本申請是國際申請日為2009年11月3日的國際申請pct/ep2009/064483進(jìn)入中國、申請?zhí)枮?00980153604.7的題為“抑制vegf-a受體相互作用的結(jié)合蛋白”的發(fā)明專利申請的分案申請。

本發(fā)明涉及對vegf-a特異的重組結(jié)合蛋白，以及編碼這類vegf-a結(jié)合蛋白的核酸，包括這類蛋白的藥物組合物，和這類蛋白在治療腫瘤和眼病中的用途。

背景技術(shù)：

血管生成(從先存在的血管生長出新的血管)，是數(shù)種病理狀況下的關(guān)鍵過程，包括腫瘤生長和眼病，尤其是眼的新生血管形成疾病，諸如老年性黃斑變性(amd)或糖尿病黃斑水腫(dme)(carmeliet,p.,nature438,932–936,2005)。血管內(nèi)皮生長因子(vegfs)刺激血管生成和淋巴管生成，通過激活內(nèi)皮細(xì)胞中的vegf受體(vegfr)酪氨酸激酶(ferrara,n.,gerber,h.p.andlecouter,j.,naturemed.9,669–676,2003)。

哺乳動物vegf家族由稱為vegf-a，vegf-b，vegf-c，vegf-d(亦稱為figf)和胎盤生長因子(plgf，亦稱為pgf)的5種糖蛋白組成。vegf-a已被證明是抗血管生成療法的有效靶標(biāo)(ellis,l.m.andhicklin,d.j.,naturerev.cancer8,579-591,2008)。vegf-a配體結(jié)合并活化3種結(jié)構(gòu)類似的iii型受體酪氨酸激酶，稱為vegfr-1(亦稱為flt1)，vegfr-2(亦稱為kdr)和vegfr-3(亦稱為flt4)。vegf配體對這些酪氨酸激酶受體中的每一種都具有獨(dú)特的結(jié)合特異性，這有助于它們功能的多樣性。響應(yīng)配體結(jié)合，vegfr酪氨酸激酶激活不同下游信號傳導(dǎo)途徑的網(wǎng)絡(luò)。vegfr-1和vegfr-2主要發(fā)現(xiàn)于血管內(nèi)皮，而vegfr-3大部分發(fā)現(xiàn)于淋巴內(nèi)皮。這些受體都具有胞外結(jié)構(gòu)域，單跨膜區(qū)和被激酶插入結(jié)構(gòu)域中斷的共有酪氨酸激酶序列。最近，神經(jīng)氈蛋白(nrp-1)(最初被鑒定為神經(jīng)元指引介質(zhì)的腦信號蛋白/腦衰蛋白家族的受體)，被證明作為vegf-a的同種型特異性受體。

各種同種型的vegf-a已知由vegf-a基因內(nèi)8個外顯子的選擇性剪接產(chǎn)生。所有同種型包含外顯子1-5和末端外顯子，外顯子8。外顯子6和7(編碼肝素-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)可以被包括或排除。這產(chǎn)生依據(jù)它們的氨基酸數(shù)目命名的蛋白家族：vegf-a165，vegf-a121，vegf-a189等。但是，外顯子8在核苷酸序列中包含兩個3'剪接位點(diǎn)，這可以被細(xì)胞使用產(chǎn)生具有相同長度的兩個家族的同種型，但c端氨基酸序列不同(varey,a.h.r.etal.,britishj.cancer98,1366-1379,2008)。利用外顯子8中最接近序列(導(dǎo)致包括外顯子8a)產(chǎn)生vegf-axxx(“xxx”表示成熟蛋白的氨基酸數(shù)目)(促血管生成家族的同種型)。最近描述的抗血管生成vegf-axxxb同種型是利用遠(yuǎn)端剪接位點(diǎn)(從鄰近的剪接位點(diǎn)沿著基因66bp更遠(yuǎn))產(chǎn)生。這導(dǎo)致剪接出外顯子8a，以及產(chǎn)生編碼vegf-axxxb家族的mrna序列。vegf-a165是主要的促血管生成同種型，通常在各種人實(shí)體瘤中過表達(dá)。vegf-a165b是鑒定出的第一個外顯子8b編碼的同種型，顯示具有抗血管生成作用(vareyetal.,在上述引文中；konopatskaya,o.etal.,molecularvision12,626-632,2006)。它是vegf-a的內(nèi)源抑制形式，其降低vegf-a誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。盡管它可以結(jié)合vegfr-2，vegf-a165b結(jié)合不引起受體磷酸化或下游信號傳導(dǎo)途徑的活化。

存在數(shù)種方法抑制vegf-a信號傳導(dǎo)，包括通過抗體中和配體或受體，以及利用酪氨酸激酶抑制劑阻斷vegf-a受體活化和信號傳導(dǎo)。vegf-a靶向療法已被證明是amd，dme，腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌中有效的單一治療劑，而對轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者來說只有當(dāng)其與化療聯(lián)用時才是有益的(narayanan,r.etal.,natrev.drugdiscov.5,815-816,2005；ellisandhicklin,在上述引文中)。

除了抗體，可以使用其他結(jié)合結(jié)構(gòu)域來中和配體或受體(skerra,a.,j.mol.recog.13,167-187,2000；binz,h.k.,amstutz,p.andplückthun,a.,nat.biotechnol.23,1257-1268,2005)。這類新型結(jié)合結(jié)構(gòu)域基于設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(wo02/20565；binz,h.k.,amstutz,p.,kohl,a.,stumpp,m.t.,briand,c.,forrer,p.,grütter,m.g.,andplückthun,a.,nat.biotechnol.22,575-582,2004)。wo02/20565描述了如何構(gòu)建重復(fù)蛋白的大文庫以及它們的一般應(yīng)用。盡管如此，wo02/20565既沒有公開具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的選擇，也沒有公開特異性結(jié)合vegf-axxx的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的具體重復(fù)序列基序。

用現(xiàn)有療法靶向vegf-a不是在所有患者中都是有效的，或針對所有疾病有效的(例如，表達(dá)egfr的癌癥)。以下事實(shí)甚至變得日益清楚，與vegf-a靶向療法有關(guān)的治療益處是復(fù)雜的，可能涉及多種機(jī)制(ellisandhicklin,在上述引文中)。例如，市售的抗vegf藥物，諸如bevacizumab(avastin?)或ranibizumab(lucentis?)(參見wo96/030046,wo98/045331和wo98/045332)或正在臨床開發(fā)的藥物，諸如vegf-trap?(wo00/075319)，不區(qū)分vegf-a的促血管生成形式和抗血管生成形式，因此這兩種形式都被它們抑制。因此它們抑制血管生成，并且剝奪健康組織的一種重要存活因子，即vegf-axxxb，產(chǎn)生細(xì)胞毒性和劑量限制性副作用，這進(jìn)而限制功效。現(xiàn)有抗vegf-a療法的常見副作用是胃腸穿孔，出血，高血壓，血栓栓子事件和蛋白尿(kamba,t.andmcdonald,d.m.,br.j.cancer96,1788-95,2007)。因此，現(xiàn)在需要改進(jìn)的抗血管生成劑來治療癌癥和其他病理狀況。

