本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鹵泛曲林的高效液相檢測方法。

背景技術(shù)：

瘧疾是一種危害嚴(yán)重的疾病，當(dāng)前全世界約1億人口受瘧原蟲感染。由于抗藥性惡性瘧原蟲的產(chǎn)生與擴散，使氯喹和其他一些抗瘧藥的應(yīng)用受到限制。美國walter醫(yī)學(xué)研究所和smithkline實驗室先后發(fā)現(xiàn)鹵泛曲林及其代謝物對氯喹敏感或有抗性的惡性瘧原蟲均具有同樣的療效。

鹵泛曲林(halofantrinehcl)，又名鹵泛群、氯氟菲醇，是菲醇類的新型抗瘧原蟲紅內(nèi)期裂殖體殺滅藥，其抗瘧原蟲作用同氯喹相仿，主要作用于食物泡和線粒體。對各種瘧疾包括多種藥物有抗性的惡性瘧均有效，臨床平均治愈率為95％，藥物副作用輕，患者耐受性良好。

關(guān)于鹵泛曲林的hplc分析方法及含量測定，現(xiàn)有技術(shù)已有報道(mariahotoftmichaelsen,olenasivak,researharticle.2015,20)，其檢測方法是：原料采用hplcp680，watersx-bridgec8色譜柱，acetonitrile/0.2％sds+0.2％glacialaceticacidinwater(80:20,v:v)流速0.8ml/min，進樣量10ul，在257nm波長處檢測；生物樣品采用acetonitrile/0.2％sds+0.2％glacialaceticacidinwater(85:15,v:v)作為流動相，進樣25ul，流速1.0ml/min，該方法主要是對鹵泛曲林的釋放及代謝進行檢測。發(fā)明人按該方法對鹵泛曲林含量進行測試，發(fā)現(xiàn)hplc譜的分離效果差，分離度r小于1，無法有效檢出個別工藝雜質(zhì)峰或有關(guān)物質(zhì)峰，洗脫時基線有漂移，積分不準(zhǔn)確，其用于定量分析時的精確度和準(zhǔn)確度不高，且檢測需要15min以上，耗時長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種檢測時間短、分離效果好、精確度和準(zhǔn)確度更高的鹵泛曲林的高效液相檢測方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的鹵泛曲林的高效液相檢測方法，色譜條件如下：

色譜柱采用反相c18色譜柱；

檢測器采用dad檢測器；

流動相包括流動相a和流動相b；流動相a是甲酸-乙酸銨的水溶液和乙腈的混合溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.01～0.03％，水溶液中乙酸銨濃度為0.5～1.5mm，水溶液與乙腈的體積比為100～95：0～5；流動相b是甲酸-乙酸銨的乙腈溶液和水的混合溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.01～0.03％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為0.5～1.5mm，乙腈溶液與水的體積比為100～95：0～5；

采用梯度洗脫，梯度洗脫程序按以下程序進行：0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至90％；2.10～2.11min，流動相b體積百分?jǐn)?shù)由90％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分?jǐn)?shù)為20％。

在一個優(yōu)選的實施例中，流動相a是甲酸-乙酸銨的水溶液和乙腈的體積分?jǐn)?shù)為95：5的混合溶液，流動相b是甲酸-乙酸銨的乙腈溶液和水的體積分?jǐn)?shù)為95：5的混合溶液。

在一個優(yōu)選的實施例中，流動相a中，水溶液中甲酸體積濃度為0.025％；流動相b中，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.025％。

在一個優(yōu)選的實施例中，流動相a中，水溶液中乙酸銨濃度為1mm；流動相b中，乙腈溶液中乙酸銨濃度為1mm。

在一個優(yōu)選的實施例中，色譜柱柱長為100mm。

在一個優(yōu)選的實施例中，流速為1.0～2.0ml/min，更優(yōu)選為1.4ml/min。

在一個優(yōu)選的實施例中，檢測波長為250～255nm，更優(yōu)選為254nm。

在一個優(yōu)選的實施例中，柱溫控制在35～40℃，更優(yōu)選為40℃。

在一個優(yōu)選的實施例中，進樣量為2～8μl，更優(yōu)選為3～5μl。

本發(fā)明還提供一種測定鹵泛曲林含量的高效液相方法，包括以下步驟：

(1)對照品溶液及供試品溶液的制備：精密稱取適量鹵泛曲林對照品，用注射用水溶解并定容成具有一定濃度梯度的多個對照品溶液；精密稱取適量鹵泛曲林供試品，用注射用水溶解并定容得到供試品溶液；

(2)色譜條件：

色譜柱采用反相c18色譜柱；

檢測器采用dad檢測器；

流動相包括流動相a和流動相b；流動相a是甲酸-乙酸銨的水溶液和乙腈的混合溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.025％，水溶液中乙酸銨濃度為1mm，水溶液與乙腈的體積比為95：5；流動相b是甲酸-乙酸銨的乙腈溶液和水的混合溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.025％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為1mm，乙腈溶液與水的體積比為95：5；

采用梯度洗脫，梯度洗脫程序按以下程序進行：0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至90％；2.10～2.11min，流動相b體積百分?jǐn)?shù)由90％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分?jǐn)?shù)為20％；

