+mJpfAKpf多膚的質(zhì)譜分析，表明合成 多膚與抗體親和富集后質(zhì)譜鑒定到的多膚除了因同位素標(biāo)記引起的4Da的差別外具有完 全一致的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖5A)。采用除采用合成多膚的方法來驗(yàn)證W外，還在細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證 了CDC化蛋白中的賴氨酸單甲基化修飾。通過免疫沉淀將內(nèi)源性CDC化蛋白從培養(yǎng)的K562 細(xì)胞中純化出來后進(jìn)行質(zhì)譜分析。如前所述，用"CDs-標(biāo)記甲基基團(tuán)，接著質(zhì)譜分析純化的 CDC化蛋白。從細(xì)胞內(nèi)純化的CDC化蛋白中鑒定出K164的單甲基化多膚LANTQGK"CD3meK。 為進(jìn)一步驗(yàn)證送個(gè)位點(diǎn)，通過分析對應(yīng)的合成多膚的圖譜，表明與胞內(nèi)多膚的圖譜除了因 同位素標(biāo)記引起的4Da的差別外，基本一致（圖5B)。
[005引同樣的驗(yàn)證方法也證明了在化La細(xì)胞中KHDRSB1蛋白鑒定的PVKpf+meGAYR膚段的 二級(jí)質(zhì)譜圖（圖6A)與人工合成的PVKpf+meGAYR膚段的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖6A) -致；在K562 細(xì)胞EIF4H蛋白鑒定的Kpf+m^GPDDR膚段的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖6C)與對應(yīng)的體外合成多膚 Kpf+m^GPDDR的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖抓）一致。由此證明了本發(fā)明所提供的方法能夠高置信度的 鑒定賴氨酸單甲基化修飾。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 本發(fā)明采用具體的實(shí)施方式來對細(xì)胞或組織中是否存在賴氨酸單甲基修飾的膚 或蛋白進(jìn)行鑒定或定量，送種列舉只是示范性的舉例說明本發(fā)明的方法是如何實(shí)現(xiàn)的，并 不能對本發(fā)明起到任何的限制。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都可W在不違背本發(fā)明的精髓的 情況下對本發(fā)明做任何的改進(jìn)和變化，但是送種變化都被包含在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍 中。
[0060] 實(shí)施例子1 ;甲硫氨酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記、體外丙醜化衍生反應(yīng)與蛋白酶解
[0061] L1甲硫氨酸穩(wěn)定同份素標(biāo)巧
[0062] 本發(fā)明所用到的細(xì)胞，包括化La細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞系），K562細(xì)胞（慢性骨髓白 血病細(xì)胞），SW620細(xì)胞（結(jié)腸癌細(xì)胞），A549細(xì)胞（肺癌細(xì)胞）和SMM7721細(xì)胞（肝癌細(xì) 胞），培養(yǎng)在RPMI或DMHM培養(yǎng)基中化ifeTechnologies,CA)講行甲硫氨酸穩(wěn)定同份素標(biāo) 丑^培養(yǎng)基中主要包含如下成分；1??-蛋氨酸或1化化-蛋氨酸（Sigma-Al化ich，M0)，10% 的透析胎牛血清（v/v)(dialyzedFB巧(XifeTechnologies,CA)和IX抗生素（Thermo Scientific,Μ)W及其他適合細(xì)胞生長的營養(yǎng)元素。培養(yǎng)基中細(xì)胞在37°C及5% (?中進(jìn) 行生長培養(yǎng)。