本發(fā)明的技術(shù)問題是鑒定新的抗血管生成劑，諸如具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，用于癌癥和其他病理狀況(例如眼病諸如amd或dme)的改進(jìn)治療。通過提供權(quán)利要求所表征的實(shí)施方案來解決該技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制vegf-axxx結(jié)合vegfr-2，并且所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域在熱解折疊時具有高于40℃的中點(diǎn)變性溫度(tm)，當(dāng)在pbs中37℃溫育1天時在高達(dá)10g/l的濃度形成少于5%(w/w)的不溶性聚集體。更具體地，本發(fā)明涉及包括至少一個重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白，其中所述重復(fù)結(jié)構(gòu)域以低于10^-7m的kd結(jié)合vegf-axxx，并抑制vegf-axxx結(jié)合vegfr-2。尤其是這類結(jié)合蛋白以低于10nm的ic50值抑制huvec球體(spheroids)的生芽(sprouting)，并且這類結(jié)合蛋白與vegf-axxxb的相互作用的解離常數(shù)kd是其與vegf-axxx相互作用的kd至少10倍高。

尤其是，本發(fā)明涉及一種重組結(jié)合蛋白，包括具有對vegf-a的特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其是重復(fù)結(jié)構(gòu)域，例如錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域，尤其是包括重復(fù)組件的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域，所述重復(fù)組件具有錨蛋白重復(fù)序列基序

1d23g4tplhlaa56ghleivevllk7gadvna(seqidno:1)

其中1,2,3,4,5,6,和7，彼此獨(dú)立，代表選自a,d,e,f,h,i,k,l,m,n,q,r,s,t,v,w和y的氨基酸殘基。

本發(fā)明還涉及一種重組結(jié)合蛋白，包括具有對vegf-a的結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，其與本發(fā)明的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域具有至少70%的氨基酸序列同一性，或其包括與本發(fā)明的錨蛋白重復(fù)組件具有至少70%氨基酸序列同一性的重復(fù)組件，或其中錨蛋白重復(fù)組件的一個或更多個氨基酸殘基被在比對錨蛋白重復(fù)單位時對應(yīng)位置上發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基替換。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括本發(fā)明重組結(jié)合蛋白的結(jié)合蛋白，其連接有一個或更多個其他的部分，例如，還結(jié)合vegfr-2或不同靶的部分，標(biāo)記部分，促進(jìn)蛋白純化的部分，或提供改善的藥代動力學(xué)的部分，例如聚乙二醇部分。在一些實(shí)施方案中，其他的部分是蛋白部分。在某些其他實(shí)施方案中，其他的部分是非蛋白的多聚體部分。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明重組結(jié)合蛋白的核酸分子，以及包括一種或更多種上述結(jié)合蛋白或核酸分子的藥物組合物。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用本發(fā)明的結(jié)合蛋白治療癌癥和其他病理狀況(例如眼病諸如amd或dme)的方法。

附圖說明

圖1.挑選的設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白的特異性狗vegf-a164結(jié)合。

用粗提物elisa顯示挑選的克隆與狗vegf-a164(vegf)和陰性對照蛋白(mbp，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白)的相互作用。將生物素化的狗vegf-a164和mbp固定在neutravidin上。編號表示在抗狗vegf-a164或?qū)?yīng)的人vegf-a165的核糖體展示中挑選的單個darpin克隆。a=吸光度。白色柱圖指示結(jié)合狗vegf-a164，黑色柱圖顯示結(jié)合mbp的非特異性背景。

圖2.挑選的darpin的球體生長抑制。

在存在各種濃度的(a)darpin#30(seqidno:29)，對vegf-axxx具有特異性的darpin，或(b)darpinnc，對vegf-axxx沒有特異性的陰性對照darpin的條件下，顯示球體生長抑制測定中芽的長度。

圖3.vegf-a同種型的特異性識別。

結(jié)合蛋白對vegf-a同種型的表面等離子體共振(spr)分析。

(a)和(b):avastin?的spr分析。將250nmavastin?添加到固定有狗vegf-a164(a)或狗vegf-a164b(b)的流動池100秒，然后通過緩沖液流動進(jìn)行清洗。

(c)和(d):darpin#27(seqidno:16)的spr分析。將250nmdarpin#_27添加到固定有狗vegf-a164(c)或狗vegf-a164b(d)的流動池100秒，然后通過緩沖液流動進(jìn)行清洗。ru=共振單位。

圖4.兔眼中人vegf-a165的有效抑制。

血管滲漏兔模型顯示與lucentis?相比，darpin在眼中抑制人vegf-a165的功效。在第1天，通過玻璃體內(nèi)注射將pbs，darpin#30或lucentis?施用到每只兔的一只眼(治療的眼)。在第4天或第30天，通過玻璃體內(nèi)注射500ng人vegf-a165攻擊每只兔的兩只眼。所有眼在vegf-a165注射后48小時進(jìn)行評估，通過測量靜脈注射鈉熒光素后1小時所有眼的玻璃體和視網(wǎng)膜中熒光素的含量。

r=治療眼的熒光素測量值/未治療眼的熒光素測量值的比例。標(biāo)準(zhǔn)偏差用誤差線表示。4-pbs=pbs注射后4天的比例(對照)；4-d=darpin#30注射后4天的比例；30-d=darpin#30注射后30天的比例；4-l=lucentis?注射后4天的比例；30-l=lucentis?注射后30天的比例。

具體實(shí)施方式

哺乳動物vegf-a以兩個家族的選擇性剪接同種型存在：(i)促血管生成的“vegf-axxx”同種型，通過外顯子8的鄰近剪接產(chǎn)生和(ii)抗血管生成的“vegf-axxxb”同種型，通過外顯子8的遠(yuǎn)端剪接產(chǎn)生。優(yōu)選的，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?，兔，猴或人來源的促血管生成vegf-axxx是特異性的。更優(yōu)選的，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)θ藖碓吹拇傺苌蓈egf-axxx是特異性的。最優(yōu)選的，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)θ藇egf-a165是特異性的。

術(shù)語“蛋白”是指多肽，其中所述多肽的至少一部分具有或能夠獲得指定的三維結(jié)構(gòu)，通過在其多肽鏈內(nèi)和/或之間形成二級、三級或四級結(jié)構(gòu)。如果蛋白包括兩個或更多個多肽，單條多肽鏈可以通過例如兩個多肽之間的二硫鍵非共價或共價相連。蛋白的一部分(其通過形成二級或三級結(jié)構(gòu)單獨(dú)具有或能夠獲得指定的三維結(jié)構(gòu))被稱為“蛋白結(jié)構(gòu)域”。這類蛋白結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

當(dāng)用于重組蛋白，重組蛋白結(jié)構(gòu)域等等時術(shù)語“重組”表示所述多肽是利用相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組dna技術(shù)產(chǎn)生的。例如，可以將編碼多肽的重組dna分子(例如通過基因合成產(chǎn)生)克隆入細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒(例如pqe30，qiagen)。當(dāng)這類構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒被插入細(xì)菌(例如大腸桿菌)時，該細(xì)菌可以產(chǎn)生所述重組dna編碼的多肽。對應(yīng)產(chǎn)生的多肽被稱為重組多肽。

術(shù)語“多肽標(biāo)簽”是指與多肽/蛋白連接的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列用于所述多肽/蛋白的純化，檢測或靶向，或所述氨基酸序列改進(jìn)多肽/蛋白的物化性質(zhì)，或所述氨基酸序列具有效應(yīng)物功能。結(jié)合蛋白的單個多肽標(biāo)簽，部分和/或結(jié)構(gòu)域可以直接或通過多肽接頭彼此連接。這些多肽標(biāo)簽都是本領(lǐng)域公知的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以得到的。多肽標(biāo)簽的實(shí)例是小的多肽序列，例如，his，myc，flag，或strep-標(biāo)簽或部分諸如酶(例如酶，像堿性磷酸酶)，其允許檢測所述多肽/蛋白，或可用于靶向(諸如免疫球蛋白或其片段)和/或用做效應(yīng)分子的部分。