(3)測定方法：

將所述多個對照品溶液以及供試品溶液按所述(2)色譜條件依次進樣，記錄色譜圖，根據(jù)多個對照品溶液的圖譜數(shù)據(jù)和濃度數(shù)據(jù)制備線性相關(guān)工作曲線，代入供試樣品的圖譜數(shù)據(jù)計算并得出供試品溶液濃度，完成了鹵泛曲林含量的測定。

在一個優(yōu)選的實施例中，對照品溶液的濃度依次為6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml，流速為1.4ml/min。檢測波長為254nm，柱溫為40℃，進樣量為3～5μl。

本發(fā)明提供的鹵泛曲林的高效液相檢測方法的技術(shù)優(yōu)勢在于：

1.本發(fā)明的方法能夠有效檢出鹵泛曲林及其有關(guān)物質(zhì)，并且分離度r能達(dá)1.5以上，而現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法難以實現(xiàn)鹵泛曲林及其有關(guān)物質(zhì)的有效分離，分離度r小于1。

2.本發(fā)明的方法測定hplc譜基線平穩(wěn)，不發(fā)生漂移。

3.本發(fā)明的方法檢測時間短，只需3min即可完成高效液相檢測過程，而現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法則需要至少15min以上才能完成檢測，本方法大大提高了檢測效率，適合高通量篩選。

4.本發(fā)明的方法能節(jié)省溶劑，降低成本，操作安全簡易，處理方便快捷。

5.本發(fā)明的方法用于鹵泛曲林的含量測定，具有良好的線性關(guān)系，重現(xiàn)性高，在原料藥、制劑質(zhì)量研究以及相關(guān)藥動學(xué)定量研究等方面具有重要研究價值。

附圖說明

圖1為采用本發(fā)明的方法測定鹵泛曲林供試品的hplc圖譜一。

圖2為采用本發(fā)明的方法測定鹵泛曲林供試品的hplc圖譜二。

圖3為采用本發(fā)明的方法測定鹵泛曲林供試品的hplc圖譜三。

圖4為采用本發(fā)明的方法測定鹵泛曲林供試品的hplc圖譜四。

圖5為采用本發(fā)明的方法繪制的鹵泛曲林工作曲線。

具體實施方式

本申請的發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和大量的實驗，摸索得到了一種鹵泛曲林的高效液相檢測方法，該方法提供了能夠有效分離鹵泛曲林及其有關(guān)物質(zhì)的流動相體系及梯度洗脫程序，可以將現(xiàn)有技術(shù)中難以有效分離的鹵泛曲林及其有關(guān)物質(zhì)實現(xiàn)很好的分離效果，分離度r可達(dá)1.5以上。

發(fā)明人采用的鹵泛曲林的高效液相檢測方法是：

色譜柱采用反相c18色譜柱，比如以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的watersxbridge色譜柱；

檢測器采用dad檢測器；

流動相包括流動相a和流動相b；流動相a是甲酸-乙酸銨的水溶液/乙腈(100～95/0～5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.01～0.03％，水溶液中乙酸銨濃度為0.5～1.5mm；流動相b是甲酸-乙酸銨的乙腈溶液/水(100～95/0～5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.01～0.03％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為0.5～1.5mm；

采用梯度洗脫，流動相a+流動相b＝100％，梯度洗脫程序按以下程序進行：0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至90％；2.10～2.11min，流動相b體積百分?jǐn)?shù)由90％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分?jǐn)?shù)為20％。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，流動相a是甲酸-乙酸銨的水溶液和乙腈的體積分?jǐn)?shù)為95：5的混合溶液，流動相b是甲酸-乙酸銨的乙腈溶液和水的體積分?jǐn)?shù)為95：5的混合溶液。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，流動相a中，水溶液中甲酸體積濃度為0.025％；流動相b中，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.025％。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，流動相a中，水溶液中乙酸銨濃度為1mm；流動相b中，乙腈溶液中乙酸銨濃度為1mm。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，色譜柱柱長為100mm。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，流速為1.0～2.0ml/min，更優(yōu)選為1.4ml/min。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，檢測波長為250～255nm，更優(yōu)選為254nm。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，柱溫控制在35～40℃，更優(yōu)選為40℃。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，進樣量為2～8μl，更優(yōu)選為3～5μl。

下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明實施例中的實驗條件如下：

儀器：高效液相色譜儀(lc-20a)

色譜柱：watersxbridgec18色譜柱，柱長為100mm；

供試品溶液：精密稱取鹵泛曲林供試品10mg，置于10ml容量瓶，用注射用水溶解并定容，得到供試品溶液；

流速：1.4ml/min；

檢測波長：254nm；

柱溫：40℃；

流動相：流動相a+流動相b＝100％；

梯度洗脫：0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至90％；2.10～2.11min，流動相b體積百分?jǐn)?shù)由90％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分?jǐn)?shù)為20％。

實施例1

流動相a是甲酸—乙酸銨的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.025％，水溶液中乙酸銨濃度為1mm；流動相b是甲酸—乙酸銨的乙腈溶液/水(95/5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.025％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為1mm。

