本發(fā)明涉及的是一種新型試紙快速篩查可疑人員是否吸食嗎啡的方法，特別涉及一種基于受體配體結合技術篩查吸食嗎啡的試劑、制備方法及應用。

背景技術：

嗎啡(Morphine，MOP)是鴉片類毒品的重要組成部分，1806年法國化學家澤爾蒂納首次將其從鴉片中分離出來。其衍生物鹽酸嗎啡是臨床上常用的麻醉劑，有極強的鎮(zhèn)痛作用，多用于創(chuàng)傷、手術、燒傷等引起的劇痛，也用于心肌梗死引起的心絞痛，還可作為鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳和止瀉劑等，但其最大缺點是易成癮。這使得長期吸食者無論從身體上還是心理上都會對嗎啡產生嚴重的依賴性，造成嚴重的毒物癖，從而對自身和社會均造成極大的危害。分子式為C17H19NO3，分子量285，學名： 17-甲基-4，5α-環(huán)氧-7，8-二脫氫嗎啡喃-3，6α-二醇。

阿片受體屬于GPCR蛋白家族成員，體內至少存在8種亞型，在中樞神經系統(tǒng)內至少存在4種亞型:μ、κ、δ、σ。嗎啡類藥物對不同型的阿片受體，親和力和內在活性均不完全相同，每一種受體都有不同亞型。嗎啡是μ、κ、δ三種受體的激動劑，對三受體亞型的作用強度依次減弱。

傳統(tǒng)方法是通過抗原抗體結合技術實現的，抗體生產程序復雜，成本較高，小分子化合物抗體親和力和對不同亞型選擇性也不如受體配體。

技術實現要素：

針對現有技術不足,本發(fā)明的目的是提供一種基于受體配體結合技術方法篩查吸食嗎啡人員的方法，具有靈敏度更高（10-100倍），生產成本更低（降低成本30%以上）的優(yōu)勢。為此，本發(fā)明提供以下技術方案；

一種基于受體配體結合技術篩查吸食嗎啡的試劑，該試劑的蛋白序列如序列表SEQ NO.1所示；該試劑是對阿皮受體改造所得，針對原始序列分別對第138位和386位氨基酸做點突變，以增強受體與配體親和力。通過免疫熒光方法確定138位突變的蛋白活力最好（IC50小于10nM），滿足產品研發(fā)要求。

SEQ NO.1：

1 mdssaaptna snctdalays scspapspgs wvnlshldgn lsdpcgpnrt dlggrdslcp

61 ptgspsmita itimalysiv cvvglfgnfl vmyvivrytk mktatniyif nlaladalat

121 stlpfqsvny lmgtwpfmti lckivisidy ynmftsiftl ctmsvdryia vchpvkaldf

181 rtprnakiin vcnwilssai glpvmfmatt kyrqgsidct ltfshptwyw enllkicvfi

241 fafimpvlii tvcyglmilr lksvrmlsgs kekdrnlrri trmvlvvvav fivcwtpihi

301 yviikalvti pettfqtvsw hfcialgytn sclnpvlyaf ldenfkrcfr efciptssni

361 eqqnstrirq ntrdhpstan tvdrtnhqle nleaetaplp。

一種基于受體配體結合技術篩查吸食嗎啡的試劑盒，所述試劑盒包括采用所述的試劑制備成的阿片受體結合物墊，所述阿片受體結合物墊與硝酸纖維膜和吸樣墊裝配成反應板，該反應板切成試劑條并裝卡。

本發(fā)明還包括以下方法：一種基于受體配體結合技術篩查吸食嗎啡的試劑的制備方法，包括以下步驟：

1）構建阿片受體表達系統(tǒng)：

1.1）雙酶切，將分別將原始序列，138和386突變克隆入PET32表達載體。

1.2）轉化到DH5α感受態(tài)細菌中擴增，提質粒。

1.3）將質粒轉化入表達菌株，挑菌檢測并保種，表達菌株如Bl21（DE3）蛋白的誘導表達。

1.3.1）將表達菌株在3ml LB培養(yǎng)基中搖至OD=0.6左右，加入IPTG，濃度梯度從25μM到1m M。37度誘導過夜(一般3h以上即有大量表達)。

1.3.2）SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。

1.3.3）將有表達的菌株10%甘油保種，保存1ml左右就足夠了，并記錄IPTG濃度范圍。甘油是用0.22μm過濾除菌的，儲存濃度一般是30%-60%，使用時自己計算用量。