[0063] 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的關(guān)鍵在于標(biāo)記效率要達(dá)到97% W上，并有質(zhì)譜檢測加W確認(rèn)。 根據(jù)細(xì)胞每分裂一代50%的1??-被"CDs-的計(jì)算（生理狀態(tài)下為i2CH3-)，當(dāng)細(xì)胞連續(xù)分 裂6代W后，體內(nèi)超過99%的1??-被"CDs-替換，從而滿足理論所需的穩(wěn)定同位素標(biāo)記效 率。在平行進(jìn)行的"輕"C2CH3-Med或"重"（"CDs-Med穩(wěn)定同位素的細(xì)胞標(biāo)記過程中，當(dāng) "重"（"CDs-Med穩(wěn)定同位素的標(biāo)記達(dá)到要求后，"輕"C2CH3-Med或"重"（"CD3-M如穩(wěn)定 同位素標(biāo)記的細(xì)胞需要繼續(xù)培養(yǎng)直至所需的細(xì)胞數(shù)量（1〇8)能夠提取足夠的蛋白用于后繼 的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至滿足要求后，如進(jìn)行細(xì)胞中賴氨酸單甲基修飾的定性鑒定，僅收集 "重"("CDs-Met)標(biāo)記的細(xì)胞后進(jìn)行總蛋白提取。如進(jìn)行細(xì)胞中賴氨酸單甲基修飾的定量分 析，則"輕"C2CH3-Med或"重"（"CD3-M如標(biāo)記的細(xì)胞收集后等量混合進(jìn)行蛋白的提取。
[0064] 1. 2標(biāo)巧細(xì)胸中說帝白的據(jù)取
[0065] 培養(yǎng)標(biāo)記的細(xì)胞在收集前用預(yù)冷的磯酸鹽緩沖液（PB巧洗3遍，然后在預(yù)冷的裂 解緩沖液中裂解細(xì)胞(8M尿素溶于2:1的0. 1M畑4肥〇3緩沖液（PH= 8)和0. 1M胞肥〇3溶 液；lx蛋白酶抑制劑（v/v))，最后在冰上賠育半小時(shí)。離必（20000Xg)除去細(xì)胞碎片，保 留上清，并測定上清液體中總蛋白的含量。
[0066] L3說帝白的體外巧酣化衍牛巧府及帝白酶解
[0067] 總蛋白的體外丙醜化衍生反應(yīng)的具體的步驟如下：
[0068] 1)取1. 2節(jié)中的各個(gè)細(xì)胞系的蛋白質(zhì)提取上清液，其中每個(gè)上清液含有20mg總蛋 白來制備丙醜化反應(yīng)；
[0069] 2)立即向收集富含蛋白質(zhì)的上清液體中加入200μL丙酸酢，潤旋混勻，加入適量 體積的2Μ化0Η，將抑調(diào)整至8. 0,室溫反應(yīng)1小時(shí)。
[0070] 3)重復(fù)步驟2 -次。重新加入200μL丙酸酢于步驟2中的溶液中，混勻，加入適 量體積的2Μ化0Η，調(diào)整抑至8. 0,室溫反應(yīng)2小時(shí)。
[0071]4)反應(yīng)接束后，隨后加入10μL己醇胺（ethanolamine)，室溫30分鐘，終止步驟 3的丙醜化反應(yīng)。
[0072]5)向步驟4中的溶液中，逐滴加入Η氯己酸燈CA)至終濃度為20% (v/v)，搖床上 輕搖，4°C沉淀過夜。
[0073] 6)第二日 16,000Xg，4°C離必lOmin，棄上清。
[0074] 7)加入4°C預(yù)冷的丙麗重懸蛋白沉淀，再16000Xg，4°C離必lOmin，棄上清。
[0075] 8)重復(fù)步驟7兩次。
[0076] 9)加入2血lOOmM碳酸氨倭，pH= 8重懸步驟8中的蛋白沉淀。
[0077] 10)按膜酶與蛋白沉淀的底物1:50 (w/w)的比例，加入適量的膜酶于上述蛋白溶 液中，37 °C恒溫水浴中酶解過夜。
[0078] 11)第二天，離必，加入二硫蘇糖醇值TT)至終濃度為5mM，55°C恒溫水浴中反應(yīng)30 分鐘。
[007引離必，加入新鮮配制的賄己醜胺水溶液至終濃度為15mM，室溫避光反應(yīng) 30min0
[0080] 13)反應(yīng)結(jié)束后，離必，加入0. 72M半脫氨酸，至終濃度30mM，室溫反應(yīng)30min。
[008。 14)再按膜酶與底物1:100 (w/w)的比例，加入適量膜酶，37°C恒溫水浴酶解3小時(shí) 后，1化柱脫鹽，用HPLC分離多膚組分。
[0082] 連施例子2 :某于HPLC的《化紐份外離
[0083] 在親和純化之前，通過實(shí)施例子1獲得的來自每個(gè)樣品的丙醜化衍生化的膜酶 膚段首先通過HPLC被分離。分離的方法如下；本次分離使用的是VarianSDlLC(Agilent Technologies,CA)和甜ridgeC18 (19X150cm;Waters,ΜΑ)，義用 2 至 40% 的bufferB(lOmM 氨水或80%ACN，p冊.5)，梯度設(shè)置為70分鐘，W流速lOml/min洗脫。等時(shí)間收集樣品，共 收集到60個(gè)組份（約10ml/管），然后合并為20個(gè)組份。所有20個(gè)組份的每個(gè)組分分別 用真空濃縮儀（ThermoFisher)抽干。
