本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
pd-1全稱(chēng)程序性死亡受體1，英文名字為programmeddeath1，是一種重要的免疫抑制分子，為cd28超家族成員。以pd-1為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)在抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等方面均有重要的意義。其配體pd-l1也可作為靶點(diǎn)，相應(yīng)的抗體也可以起到相同的作用。pd-l1全稱(chēng)程序性死亡-配體1，英文名字programmedcelldeath-ligand1，是大小為40kda的第一型跨膜蛋白。正常情形下免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)聚集在淋巴結(jié)或脾臟的外來(lái)抗原產(chǎn)生反應(yīng)，促進(jìn)具有抗原特異性的t細(xì)胞增生。而程序性死亡受體1(pd-1)與程序性死亡-配體1(pd-l1)結(jié)合，可以傳導(dǎo)抑制性的信號(hào)，減低t細(xì)胞的增生。腫瘤細(xì)胞逃避t細(xì)胞摧毀的一種途徑是通過(guò)在它表面產(chǎn)生pd-l1，當(dāng)免疫細(xì)胞t細(xì)胞表面的pd-1識(shí)別pd-l1后，可以傳導(dǎo)抑制行信號(hào)，t細(xì)胞就不能發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和向腫瘤細(xì)胞發(fā)出攻擊信號(hào)。
中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn105579471a提供了特異性結(jié)合人pd-l1的分離的抗體以及此類(lèi)抗體的抗原結(jié)合片段，以及包含所述抗pd-l1抗體或結(jié)合片段和一組用于檢測(cè)結(jié)合人pd-l1的所述抗體或其抗原結(jié)合片段的復(fù)合物的試劑的試劑盒。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)cn105274104a公開(kāi)了一種預(yù)測(cè)抗pd-l1抗體藥物藥效的檢測(cè)試劑盒，其中包括檢測(cè)pold蛋白和pole蛋白糾正dna合成錯(cuò)誤的結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的基因位點(diǎn)的引物及探針。
癌癥包括范圍廣泛的疾病，癌癥的負(fù)面影響的嚴(yán)重性是深刻的，普遍影響到了醫(yī)療保險(xiǎn)以及社會(huì)。由于多種類(lèi)型的癌癥標(biāo)志是惡性細(xì)胞的快速和不受調(diào)控的增殖，因此改善針對(duì)癌癥的方法的一個(gè)決定性難題是對(duì)早期檢測(cè)和診斷的需求。pd-l1是一種在多種腫瘤細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞中動(dòng)態(tài)、廣泛表達(dá)的標(biāo)志物。臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，阻斷pd-l1可以有效地治療或抑制腫瘤生長(zhǎng)。因此，臨床上需要簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)手段篩選出腫瘤組織或細(xì)胞高度表達(dá)pd-l1的腫瘤患者，為個(gè)性化地進(jìn)行阻斷pd-l1的治療提供指導(dǎo)和依據(jù)。而現(xiàn)有的用于檢測(cè)pd-l1的試劑盒存在靈敏度較低，以及特異性不高等缺點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒具有檢測(cè)時(shí)間短、用量少、高效、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括發(fā)光底物溶液ⅰ，發(fā)光底物溶液ⅱ，濃縮洗滌液，pd-l1標(biāo)準(zhǔn)品，pd-l1質(zhì)控品，抗體吖啶酯標(biāo)記物和磁珠免疫復(fù)合物。
所述發(fā)光底物液ⅰ的制備方法為：用雙蒸水和硝酸配制成濃度為0.1m的稀硝酸溶液，加入過(guò)氧化氫，使過(guò)氧化氫的濃度為0.08m。
所述發(fā)光底物液ⅱ的制備方法為：用雙蒸水和氫氧化鈉配制成濃度為0.2m的氫氧化鈉溶液，加入tritonx-100，使tritonx-100的質(zhì)量濃度為2％。
