一種納米復(fù)合材料的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)發(fā)光傳感器，尤其是涉及一種納米復(fù)合材料的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一種威脅人類(lèi)身體健康的重大疾病。根據(jù)有關(guān)部門(mén)調(diào)查，惡性腫瘤高居我國(guó)人口死亡原因第二位。目前世界上仍缺乏有效的治療手段來(lái)攻克癌癥，如果能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)癌癥有效的早期診斷，這對(duì)后期的治療有著十分重要的意義，早期診斷是降低惡性腫瘤死亡率的主要途徑。腫瘤標(biāo)志物(Tumor Marker)是反映腫瘤存在的化學(xué)類(lèi)物質(zhì)，它們?cè)谀[瘤組織中的含量大大超過(guò)在正常組織里的含量，它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞功能，以幫助腫瘤的診斷、分類(lèi)、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)。臨床診斷主要通過(guò)監(jiān)測(cè)人體中腫瘤標(biāo)志物的含量，以分析病人的病程、療效、復(fù)發(fā)及預(yù)后等?，F(xiàn)階段檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的主要方法有:酶聯(lián)免疫分析法、熒光免疫分析法、放射免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法和電化學(xué)免疫分析法等等。這些傳統(tǒng)的分析方法雖然特異性強(qiáng)、靈敏度高，但也存在一些不足之處，如:操作流程復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、后續(xù)數(shù)據(jù)處理復(fù)雜和儀器設(shè)備昂貴等等。因此，設(shè)計(jì)一種新型的免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度腫瘤標(biāo)志物的簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)保護(hù)人類(lèi)健康有著相當(dāng)重大的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]中國(guó)專(zhuān)利CN104155445A公開(kāi)了一種無(wú)標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及在腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)中的應(yīng)用，利用新型微納米材料NH4CoPOJt為基底，使得魯米諾--過(guò)氧化氫發(fā)光體系的發(fā)光穩(wěn)定性大大增強(qiáng)，同時(shí)利用棒狀的金@銀核殼納米粒子作為生物模擬酶催化發(fā)光體系，從而制備了一種成本低、靈敏度高、特異性好、檢測(cè)快速、制備簡(jiǎn)單的檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。上述組分中所用的基底材料是NH4CoPO4,相比較于該材料，本申請(qǐng)采用綠色方法合成的仿生材料AuOBSA作為傳感器的固載體，成功固載上發(fā)光物質(zhì)Iuminol和Ant1-CEA分子。將該復(fù)合材料材料共價(jià)鍵合到電沉積金納米層修飾電極表面，使構(gòu)建的傳感器具有生物相容性好，導(dǎo)電性好，靈敏度高等特點(diǎn)。另外，對(duì)比該專(zhuān)利(CN104155445A)采用非共價(jià)地靜電組裝法制備無(wú)標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，本申請(qǐng)采用共價(jià)鍵合法來(lái)構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器，將有利于提高傳感器穩(wěn)定性測(cè)試性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種生物相容性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測(cè)范圍寬的納米復(fù)合材料的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0006]—種納米復(fù)合材料的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，采用以下步驟:
[0007](I)在室溫?cái)嚢柘?，將HAuCl4溶液和牛血清白蛋白溶液混合均勻，在劇烈攪拌的條件下，向混合的溶液中快速加入水合肼，反應(yīng)完全之后，陳化12小時(shí)，將得到的產(chǎn)物離心分離后，用蒸餾水和乙醇交替洗滌，最終將洗后的產(chǎn)物冷凍干燥制備得到的AuOBSA納米材料；
[0008](2)利用戊二醛的交聯(lián)作用，將發(fā)光物質(zhì)魯米諾化學(xué)交聯(lián)到AuOBSA納米材料表面，進(jìn)一步活化AuOBSA表面的羧基以連接CEA抗體，制備得到復(fù)合材料Iuminol-AuOBSA-ant1-CEA ；