1.3.4）用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導10ml表達菌，18度，低轉速（140-180rpm），誘導過夜作為包涵體檢測樣品。

2）表達138位突變阿片受體：

2.1）取保種的表達菌株先搖10ml，37度，300rpm搖至OD>=1.5，約5h左右，視菌種的活性而異，也可過夜搖菌。

2.2）將上一步中的8ml加入300ml培養(yǎng)基中37度，250rpm搖至OD= 1.0左右（約2.5h~3h），然后加IPTG（濃度同包涵體檢測中使用的濃度）。過夜搖菌，使用包涵體檢測的溫度（18°左右），轉速140rpm左右。

2.2.1）將菌液6000rpm，4min，4度離心收集菌體。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡緩沖液重懸。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡緩沖液，視菌液的濃度而定?？捎?支50ml的離心管同時離心，但是，離心管要重復使用，用完后洗凈保存。

2.3）對上一步的產物進行超聲波裂解，用6mm變幅桿，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。

2.4）取超聲波裂解后的產物上清。將破碎好的溶液收集到50ml離心管中，10000rpm，15min，4°離心。沉淀為包涵體、細胞碎片和未破碎的細胞。輕輕的將上清倒出，盡量不要倒出沉淀。（此時可以測量一下pH值，pH值最好在7.5左右，平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就會在7.5左右。）

2.5）純化上清---摸洗脫條件。

2.5.1）鎳柱處理。將1ml鎳柱吸入空層析管中，待其中的液體流完后加入平衡緩沖液3ml。

2.5.2）將10ml上清加到已經平衡過的NI柱上，并將過柱的樣品重復上樣3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一個針頭，或者用1ml的槍將膠體吹散。）取20μl過柱后的樣品，以備跑膠。

2.5.3）分別加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度來洗脫雜蛋白。每個梯度分別的上樣量為4ml、2ml、2ml、2ml。每個次上樣的液體分前面1ml和后面1ml分別收集入EP管中，以備跑膠。

2.5.4）加洗脫緩沖液（洗脫緩沖液）將目的蛋白洗脫。上樣量為4.5ml（將前面的0.5ml單獨接入EP管，再將后面的4ml接入另外兩個EP管），留跑膠樣品。

2.6）跑膠驗證。

2.6.1）跑2塊0.75mm的PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）膠，把所有的樣品都加上去，兩塊膠的濃分離比要相同兩塊膠才會比較一致。

2.6.2）跑膠順序：負對照、正對照、上清、過柱樣品，300V快速壓膠5min左右，160V分離樣品50min左右。（也可以300V,30min，只是圖沒有160V好看。）

2.6.3）考馬斯亮藍染色。一般染色2h即可。

2.6.4）脫色。先用脫色劑1脫15min，再用脫色劑2脫過夜。

2.7）純化上清---收集目的蛋白

2.7.1）將重生的鎳柱再次平衡（即加對消洗脫液Equilibration Buffer 3ml）。

2.7.2）重復步驟12中的操作，只是清洗時只用步驟12中摸好的咪唑濃度洗。

2.8）再次跑膠驗證并保存；這次膠圖用160V，保存好。

2.9）透析。

2.9.1）配制2L透析液（配方見附件1），并放于-20度冰箱預冷但不要結冰。

2.9.2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋處理液煮沸10min，用MILIQ H₂O充分洗凈。

2.9.3）用透析夾將透析袋夾?。▽⑼肝龃郫B一下會夾的更牢），將洗脫的蛋白樣品加入其中，置入提前預冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下輕微磁力攪拌20min后置入4°冰箱1.5h后換液。透析3次即可。

2.10）濃縮。

2.10.1）將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中，用預冷的聚乙二醇2000固體包埋。

2.10.2）30min后將吸水后呈漿糊狀的聚乙二醇去除，加入新的固體聚乙二醇。

2.10.3）每隔10min觀察一次，一旦出現渾濁立即停止?jié)饪s。

2.10.4）透析袋用完后，洗凈，保存于20%乙醇中4°存放。

2.11）超濾法濃縮、透析蛋白。

2.11.1）將4ml對消洗脫得到的蛋白溶液加入超濾管中。

2.12）配平。

2.12.1）7400g，30min，4°離心，結束時4ml變?yōu)?ml左右。濃縮4倍?？筛鶕枰x擇不同的離心時間，以達到不同的濃縮倍數。可以幾次的洗脫液（Elution）一起濃縮。