術(shù)語“多肽接頭”是指一種氨基酸序列，其能夠連接，例如，兩個蛋白結(jié)構(gòu)域，多肽標(biāo)簽和蛋白結(jié)構(gòu)域，蛋白結(jié)構(gòu)域和非多肽部分諸如聚乙二醇或兩個序列標(biāo)簽。這類其他的結(jié)構(gòu)域，標(biāo)簽，非多肽部分和接頭是相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。一系列實(shí)例提供于專利申請wo02/20565的說明書。這類接頭的具體實(shí)例是可變長度的甘氨酸-絲氨酸-接頭；優(yōu)選的，所述接頭具有2-16個氨基酸的長度。

在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“多肽”涉及由多個(即兩個或更多個)氨基酸通過肽鍵連接的一條或更多條鏈組成的分子。優(yōu)選的，多肽由通過肽鍵連接的超過8個氨基酸組成。

術(shù)語“結(jié)合蛋白”是指包括一個或更多個結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白，下面將進(jìn)一步解釋。優(yōu)選的，所述結(jié)合蛋白包括最多4個結(jié)合結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選的，所述結(jié)合蛋白包括最多兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域。最優(yōu)選的，所述結(jié)合蛋白只包括一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此外，任何這類結(jié)合蛋白可能包括其他的不是結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)構(gòu)域，多聚化部分，多肽標(biāo)簽，多肽接頭和/或非蛋白聚合物分子。多聚化部分的實(shí)例是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，其配對提供功能性免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域，以及亮氨酸拉鏈或包括游離巰基的多肽，其在這樣的兩個多肽之間形成分子間二硫鍵。非蛋白聚合物分子的實(shí)例是羥乙基淀粉(hes)，聚乙二醇(peg)，聚丙二醇，或聚氧化烯。

術(shù)語“peg化”表示peg部分共價連接于，例如，本發(fā)明的多肽。

術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”表示一種蛋白結(jié)構(gòu)域，其顯示與蛋白支架相同的“折疊”(三維結(jié)構(gòu))并具有預(yù)定的特性，如下文所述。這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過合理的或最常見的組合蛋白工程技術(shù)(這是本領(lǐng)域已知的技能)獲得(skerra,2000,在上述引文中；binzetal.,2005,在上述引文中)。例如，具有預(yù)定特性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過包括下列步驟的方法獲得：(a)提供顯示與下文指定的蛋白支架相同折疊的蛋白結(jié)構(gòu)域的多樣集合；和(b)篩選所述多樣集合和/或從所述多樣集合進(jìn)行挑選以獲得具有所述預(yù)定特性的至少一種蛋白結(jié)構(gòu)域。根據(jù)使用的篩選和/或挑選系統(tǒng)，蛋白結(jié)構(gòu)域的多樣集合可以通過數(shù)種方法提供，可以包括使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，諸如噬菌體展示或核糖體展示。

術(shù)語“蛋白支架”表示具有暴露表面區(qū)域的蛋白，在該區(qū)域中氨基酸插入、取代或缺失是高度耐受的?？捎糜诋a(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白支架的實(shí)例是抗體或其片段，諸如單鏈fv或fab片段，來自金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的蛋白a，來自大菜粉蝶(pierisbrassicae)的膽汁三烯結(jié)合蛋白或其他脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，錨蛋白重復(fù)蛋白或其他重復(fù)蛋白，和人纖連蛋白。蛋白支架是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(binzetal.,2005,在上述引文中；binzetal.,2004,在上述引文中)。

術(shù)語“預(yù)定特性”是指一種特性，諸如結(jié)合靶，阻斷靶，活化靶介導(dǎo)的反應(yīng)，酶活性，以及相關(guān)其他特性。根據(jù)所需特性的類型，普通技術(shù)人員將能夠確定篩選和/或挑選具有所需特性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的格式和必需步驟。優(yōu)選的，所述預(yù)定特性是結(jié)合靶。

優(yōu)選的，本發(fā)明的結(jié)合蛋白不是抗體或其片段，諸如fab或scfv片段。抗體及其片段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

還優(yōu)選的，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域不包括存在于抗體中的免疫球蛋白折疊和/或iii型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白折疊是常見的全部-β蛋白折疊，其由排列為兩個β片層的約7個反平行β鏈的雙層夾層組成。免疫球蛋白折疊是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，包括免疫球蛋白折疊的這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域描述于wo07/080392或wo08/097497。

進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域不包括免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(如在vegfr-1或vegfr-2中發(fā)現(xiàn))。這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域描述于wo00/075319。

優(yōu)選的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有抗血管生成作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗血管生成作用可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的測定法來確定，諸如實(shí)例2描述的huvec球體的生芽測定法。

進(jìn)一步優(yōu)選的是包括70-300個氨基酸的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，尤其是100-200個氨基酸。

進(jìn)一步優(yōu)選的是不含游離cys殘基的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。游離的cys殘基不參與二硫鍵的形成。甚至更優(yōu)選的是不含任何cys殘基的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是重復(fù)結(jié)構(gòu)域或設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選的如wo02/20565所述。

尤其優(yōu)選的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域(binz,h.k.etal.,2004,在上述引文中)，優(yōu)選的如wo02/20565所述。設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例顯示于實(shí)施例中。

下文關(guān)于重復(fù)蛋白的定義是基于專利申請wo02/20565。專利申請wo02/20565還包含重復(fù)蛋白特征、技術(shù)和應(yīng)用的一般說明。

術(shù)語“重復(fù)蛋白”是指包括一個或更多個重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白。優(yōu)選的，所述重復(fù)蛋白中的每一個包括最多4個重復(fù)結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選的，所述重復(fù)蛋白中的每一個包括最多兩個重復(fù)結(jié)構(gòu)域。最優(yōu)選的，每一重復(fù)蛋白只包括一個重復(fù)結(jié)構(gòu)域。此外，所述重復(fù)蛋白可以包括其他的非重復(fù)蛋白結(jié)構(gòu)域，多肽標(biāo)簽和/或多肽接頭。

術(shù)語“重復(fù)結(jié)構(gòu)域”是指包括作為結(jié)構(gòu)單位的兩個或更多個連續(xù)重復(fù)單位(組件)的蛋白結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)構(gòu)單位具有相同折疊并緊密堆積產(chǎn)生。例如，具有節(jié)點(diǎn)疏水核(jointhydrophobiccore)的超螺旋結(jié)構(gòu)。

術(shù)語“設(shè)計的重復(fù)蛋白”和“設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域”分別是指重復(fù)蛋白或重復(fù)結(jié)構(gòu)域，通過專利申請wo02/20565說明的創(chuàng)造性方法獲得。設(shè)計的重復(fù)蛋白和設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域是合成的，而非來自自然界。它們分別是人工的蛋白或結(jié)構(gòu)域，通過表達(dá)相應(yīng)設(shè)計的核酸獲得。優(yōu)選的，表達(dá)在真核或原核細(xì)胞(諸如細(xì)菌細(xì)胞)中完成，或使用不含細(xì)胞的體外表達(dá)系統(tǒng)。

術(shù)語“結(jié)構(gòu)單位”是指多肽局部有序的部分，由沿著多肽鏈彼此鄰近的二級結(jié)構(gòu)的兩個或更多個區(qū)段的三維相互作用形成。這類結(jié)構(gòu)單位顯示結(jié)構(gòu)基序。術(shù)語“結(jié)構(gòu)基序”是指至少一個結(jié)構(gòu)單位中存在的二級結(jié)構(gòu)元件的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)基序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。單獨(dú)的結(jié)構(gòu)單位不能獲得確定的立體結(jié)構(gòu)；但是，它們的連續(xù)排列，例如作為重復(fù)結(jié)構(gòu)域中的重復(fù)組件，導(dǎo)致相鄰單位的相互穩(wěn)定，以產(chǎn)生超螺旋結(jié)構(gòu)。

