本發(fā)明涉及中藥指紋圖譜的構(gòu)建方法,特別涉及一種千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
背景技術(shù):
中藥指紋圖譜特指某種中藥材或中成藥所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制手段,可提供比單一指標(biāo)成分更全面的信息。目前,fda、英國(guó)草藥典、印度草藥典、德國(guó)藥用植物學(xué)會(huì)、加拿大藥用植物學(xué)會(huì)等均接受指紋圖譜的質(zhì)控方法,中國(guó)藥品監(jiān)督管理局也頒布了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》。在現(xiàn)階段中藥有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下,中藥指紋圖譜對(duì)于有效控制和評(píng)價(jià)中藥材或中成藥的質(zhì)量具有重要的意義。中藥指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為牽動(dòng)行業(yè)全面進(jìn)步、帶動(dòng)中藥現(xiàn)代化、推動(dòng)中藥走向世界的關(guān)鍵技術(shù)之一。
千年健為天南星科植物千年健homalomenaocculta(lour.)schott的干燥根莖,又名千顆針、絲棱線。產(chǎn)于廣西、云南等地,具有祛風(fēng)濕,壯筋骨之功效,臨床常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。千年健含大量揮發(fā)油成分,2015年版中國(guó)藥典一部規(guī)定用千年健中含芳樟醇的含量(不少于0.2%)來控制千年健藥材的質(zhì)量,但此單指標(biāo)成分的質(zhì)量控制不能全面的評(píng)價(jià)藥材的優(yōu)劣。中藥指紋圖譜是控制天然藥物質(zhì)量的有效方式之一。指紋圖譜全面整體地反映了藥材的內(nèi)在質(zhì)量,能為中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供一個(gè)有效的參考方法。全面、系統(tǒng)而又特征地指紋圖譜有利于全方位地控制中藥質(zhì)量并與國(guó)際接軌。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的上述不足,提供一種符合千年健藥材特點(diǎn)的指紋圖譜構(gòu)建方法。該指紋圖譜構(gòu)建方法前處理簡(jiǎn)單,所得圖譜中各峰分離度佳,構(gòu)成了千年健藥材的指紋特征,可作為千年健藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案:
一種千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法,包括以下步驟:
s1、供試品溶液的制備:精密稱取千年健粉末,加入甲醇后超聲提取,靜置冷卻,用甲醇補(bǔ)足失重,離心,取上清液蒸發(fā)干燥,殘?jiān)蛹状紡?fù)溶,渦旋,過濾,取續(xù)濾液,所得溶液即為供試品溶液;
s2、供試品溶液的測(cè)定:吸取供試品溶液注入液相色譜儀,以高效液相色譜法采用梯度洗脫進(jìn)行測(cè)定,得到千年健的指紋圖譜;
其中,高效液相色譜的色譜條件為:色譜柱的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠;流動(dòng)相a為乙腈,流動(dòng)相b為磷酸水溶液,流動(dòng)相中a與b的體積比隨時(shí)間逐漸增加;檢測(cè)波長(zhǎng)為285~305nm;
梯度洗脫的程序是:
0~10分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=2.5:97.5;
10~20分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=2.5:97.5~3:97;
20~35分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=3:97~5:95;
35~40分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=5:95~8:92;
40~50分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=8:92~10∶90;
50~60分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=10∶90~14:86;
60~80分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=14:86~15:85;
80~90分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=15:85~20:80;
90~110分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=20:80~30:70;
梯度洗脫過程中,流速為0.5~1.0毫升/分鐘,梯度洗脫程序中的比例均為體積比。
根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,步驟s1中千年健粉末全部能夠通過標(biāo)準(zhǔn)藥典篩三號(hào)篩。
根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,步驟s1中超聲提取的時(shí)間為30分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,步驟s1中過濾為用0.45μm有機(jī)系微孔濾膜過濾。
根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,高效液相色譜的色譜柱采用phenomenexc18色譜柱,規(guī)格為250mm×4.6mm×5μm。
根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,高效液相色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm。
根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,高效液相色譜分析的柱溫為25℃~45℃。
