一種鑒定賴氨酸ε-氨基側(cè)鏈單甲基化修飾的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于檢測診斷領(lǐng)域，特別地，屬于一種鑒定及定量細(xì)胞或組織中賴氨酸單甲基化修飾底物的方法；更特別的，屬于利用特異性抗體的親和富集與質(zhì)譜分析的蛋白組學(xué)方法鑒定及定量細(xì)胞或組織中賴氨酸單甲基化修飾底物?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的ε-氨基側(cè)鏈可W發(fā)生單、雙或Η甲基化修飾。在過去的幾十年里，對賴氨酸甲基化修飾（Kme)的生物學(xué)研究主要集中在核必組蛋白。前期的研究證明了送種修飾在染色體結(jié)構(gòu)和功能行使中的關(guān)鍵作用。送種修飾狀態(tài)被2組具有相反催化功能的酶所調(diào)節(jié)，即賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶和賴氨酸去甲基化酶。目前有超過50個賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶和約25賴氨酸去甲基化酶被發(fā)現(xiàn)。組蛋白來氨酸甲基化修飾與各種疾病相關(guān)，例如癌癥。相應(yīng)的，賴氨酸甲基化調(diào)節(jié)酶成為一系列潛在的藥物祀點(diǎn)。[0003]當(dāng)今在組蛋白中所發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型（PTMs)在非組蛋白中都存在。在鑒定到的賴氨酸甲基化調(diào)節(jié)酶中，存在一些非細(xì)胞核定位的酶和新發(fā)現(xiàn)的不W組蛋白為底物的賴氨酸甲基化調(diào)節(jié)酶，說明賴氨酸甲基化應(yīng)該在非組蛋白中廣泛分布。鑒定蛋白質(zhì)底物是確定蛋白質(zhì)翻譯后修飾功能的前提，賴氨酸甲基化生物學(xué)的研究歷史將該前提的重要性闡述的非常清楚。整合我們和他人的數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，賴氨酸己醜化底物出現(xiàn)在染色體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和如新陳代謝Η個研究領(lǐng)域中，而且相互之間具有底物的重疊性。盡管賴氨酸己醜化修飾的底物鑒定較遲，關(guān)于它的研究表明賴氨酸己醜化在上述Η個研究領(lǐng)域中是協(xié)同作用。類似地，賴氨酸甲基化修飾組的鑒定和定量比較發(fā)現(xiàn)了一些下游的與染色體無關(guān)的非組蛋白及信號通路，送為后續(xù)的功能研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。[0004]雖然如此，鑒定賴氨酸甲基化底物并不簡單。與鑒定磯酸化修飾用引入32Ρ標(biāo)記不同，3Η或"c的低放射性使放射性同位素檢測方法在賴氨酸甲基化底物鑒定上難W實(shí)施。甲基化，尤其是單甲基化（Kmel)，只在其底物中引入了一個很小的結(jié)構(gòu)基團(tuán)，因而被修飾的賴氨酸基團(tuán)與未發(fā)生修飾的賴氨酸基團(tuán)差別細(xì)微，只有一個極小的構(gòu)象用來開發(fā)親和性抗體。若要同時(shí)兼顧親和性和特異性，開發(fā)與序列無關(guān)的甲基化抗體（泛抗體）是一個巨大挑戰(zhàn)。其結(jié)果是，由于沒有合適的甲基化膚段富集方法為后續(xù)質(zhì)譜分析提供膚段，賴氨酸甲基化底物的鑒定進(jìn)程緩慢。正如磯酸化和賴氨酸己醜化組學(xué)研究中描述，親和富集是研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM)整體分析的關(guān)鍵步驟化im，S.C.etal.Substrateandfunctionaldiversityoflysineacetylationrevealedbyaproteomicssurvey.MolCell23,607-618(2006))。由于單甲基化修飾的賴氨酸和未修飾的賴氨酸的物化性質(zhì)差異很小，因此采用如分離磯酸化多膚的固定化金屬親和層析（IMAC)等化學(xué)方法來分離甲基化修飾的賴氨酸多膚很困難（FicarrcsS.B.etal.PhosphoproteomeanalysisbymassspectrometryanditsapplicationtoSaccharomycescerevisiae.Naturebiotechnology20,301-305(2002))。另外，制備高特異性和高親和性的抗賴氨酸單甲基化的抗體也很困難。因此，需要對現(xiàn)有的基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)新才能對賴氨酸甲基化修飾進(jìn)行鑒定和分析。