所述濃縮洗滌液的制備方法為：向ph為7.4，濃度為1m的磷酸鹽緩沖液中加入tween-20，使tween-20的體積分?jǐn)?shù)為5％。
所述pd-l1標(biāo)準(zhǔn)品的制備包括以下步驟：用含有體積分?jǐn)?shù)為1％bsa、體積分?jǐn)?shù)為0.05％硫柳汞的ph為7.4，濃度為0.05m的磷酸鹽緩沖液，將pd-l1配制成濃度分別為100pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、3000pg/ml、5000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，即得。
所述pd-l1質(zhì)控品的制備包括以下步驟：用含有體積分?jǐn)?shù)為1％bsa、體積分?jǐn)?shù)為0.05％硫柳汞的ph為7.4，濃度為0.05m的磷酸鹽緩沖液，將pd-l1配制成濃度分別為1500pg/ml、4000pg/ml的溶液，即得。
所述抗體吖啶酯標(biāo)記物的制備包括以下步驟：
(1)取pd-l1單克隆抗體，用濃度為0.05mol/l，ph為9.5的碳酸鹽緩沖溶液調(diào)整pd-l1單克隆抗體的濃度為1mg/ml，得溶液a；
(2)取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的濃度至2mg/ml，得溶液b；
(3)將步驟(2)所得溶液b加入到步驟(1)所得溶液a中，吖啶酯與pd-l1單克隆抗體的摩爾比為14～22∶1，室溫反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為25～50min，得反應(yīng)液；
(4)將步驟(3)所得反應(yīng)液移至截留分子量為7500～95000的透析袋內(nèi)，用濃度為0.05mol/l，ph為9.5的碳酸鹽緩沖溶液透析24h，加入與上述反應(yīng)液等體積的甘油，置-25℃保存，即得。
所述磁珠免疫復(fù)合物的制備包括以下步驟：
取100μl濃度為10mg/ml的鏈霉親和素磁珠，用250μl濃縮洗滌液按照1∶100稀釋得到的溶液洗滌4次，加入50μl生物素化pd-l1單克隆抗體，置于37℃恒溫氣浴搖床中振蕩，振蕩速度為100r/min，12～16min后取出，用200μl濃縮洗滌液按照1∶100稀釋得到的溶液洗滌4次，然后，重新置于上述恒溫氣浴搖床中，加入1ml含體積分?jǐn)?shù)為2％bsa的ph為7.4，濃度為1m的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行封閉反應(yīng)，封閉反應(yīng)時(shí)間為15～22min，取出，磁性分離，去上清，用200μl濃縮洗滌液按照1∶100稀釋得到的溶液洗滌4次，加入ph為7.4，濃度為1m的磷酸鹽緩沖液配成1mg/ml的磁珠免疫復(fù)合物，置于4℃避光保存，即得；
其中，所述濃縮洗滌液的制備方法為：向ph為7.4，濃度為1m的磷酸鹽緩沖液中加入tween-20，使tween-20的體積分?jǐn)?shù)為5％。
上述磁珠免疫復(fù)合物的制備中，所述鏈霉親和素磁珠的制備包括以下步驟：
a.配制ph為7.0，濃度為0.1m的磷酸鹽緩沖液，滅菌，滅菌溫度為120℃，滅菌時(shí)間為18min，將1mg的鏈霉親和素溶于1ml上述磷酸鹽緩沖液中，得鏈霉親和素溶液，取400μl鏈霉親和素溶液裝于ep管中；
b.取5ml修飾的殼聚糖磁性微球，加入4.5ml戊二醛，室溫震蕩反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為4h，進(jìn)行磁分離，用水清洗除去多余的戊二醛后，將磁性微球重新懸浮在5mlph為7.0，濃度為0.1m的磷酸鹽緩沖液中，得磁性微球液；
c.將步驟b所得磁性微球液加入到步驟a裝有400μl鏈霉親和素溶液的ep管中，室溫震蕩培養(yǎng)4h，磁分離，得固體物，將所得固體物分散在10mlph為7.0，濃度為0.1m的磷酸鹽緩沖液中，使固體物的濃度為10mg/ml，得鏈霉親和素磁珠。
上述鏈霉親和素磁珠的制備中，步驟b所述修飾的殼聚糖磁性微球的制備包括以下步驟：
a稱(chēng)取4.02g無(wú)水乙酸鈉，加入2.9ml冰醋酸，攪拌至完全溶解，加入去離子水稀釋至500ml，得濃度為0.1m的乙酸鈉緩沖液；
b稱(chēng)取2.5g殼聚糖，加入1.5ml冰醋酸，攪拌至完全溶解，加入250ml去離子水以及250ml步驟a所得濃度為0.1m的乙酸鈉緩沖液，搖勻，得殼聚糖乙酸緩沖液；
c稱(chēng)取4.7g硫酸亞鐵銨和9.67g硫酸鐵銨，研磨混勻，加入250ml步驟a所得濃度為0.1m的乙酸鈉緩沖液以及100ml步驟b所得殼聚糖乙酸緩沖液，混合均勻，得混合液；