術(shù)語“重復(fù)單位”是指包括一個或更多個天然存在的重復(fù)蛋白的重復(fù)序列基序的氨基酸序列，其中所述“重復(fù)單位”被發(fā)現(xiàn)是多個拷貝，其顯示對確定蛋白折疊的全部所述基序共有的限定折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。這類重復(fù)單位包括骨架殘基和相互作用殘基。這類重復(fù)單位的實(shí)例是犰狳(armadillo)重復(fù)單位，富含亮氨酸的重復(fù)單位，錨蛋白重復(fù)單位，三角形四肽(tetratricopeptide)重復(fù)單位，heat重復(fù)單位，和富含亮氨酸的變體重復(fù)單位。包含兩個或更多個這類重復(fù)單位的天然存在的蛋白被稱作“天然存在的重復(fù)蛋白”。當(dāng)彼此比較時，重復(fù)蛋白的單個重復(fù)單位的氨基酸序列可以具有很多突變，取代，添加和/或缺失，但仍然基本上保留重復(fù)單位的一般模式或基序。

術(shù)語“骨架殘基”涉及重復(fù)單位的氨基酸殘基，或重復(fù)組件的相應(yīng)氨基酸殘基，其有助于折疊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，即其有助于所述重復(fù)單位(或組件)的折疊或有助于相鄰單位(或組件)的相互作用。這類貢獻(xiàn)可以是與重復(fù)單位(組件)中其他殘基的相互作用，或?qū)Ζ?螺旋或β-片層中發(fā)現(xiàn)的多肽主鏈構(gòu)象的影響，或形成線性多肽或環(huán)的氨基酸延伸。

術(shù)語“靶相互作用殘基”是指重復(fù)單位的氨基酸殘基，或重復(fù)組件的相應(yīng)氨基酸殘基，其有助于與靶物質(zhì)的相互作用。這類貢獻(xiàn)可以是與靶物質(zhì)的直接相互作用，或?qū)ζ渌苯酉嗷プ饔脷埢挠绊?，例如通過穩(wěn)定重復(fù)單位(組件)的多肽構(gòu)象以允許或增強(qiáng)直接相互作用殘基與所述靶的相互作用。這類骨架和靶相互作用殘基可以通過以下方法鑒定：對通過物化方法(諸如x射線結(jié)晶，nmr和/或cd光譜法)獲得的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，或與結(jié)構(gòu)生物學(xué)和/或生物信息學(xué)技術(shù)人員公知的已知的和相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行比較。

優(yōu)選的，用于推斷重復(fù)序列基序的重復(fù)單位是同源重復(fù)單位，其中重復(fù)單位包括相同的結(jié)構(gòu)基序，并且超過70%的所述重復(fù)單位的骨架殘基是彼此同源的。優(yōu)選的，超過80%的所述重復(fù)單位的骨架殘基是同源的。最優(yōu)選的，超過90%的所述重復(fù)單位的骨架殘基是同源的。用于確定多肽之間同源性百分比的計算機(jī)程序(諸如fasta，blast或gap)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。進(jìn)一步優(yōu)選的，用于推斷重復(fù)序列基序的重復(fù)單位是同源重復(fù)單位(獲自從靶上挑選的重復(fù)結(jié)構(gòu)域)，例如描述于實(shí)施例1，并具有相同的靶特異性。

術(shù)語“重復(fù)序列基序”是指氨基酸序列，其從一個或更多個重復(fù)單位推斷得出。優(yōu)選的，所述重復(fù)單位來自于對相同靶具有結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。這類重復(fù)序列基序包括骨架殘基位置和靶相互作用殘基位置。所述骨架殘基位置對應(yīng)于重復(fù)單位的骨架殘基的位置。同樣，所述靶相互作用殘基位置對應(yīng)于重復(fù)單位的靶相互作用殘基的位置。重復(fù)序列基序包括固定位置和隨機(jī)位置。術(shù)語“固定位置”是指重復(fù)序列基序中的氨基酸位置，其中所述位置被設(shè)置為特定氨基酸。最常見的，這類固定位置對應(yīng)于骨架殘基的位置和/或靶相互作用殘基(對某靶特異的)的位置。術(shù)語“隨機(jī)位置”表示重復(fù)序列基序中的氨基酸位置，其中在所述氨基酸位置允許兩個或更多個氨基酸，例如，允許常見的二十種天然存在的氨基酸的任意一種，或允許二十種天然存在氨基酸的大部分，諸如除了半胱氨酸以外的氨基酸，或除了甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸以外的氨基酸。最常見的，這類隨機(jī)位置對應(yīng)靶相互作用殘基的位置。但是，骨架殘基的一些位置也可以是隨機(jī)的。

術(shù)語“折疊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)”是指所述重復(fù)單位的三級結(jié)構(gòu)。通過形成至少部分α-螺旋或β-片層的氨基酸延伸，或形成線性多肽或環(huán)的氨基酸延伸，或α-螺旋、β-片層和/或線性的多肽/環(huán)的任意組合，確定折疊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

術(shù)語“連續(xù)的”是指一種排列，其中重復(fù)單位或重復(fù)組件串聯(lián)排列。在設(shè)計的重復(fù)蛋白中，存在至少2個，通常約2到6個，尤其是至少約6個，通常是20或更多個重復(fù)單位。在大多數(shù)情況下，重復(fù)單位將顯示高度的序列同一性(對應(yīng)位置相同的氨基酸殘基)或序列相似性(氨基酸殘基是不同的，但具有類似的物化特性)，一些氨基酸殘基可能是在天然存在的蛋白中發(fā)現(xiàn)的不同重復(fù)單位中高度保守的關(guān)鍵殘基。但是，只要維持常見的折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在天然存在的蛋白中發(fā)現(xiàn)的不同重復(fù)單位之間的氨基酸插入和/或缺失和/或取代造成的高度序列變異性也是可能的。

通過物理化學(xué)法諸如x射線結(jié)晶、nmr或cd光譜法直接檢測重復(fù)蛋白的折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。用于鑒定和確定重復(fù)單位或重復(fù)序列基序或鑒定包括這類重復(fù)單位或基序的相關(guān)蛋白的家族的方法，諸如同源性查找(blast等)，在生物信息學(xué)領(lǐng)域是完善的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。改進(jìn)初始重復(fù)序列基序的步驟可以包括迭代過程。

術(shù)語“重復(fù)組件”是指設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)氨基酸序列，其最初源自天然存在的重復(fù)蛋白的重復(fù)單位。重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括的每個重復(fù)組件來源于天然存在的重復(fù)蛋白的家族或亞家族的一個或更多個重復(fù)單位，例如，armadillo重復(fù)蛋白或錨蛋白重復(fù)蛋白的家族。

“重復(fù)組件”可以包括具有在相應(yīng)重復(fù)組件的所有拷貝存在氨基酸殘基的位置("固定位置")和具有不同或"隨機(jī)"氨基酸殘基的位置("隨機(jī)位置")。

術(shù)語“加帽組件”是指融合到重復(fù)結(jié)構(gòu)域的n或c端重復(fù)組件的多肽，其中所述加帽組件與所述重復(fù)組件形成緊密的三級相互作用從而提供保護(hù)所述重復(fù)組件的疏水核在側(cè)面不與來自溶劑的連續(xù)重復(fù)組件接觸的帽。所述n和/或c端加帽組件可以是，或可以來自，鄰近于重復(fù)單位的天然存在的重復(fù)蛋白中發(fā)現(xiàn)的加帽單位或其他結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“加帽單位”是指天然存在的折疊多肽，其中所述多肽限定與重復(fù)單位n或c端融合的特定結(jié)構(gòu)單位，其中所述多肽與所述重復(fù)單位形成緊密的三級相互作用從而提供保護(hù)所述重復(fù)單位的疏水核在一側(cè)免于溶劑的帽。這類加帽單位可以具有類似所述重復(fù)序列基序的序列。加帽組件和加帽重復(fù)描述于wo02/020565。例如，seqidno:21的n端加帽組件由位置1到32的氨基酸編碼。此外優(yōu)選的是在位置5具有甘氨酸或天冬氨酸殘基的這類n端加帽組件。