特別地，需要對賴氨酸單甲基化修飾的底物鑒定與定量分析方法進(jìn)行全新的發(fā)明創(chuàng)造?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]為解決送個技術(shù)困難，本發(fā)明開發(fā)了一個新的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法。利用該方法可W高效、準(zhǔn)確的鑒定膚段中是否發(fā)生賴氨酸ε-胺基單甲基化修飾W及修飾的位點(diǎn)，定量分析修飾的變化水平。[0006]-方面，本發(fā)明提供一種鑒定底物膚段或蛋白中是否在賴氨酸的ε-胺基上發(fā)生單甲基化修飾的方法，方法包括；采用體外氮醜化衍生化反應(yīng)，讓所述的底物上的單甲基化ε-胺基的賴氨酸殘基衍生為醜甲基化ε-胺基；用抗醜甲基化的泛抗體親和富集發(fā)生醜甲基化修飾的膚段；用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀鑒定抗體親和富集的多膚是否發(fā)生了丙醜甲基化修飾。[0007]優(yōu)選的，根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀檢測獲得的結(jié)果，并由此判斷或推定底物蛋白或膚段上是否實(shí)際存在的賴氨酸單甲化修飾。[0008]優(yōu)選的，對底物蛋白賴氨酸殘基單甲基化ε-胺基進(jìn)行氮醜化修飾的修飾基團(tuán)的碳原子總數(shù)小于8個。優(yōu)選的碳原子總數(shù)小于6個。優(yōu)選的，該修飾基團(tuán)可W包括烷基或者芳香基，其中烷基或者芳香基的碳原子總數(shù)小于8個。優(yōu)選的，烷基的碳原子總數(shù)小于6個，或，芳香基的碳原子總數(shù)小于8個。[0009]優(yōu)選的，讓胺基的賴氨酸殘基衍生為己醜甲基化ε-胺基，了醜甲基化ε-胺基，異了醜甲基化ε-胺基，戊醜甲基化ε-胺基，2-甲基了醜化甲基化ε-胺基，3-甲基了醜化甲基化ε-胺基，2,2-二甲基丙醜化ε-胺基，玻巧醜化甲基化ε-胺基或丙二醜化甲基化ε-胺基等。醜化試劑包括各種駿酸，酸酢，醜氯，和其他的一切醜化試劑。[0010]優(yōu)選的，醜化試劑為具有穩(wěn)定同位素的醜化試劑。同位素醜化試劑為含碳，氨，氧，氮穩(wěn)定同位素的駿酸，酸酢，醜氯，駿酸醋，醜胺和其他的一切醜化試劑。優(yōu)先地，穩(wěn)定同位素試劑是12(：化。〇3丙酸酢，"(：化。〇3丙酸酢或12站>1。〇3丙酸酢。[0011]在另一些優(yōu)選的方式中，讓底物蛋白或膚進(jìn)行氮醜化反應(yīng)在體外進(jìn)行。在一些優(yōu)選的方式中，底物蛋白或膚的醜化反應(yīng)可W在蛋白酶消化底物之前或者之后進(jìn)行。優(yōu)選的，底物蛋白或多膚提取于任何細(xì)胞、組織或體液。所述的底物蛋白或多膚為總蛋白或總的多膚。[0012]在一些優(yōu)選的方式中，從細(xì)胞或組織中提取總蛋白與丙醜酢在抑值為8.5的碳酸倭-碳酸氨鋼緩沖液中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生賴氨酸丙醜化體外衍生蛋白，反應(yīng)完全后經(jīng)膜蛋白酶消化產(chǎn)生賴氨酸丙醜化衍生酶解多膚。在一些優(yōu)選的方式中，制備丙醜化反應(yīng)完全的賴氨酸丙醜化體外衍生蛋白的方法包括；200μL丙酸酢被迅速加入到含20mg總蛋白的細(xì)胞裂解液中，震蕩并將加入適量2M化0H將抑調(diào)至8,然后在室溫賠育30分鐘；反應(yīng)后的賴氨酸丙醜化體外衍生蛋白通過Η氯己酸（TCA)沉淀法沉淀。為進(jìn)一步產(chǎn)生賴氨酸丙醜化衍生酶解多膚將沉淀蛋白在2ml的消化緩沖液（0.1Μ畑4肥〇3,抑=8.5)中重懸，然后用溶于消化緩沖液膜蛋白酶（trypsin)消化蛋白16小時(shí)；消化完全后，通過20,OOOxg的10分鐘離必除去沉淀，獲得賴氨酸丙醜化衍生酶解多膚上清。優(yōu)選的方式中，膜酶與賴氨酸丙醜化體外衍生蛋白的比例為1:100(w/w)。[0013]在體外賴氨酸衍生化反應(yīng)中，未修飾賴氨酸或單甲基化修飾賴氨酸的ε-胺基均可W發(fā)生丙醜化反應(yīng)，生成丙醜化賴氨酸或丙醜甲基化賴氨酸，而二甲基化和Η甲基化賴氨酸卻不能發(fā)生上述反應(yīng)。理論上若丙醜化反應(yīng)完全，則反應(yīng)后蛋白的賴氨酸殘基上將不存在未修飾的賴氨酸。因此，將反應(yīng)后的蛋白經(jīng)酶解產(chǎn)生酶解多膚后，通過質(zhì)譜分析鑒定賴氨酸殘基上未發(fā)生任何修飾的多膚，比較該類型多膚在所有鑒定出的賴氨酸殘基修飾多膚的比例即可評估丙醜化反應(yīng)的反應(yīng)效率。。[0014]在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的蛋白（總蛋白或總的多膚，或特定的蛋白或多膚）在進(jìn)行丙醜化反應(yīng)前，提取于經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞或臨床樣本中。