d在氮?dú)獗Ｗo(hù)的密閉體系環(huán)境下，向三頸瓶中加入100ml濃度為6m的氫氧化鈉溶液，攪拌，加熱升溫至60℃，平均分三次加入步驟c所得混合液，每次加入的時(shí)間間隔為30分鐘，加完后維持反應(yīng)45min，用去離子水反復(fù)洗滌所得產(chǎn)物，直至上層液體變澄清，用試劑agno3檢查硫酸根離子至無(wú)沉淀為止，磁分離，得固體產(chǎn)物，將所得固體產(chǎn)物冷凍干燥得殼聚糖磁性納米粒子；
e取0.5g步驟d所得殼聚糖磁性納米粒子，加入10ml質(zhì)量濃度為0.1％的聚乙烯醇溶液，超聲分散，得內(nèi)水相，稱(chēng)取0.6g甲氧基聚乙二醇-聚乳酸溶于15ml二氯甲烷中，得油相，將上述內(nèi)水相和油相混合，超聲乳化，超聲乳化時(shí)間為16min，得復(fù)乳；
f將步驟e所得復(fù)乳加入到20ml質(zhì)量濃度為0.1％的聚乙烯醇溶液中，均質(zhì)乳化，均質(zhì)乳化速度為6000r/min，均質(zhì)乳化時(shí)間為18min，將二氯甲烷揮發(fā)完全，得產(chǎn)物，將所得產(chǎn)物用去離子水反復(fù)洗滌，磁分離，得固體產(chǎn)物，向所得固體物中加入ph為7.0，濃度為0.1m的磷酸鹽緩沖液，使固體產(chǎn)物的濃度為20mg/ml，得修飾的殼聚糖磁性微球。
上述磁珠免疫復(fù)合物的制備中，所述生物素化pd-l1單克隆抗體的制備包括以下步驟：
ⅰ取pd-l1單克隆抗體，用濃度為0.05mol/l，ph為9.5的碳酸鹽緩沖溶液調(diào)整pd-l1單克隆抗體的濃度為1mg/ml，得溶液a；
ⅱ將生物素、二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力攪拌反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為12h，濾去反應(yīng)液中生成的白色沉淀二環(huán)己基脲，收集濾液，加入乙醚至沉淀不再增加，置于冰浴中，放置時(shí)間為1h，過(guò)濾收集沉淀，得活性生物素酯粗品，將上述活性生物素酯粗品用熱異丙醇溶解，置于冰浴中，放置時(shí)間為3h，過(guò)濾收集結(jié)晶，用二甲基甲酰胺溶解后加入乙醚，置于冰浴中，放置時(shí)間為1h，過(guò)濾收集沉淀，真空干燥，得活性生物素酯；
ⅲ向步驟ⅰ所得溶液a中加入步驟ⅱ所得活性生物素酯，活性生物素酯與pd-l1單克隆抗體的摩爾比為11～14∶1，室溫反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為35～50min，得反應(yīng)液；
ⅳ將步驟ⅲ所得反應(yīng)液移至截留分子量為7500～95000的透析袋內(nèi)，用濃度為0.05mol/l，ph為9.5的碳酸鹽緩沖溶液透析24h，加入與上述反應(yīng)液等體積的甘油，置-25℃保存，即得。
另外，本發(fā)明還提供了所述用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
s1將待測(cè)樣本進(jìn)行預(yù)處理，取上清液，25℃平衡10分鐘；
s2在每一平底試管中加入25μlpd-l1校準(zhǔn)品、pd-l1質(zhì)控品或待測(cè)樣本，37℃溫育10分鐘，加入25μl磁珠免疫復(fù)合物，混勻后，37℃溫育10分鐘；
s3將平底試管在磁分離器上靜置，靜置時(shí)間為3分鐘，去上清液，將平底試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍打3次，使孔中的液體完全除去，每一平底試管中加入200μl濃縮洗滌液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置，靜置時(shí)間為3分鐘，去上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干拍打3次，重復(fù)兩次；
s4向平底試管中加入抗體吖啶酯標(biāo)記物，抗體吖啶酯標(biāo)記物的加入量為每平底試管50μl，混勻后置37℃孵育15分鐘；
s5重復(fù)步驟s3的操作；
s6向平底試管中加入發(fā)光底物溶液ⅰ，發(fā)光底物溶液ⅰ的加入量為每平底試管50μl，1s后加入發(fā)光底物溶液ⅱ，發(fā)光底物溶液ⅱ的加入量為每平底試管50μl；
s7用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)每管的發(fā)光值，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出待測(cè)樣本中pd-l1的濃度。