術(shù)語“靶”是指單個分子諸如核酸分子，多肽或蛋白，碳水化合物，或任何其他天然存在的分子，包括這類單個分子的任意部分，或兩個或更多個這類分子的復(fù)合物。靶可以是全細(xì)胞或組織樣品，或它可以是任何非天然的分子或部分。優(yōu)選的，靶是天然存在或非天然的多肽或包含化學(xué)修飾的多肽，例如通過天然或非天然的磷酸化，乙酰化或甲基化進(jìn)行的修飾。在本發(fā)明的特定應(yīng)用中，靶是vegf-axxx或vegfr-2。

術(shù)語“共有序列”是指一種氨基酸序列，其中所述共有序列是通過多個重復(fù)單位的結(jié)構(gòu)和/或序列比對獲得的。利用兩個或更多個結(jié)構(gòu)和/或序列比對的重復(fù)單位，并允許比對中的缺口，有可能確定每個位置最常見的氨基酸殘基。共有序列是包括每個位置最常出現(xiàn)的氨基酸的序列。如果在單個位置有兩個或更多個氨基酸出現(xiàn)高于平均值，則共有序列可以包括這些氨基酸的亞組。所述兩個或更多個重復(fù)單位可以獲自單個重復(fù)蛋白中包括的重復(fù)單位，或獲自兩個或更多個不同的重復(fù)蛋白。

共有序列以及確定它們的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

“保守氨基酸殘基”是在共有序列的某些位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸。如果在所述兩個或更多個重復(fù)單位中發(fā)現(xiàn)具有類似概率的兩個或更多個(例如3，4或5個)氨基酸殘基，共有氨基酸可以是最常發(fā)現(xiàn)的氨基酸之一或所述兩個或更多個氨基酸殘基的組合。

進(jìn)一步優(yōu)選的是非天然存在的結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

術(shù)語“非天然存在”表示合成的或不是來自自然界的，更具體地，該術(shù)語表示由人工制備。術(shù)語“非天然存在的結(jié)合蛋白”或“非天然存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域”表示所述結(jié)合蛋白或所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是合成的（即通過化學(xué)合成從氨基酸產(chǎn)生）或重組的并且不是來自自然界?！胺翘烊淮嬖诘慕Y(jié)合蛋白”或“非天然存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域”分別是通過表達(dá)相應(yīng)設(shè)計的核酸獲得的人造蛋白或結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的，表達(dá)在真核或細(xì)菌細(xì)胞中完成，或使用不含細(xì)胞的體外表達(dá)系統(tǒng)。進(jìn)一步的，該術(shù)語表示所述結(jié)合蛋白或所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列在序列數(shù)據(jù)庫中不作為非人工序列條目存在，例如在genbank，embl-bank或swiss-prot中。這些數(shù)據(jù)庫和其他類似的序列數(shù)據(jù)庫是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

本發(fā)明涉及包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制vegf-axxx結(jié)合vegfr-2，并且所述結(jié)合蛋白和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域在熱解折疊時具有高于40℃的中點(diǎn)變性溫度(tm)，當(dāng)在磷酸緩沖鹽溶液(pbs)中37℃溫育1天時，在高達(dá)10g/l的濃度形成低于5%(w/w)的不溶性聚集體。

結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以抑制vegf-axxx結(jié)合vegfr-2，通過以以下方式結(jié)合vegf-axxx或結(jié)合vegfr-2：vegf-axxx和vegfr-2之間的表觀解離常數(shù)(kd)增加超過10²倍，優(yōu)選的超過10³倍，更優(yōu)選的超過10⁴倍，更優(yōu)選的超過10⁵倍，和最優(yōu)選的超過10⁶倍。優(yōu)選的，結(jié)合結(jié)構(gòu)域與vegf-axxx或vegfr-2的相互作用的kd是小于10^-7m，優(yōu)選的小于10^-8m，更優(yōu)選的小于10^-9m，更優(yōu)選的小于10^-10m，和最優(yōu)選的小于10^-11m。用于確定蛋白-蛋白相互作用的解離常數(shù)的方法，諸如基于表面等離子體共振(spr)的技術(shù)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

優(yōu)選的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合vegf-axxx。甚至更優(yōu)選的是結(jié)合人vegf-a165的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

術(shù)語“pbs”表示包含137mmnacl，10mm磷酸鹽和2.7mmkcl并且具有ph7.4的磷酸鹽緩沖水溶液。

優(yōu)選的，結(jié)合蛋白和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域在熱解折疊時具有高于45℃的中點(diǎn)變性溫度(tm)，更優(yōu)選的高于50℃，更優(yōu)選的高于55℃，和最優(yōu)選的高于60℃。本發(fā)明的結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域在生理條件下具有確定的二級和三級結(jié)構(gòu)。這類多肽的熱解折疊導(dǎo)致其三級和二級結(jié)構(gòu)的喪失，這可以例如通過圓二色性(cd)測量進(jìn)行追蹤。在熱解折疊時結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的中點(diǎn)變性溫度對應(yīng)于所述蛋白或結(jié)構(gòu)域在熱變性時(通過從10℃緩慢升溫到約100℃)的生理緩沖液中協(xié)同轉(zhuǎn)換的中點(diǎn)的溫度。熱解折疊時中點(diǎn)變性溫度的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。熱解折疊時結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述中點(diǎn)變性溫度提示所述多肽的熱穩(wěn)定性。

還優(yōu)選的是當(dāng)在37℃的pbs中溫育超過5天，優(yōu)選的超過10天，更優(yōu)選的超過20天，更優(yōu)選的超過40天，和最優(yōu)選的超過100天時，在高達(dá)20g/l，優(yōu)選的高達(dá)40g/l，更優(yōu)選的高達(dá)60g/l，甚至更優(yōu)選的高達(dá)80g/l，和最優(yōu)選的高達(dá)100g/l的濃度，結(jié)合蛋白和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成低于5%(w/w)的不溶性聚集體。不溶性聚集體的形成可以通過可見沉淀、凝膠過濾或動態(tài)光散射(其在不溶性聚集體形成時明顯增加)的出現(xiàn)來檢測。通過在10’000xg離心10分鐘可以從蛋白樣品中去除不溶性聚集體。優(yōu)選的，在37℃的pbs中，在所述溫育條件下結(jié)合蛋白和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成低于2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%,或0.05%(w/w)的不溶性聚集體。不溶性聚集體的百分比可以通過以下方式確定：分離不溶性聚集體和可溶性蛋白，然后通過標(biāo)準(zhǔn)定量法確定可溶性和不溶性組分中的蛋白量。

還優(yōu)選的是37℃包含100mm二硫蘇糖醇(dtt)的pbs中溫育1或10小時，結(jié)合蛋白和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域不喪失其天然三維結(jié)構(gòu)。

在一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種結(jié)合蛋白，其包括抑制vegf-axxx結(jié)合vegfr-2的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且具有指定的或優(yōu)選的中點(diǎn)變性溫度以及如上所述的非聚集特性，其中所述結(jié)合蛋白以低于100nm的ic50值抑制huvec球體的生芽。