優(yōu)選的，細(xì)胞為可進(jìn)行基于細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SILAC)的永生傳代的腫瘤細(xì)胞。更優(yōu)選的，為鑒定細(xì)胞中賴氨酸單甲基化修飾底物，細(xì)胞可培養(yǎng)在添加有穩(wěn)定同位素氨基酸的SILAC培養(yǎng)基中。優(yōu)先地，同位素氨基酸包括1化-精氨酸或"C-精氨酸，更優(yōu)先地，1化-賴氨酸或"C-賴氨酸，更優(yōu)先地，穩(wěn)定同位素氨基酸為12邸3-甲硫氨酸或"CDs-甲硫氨酸。在一些優(yōu)選的方式中，為體外提供賴氨酸甲基化修飾的甲基來源，在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了1化&-甲硫氨酸C2CH3-Met);或者，在培養(yǎng)基中添加"CDs-甲硫氨酸（"CDs-Med。在送里，甲硫氨酸上甲基團(tuán)上的1?被穩(wěn)定同位素的"C所取代，&(氨）被穩(wěn)定同位素的化（気）所取代。[0015]在定量比較一對細(xì)胞中甲基化修飾的變化時(shí)，需要將一個細(xì)胞培養(yǎng)在含1??-甲硫氨酸的培養(yǎng)基中，另一個細(xì)胞培養(yǎng)在穩(wěn)定同位素標(biāo)記的"CDs-甲硫氨酸的培養(yǎng)基中，該方法稱之為基于細(xì)胞培養(yǎng)的氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記策略（SILAC)的ngSEandMannΜ.Apracticalrecipeforstableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture(SILAC)·NatProtoc.1巧）：2650-60.巧006))。[0016]在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的細(xì)胞來源于商業(yè)購買的細(xì)胞系，選自K562細(xì)胞(慢性骨髓白血病細(xì)胞系），SW620細(xì)胞（結(jié)腸癌細(xì)胞系），A549細(xì)胞（非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系）和SMM7721細(xì)胞（肝癌細(xì)胞）中的一種或多種。組織來源為臨床診斷為肝癌患者手術(shù)切除的肝癌組織樣本。[0017]在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，需要對發(fā)生氮醜甲基化修飾的膚段進(jìn)行特異性抗氮醜甲基化泛抗體的親和富集。優(yōu)選的方式中，氮醜甲基化賴氨酸泛抗體事先通過化學(xué)交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)結(jié)合任何不破壞抗體親和性的基質(zhì)上。所述的基質(zhì)為瓊脂糖樹脂，通過非共價(jià)結(jié)合在蛋白A或蛋白G或蛋白A/G的瓊脂糖樹脂上；更優(yōu)先地，非共價(jià)結(jié)合在蛋白A瓊脂糖樹脂上制備成抗體偶聯(lián)樹脂。[0018]優(yōu)選的，所述的泛抗體通過化學(xué)交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)結(jié)合到不破壞抗體親和性的基質(zhì)上。優(yōu)先地，通過非共價(jià)結(jié)合在蛋白A或蛋白G或蛋白A/G的瓊脂糖樹脂上。更優(yōu)先地，非共價(jià)結(jié)合在蛋白A瓊脂糖樹脂上制備成抗體偶聯(lián)樹脂。[0019]在一些優(yōu)選的方式中，所述的抗體為特異結(jié)合丙醜甲基化的泛抗體。該富集方法包括如下步驟：將泛丙醜甲基化泛抗體與蛋白A交聯(lián)的瓊脂糖樹脂進(jìn)行偶聯(lián)，制備蛋白A抗體偶聯(lián)樹脂。在一些實(shí)施方式中，親和富集還包括在4°C條件下把丙醜甲基化泛抗體與賴氨酸丙醜化衍生多膚過夜賠育?；蛘呤褂每贵w偶聯(lián)樹脂與賴氨酸丙醜化衍生多膚過夜賠育，然后使用1ml肥TN緩沖液（lOOmM化Cl，lmM邸TA，20mMTrisP冊.OandO.5%(w/v)NP-40)洗涂賠育后的抗體偶聯(lián)樹脂；然后將抗體樹脂上親和富集的丙醜甲基化修飾的膚段用100μ1的0.1%(v/v)立氣己酸（TFA)經(jīng)過3次洗脫洗下來；洗脫液合并然后用濃縮儀抽干。[0020]在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，在用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀鑒定被修飾的膚段前，對進(jìn)行丙醜化衍生化反應(yīng)后蛋白的酶解膚段進(jìn)行HP當(dāng)前第1頁1 2 3 4 5 6