期望的α-亞油酸的鈉鹽(250mg，83％)。
4.特定α-酮醇脂肪酸(2A)的制備將上述3中制備的α-亞油酸的鈉鹽(15mg50μmol)溶解在30mL的0.1M的磷酸緩沖液(pH7.0)中。然后在25℃，氧氣流下向該溶液中添加由上述1制備的3.18mL的由米胚芽得到的脂肪氧合酶的粗酶液，然后攪拌30分鐘，再添加3.18mL的同樣的從米胚芽得到的脂肪氧合酶的粗酶液，攪拌30分鐘。
該攪拌結(jié)束后，在氮氣流下，向該脂肪氧合酶反應(yīng)物中添加上述2中制備的34.5mL的丙二烯氧化合成酶的粗酶液，攪拌30分鐘后，冰冷下添加稀鹽酸，將反應(yīng)液的pH調(diào)至3.0。接著，用CHCl3-MeOH＝10∶1的溶劑提取該反應(yīng)溶液。在得到的有機層中添加硫酸鎂進行脫水，減壓蒸餾除去溶劑，干燥。
使用HPLC對由此得到的粗產(chǎn)物進行處理，分取認(rèn)為是該特定α-酮醇脂肪酸(2A)的峰(保留時間16分左右)的組分，在分取的組分中加入氯仿，分離氯仿層后水洗，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾除去氯仿，得到精制物。
為了確認(rèn)該精制物的結(jié)構(gòu)，將之溶解于氘代甲醇溶液中，測定1H以及13C-NMR譜。其結(jié)果為，從1H-NMR譜上可確認(rèn)，末端甲基[δ0.98(t)]，2組的烯烴單元[(δ5.25，5.40)，(δ5.55，5.62)]，仲羥基[δ4.09(dd)]以及大量的基于亞甲基的信號，由此推定該精制物是特定α-酮醇脂肪酸(2)。
進一步，對13C-NMR的化學(xué)位移值進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該精制物的13C-NMR的化學(xué)位移值與特定α-酮醇脂肪酸(2A)[參考特開平10-324602號公報中的第7頁第11欄的倒數(shù)第1行以后記載的“制備例(提取法)”中的13C-NMR的化學(xué)位移值(同一公開公報第8頁第13欄第2行以后，段落編號0054以及段落編號0055)]相同。
所以，可以確定上述那樣通過酶催化法制備的合成物確實是9-羥基-10-氧代-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸。也就是說，可以確定上述合成物是通式(2)中記載的R1是C2的直鏈烷基，R2是C7的直鏈飽和烴基的α-酮醇脂肪酸(2A)。
制備例2特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的制備例1如下所述，制備特定酮醇脂肪酸衍生物9，15，16-三羥基-10-氧代-12(Z)-十八碳烯酸(1A)，并進行分離精制以及結(jié)構(gòu)分析。
在1.3L水中溶解上述制備例1中制備的500mg的特定酮醇脂肪酸(2A)，再加入192mg的氯化三聚異氰酸，25℃下攪拌30分鐘，使之反應(yīng)。用500mL氯仿提取該反應(yīng)液3次，用無水硫酸鎂干燥，過濾后濃縮，將得到的粗提取物進行HPLC處理，確認(rèn)其為生成物(1A)(分析柱CAPCELL PAK C18 UG120，4.6×250mm(資生堂)，溶劑25％乙腈+0.1％三氟乙酸，流速為1ml/min，波長為300nm)。
關(guān)于保留時間為5.7分的峰成分，使用大尺寸的分析柱(CAPCELLPAK C18 UG120，10×250mm)，分取后用氯仿提取，得到187.5mg化合物(1A)(收率38％)。對該化合物(1A)進行結(jié)構(gòu)分析。
該化合物的吸收光譜，即，UV V-560分光光度計(日本分光)、1H以及13C-NMR分別使用ECP-400(日本電子)測定。其結(jié)果如下。
化合物(1A)UV λmax(MeOH，nm)201.0nm(ε＝4520)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.97(3H，t，J＝7.2，18-H3)，1.25-1.46(8H，4，5，6，7-H2)，1.63(4H，m，3，17-H2)，1.63，1.83(both 1H，m，8-H2)，2.34(2H，t-like，J＝7.2，2-H2)，2.58，2.66(both 1H，m，14-H2)，3.31(2H，m，11-H2)，3.75(1H，m，15-H)，3.85(1H，m，16-H)，4.24(1H，m，9-H)，5.68(1H，m，12-H)，5.72(1H，m，13-H)。
