本發(fā)明屬于生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法。
背景技術(shù)：
瘧疾是經(jīng)按蚊叮咬或輸入帶瘧原蟲者的血液而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病，其居全球致死的寄生蟲病的第一位。寄生于人體的瘧原蟲共有四種，即間日瘧原蟲，三日瘧原蟲，惡性瘧原蟲和卵形瘧原蟲。在我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲，其他兩種少見，近年偶見國外輸入的一些病例。不同的瘧原蟲分別引起間日瘧、三日瘧、惡性瘧及卵圓瘧。瘧疾主要表現(xiàn)為周期性規(guī)律發(fā)作，全身發(fā)冷、發(fā)熱、多汗，長期多次發(fā)作后，可引起貧血和脾腫大。
據(jù)法國國家科研中心介紹，每年全世界約有100萬人死于瘧疾，但醫(yī)學(xué)界至今仍未研制出針對這種傳染病的有效疫苗。作為瘧原蟲的一種，惡性瘧原蟲致病性極強(qiáng)，它主要存在于非洲、南美和亞洲的熱帶地區(qū)，并與80%的人類瘧疾相關(guān)。十幾年來，醫(yī)學(xué)界一直使用青蒿素及其衍生產(chǎn)品對病人進(jìn)行治療，它不但治愈率高，而且見效很快。但是目前科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)少數(shù)惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物表現(xiàn)出抗藥性，這為瘧疾的防治工作敲響了警鐘。
目前國內(nèi)外對于瘧疾的主要檢測方法有：鏡檢法、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、免疫學(xué)法。實(shí)驗(yàn)室診斷包括瘧疾病原學(xué)診斷技術(shù)和瘧疾抗體診斷技術(shù)，這些診斷技術(shù)中某些方法存在有檢測上的缺陷。瘧疾病原學(xué)診斷技術(shù)中的病原學(xué)診斷（顯微鏡血片檢查）鏡檢法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且需要專業(yè)人員操作，在瘧原蟲血癥較低的時(shí)候容易出現(xiàn)誤診和漏診。瘧疾病原學(xué)診斷技術(shù)中的病原基因檢測（PCR）檢測需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)儀器和人員。瘧疾抗體診斷技術(shù) （IFA）需要熒光顯微鏡，熒光結(jié)果判定存在一定主觀因素。瘧疾病原學(xué)診斷技術(shù)中的病原免疫學(xué)診斷（快速免疫診斷試條）快速免疫診斷試條與顯微鏡檢查瘧原蟲方法相似，主要用于瘧疾病人的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷及居民帶蟲調(diào)查，具有方便、快速、簡單、不需要儀器設(shè)備和有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員等優(yōu)點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法，該制備方法得到的試紙采用一份微量樣本（5微升）不僅可以檢測是否感染了惡性瘧，還可以檢測除惡性瘧以外的是否有其他三種瘧疾（三日瘧、卵形瘧、間日瘧）的單項(xiàng)或者混合感染，診斷快速且結(jié)果準(zhǔn)確。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法，包括步驟為：
（1）制備pf重懸液：所述pf重懸液中包括三羥甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和吐溫20，將三羥甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和吐溫20溶于水并定容，調(diào)節(jié)pH值至8-9得到；制備pan重懸液：所述pan重懸液中包括三羥甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和酪蛋白，將三羥甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和酪蛋白溶于水并定容，調(diào)節(jié)pH值至8-9得到；制備包被基液：海藻糖溶于pH值為7-8的磷酸緩沖溶液并定容得到；
（2）將膠體金與碳酸鉀混合并調(diào)節(jié)pH值，再加入惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體、牛血清白蛋白溶液混合，離心得到第一沉淀，所述第一沉淀用所述pf重懸液重懸，得到pf免疫金；將膠體金與碳酸鉀混合并調(diào)節(jié)pH值，再加入瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體、牛血清白蛋白溶液混合，離心得到第二沉淀，所述第二沉淀用所述pan重懸液重懸，得到pan免疫金；
（3）用所述包被基液稀釋所述惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體得到惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體檢測線包被液；用所述包被基液稀釋所述瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體得到瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體檢測線包被液；用所述包被基液稀釋羊抗鼠IgG多抗得到對照線包被液；