此方法下經(jīng)過四次進樣，hplc圖譜如圖1-4所示，基線平穩(wěn)，重復(fù)性好，3min能夠全部出峰，鹵泛曲林保留時間為1.739～1.741min，工藝雜質(zhì)保留時間為0.751～0.753min，且分離度均達(dá)到1.7，理論塔板數(shù)為3449。

實施例2

流動相a是甲酸—乙酸銨的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.01％，水溶液中乙酸銨濃度為0.5mm；流動相b是甲酸—乙酸銨的乙腈溶液/水(95/5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.01％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為0.5mm。

此方法下基線平穩(wěn)，鹵泛曲林保留時間為1.79min左右，且分離度為1.6。

實施例3

流動相a是甲酸—乙酸銨的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.03％，水溶液中乙酸銨濃度為1.5mm；流動相b是甲酸—乙酸銨的乙腈溶液/水(95/5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.03％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為1.5mm。

此方法下基線平穩(wěn)，鹵泛曲林保留時間為1.72min左右，且分離度為1.5。

實施例4

流動相a是甲酸—乙酸銨的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.025％，水溶液中乙酸銨濃度為1mm；流動相b是甲酸-乙酸銨的乙腈溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.025％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為1mm。

此方法下基線平穩(wěn)，鹵泛曲林保留時間為1.61min左右，且分離度為1.5。

實施例5

流動相a是甲酸-乙酸銨的水溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.025％，水溶液中乙酸銨濃度為1mm；流動相b是甲酸-乙酸銨的乙腈溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.025％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為1mm。

此方法下基線平穩(wěn)，鹵泛曲林保留時間為1.81min左右，且分離度為1.6。

實施例6

流動相a是甲酸-乙酸銨的水溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.025％，水溶液中乙酸銨濃度為1mm；流動相b是甲酸-乙酸銨的乙腈溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.025％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為1mm。

流動相：流動相a+流動相b＝100％；

梯度洗脫：0～0.01min，流動相b保持體積百分比為10％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由10％遞增至80％；2.10～2.11min，流動相b體積百分?jǐn)?shù)由80％遞減至10％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分?jǐn)?shù)為10％；

此方法下出現(xiàn)基線不平穩(wěn)、分離度小于1。

實施例7鹵泛曲林的含量測定

基于前述檢測方法，發(fā)明人還提供一種測定鹵泛曲林含量的高效液相方法，按以下步驟進行：

(1)對照品溶液及供試品溶液的制備：精密稱取鹵泛曲林對照品，用注射用水溶解并定容得到1mg/ml的儲備液，準(zhǔn)確吸取50μl儲備液，用注射用水依次稀釋定容得到6.25、12.5、25、50、100、200ug/ml的對照品溶液；精密稱取鹵泛曲林供試品，用注射用水溶解并定容得到供試品溶液；

(2)色譜條件：

色譜柱采用反相c18色譜柱；

檢測器采用dad檢測器；

流動相包括流動相a和流動相b；流動相a是甲酸—乙酸銨的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸體積濃度為0.025％，水溶液中乙酸銨濃度為1mm；流動相b是甲酸—乙酸銨的乙腈溶液/水(95/5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸體積濃度為0.025％，乙腈溶液中乙酸銨濃度為1mm；

采用梯度洗脫，梯度洗脫程序按以下程序進行：0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至90％；2.10～2.11min，流動相b體積百分?jǐn)?shù)由90％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分?jǐn)?shù)為20％；

(3)測定方法：

將所述6個對照品溶液和供試品溶液按所述色譜條件依次進樣，記錄色譜圖，根據(jù)6個對照品溶液的鹵泛曲林峰面積和濃度數(shù)據(jù)制備線性相關(guān)工作曲線(如圖5所示)，該工作曲線線性關(guān)系良好，r≥0.9999；代入供試樣品的鹵泛曲林峰面積計算并得出供試品溶液濃度，比較測定的供試品溶液濃度和定容的供試品溶液濃度以及進樣時的稀釋倍數(shù)，計算得出鹵泛曲林的含量。

本發(fā)明的鹵泛曲林的高效液相檢測方法，能夠有效檢出鹵泛曲林及其有關(guān)物質(zhì)，并且分離度r能達(dá)1.5以上，而現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法難以實現(xiàn)鹵泛曲林及其有關(guān)物質(zhì)的有效分離；本發(fā)明的檢測方法的hplc譜基線穩(wěn)定，不發(fā)生漂移；本發(fā)明的方法檢測時間短，只需3min即可完成高效液相檢測過程，而現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法則需要至少15min以上才能完成檢測，本方法大大提高了檢測效率，適合高通量篩選；本發(fā)明的方法能節(jié)省溶劑，降低成本，操作安全簡易，處理方便快捷；本發(fā)明的方法用于鹵泛曲林的含量測定，具有良好的線性關(guān)系，r≥0.9999，重現(xiàn)性高，在原料藥、制劑質(zhì)量研究以及相關(guān)藥動學(xué)定量研究等方面具有重要研究價值。

綜上所述，上述各實施例及附圖僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，皆應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。