13C-NMR(100MHz，CDCl3)10.0(C-18)，24.5，27.8，28.1，28.8，28.9，29.0(C-3，4，5，6，7，17)，33.5(C-2)，33.8(C-8)，33.9(C-14)，36.6(C-11)，66.1(C-15)，73.9(C-16)，76.2(C-9)，123.3(C-13)，128.9(C-12)，179.1(C-1)，210.3(C-10)。
上述氫以及碳的歸屬，使用DIFCOSY，HMQC以及HMBC譜等的二維NMR譜進行測定，將得到的數(shù)據(jù)同化合物(2A)的數(shù)據(jù)(參考特開平9-295908號公報以及文獻Yokoyama et al.，Plant Cell Physiol.，41，110-113，2000中的記載)相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物(2A)的1組烯烴單元消失了，取而代之的是2個結(jié)合了羥基的亞甲基。
關(guān)于該消失了的烯烴單元，依照HMBC以及DIFCOSY的分析結(jié)果可以判定其是第15位的烯烴單元。
根據(jù)上述記載可以判定，結(jié)合了羥基的次甲基的位置是C-15，C-16。另外，該化合物在第9位存在羥基，第10位存在氧代基。
根據(jù)以上的數(shù)據(jù)，將化合物(1A)的結(jié)構(gòu)定為上述式(1A)那樣。
制備例3特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的制備例2如下所述，研究在特定酮醇脂肪酸衍生物9，15，16-三羥基-10-氧代-12(Z)-十八碳烯酸(1A)制備過程中使用次氯酸鈉時，兩者的最佳比率。
在25mL的精制水中加入188μl的特定α-酮醇脂肪酸(2A)的乙醇溶液(112mM，3.5％)，(不能完全溶解，呈白濁狀態(tài))。一邊攪拌該特定α-酮醇脂肪酸(2A)的水溶液，一邊添加次氯酸鈉溶液(和光純藥工業(yè)株式會社制)，添加量從6μl開始，每次添加1μl，直至增加到20μl。
添加次氯酸鈉溶液10分鐘后，使用HPLC(柱CAPCELL PAK C18UG120，4.6×250mm，溶劑25％乙腈+0.1％三氟乙酸，流速為1ml/min，波長為300nm)進行分析，測定特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的生成率。
結(jié)果表明，次氯酸鈉溶液添加到0.09％左右時，特定α-酮醇脂肪酸(2A)幾乎100％轉(zhuǎn)換成特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)。結(jié)果如圖1所示。
制備例4特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的制備例3在1.9L的水中溶解500mg的特定α-酮醇脂肪酸(2A)，接著再加入1.2mL的次氯酸鈉溶液，室溫放置10分鐘以上。
用500mL的氯仿提取該反應(yīng)液3次，用無水硫酸鎂干燥，過濾后濃縮，將得到的粗提取物通過HPLC進行分取(柱CAPCELL PAK C18UG120，10×250mm，溶劑25％乙腈+0.1％三氟乙酸，流速為4ml/min，波長為300nm)。
分取后用氯仿進行提取，得到472mg的化合物(1A)(收率85％)。
使用例特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)對牽?；ㄔ黾踊ㄑ康幕钚杂脻饬蛩釋?g牽?；?品種名紫草(ムラサキ))的種子處理20分鐘，然后在流動的水下放置1夜。
接著，將種子臍部朝上放置在潮濕的海砂上24小時，使之生根，將這些已生根的種子播種在海砂的約1cm深處，連續(xù)光照下進行培養(yǎng)(約5天)。
將這些經(jīng)培育長葉的牽牛花整株植物移植到培養(yǎng)液[在1L蒸餾水中溶解了KNO3(250mg)，NH4NO3(250mg)，KH2PO4(250mg)，MgSO4·7H2O(250mg)，MnSO4·4H2O(1mg)，n水合檸檬酸鐵(Fe-citrate n-hydrate)(6mg)，H3BO3(2mg)，CuSO4·5H2O(0.1mg)，ZeSO4·7H2O(0.2mg)，Na2MoO4·2H2O(0.2mg)，Ca(H2PO4)2·2H2O(250mg)]中。
在該培養(yǎng)系中，以0.1mL/株的量，噴霧水，或含有0.01，0.1，1，或100μM的特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的水溶液，接著進行13.5小時的暗處理。