（4）用所述pf免疫金對金墊噴金得到pf免疫金墊；用所述pan免疫金對金墊噴金得到pan免疫金墊；用所述惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體檢測線包被液、所述瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體檢測線包被液和所述對照線包被液分別在貼于聚氯乙烯底板的硝酸纖維素膜上劃線，得到點(diǎn)膜的聚氯乙烯底板；
（5）將樣品墊、所述pf免疫金墊、所述pan免疫金墊、所述點(diǎn)膜的聚氯乙烯底板和吸水紙組裝在一起，切割成瘧原蟲pf/pan檢測試紙。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（1）中所述pf重懸液中所述三羥甲基氨基甲烷、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白、所述吐溫20和定容總體積的比例為0.242g：10g：5g：1g：0.2 mL：100mL；所述pan重懸液中所述三羥甲基氨基甲烷、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白、所述酪蛋白和定容總體積的比例為0.242g：10g：5g：1g：0.2g：100mL。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（1）中所述pf重懸液的pH值用1M鹽酸調(diào)節(jié)至8.5；所述pan重懸液的pH值用1M鹽酸調(diào)節(jié)至9.0；所述磷酸緩沖溶液為0.01M、pH值為7.4的磷酸緩沖溶液。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（2）中制備pf免疫金的具體步驟為：將膠體金與碳酸鉀混合并調(diào)節(jié)pH值后攪拌5min，加入惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體并攪拌5min，再加入牛血清白蛋白溶液混合并攪拌5min，在4℃、轉(zhuǎn)速為6000r/min的條件下離心 30min得到第一沉淀，所述第一沉淀用所述pf重懸液重懸至離心前體積的1/10，得到pf免疫金；制備pan免疫金的具體步驟為：將膠體金與碳酸鉀混合并調(diào)節(jié)pH值后攪拌5min，加入瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體并攪拌5min，再加入牛血清白蛋白溶液混合并攪拌5min，在4℃、轉(zhuǎn)速為6000r/min的條件下離心 30min得到第二沉淀，所述第二沉淀用所述pan重懸液重懸至離心前體積的1/20，得到pan免疫金。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（2）中所述碳酸鉀為0.2M碳酸鉀，所述0.2M碳酸鉀和所述惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體的比例為3uL/mL:10μg/mL，所述0.2M碳酸鉀和所述瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體的比例為4uL/mL:5μg/mL；所述牛血清白蛋白溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的牛血清白蛋白溶液，所述質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的牛血清白蛋白溶液的加入體積為所述膠體金體積的1/10；攪拌是置于磁力攪拌器上實(shí)現(xiàn)的。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（3）中所述惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體檢測線包被液中所述惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體的濃度為2mg/mL；所述瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體檢測線包被液中所述瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體的濃度為2mg/mL；所述對照線包被液中所述羊抗鼠IgG多抗的濃度為2mg/mL。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（4）中所述金墊采用玻璃纖維膜；所述噴金采用點(diǎn)膜噴金設(shè)備完成。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（4）中將得到的點(diǎn)膜的聚氯乙烯底板放入條件為60℃±3℃、相對濕度≤30%的環(huán)境中烘干2h，密封保存。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（6）中所述樣品墊為玻璃纖維膜；所述樣品墊在使用前用樣品墊處理液浸泡10min后干燥，其中所述樣品墊處理液中包括三羥甲基氨基甲烷、TritonX-100、表面活性劑S7、表面活性劑S9和BSA。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述樣品墊處理液是將比例為1.21g：0.3mL：0.3g：0.4g：1g的三羥甲基氨基甲烷、TritonX-100、表面活性劑S7、表面活性劑S9和BSA溶于水中定容至100 mL，pH值調(diào)節(jié)至9.0。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法，得到的檢測試紙基于免疫側(cè)向流層析技術(shù)，不需任何儀器設(shè)備，能夠通過手工操作、肉眼讀取判斷全血樣本中是否含有瘧原蟲pf/pan，診斷快速且結(jié)果準(zhǔn)確，不會對受檢者身體造成傷害。所述試紙采用一份微量樣本（5μL）即能對瘧原蟲pf/pan同時(shí)檢測，提示是否感染了惡性瘧或者除惡性瘧以外的其他三種瘧疾（三日瘧、卵形瘧、間日瘧）的單項(xiàng)或者混合感染，適用于瘧疾疑似患者的輔助診斷或瘧區(qū)的篩查。