2.11.2）加入需要的蛋白儲存液至4ml，離心。重復操作可以使Elution液逐漸換為所需的蛋白儲存液。蛋白儲存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或適當濃度和pH的三（羥甲基）氨基甲烷（tris-HCl）溶液。如果蛋白有沉淀達不到預定濃度可以添加適當的甘油（1%-5%即可）助溶。

2.13）收集。將溶液從超濾管中收集到EP管中，標記好儲存液的成分，蛋白名稱，蛋白濃度（測量后），及制備日期。

3）制備阿片受體膠體金墊。

3.1）受體金標處理：通過還原法制備40 nm-50 nm左右的膠體金溶液，顏色變得鮮紅清亮后分別三份進行實驗，第一份用0.1 mol/L K2CO3調PH為8.0，第二份調PH為8.5，第三份調PH為9.0。然后在溶液中分別加入1 mg、1.5 mg、2.0 mg阿片受體，緩慢逐滴加入，繼續(xù)攪拌35分鐘后，再加入終濃度為3%的BSA和終濃度為1%的TWEEN20繼續(xù)攪拌10分鐘，然后4 ℃，12000 rpm離心45分鐘，小心吸取上清棄去；用膠體金溶液重新定容至100ml，按1ml溶液鋪30 cm2的比例均勻鋪在玻璃纖維或無紡布上，置于干燥間，37 ℃，濕度25%條件下干燥3小時，制成膠體金墊。

3.2）樣品墊的處理：將玻璃纖維或無紡布浸泡于50 ml 0.01 mol/L PH=7.4的磷酸鹽緩沖液中（含終濃度3% BSA, 0.05%的TWEEN20）中1小時，37 ℃烘干，真空封裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3）嗎啡包被：用碳酸鹽緩沖液和終濃度為3%的BSA混合液將嗎啡溶液稀釋到0.5mg/ml、1mg/ml和1.5mg/ml，用點膜機將包被液劃到硝酸纖維膜上，37℃干燥4小時，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4）切割裝配：

將上樣墊、膠體金標記的阿片受體結合物墊、嗎啡的硝酸纖維膜、吸樣墊裝配成反應板，用切條機切成4mm試劑條，進行裝卡后，裝入鋁箔袋制成成品。

檢測方法和結果判斷：取50ul-100ul左右待測尿液或唾液在上樣墊上，反應大約1分鐘左右，根據顏色反應用肉眼直接觀測結果，T線和C線同時顯色說明樣品中不含嗎啡，如果只有C線顯色說明樣品中含有嗎啡，如果C線沒出現說明產品檢測無效。

參數確定：根據最后檢測結果顯示，試劑紙最近標記PH約為9.0；阿片受體膠體金標記抗體最佳量1.5 mg/100 ml膠體金溶液，嗎啡的最佳標記量為1 mg/ml，最佳的膠體金工作液為PH為9.0的含0.01%的氯金酸和1%檸檬酸鈉水溶液，并加入了3% BSA和1% TWEEN20，檢定最佳時間為30秒。

人體只要吸食過嗎啡，嗎啡就會通過胃腸道或者血液循環(huán)進入人體，而嗎啡的化學物質就會殘留在人體內一段時間，并且嗎啡的原化學物質或者其代謝產物就會在嗎啡吸食人員的唾液中或者尿液中呈現。根據這個特點，吸毒人員測定系列可以通過檢測人員的唾液或者尿液準確的檢測出是否在一定時間內曾經吸食過某種類型的嗎啡。例如：人體一旦吸食過嗎啡，在之后的24小時內，此人的尿液中將會持續(xù)呈現嗎啡殘留，只要本項目的吸毒人員測定系列中嗎啡檢測呈陽性，即可判定此人在24小時內有吸食嗎啡的行為。

同時，醫(yī)療衛(wèi)生防疫部門、以及其他體檢篩查，例如兵役人員的檢測以及出入境人員檢查，也可以應用本項目的嗎啡吸食人員的測定系列。

采用本發(fā)明技術方案，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明運用受體配體結合，選擇性好，生產成本較低。有利于公安部門、禁毒機構對可疑人群的篩查中，及時鑒別吸毒人員，從而為公安部門、禁毒機構的禁毒行動爭取到重要的時間。

因為操作和檢測無需任何專業(yè)人士的參與，并且具有快速、便于攜帶的特點，本系列產品亦可應用于在戒毒機構的治療監(jiān)控，以及無毒社區(qū)的建設過程中。