術(shù)語“huvec”表示人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，其可以分離自正常人臍靜脈，并對vegf-a刺激有反應(yīng)。測量huvec球體生芽的測定法(諸如實(shí)施例2的描述)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

ic50值是實(shí)驗確定的參數(shù)(諸如huvec球體的生芽)的體外50%抑制所需的物質(zhì)(諸如結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的濃度。ic50值可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便的確定(korfft.andaugustinh.g.,j.cellbiol.143(5),1341-52,1998)。

優(yōu)選的是結(jié)合蛋白和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域以低于10nm，優(yōu)選的低于1nm，更優(yōu)選的低于0.1nm，和最優(yōu)選的低于0.05nm的ic50值抑制huvec球體的生芽。

進(jìn)一步優(yōu)選的是單體結(jié)合蛋白和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制huvec球體生芽的ic50值低于ranibizumab(lucentis?，genentech的注冊商標(biāo))，bevacizumab(avastin?，genentech的注冊商標(biāo))，aflibercept(vegftrap?，regeneron的注冊商標(biāo))，或pegaptanib(macugen?，pfizer的注冊商標(biāo))的對應(yīng)ic50值。

具體來說，本發(fā)明涉及一種結(jié)合蛋白，其包括抑制vegf-axxx結(jié)合vegfr-2的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并具有指定的或優(yōu)選的中點(diǎn)變性溫度和如上所述的非聚集特性，其中與所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)vegf-axxx的相互作用的kd相比，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和vegf-axxxb的相互作用的kd是至少10倍高。

優(yōu)選的，與所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)vegf-axxx的相互作用的kd相比，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域和vegf-axxxb的相互作用的kd是至少10²倍高，優(yōu)選的10³倍高，更優(yōu)選的10⁴倍高，更優(yōu)選的10⁵倍高，和最優(yōu)選的10⁶倍高。

還優(yōu)選的，結(jié)合結(jié)構(gòu)域與vegf-axxxb的相互作用的kd高于10³nm，結(jié)合結(jié)構(gòu)域與vegf-axxx的相互作用的kd低于10或1nm.。

優(yōu)選的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與vegf-b,vegf-c,vegf-d,plgf或pdgf的相互作用的kd高于1nm，優(yōu)選的高于10nm，更優(yōu)選的高于10²nm，甚至更優(yōu)選的高于10³nm，和最優(yōu)選的高于10⁴nm。

優(yōu)選的，vegf-axxx是狗vegf-a164或猴vegf-a165或人vegf-a165，并且vegf-axxxb是狗vegf-a164b或猴vegf-a165b或人vegf-a165b。

另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是重組結(jié)合蛋白包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制vegf-axxx結(jié)合vegfr-2，并且所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是重復(fù)結(jié)構(gòu)域或設(shè)計的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。這類重復(fù)結(jié)構(gòu)域可以包括一個，兩個，三個或更多個內(nèi)部重復(fù)組件，它們將參與結(jié)合vegf-axxx。優(yōu)選的，這類重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括n端加帽組件，兩到四個內(nèi)部重復(fù)組件，和c端加帽組件。優(yōu)選的，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域。

優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中1,2,3,4,5,6,和7各自獨(dú)立的代表選自a,d,e,f,h,i,k,l,m,n,q,r,s,t,v,w和y的氨基酸殘基。

尤其優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自f,t,n,r,v,a,i,k,q,s和y的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自f,t,n,r和v；更優(yōu)選的選自f和t；

2代表選自w,y,h和f的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自w,y和h；

3代表選自m,i,f和v的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自m和i；

4代表選自h,a,k,g,l,m,n,t,v,w和y的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自h,a和k；

5代表選自e,y,f,v,h,i,l,n和r的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自e,y,f,v和h；更優(yōu)選的選自e,y,f和v；和

6代表選自a,n,y,h和r的氨基酸殘基。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自t,e,a,d,f,k,n,q,r,s,w和y的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自t和e；

2代表選自v,f,y,a,h,i,k,r,t和w的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自v,f和y；

3代表選自s,a,n,f和m的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自s,a和n；更優(yōu)選的選自s和a；

4代表選自y,f,s和w的氨基酸殘基；

5代表選自a,s,l和y的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自a和s；

6代表選自d,n,m,a,i,k和y的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自d,n和m；更優(yōu)選的選自d和n；

7代表選自a,y,h,n和d的氨基酸殘基；和

8代表氨基酸殘基t或a。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自k,t和y的氨基酸殘基；

2代表氨基酸殘基n或m；

3代表氨基酸殘基t或f；

4代表氨基酸殘基s或a；

5代表氨基酸殘基h或r；

6代表選自a,y,h和n的氨基酸殘基；和

7代表氨基酸殘基a或t。

甚至更優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有seqidno:3的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件，其中所述重復(fù)組件之前是具有seqidno:2的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件和/或之后是具有seqidno:4的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自a,n,r,v,y,e,h,i,k,l,q,s和t的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自a,n,r,v和y；更優(yōu)選的選自a和r；

2代表選自s,a,n,r,d,f,l,p,t和y的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自s,a,n和r；

3代表選自t,v,s,a,l和f的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自t,v,s,a和l；更優(yōu)選的選自t,v和s；

4代表選自w,f和h的氨基酸殘基；

5代表選自p,i,a,l,s,t,v和y的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自p和i；

6代表選自w,f,i,l,t和v的氨基酸殘基；

7代表氨基酸殘基l或p；和

8代表選自a,h,n和y的氨基酸殘基。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自h,q,a,k,r,d,i,l,m,n,v和y的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自h,q,a,k和r；更優(yōu)選的選自a和r；

2代表選自y,f和h的氨基酸殘基；

3代表選自q,f和t的氨基酸殘基；

4代表選自w,m,g,h,n和t的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自w和m；

5代表選自t,a,m,l和v的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自t,a和m；

6代表選自i,l,v,d和t的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自i,l和v；和

7代表選自a,h,n和y的氨基酸殘基。

甚至更優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有seqidno:6的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件，其中所述重復(fù)組件之前是具有seqidno:5的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自k,m,n,r和v的氨基酸殘基；

2代表選自y,h,m和v的氨基酸殘基；

3代表選自f,l,m和v的氨基酸殘基；

4代表選自r,h,v,a,k和n的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自r,h,v和a；

5代表選自f,d,h,t,y,m和k的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自f,d,h,t和y；和

6代表選自a,h,n和y的氨基酸殘基。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自t,a,h,i,n和s的氨基酸殘基；

2代表選自f,i,q,r,v和n的氨基酸殘基；

3代表選自a,g,n,q和v的氨基酸殘基；

4代表氨基酸殘基w或y；

5代表選自a,s,t和m的氨基酸殘基；

6代表選自n,v,s,f,m和w的氨基酸殘基；

7代表選自a,h,n和y的氨基酸殘基；和

8代表氨基酸殘基t或a。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自k,a,v和n的氨基酸殘基；

2代表選自n,i和y的氨基酸殘基；

3代表選自t,f,y和w的氨基酸殘基；

4代表選自w,d和y的氨基酸殘基；

5代表氨基酸殘基s或a；

6代表選自d,i和m的氨基酸殘基；

7代表選自l,t和y的氨基酸殘基；和

8代表選自a,h,y和n的氨基酸殘基。

甚至更優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有seqidno:8的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件，其中所述重復(fù)組件之前是具有seqidno:7的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件和/或之后是具有seqidno:9的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自l,s和t的氨基酸殘基；

2代表選自g,s和c的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自g和s；

3代表氨基酸殘基s或a；

4代表選自q,s,m和n的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自q和s；

5代表選自l,m和q的氨基酸殘基；和

6代表選自a,h,n,y和d的氨基酸殘基。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自y,h,f,i,l和w的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自y和h；