具體實(shí)施方式
下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
（一）容器及材料
容器設(shè)備：燒杯、量筒、容量瓶、玻璃棒、磁力攪拌機(jī)、電子天平、移液槍、點(diǎn)膜噴金設(shè)備、裁切機(jī)、切條機(jī)、封口機(jī)、壓殼機(jī)、pH計(jì)、鼓風(fēng)干燥箱。
試劑輔料：氯金酸、檸檬酸三鈉、K2CO3、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、HCl、BSA（牛血清白蛋白）、表面活性劑S7、表面活性劑S9、TritonX-100（曲拉通）、酪蛋白、Tween-20（吐溫20）、蔗糖、海藻糖。
物料：玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、聚氯乙烯底板、吸水紙、塑料卡、干燥劑、一次性滴管、鋁箔袋。
環(huán)境：潔凈、室溫、干區(qū)相對濕度≤30%，濕區(qū)相對濕度45-65%，水質(zhì)：高純水。
（二）制備過程
1、膠體金的制備：采用檸檬酸三鈉還原法
50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯金酸溶液配制：取1g/瓶的氯金酸溶于高純水中，容量瓶定容至50 mL，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的檸檬酸三鈉溶液配制：稱取5.00g檸檬酸三鈉溶于高純水中，容量瓶定容至100 mL，用0.22 μm濾頭過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。
膠體金制備方法：取兩只潔凈燒杯，分別加入500mL和500mL高純水，前者加入2%氯金酸溶液，后者加入5%檸檬酸三鈉溶液，于磁力攪拌機(jī)上加熱至煮沸，待兩種溶液都沸騰時(shí)，將檸檬酸三鈉溶液，快速倒入沸騰的氯金酸溶液中，繼續(xù)煮沸30min，冷卻后加高純水稀釋，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
各組份加入體積：
2、樣品墊的預(yù)處理：
1L樣品墊處理液配制：稱取12.1g Tris、3g表面活性劑S7、4g表面活性劑S9、1g BSA，溶于高純水中，注入3mL TritonX-100，容量瓶定容至1L，用1M鹽酸調(diào)pH為9.0，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
將型號為SB08的玻璃纖維膜在樣品墊處理液中浸潤，浸泡10min，取出，相對濕度≤30%下風(fēng)干4h，裁去邊緣防止邊緣效應(yīng)，裝入鋁箔袋中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>
3、重懸液、包被基液配制
100mL 1M鹽酸配制：量取8.59 mL濃鹽酸溶于高純水中，容量瓶定容至100 mL，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>
100mL pf重懸液配制：稱取0.24g Tris、10g蔗糖、5g海藻糖和1g BSA溶于高純水，加入0.2mL Tween-20，在100mL容量瓶中定容，用1M鹽酸調(diào)pH為8.5，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
100mL pan重懸液配制：稱取0.24g Tris、10g蔗糖、5g海藻糖、1g BSA和0.2g酪蛋白溶于高純水，在100mL容量瓶中定容，用1M鹽酸調(diào)pH為9.0，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
磷酸緩沖液（PB）配制：稱取2.84g磷酸氫二鈉溶于高純水，容量瓶定容至100 mL，即為0.2M磷酸氫二鈉溶液；稱取2.40g磷酸二氫鈉溶于高純水，容量瓶定容至100 mL，即為0.2M磷酸二氫鈉溶液；用0.22 μm濾頭過濾，2-8℃保存?zhèn)溆?。量?9 mL0.2M磷酸二氫鈉溶液，81 mL0.2M磷酸氫二鈉溶液，加入1900 mL高純水，混勻，即為0.01M，pH=7.4的磷酸緩沖液（PB），2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
包被基液配制：稱取1.00g海藻糖溶于磷酸緩沖液（PB），容量瓶定容至100 mL，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
4、免疫金標(biāo)記
100mL 0.2 M碳酸鉀溶液配制：稱取2.76 g碳酸鉀溶于高純水，容量瓶定容至100mL，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
100mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的BSA溶液配制：稱取10 g BSA溶于高純水中，容量瓶定容至100mL， 2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
標(biāo)記惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體：取燒杯，加入膠體金，置磁力攪拌機(jī)上攪拌，加入3uL/mL的0.2M碳酸鉀，調(diào)節(jié)pH并攪拌5min，緩慢加入10μg/mL的惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體，攪拌5min，緩慢加入10% BSA保護(hù)劑，至終濃度1%，攪拌5min，在4℃下轉(zhuǎn)速為6000r/min的條件下離心30min，棄去上清液，沉淀用重懸液重懸至原體積的1/10，得到pf免疫金，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