附圖說明

圖1為本發(fā)明克隆鑒定核算電泳圖。

圖2為本發(fā)明不同突變蛋白結合活力比較。

圖3為本發(fā)明快速蛋白液相色譜（FPLC）蛋白純化紫外吸收圖。

具體實施方式

如圖所示，一種基于受體配體結合技術篩查吸食嗎啡的試劑盒，所述試劑盒包括采用所述的試劑制備成的阿片受體結合物墊，所述阿片受體結合物墊與硝酸纖維膜和吸樣墊裝配成反應板，該反應板切成試劑條并裝卡。

1）構建阿片受體表達系統(tǒng)：

1.1）雙酶切，將分別將原始序列，138和386突變克隆入PET32表達載體。

1.2）轉化到DH5α感受態(tài)細菌中擴增，提質粒。

1.3）將質粒轉化入表達菌株，挑菌檢測并保種，表達菌株如Bl21（DE3）蛋白的誘導表達。

1.3.1）將表達菌株在3ml LB培養(yǎng)基中搖至OD=0.6左右，加入IPTG（異丙基硫代半乳糖苷)，濃度梯度從25μM到1m M。37度誘導過夜(一般3h以上即有大量表達)。

1.3.2）SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。

1.3.3）將有表達的菌株10%甘油保種，保存1ml左右就足夠了，并記錄IPTG濃度范圍。甘油是用0.22μm過濾除菌的，儲存濃度一般是30%-60%，使用時自己計算用量。

1.3.4）用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導10ml表達菌，18度，低轉速（140-180rpm），誘導過夜作為包涵體檢測樣品。

2）表達138位突變阿片受體：

2.1））取保種的表達菌株先搖10ml，37度，300rpm搖至OD>=1.5，約5h左右，視菌種的活性而異，也可過夜搖菌。

2.2）將上一步中的8ml加入300ml培養(yǎng)基中37度，250rpm搖至OD= 1.0左右（約2.5h~3h），然后加IPTG（濃度同包涵體檢測中使用的濃度）。過夜搖菌，使用包涵體檢測的溫度（18°左右），轉速140rpm左右。

2.2.1）將菌液6000rpm，4min，4度離心收集菌體。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡緩沖液重懸。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡緩沖液，視菌液的濃度而定?？捎?支50ml的離心管同時離心，但是，離心管要重復使用，用完后洗凈保存。

2.3）對上一步的產物進行超聲波裂解，用6mm變幅桿，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。

2.4）取超聲波裂解后的產物上清。將破碎好的溶液收集到50ml離心管中，10000rpm，15min，4°離心。沉淀為包涵體、細胞碎片和未破碎的細胞。輕輕的將上清倒出，盡量不要倒出沉淀。（此時可以測量一下pH值，pH值最好在7.5左右，平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就會在7.5左右。）

2.5）純化上清---摸洗脫條件。

2.5.1）鎳柱處理。將1ml鎳柱吸入空層析管中，待其中的液體流完后加入平衡緩沖液3ml。

2.5.2）將10ml上清加到已經平衡過的NI柱上，并將過柱的樣品重復上樣3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一個針頭，或者用1ml的槍將膠體吹散。）取20μl過柱后的樣品，以備跑膠。

2.5.3）分別加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度來洗脫雜蛋白。每個梯度分別的上樣量為4ml、2ml、2ml、2ml。每個次上樣的液體分前面1ml和后面1ml分別收集入EP管中，以備跑膠。

2.5.4）加洗脫緩沖液（洗脫緩沖液）將目的蛋白洗脫。上樣量為4.5ml（將前面的0.5ml單獨接入EP管，再將后面的4ml接入另外兩個EP管），留跑膠樣品。

2.6）跑膠驗證。

2.6.1）跑2塊0.75mm的PAGE膠，把所有的樣品都加上去，兩塊膠的濃分離比要相同兩塊膠才會比較一致。

2.6.2）跑膠順序：負對照、正對照、上清、過柱樣品，300V快速壓膠5min左右，160V分離樣品50min左右。（也可以300V,30min，只是圖沒有160V好看。）

2.6.3）考馬斯亮藍染色。一般染色2h即可。

2.6.4）脫色。先用脫色劑1脫15min，再用脫色劑2脫過夜。

2.7）純化上清---收集目的蛋白

2.7.1）將重生的鎳柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml）。

2.7.2）重復步驟12中的操作，只是清洗時只用步驟12中摸好的咪唑濃度洗。

2.8）再次跑膠驗證并保存；這次膠圖用160V，保存好。

2.9）透析。

2.9.1）配制2L透析液（配方見附件1），并放于-20度冰箱預冷但不要結冰。

2.9.2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋處理液煮沸10min，用MILIQ H₂O充分洗凈。