[0009](3)利用電沉積的方法，在工作電極裸玻碳電極表面電沉積一層金納米層，通過(guò)Au-S鍵的作用將得到的復(fù)合材料luminol-Au@BSA-ant1-CEA連接到電極表面，得到對(duì)抗原CEA具有靶向作用的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
[0010]步驟⑴中HAuCl4、牛血清白蛋白和水合肼之間的重量比是20?30:10?20:5?10。
[0011]步驟(2)具體采用以下步驟:
[0012](2-1)將AuOBSA納米材料與戊二醛混合后在室溫的條件下，搖床反應(yīng)2_4h，然后將離心得到的產(chǎn)物利用超純水洗三次，去除未反應(yīng)的試劑；
[0013](2-2)將得到的沉淀物超聲溶解到pH為7.4的PBS溶劑中，加入魯米諾溶液搖床反應(yīng)2_4h，得到AuOBSA-1uminol納米材料；
[0014](2-3)利用二次蒸餾水對(duì)得到的AuOBSA-1uminol納米材料進(jìn)行水洗，然后與EDC、NHS共同溶解在pH為7.4的PBS溶劑中，攪拌反應(yīng)以活化AuOBSA-luminol表面的羧基，然后將Ant1-CEA加入到上述的混合溶液中，冰水浴的條件下攪拌過(guò)夜，將離心得到的產(chǎn)物利用二次蒸饋水洗凈，即得到復(fù)合材料luminol-Au@BSA-ant1-CEA。
[0015]步驟(2-1)中，AuOBSA納米材料與戊二醛的重量比為30:1?2。
[0016]步驟(2-2)中，沉淀物與魯米諾的重量比為3:1?2。
[0017]步驟(2-3)中，AuOBSA-1uminol納米材料、EDC、NHS、Ant1-CEA 的重量比為 400 ?500:40:40:1 ?2。
[0018]步驟⑶具體采用以下步驟:
[0019](3-1)用0.3 μ m及0.05 μ m Al2O3拋光粉對(duì)裸玻碳電極進(jìn)行拋光，拋光好的電極在分別在二次蒸餾水和乙醇中各超聲2min，除去殘余在電極表面的Al2O3顆粒，再用N2吹干；
[0020](3-2)干燥的電極置于HAuCl4溶液中，在恒電位為-0.2V的條件下，在電極表面電沉積一層金納米層，電鍍時(shí)間為300s ；
[0021](3-3)常溫下，將復(fù)合材料luminol-Au@BSA-ant1-CEA滴加到金納米層表面，避光靜置4h，利用Au-S的作用，將Iuminol-AuOBSA-Ant1-CEA納米復(fù)合材料鍵合到金納米層的表面。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用綠色仿生材料AuOBSA作為固載體。綠色合成的AuOBSA具有生物相容性好，比表面積大和導(dǎo)電性好等特點(diǎn)，使構(gòu)建好的免疫傳感器具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。本申請(qǐng)采用共價(jià)鍵合法來(lái)構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器，將有利于提高傳感器穩(wěn)定性測(cè)試性能，除此之外，相比較其他方法而言，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建傳感器的方法快速、簡(jiǎn)便，為腫瘤早期診斷及其他腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)提供了新的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為制備得到的AuOBSA納米微球的TEM照片；
[0024]圖2為不同的納米粒子的Zeta電位圖；
[0025]圖3為不同濃度的CEA(ng/mL)修飾的傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0027]實(shí)施例1
[0028]實(shí)驗(yàn)試劑
[0029]魯米諾(>98% )購(gòu)買(mǎi)自上海生物生工股份有限公司。氯金酸(HAuCl4.3H20)購(gòu)買(mǎi)于薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司(安耐吉)。無(wú)水乙醇(CH3CH2OH, AR)、水合肼(N2H4.H2O)和戊二醛(25% ,GA)購(gòu)買(mǎi)自上?；瘜W(xué)試劑品有限公司。牛血清白蛋白(BSA，純度>99.8%，分子量68000)購(gòu)買(mǎi)自廈門(mén)星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司。乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-輕基琥泊酰亞胺(NHS)購(gòu)買(mǎi)自Sigma-Aldrich公司。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)和CEA抗體購(gòu)買(mǎi)自上海領(lǐng)潮生物有限公司。實(shí)驗(yàn)所用水為去離子水(18.2M Ω )。
[0030]二、AuiBSA納米微球的制備
[0031 ] 向50mL 5.0mg/mL的BSA溶液中加入20mL氯金酸溶液(28.43mM)，室溫下劇烈攪拌lOmin。之后，在攪拌的條件下0.05mL N2H4.H2O,反應(yīng)30min后，陳化12h。反應(yīng)結(jié)束之后，產(chǎn)物在15000rpm離心15min，得到黑色固體。得到的固體，用蒸餾水和乙醇分別洗滌三次，冷凍干燥12h，待測(cè)。
[0032]所制得的AuOBSA納米微球的TEM如圖1所示。
[0033]三、Iuminol-AuOBSA-Ant1-CEA復(fù)合材料的制備
[0034]Iuminol-AuiBSA