本發(fā)明提供的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒的原理是：采用雙抗體夾心法。本發(fā)明以鏈霉親和素磁珠作為固相載體，通過(guò)鏈親和素-生物素的親和作用，將生物素標(biāo)記的pd-l1單克隆抗體偶聯(lián)在鏈霉親和素磁珠表面，制備得到磁珠免疫復(fù)合物。利用連接于固相載體鏈霉親和素磁珠上的生物素標(biāo)記的pd-l1單克隆抗體，以及抗體吖啶酯標(biāo)記物分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和吖啶酯標(biāo)記的抗體的量相對(duì)于待測(cè)抗原是過(guò)量的，因此復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原的含量成正比。測(cè)定復(fù)合物中的吖啶酯作用于加入的底物后的發(fā)光值，即可確定待測(cè)抗原含量。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒具有以下優(yōu)勢(shì)：
(1)本發(fā)明提供的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒具有穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性。
(2)本發(fā)明提供的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒具有高效、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)。
(3)本發(fā)明提供的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒適用血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標(biāo)本類(lèi)型。
(4)本發(fā)明提供的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)時(shí)間短、用量少。
(5)在使用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不需要用離心的方式對(duì)檢測(cè)體系中多余的雜質(zhì)進(jìn)行分離，只需在外加磁場(chǎng)的作用下即可達(dá)到快速分離雜質(zhì)和固相抗體-抗原-抗體復(fù)合物的目的，使復(fù)合物從復(fù)雜的環(huán)境中高效分離出來(lái)，達(dá)到分離特異性抗原的目的，另外，還能夠減少環(huán)境對(duì)檢測(cè)的干擾因素。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明程序性死亡-配體1抗體可購(gòu)自上海誠(chéng)凜生物科技有限公司，貨號(hào)cl-1103t，殼聚糖可購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號(hào)448877，鏈霉親和素可購(gòu)自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)21122，甲氧基聚乙二醇-聚乳酸可購(gòu)自西安瑞禧生物科技有限公司，貨號(hào)32423，聚乙烯醇可購(gòu)自上海美夢(mèng)佳化工科技有限公司，貨號(hào)2099，程序性死亡-配體1(pd-l1)可購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)70-ek1261s。
實(shí)施例1、本發(fā)明用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒的組成與制備
本發(fā)明所述的試劑盒包括以下組分：
(1)發(fā)光底物溶液?。?2)發(fā)光底物溶液ⅱ；(3)濃縮洗滌液；(4)pd-l1標(biāo)準(zhǔn)品；(5)pd-l1質(zhì)控品；(6)抗體吖啶酯標(biāo)記物和(7)磁珠免疫復(fù)合物。
本發(fā)明試劑盒中各試劑的制備包括以下步驟：
(1)發(fā)光底物溶液ⅰ的制備：
制備方法：用雙蒸水和硝酸配制成濃度為0.1m的稀硝酸溶液，加入過(guò)氧化氫，使過(guò)氧化氫的濃度為0.08m。
(2)發(fā)光底物溶液ⅱ的制備：
制備方法：用雙蒸水和氫氧化鈉配制成濃度為0.2m的氫氧化鈉溶液，加入tritonx-100，使tritonx-100的質(zhì)量濃度為2％。
(3)濃縮洗滌液的制備：