然后在25℃下，連續(xù)光照培育14天，統(tǒng)計第14天已形成的花芽數(shù)。
將8株牽?；ǖ慕Y(jié)果進行平均，并將該結(jié)果表示在圖2中。
噴霧水時的成花數(shù)平均為1.25個/株。
如圖2所示，經(jīng)過特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)處理的花芽形成數(shù)增加200％以上。
α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的最佳濃度是1μM，該濃度是特定α-酮醇脂肪酸(2A)的最佳濃度100μM(參考特開平11-29410號公報)的1/100。
穩(wěn)定性評價特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的穩(wěn)定性按照以下的方法評價特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的穩(wěn)定性。
用水將16mM的上述衍生物(1A)的乙醇溶液稀釋30倍，將該稀釋的溶液分別在4℃，25℃以及25℃的溫度下長時間放置，使用HPLC對經(jīng)時的分解程度進行分析(分析柱CAPCELL PAK C18 UG120，4.6×250mm，溶劑50％乙腈+0.1％三氟乙酸，流速為1ml/min，波長為210nm)。
為了進行比較，對特定α-酮醇脂肪酸衍生物(2A)進行同樣稀釋，將制備的溶液，分別在25℃以及50℃的溫度下長時間放置，同樣地調(diào)查分解程度。
該調(diào)查結(jié)果表示在圖3中。圖3的結(jié)果表明，放置在25℃以及50℃的兩種溫度下，本發(fā)明的特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)的穩(wěn)定性都比用來作比較對照的特定α-酮醇脂肪酸衍生物(2A)優(yōu)異。
另外，只對本發(fā)明的特定α-酮醇脂肪酸衍生物(1A)實施了4℃下的穩(wěn)定性調(diào)查，其結(jié)果表明，4℃的穩(wěn)定性比25℃和50℃更為優(yōu)異。
權(quán)利要求
1.下述通式(1)表示的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物， 式中，R1表示碳原子數(shù)1～5的直鏈烷基，或者表示有1個或2個雙鍵的碳原子數(shù)3～5的直鏈不飽和烴基，R2表示碳原子數(shù)1～15的直鏈亞烷基，或者表示有1～3個雙鍵的碳原子數(shù)2～15的直鏈不飽和烴基，但碳原子之間的雙鍵數(shù)最大是4。
2.含有下述通式(1)表示的α-酮醇不飽和脂肪酸衍生物的植物生長調(diào)節(jié)劑， 式中，R1表示碳原子數(shù)1～5的直鏈烷基，或者表示有1個或2個雙鍵的碳原子數(shù)3～5的直鏈不飽和烴基，R2表示碳原子數(shù)1～15的直鏈亞烷基，或者表示有1～3個雙鍵的碳原子數(shù)2～15的直鏈不飽和烴基，但碳原子之間的雙鍵數(shù)最大是4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物生長調(diào)節(jié)劑，其中，上述不飽和脂肪酸衍生物的碳原子數(shù)是18，且碳原子之間的雙鍵是1個或2個。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的植物生長調(diào)節(jié)劑，其中，上述不飽和脂肪酸衍生物是9，15，16-三羥基-10-氧代-12(Z)-十八碳烯酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了下述通式(1)表示的α－酮醇不飽和脂肪酸衍生物，以及含有該α－酮醇不飽和脂肪酸衍生物的植物生長調(diào)節(jié)劑，所述植物生長調(diào)節(jié)劑在低濃度下也具有植物成花促進性能等的植物生長調(diào)節(jié)性能，并且穩(wěn)定性優(yōu)異。通式(1)中，R
文檔編號A01P21/00GK101056840SQ200580039040
公開日2007年10月17日 申請日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日
發(fā)明者橫山峰幸, 山口祥子, 渡邊哲 申請人:株式會社資生堂, 組合化學(xué)工業(yè)株式會社