標(biāo)記瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體：取燒杯，加入膠體金，置磁力攪拌機(jī)上攪拌，加入4uL/mL的0.2M碳酸鉀，調(diào)節(jié)pH并攪拌5min，緩慢加入5μg/mL 的瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體，攪拌5min，緩慢加入10% BSA保護(hù)劑，至終濃度1%，攪拌5min，在4℃下轉(zhuǎn)速為6000 r/min的條件下離心30min，棄去上清液，沉淀用重懸液重懸至原體積的1/20，得到pan免疫金，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
5、點(diǎn)膜噴金操作
噴金：打開點(diǎn)膜噴金設(shè)備，將噴金模塊壓下去，劃線模塊抬上來，防止劃線頭碰觸到板面，打開真空泵至0.5個(gè)大氣壓。
按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，選擇[程序]轉(zhuǎn)換到噴金工作模式。進(jìn)入程序數(shù)據(jù)畫面后選擇好程序號，編輯好“長度”、“濃度”、“速度”、“原點(diǎn)X、Y、Z”等參數(shù)，修改好參數(shù)后，按[保存]保存數(shù)據(jù)，按[永久保存]將永久保存數(shù)據(jù)。
按[手動]進(jìn)入手動畫面，將2號泵（噴金模式）樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。待拿走高純水試管后，選擇[排液]直至管道內(nèi)無水分。此時(shí)將2號泵樣品管道插入試管中，按[加液]直至管道內(nèi)充滿pf免疫金。將金墊放在板面上的合適位置，按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，按[開始]進(jìn)行噴金。
噴金完畢，將2號泵樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。待拿走高純水試管后，選擇[排液]直至管道內(nèi)無水分。此時(shí)將2號泵樣品管道插入試管中，按[加液]直至管道內(nèi)充滿pan免疫金。將金墊放在板面上的合適位置，按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，按[開始]進(jìn)行噴金。
噴金完畢，將2號泵樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。按[主菜單]的[氣操作]開氣至氣壓為零。
噴金處理后的pf金墊與pan金墊于相對濕度≤30%下風(fēng)干1h。干燥處理后的免疫金墊置于鋁箔袋中，加干燥劑室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>
配制檢測線包被液：用包被基液稀釋惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體至終濃度為2mg/mL，得到檢測線包被液即T1線工作液；用包被基液稀釋瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體至終濃度為2mg/mL，得到檢測線包被液即T2線工作液，分別將兩種T線工作液2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
配制對照線包被液：用包被基液將羊抗鼠IgG多抗稀釋至終濃度為2mg/mL，得到對照線包被液即C線工作液，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
點(diǎn)膜：將劃線模塊壓下去，將噴金模塊抬上來，形成一定的落差，防止噴金頭觸碰板面。
按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，選擇[程序]轉(zhuǎn)換到劃線工作模式。進(jìn)入程序數(shù)據(jù)畫面后選擇好程序號，編輯好“長度”、“濃度”、“速度”、“原點(diǎn)X、Y、Z”等參數(shù)，其中“速度”不可太快，為80mm/s，修改好參數(shù)后，按[保存]保存數(shù)據(jù)，按[永久保存]將永久保存數(shù)據(jù)。
按[手動]進(jìn)入手動畫面，將1、3號泵（劃線模式）樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。待拿走高純水試管后，選擇[排液]直至管道內(nèi)無水分。此時(shí)將1號泵（劃線模式）樣品管道插入C線工作液中，將3號泵（劃線模式）樣品管道插入T1線工作液中，按[加液]直至管道內(nèi)充滿包被液。將準(zhǔn)備好的粘貼有硝酸纖維素膜的聚氯乙烯底板放在板面上的合適位置，按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，按[開始]進(jìn)行劃線。
劃線操作完畢，將1、3號泵樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。待拿走高純水試管后，選擇[排液]直至管道內(nèi)無水分。關(guān)閉1號泵。將3號泵（劃線模式）樣品管道插入T2線工作液中，按[加液]直至管道內(nèi)充滿包被液。將準(zhǔn)備好的粘貼有硝酸纖維素膜的聚氯乙烯底板放在板面上的合適位置，按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，按[開始]進(jìn)行劃線。劃線操作完畢，將3號泵樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。關(guān)閉點(diǎn)膜噴金儀。劃線完成后的硝酸纖維素膜即反應(yīng)膜，將粘有反應(yīng)膜的聚氯乙烯底板置于干燥箱中，60℃±3℃，相對濕度≤30%，烘干2h。干燥完成后將所述聚氯乙烯底板置于鋁箔袋中，加干燥劑室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>