制備方法：向ph為7.4，濃度為1m的磷酸鹽緩沖液中加入tween-20，使tween-20的體積分?jǐn)?shù)為5％。
(4)pd-l1標(biāo)準(zhǔn)品的制備：
制備方法：用含有體積分?jǐn)?shù)為1％bsa、體積分?jǐn)?shù)為0.05％硫柳汞的ph為7.4，濃度為0.05m的磷酸鹽緩沖液，將pd-l1配制成濃度分別為100pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、3000pg/ml、5000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，即得。
(5)pd-l1質(zhì)控品的制備：
制備方法：用含有體積分?jǐn)?shù)為1％bsa、體積分?jǐn)?shù)為0.05％硫柳汞的ph為7.4，濃度為0.05m的磷酸鹽緩沖液，將pd-l1配制成濃度分別為1500pg/ml、4000pg/ml的溶液，即得。
(6)抗體吖啶酯標(biāo)記物的制備：
制備方法：
(1)取pd-l1單克隆抗體，用濃度為0.05mol/l，ph為9.5的碳酸鹽緩沖溶液調(diào)整pd-l1單克隆抗體的濃度為1mg/ml，得溶液a；
(2)取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的濃度至2mg/ml，得溶液b；
(3)將步驟(2)所得溶液b加入到步驟(1)所得溶液a中，吖啶酯與pd-l1單克隆抗體的摩爾比為14～22∶1，室溫反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為25～50min，得反應(yīng)液；
(4)將步驟(3)所得反應(yīng)液移至截留分子量為7500～95000的透析袋內(nèi)，用濃度為0.05mol/l，ph為9.5的碳酸鹽緩沖溶液透析24h，加入與上述反應(yīng)液等體積的甘油，置-25℃保存，即得。
(7)磁珠免疫復(fù)合物的制備：
①修飾的殼聚糖磁性微球的制備：
a稱(chēng)取4.02g無(wú)水乙酸鈉，加入2.9ml冰醋酸，攪拌至完全溶解，加入去離子水稀釋至500ml，得濃度為0.1m的乙酸鈉緩沖液；
b稱(chēng)取2.5g殼聚糖，加入1.5ml冰醋酸，攪拌至完全溶解，加入250ml去離子水以及250ml步驟a所得濃度為0.1m的乙酸鈉緩沖液，搖勻，得殼聚糖乙酸緩沖液；
c稱(chēng)取4.7g硫酸亞鐵銨和9.67g硫酸鐵銨，研磨混勻，加入250ml步驟a所得濃度為0.1m的乙酸鈉緩沖液以及100ml步驟b所得殼聚糖乙酸緩沖液，混合均勻，得混合液；
d在氮?dú)獗Ｗo(hù)的密閉體系環(huán)境下，向三頸瓶中加入100ml濃度為6m的氫氧化鈉溶液，攪拌，加熱升溫至60℃，平均分三次加入步驟c所得混合液，每次加入的時(shí)間間隔為30分鐘，加完后維持反應(yīng)45min，用去離子水反復(fù)洗滌所得產(chǎn)物，直至上層液體變澄清，用試劑agno3檢查硫酸根離子至無(wú)沉淀為止，磁分離，得固體產(chǎn)物，將所得固體產(chǎn)物冷凍干燥得殼聚糖磁性納米粒子；
e取0.5g步驟d所得殼聚糖磁性納米粒子，加入10ml質(zhì)量濃度為0.1％的聚乙烯醇溶液，超聲分散，得內(nèi)水相，稱(chēng)取0.6g甲氧基聚乙二醇-聚乳酸溶于15ml二氯甲烷中，得油相，將上述內(nèi)水相和油相混合，超聲乳化，超聲乳化時(shí)間為16min，得復(fù)乳；
f將步驟e所得復(fù)乳加入到20ml質(zhì)量濃度為0.1％的聚乙烯醇溶液中，均質(zhì)乳化，均質(zhì)乳化速度為6000r/min，均質(zhì)乳化時(shí)間為18min，將二氯甲烷揮發(fā)完全，得產(chǎn)物，將所得產(chǎn)物用去離子水反復(fù)洗滌，磁分離，得固體產(chǎn)物，向所得固體物中加入ph為7.0，濃度為0.1m的磷酸鹽緩沖液，使固體產(chǎn)物的濃度為20mg/ml，得修飾的殼聚糖磁性微球。
②鏈霉親和素磁珠的制備：
a.配制ph為7.0，濃度為0.1m的磷酸鹽緩沖液，滅菌，滅菌溫度為120℃，滅菌時(shí)間為18min，將1mg的鏈霉親和素溶于1ml上述磷酸鹽緩沖液中，得鏈霉親和素溶液，取400μl鏈霉親和素溶液裝于ep管中；
b.取5ml修飾的殼聚糖磁性微球，加入4.5ml戊二醛，室溫震蕩反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為4h，進(jìn)行磁分離，用水清洗除去多余的戊二醛后，將磁性微球重新懸浮在5mlph為7.0，濃度為0.1m的磷酸鹽緩沖液中，得磁性微球液；
c.將步驟b所得磁性微球液加入到步驟a裝有400μl鏈霉親和素溶液的ep管中，室溫震蕩培養(yǎng)4h，磁分離，得固體物，將所得固體物分散在10mlph為7.0，濃度為0.1m的磷酸鹽緩沖液中，使固體物的濃度為10mg/ml，得鏈霉親和素磁珠。