根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,高效液相色譜分析的柱溫為30℃。
根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,梯度洗脫的流動(dòng)相的流速為0~10分鐘流速為0.5毫升/分鐘,10~110分鐘流速為1毫升/分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的千年健指紋圖譜構(gòu)建方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,流動(dòng)相b為體積分?jǐn)?shù)為0.01%的磷酸水溶液。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種千年健的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,所述千年健的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜有11個(gè)共有峰,其中以4號(hào)峰為參照峰,各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別如下:
相對(duì)保留時(shí)間:
1號(hào)峰:0.4630~0.5203,2號(hào)峰:0.5818~0.6321;
3號(hào)峰:0.7778~0.8663,4號(hào)峰:1.0000;
5號(hào)峰:1.2414~1.3366,6號(hào)峰:2.0336~2.2459;
7號(hào)峰:2.8514~3.2557,8號(hào)峰:4.8665~5.4458;
9號(hào)峰:6.0079~7.0212,10號(hào)峰:8.9389~10.0941;
11號(hào)峰:9.0958~10.2898;
相對(duì)峰面積:
1號(hào)峰:0.7009~0.8801;2號(hào)峰:0.2832~0.4267;
3號(hào)峰:0.1334~0.1786;4號(hào)峰:1.0000;
5號(hào)峰:0.1623~0.3051;6號(hào)峰:0.4014~2.0643;
7號(hào)峰:0.1332~0.2106;8號(hào)峰:0.1088~0.1687;
9號(hào)峰:0.1616~0.2553;10號(hào)峰:1.5681~2.8527;
11號(hào)峰:0.3848~0.6889。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明提供的千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法,確認(rèn)了千年健藥材11個(gè)共有特征指紋峰,并對(duì)其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行了研究,保證了千年健原材料質(zhì)量的穩(wěn)定性。
2、本發(fā)明建立的千年健標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜代表著千年健藥材大部分藥理活性,能有效地表征千年健藥材的質(zhì)量,為千年健藥材的鑒別、質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù),對(duì)千年健藥材的全面質(zhì)量控制具有重要的意義,也為不同廠家千年健藥材的質(zhì)量分析提供了新的科學(xué)依據(jù)。
3、本發(fā)明提供的千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn),能夠用于千年健藥材的綜合質(zhì)量控制。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中10批次千年健藥材的hplc指紋圖譜。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中千年健藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜r。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合試驗(yàn)例及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例,凡基于本發(fā)明內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
千年健指紋圖譜的構(gòu)建
1.主要儀器與試劑:waterse2695高效液相色譜儀,waters2998pda檢測(cè)器,empower3色譜數(shù)據(jù)工作站(購自美國(guó)waters公司);bp211d型十萬分之一電子分析天平(購自德國(guó)sartorius公司);優(yōu)普系列純水系統(tǒng)(購自成都超純科技有限公司);kq-500db型數(shù)控超聲波清洗器(購自昆山市超聲儀器有限公司);標(biāo)準(zhǔn)藥典篩(購自浙江紹興市不銹鋼篩廠);10批次不同廠家提供的千年健藥材(見下表1),均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蔣桂華教授鑒定為天南星科植物千年健homalomenaocculta(lour.)schott的干燥根莖;甲醇、乙腈均為色譜純(購自dikma公司),磷酸為分析純(購自成都科龍化工試劑廠),試驗(yàn)用水為超純水。
表110批不同廠家千年健藥材信息表
2、實(shí)驗(yàn)方法
供試品溶液的制備:精密稱取千年健藥材粉末過三號(hào)篩2.00g,置于10ml容量瓶中,加甲醇8ml,超聲提取30min,靜置冷卻,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,離心,取上清液蒸發(fā)干燥,殘?jiān)?ml甲醇復(fù)溶,渦旋30s后用0.45μmpvdf微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,所得溶液即為供試品溶液。