6、組裝切割、裝配、包裝
將樣品墊、pf免疫金墊、pan免疫金墊、粘有反應(yīng)膜的聚氯乙烯底板和吸水紙組裝在一起，使用自動斬切機(jī)切割成4mm試紙條。每張?jiān)嚰垪l裝配至塑料卡中，使用壓殼機(jī)壓緊。加入一個(gè)干燥劑、一個(gè)一次性滴管后裝入鋁箔袋中保存，即為成品。
7、樣本裂解液配制
100mL裂解液配制：稱取0.24g Tris、0.1g酪蛋白和1.5g 氯化鈉溶于高純水，注入1.5mL TritonX-100，在100mL容量瓶中定容，用1M鹽酸調(diào)pH為9.0， 2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
所述瘧原蟲pf/pan檢測試紙?jiān)谙跛崂w維素膜的檢測區(qū)固定了惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體、瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體，在對照區(qū)固定了羊抗鼠IgG多抗，在玻璃纖維素膜上預(yù)包被惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體-膠體金、瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體-膠體金。測試時(shí)，滴加5uL全血，再滴加一滴（約50μL）緩沖液，水平放置。免疫金墊上的惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體-膠體金和瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體-膠體金會溶解，如樣本中含有惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）或瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH），惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體-膠體金與樣本中的惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）結(jié)合在一起，形成“抗原-抗體-金”復(fù)合物，瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體-膠體金與樣本中的瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）結(jié)合在一起，形成“抗原-抗體-金”復(fù)合物，復(fù)合物沿著試紙條向后方移動，首先到達(dá)包被了惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體的檢測區(qū)（T1），“抗原-抗體-金”復(fù)合物將同惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體結(jié)合，并在檢測線上滯留下來，形成一條紅色的線，這表示陽性結(jié)果。線條顏色的深淺同樣本中的抗原數(shù)量沒有比例關(guān)系。該區(qū)里如果沒有帶顏色的線條表示樣本中不含惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）或惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）低于本試紙最低檢出限，游離的“抗原-抗體-金”復(fù)合物繼續(xù)向試紙后方移動，到達(dá)包被了瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體的檢測區(qū)（T2），抗原-抗體-金”復(fù)合物將同瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）單克隆抗體結(jié)合，并在檢測線上滯留下來，形成一條紅色的線，這表示陽性結(jié)果。線條顏色的深淺同樣本中的抗原數(shù)量沒有比例關(guān)系。該區(qū)里如果沒有帶顏色的線條表示樣本中不含瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）或瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH）濃度低于本試紙最低檢出限。復(fù)合物繼續(xù)移動，到達(dá)包被了羊抗鼠IgG多抗的對照區(qū)，游離的“抗體-金”復(fù)合物將同羊抗鼠IgG結(jié)合在一起而富集在對照區(qū)（C），形成一條紅色的線。對照線的出現(xiàn)證明試紙條檢測功能正常。無論樣本中是否含有惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）或瘧原蟲乳酸脫氫酶（panLDH），在有效試驗(yàn)中，試紙條的對照區(qū)都應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)淡紅至紫紅色的對照線。樣本繼續(xù)移動，通過對照區(qū)進(jìn)入吸收區(qū)。吸收區(qū)的作用是吸附剩余的復(fù)合物，使其在試紙條內(nèi)移動，并消除本底的顏色。自試紙條加入稀釋后的樣本混合液起計(jì)時(shí)，15~20分鐘內(nèi)方可讀取結(jié)果。
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