③生物素化pd-l1單克隆抗體的制備包括以下步驟：
ⅰ取pd-l1單克隆抗體，用濃度為0.05mol/l，ph為9.5的碳酸鹽緩沖溶液調(diào)整pd-l1單克隆抗體的濃度為1mg/ml，得溶液a；
ⅱ將生物素、二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力攪拌反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為12h，濾去反應(yīng)液中生成的白色沉淀二環(huán)己基脲，收集濾液，加入乙醚至沉淀不再增加，置于冰浴中，放置時(shí)間為1h，過(guò)濾收集沉淀，得活性生物素酯粗品，將上述活性生物素酯粗品用熱異丙醇溶解，置于冰浴中，放置時(shí)間為3h，過(guò)濾收集結(jié)晶，用二甲基甲酰胺溶解后加入乙醚，置于冰浴中，放置時(shí)間為1h，過(guò)濾收集沉淀，真空干燥，得活性生物素酯；
ⅲ向步驟ⅰ所得溶液a中加入步驟ⅱ所得活性生物素酯，活性生物素酯與pd-l1單克隆抗體的摩爾比為11～14∶1，室溫反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為35～50min，得反應(yīng)液；
ⅳ將步驟ⅲ所得反應(yīng)液移至截留分子量為7500～95000的透析袋內(nèi)，用濃度為0.05mol/l，ph為9.5的碳酸鹽緩沖溶液透析24h，加入與上述反應(yīng)液等體積的甘油，置-25℃保存，即得。
④磁珠免疫復(fù)合物的制備：
取100μl濃度為10mg/ml的鏈霉親和素磁珠，用250μl濃縮洗滌液按照1∶100稀釋得到的溶液洗滌4次，加入50μl生物素化pd-l1單克隆抗體，置于37℃恒溫氣浴搖床中振蕩，振蕩速度為100r/min，12～16min后取出，用200μl濃縮洗滌液按照1∶100稀釋得到的溶液洗滌4次，然后，重新置于上述恒溫氣浴搖床中，加入1ml含體積分?jǐn)?shù)為2％bsa的ph為7.4，濃度為1m的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行封閉反應(yīng)，封閉反應(yīng)時(shí)間為15～22min，取出，磁性分離，去上清，用200μl濃縮洗滌液按照1∶100稀釋得到的溶液洗滌4次，加入ph為7.4，濃度為1m的磷酸鹽緩沖液配成1mg/ml的磁珠免疫復(fù)合物，置于4℃避光保存，即得；
其中，所述濃縮洗滌液的制備方法為：向ph為7.4，濃度為1m的磷酸鹽緩沖液中加入tween-20，使tween-20的體積分?jǐn)?shù)為5％。
實(shí)施例2、采用本發(fā)明用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行pd-l1檢測(cè)
s1將待測(cè)樣本進(jìn)行預(yù)處理，取上清液，25℃平衡10分鐘；
s2在每一平底試管中加入25μlpd-l1校準(zhǔn)品、pd-l1質(zhì)控品或待測(cè)樣本，37℃溫育10分鐘，加入25μl磁珠免疫復(fù)合物，混勻后，37℃溫育10分鐘；
s3將平底試管在磁分離器上靜置，靜置時(shí)間為3分鐘，去上清液，將平底試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍打3次，使孔中的液體完全除去，每一平底試管中加入200μl濃縮洗滌液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置，靜置時(shí)間為3分鐘，去上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干拍打3次，重復(fù)兩次；
s4向平底試管中加入抗體吖啶酯標(biāo)記物，抗體吖啶酯標(biāo)記物的加入量為每平底試管50μl，混勻后置37℃孵育15分鐘；
s5重復(fù)步驟s3的操作；
s6向平底試管中加入發(fā)光底物溶液ⅰ，發(fā)光底物溶液ⅰ的加入量為每平底試管50μl，1s后加入發(fā)光底物溶液ⅱ，發(fā)光底物溶液ⅱ的加入量為每平底試管50μl；
s7用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)每管的發(fā)光值，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出待測(cè)樣本中pd-l1的濃度。
對(duì)比例1、試劑盒的組成與制備