[0084] 逼施例子3 ;賴氨酸丙醜甲基化巧抗體偶聯(lián)樹脂的制備與修飾巧《化的親和富集
[0085] 賴氨酸丙醜甲基化泛抗體偶聯(lián)樹脂的制備；1ml蛋白A瓊脂糖樹脂化ife Technologies，CA)經(jīng)預(yù)冷的磯酸鹽緩沖液（PB巧洗涂Η次后，和4mg賴氨酸丙醜甲基化泛 抗體（在2ml預(yù)冷的磯酸鹽緩沖液）在4°C條件下賠育4小時(shí)；500Xg離必30s后，抗體-蛋 白A瓊脂糖樹脂用預(yù)冷的磯酸鹽緩沖液洗涂Η次去除未結(jié)合的抗體，制備成賴氨酸丙醜甲 基化泛抗體偶聯(lián)樹脂。
[0086] 修飾性多膚的親和富集：由實(shí)施例2獲得的酶解多膚（2mg)溶于200ul預(yù)冷的 肥TN緩沖液（lOOmM化Cl，lmM邸TA，20mMTrisP冊.OandO. 5% (w/v)NP-40)，然后加入 20ul賴氨酸丙醜甲基化泛抗體偶聯(lián)樹脂，4°C條件下過夜賠育。500xg離必30s，親和富集 多膚-抗體-蛋白A瓊脂糖樹脂用肥TN緩沖液洗涂Η次后，再用d地20洗涂兩次。結(jié)合在 抗體-蛋白A瓊脂糖樹脂上的親和富集多膚用lOOul的0. 1%H氣己酸（TFA)洗脫，共Η 次?；旌夕Т蔚南疵撘?，用真空濃縮儀抽干后用于后繼的質(zhì)譜分析。
[0087] 實(shí)施例子4 ;HPLC-MS/MS分析和數(shù)據(jù)庫檢索蛋白序列
[0088]洗脫膚段的離子化；將實(shí)施例子3中富集到的丙醜甲基化膚段（20個(gè)組分的膚 段）分別溶于3μ1HPLC緩沖液A(0. 1 %甲酸水溶液，v/v)然后依次進(jìn)入毛細(xì)管RPLC捕集 柱（100μm內(nèi)徑x2cm，LunaC18填充，5μm，孔徑100A,中國迪馬）和最大壓強(qiáng)為250帕 的自動(dòng)取樣器，緩沖液為100%緩沖液A(HPLC級(jí)的0. 1%FA水溶液）。進(jìn)樣和洗脫結(jié)束后， 將膚段轉(zhuǎn)移到填充C18樹脂（3-um顆粒大小，90-A孔徑，中國迪馬）的分析柱（10cm長， 75μmID)，并將分析柱連接EASY-nLClOOOHPLC系統(tǒng)燈hermoFisherScientificInc,MA)。
[0089] 質(zhì)譜分析；洗脫下來的膚段被離子化后，然后通過納米噴霧導(dǎo)入到LTQ化bitrap Elite質(zhì)譜儀中（ThermoFisherScientificInc,ΜΑ)。WR= 24, 000 和m/z400 的分辨 率，進(jìn)行全范圍質(zhì)譜掃描（從m/z300至m/z2, 000)。10種最高豐度的離子一次在線性離 子阱中分離出來，經(jīng)過碰撞然后分裂（CID)，該歸一化能量為35%。與數(shù)據(jù)無關(guān)的排除間 隔為30砂，重復(fù)計(jì)數(shù)為2,排除窗口設(shè)置在巧化和-1化。獲取的HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)采用 Mascot(v2. 3,MatrixScience,UK)分析。峰列表通過ThermoFisher的extract_msn.exe 軟件生成。Mascot分析中母離子質(zhì)量誤差設(shè)置為±10ppm,片段質(zhì)量誤差設(shè)置為±0.抓a。 將所得數(shù)據(jù)在化iProtHuman(88, 817條序列）數(shù)據(jù)庫中搜索，并將搜索參數(shù)做如下設(shè)置： 固定修飾設(shè)置為半脫氨酸殘基脈甲基化，低質(zhì)量膚段的可變修飾為"CDs-蛋氨酸、"CDs-蛋 氨酸氧化、賴氨酸丙醜化（賴氨酸巧6. 0262)，賴氨酸丙醜"CDs-甲基化（賴氨酸巧4. 0640) 和賴氨酸丙醜-甲基-甲基化（賴氨酸巧0. 0418)。所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用高于20的mascot 離子分?jǐn)?shù)過濾和手工驗(yàn)證。
[0090] 實(shí)施例子5 ;Κ562細(xì)胞中CDCL1蛋白的純化
[0091] 將"CDs-蛋氨酸重標(biāo)的Κ562細(xì)胞溶解于lx肥ΤΝ緩沖液（lOOmM化C1，ImM 邸TA，20mMTrisP冊.0 和 0. 5%w/v，NP-40)。細(xì)胞勻漿在 12,000Xg，4°C條件下離必 10 分鐘出去細(xì)胞碎片。
[0092] 裂解液中加入抗CD巧L抗體（Santa化UZ，Texas) 4°C過夜，然后加入蛋白A/G瓊脂 糖樹脂（Santa化UZ，T