供試品溶液的測(cè)定:色譜條件為采用phenomenexgemini110ac18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相:a相為乙腈,b相為體積分?jǐn)?shù)為0.01%的磷酸水溶液。柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)290nm,色譜流動(dòng)相洗脫梯度程序?yàn)椋?~10分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=2.5:97.5;10~20分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=2.5:97.5~3:97;20~35分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=3:97~5:95;35~40分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=5:95~8:92;40~50分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=8:92~10∶90;50~60分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=10∶90~14:86;60~80分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=14:86~15:85;80~90分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=15:85~20:80;90~110分鐘時(shí),流動(dòng)相a∶流動(dòng)相b=20:80~30:70;上述梯度洗脫程序的各步驟中,流速為0~10分鐘流速為0.5毫升/分鐘,10~110分鐘流速為1毫升/分鐘,上述流動(dòng)相的比例均為體積比。在上述條件下精密量取供試品溶液10μl,注入液相色譜儀,得到千年健藥材的指紋圖譜。
3、方法學(xué)研究
3.1精密度試驗(yàn):稱取千年健藥材藥品(表1中編號(hào)8樣品),按上述實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液,按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間rsd均小于2.56%,相對(duì)峰面積rsd均小于1.46%;將同一供試品連續(xù)進(jìn)樣6次得到的色譜圖進(jìn)行相似度分析,結(jié)果顯示其相似度均大于0.980,表明儀器精密度良好。
3.2重復(fù)性試驗(yàn):稱取千年健藥材藥品(表1中編號(hào)8樣品)6份,分別按照上述實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間rsd均小于2.26%,相對(duì)峰面積rsd均小于2.85%。將得到的色譜圖導(dǎo)入分析軟件進(jìn)行相似度分析,結(jié)果顯示其相似度均大于0.990,表明構(gòu)建方法重復(fù)性良好。
3.3穩(wěn)定性試驗(yàn):取千年健藥材藥品(表1中編號(hào)8樣品),按上述實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液,分別于0h、3h、6h、9h、12h、24h按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖,考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。試驗(yàn)結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間rsd均小于3.00%,相對(duì)峰面積rsd均小于2.18%。將得到的色譜圖導(dǎo)入分析軟件進(jìn)行相似度分析,結(jié)果顯示其相似度均大于0.980,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
以上方法學(xué)考察表明:目前建立的指紋圖譜操作方法可行,適合千年健藥材指紋圖譜的建立和分析。
千年健藥材對(duì)照?qǐng)D譜的建立
取不同批次千年健藥材共10批(樣品詳情見表1),分別按照已建立的千年健指紋圖譜分析方法進(jìn)行分析,得到各批藥材的hplc(高效液相色譜)指紋圖譜(見附圖1)。
上述10批千年健藥材,經(jīng)專家鑒定質(zhì)量合格,且為相互獨(dú)立的藥材樣本,可作為代表性樣品。因此以上述10批次樣品的色譜指紋圖譜為基礎(chǔ),使用藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004a版)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到共有模式指紋圖譜,即為千年健標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜r(見附圖2)。
通過比較10批藥材的色譜圖,確定了11個(gè)共有峰。在標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中,以4號(hào)峰為參照峰s峰,計(jì)算10批千年健藥材指紋圖譜各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果見表2和表3。
表210批樣品共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間
表310批樣品共有指紋峰相對(duì)峰面積
借助《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004a版)對(duì)10批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)算10批千年健藥材和對(duì)照指紋圖譜之間的相似度,除s4和s10與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.492和0.624外,其余廠家千年健樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.887~0.988之間,其中s1、s2、s3、s7與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度高達(dá)0.95以上,結(jié)果見表4。
表4各批藥材與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度
以上研究表明本發(fā)明提供的千年健指紋圖譜的構(gòu)建方法具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性,有良好的實(shí)用性,能夠用于千年健的綜合質(zhì)量控制。