2.9.3）用透析夾將透析袋夾?。▽⑼肝龃郫B一下會夾的更牢），將洗脫的蛋白樣品加入其中，置入提前預冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下輕微磁力攪拌20min后置入4°冰箱1.5h后換液。透析3次即可。

2.10）濃縮。

2.10.1）將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中，用預冷的聚乙二醇2000固體包埋。

2.10.2）30min后將吸水后呈漿糊狀的聚乙二醇去除，加入新的固體聚乙二醇。

2.10.3）每隔10min觀察一次，一旦出現渾濁立即停止?jié)饪s。

2.10.4）透析袋用完后，洗凈，保存于20%乙醇中4°存放。

2.11）超濾法濃縮、透析蛋白。

2.11.1）將4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超濾管中。

2.12）配平。

2.12.1）7400g，30min，4°離心，結束時4ml變?yōu)?ml左右。濃縮4倍?？筛鶕枰x擇不同的離心時間，以達到不同的濃縮倍數。可以幾次的洗脫夜（Elution）一起濃縮。

2.11.2）加入需要的蛋白儲存液至4ml，離心。重復操作可以使Elution液逐漸換為所需的蛋白儲存液。蛋白儲存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或適當濃度和pH的三（羥甲基）氨基甲烷（tris-HCl）溶液。如果蛋白有沉淀達不到預定濃度可以添加適當的甘油（1%-5%即可）助溶。

2.13）收集。將溶液從超濾管中收集到EP管中，標記好儲存液的成分，蛋白名稱，蛋白濃度（測量后），及制備日期。

3）制備阿片受體膠體金墊。

3.1）受體金標處理：通過還原法制備40 nm-50 nm左右的膠體金溶液，顏色變得鮮紅清亮后分別三份進行實驗，第一份用0.1 mol/L K2CO3調PH為8.0，第二份調PH為8.5，第三份調PH為9.0。然后在溶液中分別加入1 mg、1.5 mg、2.0 mg阿片受體，緩慢逐滴加入，繼續(xù)攪拌35分鐘后，再加入終濃度為3%的BSA和終濃度為1%的TWEEN20繼續(xù)攪拌10分鐘，然后4 ℃，12000 rpm離心45分鐘，小心吸取上清棄去；用膠體金溶液重新定容至100ml，按1ml溶液鋪30 cm2的比例均勻鋪在玻璃纖維或無紡布上，置于干燥間，37 ℃，濕度25%條件下干燥3小時，制成膠體金墊。

3.2）樣品墊的處理：將玻璃纖維或無紡布浸泡于50 ml 0.01 mol/L PH=7.4的磷酸鹽緩沖液中（含終濃度3% BSA, 0.05%的TWEEN20）中1小時，37 ℃烘干，真空封裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3）嗎啡包被：用碳酸鹽緩沖液和終濃度為3%的BSA混合液將嗎啡溶液稀釋到0.5mg/ml、1mg/ml和1.5mg/ml，用點膜機將包被液劃到硝酸纖維膜上，37℃干燥4小時，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4）切割裝配：

將上樣墊、膠體金標記的阿片受體結合物墊、嗎啡的硝酸纖維膜、吸樣墊裝配成反應板，用切條機切成4mm試劑條，進行裝卡后，裝入鋁箔袋制成成品。

檢測方法和結果判斷：取50ul-100ul左右待測尿液或唾液在上樣墊上，反應大約1分鐘左右，根據顏色反應用肉眼直接觀測結果，T線和C線同時顯色說明樣品中不含嗎啡，如果只有C線顯色說明樣品中含有嗎啡，如果C線沒出現說明產品檢測無效。

參數確定：根據最后檢測結果顯示，試劑紙最近標記PH約為9.0；阿片受體膠體金標記抗體最佳量1.5 mg/100 ml膠體金溶液，嗎啡的最佳標記量為1 mg/ml，最佳的膠體金工作液為PH為9.0的含0.01%的氯金酸和1%檸檬酸鈉水溶液，并加入了3% BSA和1% TWEEN20，檢定最佳時間為30秒。