2代表選自m,d,i,l,v的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自m和d；

3代表選自g,s和v的氨基酸殘基；

4代表氨基酸殘基w或f；

5代表選自a,g和t的氨基酸殘基；

6代表氨基酸殘基d或w；

7代表氨基酸殘基l或f；和

8代表選自a,h,n和y的氨基酸殘基。

甚至更優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有seqidno:11的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件，其中所述重復(fù)組件之前是具有seqidno:10的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自k,s,i,n,t和v的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自k和s；

2代表選自k,n,w,a,h,m,q和s的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自k和n；

3代表選自f,q,l,h和v的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自f,q和l；

4代表氨基酸殘基f或t；

5代表氨基酸殘基q或h；

6代表氨基酸殘基y或s；

7代表選自n,h,y和m的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自n和h；和

8代表選自a,h,n和y的氨基酸殘基。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有以下錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件

其中

1代表選自f,y,h和w的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自f,y和h；

2代表選自i,m,d和v的氨基酸殘基；優(yōu)選的選自i,m和d；

3代表氨基酸殘基f或l；

4代表氨基酸殘基l或p；

5代表選自h,l和y的氨基酸殘基；和

6代表選自a,h,n,c和y的氨基酸殘基。

甚至更優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中所述錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域或所述設(shè)計的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括具有seqidno:13的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件，其中所述重復(fù)組件之前是具有seqidno:12的錨蛋白重復(fù)序列基序的重復(fù)組件。

另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是一種重組結(jié)合蛋白，其包括具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的至少一個重復(fù)結(jié)構(gòu)域，其中所述重復(fù)結(jié)構(gòu)域與選自seqidnos:16，22，23，29，30和33的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，或選自seqidnos:16，22，23，29，30，33，34，36，39和40的重復(fù)結(jié)構(gòu)域競爭結(jié)合vegf-axxx。

術(shù)語“競爭結(jié)合”表示本發(fā)明兩個不同的結(jié)合結(jié)構(gòu)域不能同時結(jié)合同一靶，而它們兩者能夠單獨(dú)結(jié)合同一靶。因此，這兩種結(jié)合結(jié)構(gòu)域競爭結(jié)合所述靶。確定兩種結(jié)合結(jié)構(gòu)域是否競爭結(jié)合靶的方法(諸如競爭性elisa或競爭性spr測量(例如通過使用biorad的proteon裝置))是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

與挑選的重復(fù)蛋白競爭結(jié)合vegf-axxx的重組結(jié)合蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法鑒定，諸如競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。

另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是一種重組結(jié)合蛋白，其包括具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，所述vegf-axxx選自seqidnos:14到33，或選自seqidnos:14到40。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的所述重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括與所述重復(fù)結(jié)構(gòu)域組的重復(fù)結(jié)構(gòu)域具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述氨基酸序列同一性是至少75%，更優(yōu)選的80%，更優(yōu)選的85%，更優(yōu)選的90%，和最優(yōu)選的95%。

進(jìn)一步優(yōu)選的是一種重組結(jié)合蛋白，其中具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的所述重復(fù)結(jié)構(gòu)域包括與所述重復(fù)結(jié)構(gòu)域組的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)組件具有至少70%氨基酸序列同一性的重復(fù)組件。優(yōu)選的，所述氨基酸序列同一性是至少75%，更優(yōu)選的80%，更優(yōu)選的85%，更優(yōu)選的90%，和最優(yōu)選的95%。

在本發(fā)明包括重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)組件的一個或更多個氨基酸殘基被比對重復(fù)單位時在對應(yīng)位置上發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基替換。優(yōu)選的，高達(dá)30%的氨基酸殘基被替換，更優(yōu)選的，高達(dá)20%，和甚至更優(yōu)選的，高達(dá)10%的氨基酸殘基被替換。最優(yōu)選的，這類重復(fù)單位是天然存在的重復(fù)單位。甚至更優(yōu)選的，所述重復(fù)結(jié)構(gòu)域具有對vegf-axxx或vegfr-2的結(jié)合特異性。

在仍然另一個具體的實(shí)施方案中，高達(dá)30%的氨基酸殘基，更優(yōu)選的，高達(dá)20%，和甚至更優(yōu)選的，高達(dá)10%的氨基酸殘基被不是在重復(fù)單位的對應(yīng)位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸替換。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，此處描述的任一種vegf-axxx結(jié)合蛋白或結(jié)構(gòu)域可以與一種或更多種其他的部分共價結(jié)合，包括，例如，也結(jié)合

vegfr-2的部分(例如vegfr-2結(jié)合多肽)，結(jié)合不同的靶諸如plgf，人血清白蛋白，細(xì)胞受體(例如her2)，免疫球蛋白(例如igg1)，細(xì)胞因子(例如tnf-alpha或白介素)或生長因子以產(chǎn)生雙特異性結(jié)合劑的部分，標(biāo)記部分(例如熒光標(biāo)記諸如熒光素，或放射性示蹤劑)，促進(jìn)蛋白純化的部分(例如小肽標(biāo)簽，諸如his-或strep-標(biāo)簽)，提供改善的治療效果的效應(yīng)物功能的部分(例如提供抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抗體fc部分，毒性蛋白部分諸如綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)外毒素a(eta)或小分子毒性劑諸如美登素類或dna烷化劑)或提供改善的藥代動力學(xué)的部分?？梢愿鶕?jù)感知的治療需要評價改善的藥代動力學(xué)。經(jīng)常希望增加生物利用度和/或增加給藥之間的時間，可能通過增加給藥后血清中仍然可用的蛋白的時間。在一些情況下，希望改善蛋白血清濃度隨時間的連續(xù)性(例如，減少在剛剛施用后和下次施用前不久之間蛋白血清濃度的差異)。傾向于減慢蛋白從血液中清除的部分包括羥乙基淀粉(hes)，聚乙二醇(peg)，糖(例如唾液酸)，良好耐受的蛋白部分(例如fc片段或血清白蛋白)，以及對豐富的血清蛋白具有特異性和親和力的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或肽，諸如抗體fc片段或血清白蛋白。本發(fā)明的重組結(jié)合蛋白可以連接到降低多肽在哺乳動物(例如小鼠，大鼠或人)中清除率的部分，相對于未修飾的多肽降低至少于1/3。

一個或更多個聚乙二醇部分可以連接到結(jié)合蛋白的不同位置，這類連接可以通過與胺、巰基或其他合適反應(yīng)基的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。聚乙二醇部分的連接(peg化)可以是定點(diǎn)的，其中將合適的反應(yīng)基引入蛋白以產(chǎn)生peg化優(yōu)選發(fā)生的位點(diǎn)，或合適的反應(yīng)基原來就存在于結(jié)合蛋白中。硫醇基可以存在于半胱氨酸殘基中；和胺基可以是，例如，在多肽n端發(fā)現(xiàn)的伯胺或存在于氨基酸側(cè)鏈的胺基，諸如賴氨酸或精氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白被改造以便在所需位置具有半胱氨酸殘基，允許半胱氨酸的定點(diǎn)peg化，例如通過與載有馬來酰亞胺功能團(tuán)的聚乙二醇衍生物反應(yīng)。聚乙二醇部分的分子量可以變化較大(即從約1kda到約100kda)，并且可以是分枝或線性的。優(yōu)選的，聚乙二醇具有約1到約50kda的分子量，優(yōu)選的約10到約40kda，甚至更優(yōu)選的約15到約30kda，和最優(yōu)選的約20kda。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼特定重組結(jié)合蛋白的核酸分子。此外，還涉及包括所述核酸分子的載體。