對(duì)比例1試劑盒的組成和制備與實(shí)施例1試劑盒的組成和制備基本相同，區(qū)別在于，所述磁珠免疫復(fù)合物由鏈霉親和素磁珠和生物素化pd-l1單克隆抗體制備而成，其中，鏈霉親和素磁珠的制備中將修飾的殼聚糖磁性微球替換為殼聚糖磁性納米粒子。
試驗(yàn)例一、用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性
1、加速破壞穩(wěn)定性
為了考核試劑盒的加速破壞穩(wěn)定性，分別對(duì)放置4℃、37℃保存10天的實(shí)施例1制備的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行性能測(cè)試，測(cè)試試劑盒的性能指標(biāo)。加速破壞穩(wěn)定性結(jié)果如表1所示。
表1：試劑盒加速破壞穩(wěn)定性結(jié)果
依據(jù)加速破壞試驗(yàn)推算試劑盒有效期的經(jīng)驗(yàn)方法，37℃下加速破壞10天，相當(dāng)于有效期1年半，可以滿足試劑盒一年的有效期要求。由表1可以看出，本發(fā)明用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒在4℃、37℃保存10天后，試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確性及精密性等均滿足要求。
2、凍融穩(wěn)定性
為模擬試劑盒在運(yùn)輸過(guò)程中，低溫環(huán)境下試劑盒各組分反復(fù)凍融對(duì)試劑盒穩(wěn)定性的影響，將實(shí)施例1制備的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒在-20℃的低溫下冷凍過(guò)夜，然后在室溫下復(fù)溶，然后再置于-20℃的低溫下冷凍過(guò)夜，如此反復(fù)凍融5次。結(jié)果如表2所示。
表2：試劑盒凍融穩(wěn)定性結(jié)果
由表2可以看出，本發(fā)明用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒經(jīng)反復(fù)凍融5次后，試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確性及精密性等均滿足要求。這說(shuō)明，本發(fā)明試劑盒具有較好的凍融穩(wěn)定性。
3、模擬運(yùn)輸穩(wěn)定性
為模擬試劑盒在運(yùn)輸過(guò)程中，車(chē)輛的顛簸以及高溫環(huán)境對(duì)試劑盒穩(wěn)定性的影響，將實(shí)施例1制備的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒固定在微量振蕩器上，放置于37℃恒溫箱振蕩7天。結(jié)果如表3所示。
表3：試劑盒模擬運(yùn)輸穩(wěn)定性結(jié)果
由表3可以看出，本發(fā)明用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒放置于37℃恒溫箱振蕩7天后，試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確性及精密性等均滿足要求。
試驗(yàn)例二、對(duì)比例1試劑盒和本發(fā)明實(shí)施例1制備的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒對(duì)pd-l1進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果比較
使用對(duì)比例1制備的試劑盒和實(shí)施例1制備的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒，對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的方法參考實(shí)施例2具體的步驟。
分別采用對(duì)比例1制備的試劑盒和實(shí)施例1制備的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒，同時(shí)對(duì)肺癌患者血清樣本100份(pd-l1陽(yáng)性率為100％)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。
表4：檢測(cè)結(jié)果比較
由表4可以看出，使用對(duì)比例1制備的試劑盒對(duì)血清中pd-l1檢測(cè)的靈敏度降低，批內(nèi)和批間精密性降低。這說(shuō)明，本發(fā)明制備的用于檢測(cè)pd-l1的快速檢測(cè)試劑盒可顯著提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)精密性。