人體只要吸食過嗎啡，嗎啡就會通過胃腸道或者血液循環(huán)進入人體，而嗎啡的化學物質就會殘留在人體內一段時間，并且嗎啡的原化學物質或者其代謝產物就會在嗎啡吸食人員的唾液中或者尿液中呈現。根據這個特點，吸毒人員測定系列可以通過檢測人員的唾液或者尿液準確的檢測出是否在一定時間內曾經吸食過某種類型的嗎啡。例如：人體一旦吸食過嗎啡，在之后的24小時內，此人的尿液中將會持續(xù)呈現嗎啡殘留，只要本項目的吸毒人員測定系列中嗎啡檢測呈陽性，即可判定此人在24小時內有吸食嗎啡的行為。

同時，醫(yī)療衛(wèi)生防疫部門、以及其他體檢篩查，例如兵役人員的檢測以及出入境人員檢查，也可以應用本項目的嗎啡吸食人員的測定系列。

SEQUENCE LISTING

<110> 紹興康知生物科技有限公司

<120> 一種基于受體配體結合技術篩查吸食嗎啡的試劑、制備方法及應用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 400

<212> PRT

<213> Human adenovirus type 1

<400> 1

Met Asp Ser Ser Ala Ala Pro Thr Asn Ala Ser Asn Cys Thr Asp Ala

1 5 10 15

Leu Ala Tyr Ser Ser Cys Ser Pro Ala Pro Ser Pro Gly Ser Trp Val

20 25 30

Asn Leu Ser His Leu Asp Gly Asn Leu Ser Asp Pro Cys Gly Pro Asn

35 40 45

Arg Thr Asp Leu Gly Gly Arg Asp Ser Leu Cys Pro Pro Thr Gly Ser

50 55 60

Pro Ser Met Ile Thr Ala Ile Thr Ile Met Ala Leu Tyr Ser Ile Val

65 70 75 80

Cys Val Val Gly Leu Phe Gly Asn Phe Leu Val Met Tyr Val Ile Val

85 90 95

Arg Tyr Thr Lys Met Lys Thr Ala Thr Asn Ile Tyr Ile Phe Asn Leu

100 105 110

Ala Leu Ala Asp Ala Leu Ala Thr Ser Thr Leu Pro Phe Gln Ser Val

115 120 125

Asn Tyr Leu Met Gly Thr Trp Pro Phe Met Thr Ile Leu Cys Lys Ile

130 135 140

Val Ile Ser Ile Asp Tyr Tyr Asn Met Phe Thr Ser Ile Phe Thr Leu

145 150 155 160

Cys Thr Met Ser Val Asp Arg Tyr Ile Ala Val Cys His Pro Val Lys

165 170 175

Ala Leu Asp Phe Arg Thr Pro Arg Asn Ala Lys Ile Ile Asn Val Cys

180 185 190

Asn Trp Ile Leu Ser Ser Ala Ile Gly Leu Pro Val Met Phe Met Ala

195 200 205

Thr Thr Lys Tyr Arg Gln Gly Ser Ile Asp Cys Thr Leu Thr Phe Ser

210 215 220

His Pro Thr Trp Tyr Trp Glu Asn Leu Leu Lys Ile Cys Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Ala Phe Ile Met Pro Val Leu Ile Ile Thr Val Cys Tyr Gly Leu

245 250 255

Met Ile Leu Arg Leu Lys Ser Val Arg Met Leu Ser Gly Ser Lys Glu

260 265 270

Lys Asp Arg Asn Leu Arg Arg Ile Thr Arg Met Val Leu Val Val Val

275 280 285

Ala Val Phe Ile Val Cys Trp Thr Pro Ile His Ile Tyr Val Ile Ile

290 295 300

Lys Ala Leu Val Thr Ile Pro Glu Thr Thr Phe Gln Thr Val Ser Trp

305 310 315 320

His Phe Cys Ile Ala Leu Gly Tyr Thr Asn Ser Cys Leu Asn Pro Val

325 330 335

Leu Tyr Ala Phe Leu Asp Glu Asn Phe Lys Arg Cys Phe Arg Glu Phe

340 345 350

Cys Ile Pro Thr Ser Ser Asn Ile Glu Gln Gln Asn Ser Thr Arg Ile

355 360 365

Arg Gln Asn Thr Arg Asp His Pro Ser Thr Ala Asn Thr Val Asp Arg

370 375 380

Thr Asn His Gln Leu Glu Asn Leu Glu Ala Glu Thr Ala Pro Leu Pro

385 390 395 400