進(jìn)一步的，涉及包括一種或更多種上述結(jié)合蛋白(尤其是包括重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重組結(jié)合蛋白)的藥物組合物，或編碼特定重組結(jié)合蛋白的核酸分子，以及任選的藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，將在下文更詳細(xì)的解釋。甚至進(jìn)一步的，涉及包括一種或更多種上述重組結(jié)合蛋白(尤其是包括重復(fù)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白)的診斷組合物。

本發(fā)明的結(jié)合蛋白抑制或預(yù)防vegf誘導(dǎo)的病理性血管生成，血管滲漏(水腫)，肺動脈高血壓，腫瘤形成和/或炎性病癥。利用“抑制”表明重組蛋白將所述疾病預(yù)防到某種程度，例如到10%或20%，更優(yōu)選的50%，尤其是70%，80%或90%，或甚至95%。

術(shù)語“水腫”表示由血管滲漏引起的狀況。炎癥期間血管舒張和增加的通透性是主要致病機(jī)制。例如，水腫導(dǎo)致中風(fēng)后的梗塞擴(kuò)大，有可能在癌癥患者中引起危急生命的顱內(nèi)高壓。此外，血漿蛋白的外滲有助于隱性腫瘤的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散，而氣道充血可能造成致命的氣喘發(fā)作。在炎癥期間發(fā)生的增加的血管滲漏可能導(dǎo)致呼吸窘迫，腹水，腹膜硬化(在透析患者中)，粘連形成(腹部手術(shù))和轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。

術(shù)語“血管生成”表示形成新血管的基本過程。人的初始血管生成期發(fā)生在胚胎發(fā)育的前三個月，但血管生成還作為正常的生理過程在組織生長期間發(fā)生，諸如肌肉或脂肪的增加以及月經(jīng)周期和懷孕期間。

術(shù)語“病理性血管生成”是指數(shù)種疾病狀態(tài)的維持和進(jìn)展期間血管的形成和生長。病理性血管生成的具體實(shí)例發(fā)現(xiàn)于血管（動脈粥樣硬化，血管瘤，血管內(nèi)皮瘤），骨和關(guān)節(jié)（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，滑膜炎，骨和軟骨損傷，骨髓炎，血管翳生長，骨贅形成，腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤），皮膚（疣，膿性肉芽腫，毛發(fā)生長，卡波西氏肉瘤，疤痕瘢痕疙瘩，變應(yīng)性水腫，腫瘤），肝，腎，肺，耳和其他上皮細(xì)胞（炎性和感染性過程包括肝炎，腎小球腎炎，肺炎；和哮喘，鼻息肉，耳炎，移植病癥，肝再生病癥，腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤），子宮，卵巢和胎盤（子宮內(nèi)避孕器造成的功能障礙性子宮出血，卵泡囊腫形成，卵巢超刺激綜合征，子宮內(nèi)膜異位，腫瘤），腦、神經(jīng)和眼睛（早產(chǎn)兒的視網(wǎng)膜病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，脈絡(luò)膜和其他眼內(nèi)病癥，白質(zhì)軟化，腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤），工作超負(fù)荷造成的心臟和骨骼肌，脂肪組織（肥胖癥），內(nèi)分泌器官（甲狀腺炎，甲狀腺腫大，胰移植病癥），造血作用（aids中的kaposi綜合征），血液惡性腫瘤（白血病），和淋巴管（腫瘤轉(zhuǎn)移，淋巴組織增生病癥）。

術(shù)語“視網(wǎng)膜局部缺血病”表示視網(wǎng)膜的血液和氧供給減少，視網(wǎng)膜的外周部分失去它們的營養(yǎng)來源并終止正常功能。視網(wǎng)膜局部缺血病的具體實(shí)例是視網(wǎng)膜病。引起視網(wǎng)膜病的常見疾病是糖尿病性視網(wǎng)膜病，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞，頸動脈狹窄，和鐮狀細(xì)胞視網(wǎng)膜病。糖尿病性視網(wǎng)膜病是糖尿病患者視覺喪失的主要原因。在局部缺血性視網(wǎng)膜中，存在新血管的生長(新生血管形成)。這些血管經(jīng)常生長在視網(wǎng)膜的表面，視神經(jīng)中，眼睛前部的虹膜上。新血管無法代替必需營養(yǎng)物的流動，相反，可能造成許多問題諸如玻璃體出血，視網(wǎng)膜剝離和不受控制的青光眼。存在這些問題是因為新血管是脆弱和易于出血的如果在其早期發(fā)現(xiàn)，利用全視網(wǎng)膜光凝術(shù)有時可以阻滯增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病。但是，一些情況下，玻璃體切割(vitrectomy)手術(shù)是唯一的選擇。

除了這些視網(wǎng)膜病外，眼睛的血管病還包括眼新生血管形成病，諸如黃斑變性和糖尿病黃斑水腫(dme)。黃斑變性源于斑點(diǎn)下脈絡(luò)膜血管的新生血管生長。存在兩種類型的黃斑變性∶干性和濕性。盡管濕性黃斑變性只包括全部黃斑變性的15%，但幾乎所有的濕性黃斑變性都致盲。此外，濕性黃斑變性幾乎總是源于干性黃斑變性。一旦一只眼染上濕性黃斑變性，該病癥通常感染另一只眼。濕性黃斑變性經(jīng)常被稱為濕性-amd的年齡相關(guān)性濕性黃斑變性，因為它主要發(fā)現(xiàn)在老人中。

糖尿病性視網(wǎng)膜病(dr)和dme是大部分發(fā)達(dá)國家的勞動年齡人口失明的主要原因。世界范圍內(nèi)糖尿病患者數(shù)量的增加表明dr和dme仍將是未來數(shù)年內(nèi)視力喪失以及相關(guān)功能性損傷的主要原因。數(shù)種生化機(jī)制(包括蛋白激酶c-β活化，增加的血管內(nèi)皮生長因子產(chǎn)生，氧化應(yīng)激，和胞內(nèi)山梨糖醇和高度糖基化最終產(chǎn)物的積聚)可能導(dǎo)致表現(xiàn)為dr/dme的血管破壞。這些途徑的抑制有希望干預(yù)dr和dme。

術(shù)語“肺部高壓”表示肺部動脈的血壓異常高的病癥。在沒有心臟或肺的其他疾病情況下，它被稱為原發(fā)性肺動脈高壓。肺部小動脈的彌散性狹窄是作為病理性動脈生成的結(jié)果發(fā)生的，然后是作為對血流阻礙增加的應(yīng)答的肺動脈高壓。發(fā)病率是100'000人中8個。但是，肺動脈高壓還可以作為慢性阻塞性肺病(copd)的并發(fā)癥(諸如肺氣腫，慢性支氣管炎或彌漫性間質(zhì)纖維化)以及在哮喘樣copd患者中發(fā)生。copd的發(fā)病率是10'000人中大約5個。

此外，本發(fā)明的結(jié)合蛋白可用于治療炎癥和更具體的來說炎性病癥。

本文使用的術(shù)語“炎癥”表示，對活組織損傷的局部反應(yīng)，尤其是小血管，它們的內(nèi)容物以及它們的相關(guān)結(jié)構(gòu)的局部反應(yīng)。血液組分穿過血管壁進(jìn)入組織是炎癥的標(biāo)志，如此形成的組織收集物被稱為滲出液或水腫。破壞活組織的任何有害步驟，例如感染細(xì)菌，過熱，冷，機(jī)械性損傷諸如擠壓，酸，堿金屬，輻射，或感染病毒都可以引起炎癥，與涉及的器官或組織無關(guān)。應(yīng)清楚，分類到“炎性疾病”的疾病以及范圍從燒傷到肺炎，麻瘋病，肺結(jié)核，和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的組織反應(yīng)都是“炎癥”。

本發(fā)明的結(jié)合蛋白可用于治療腫瘤形成。術(shù)語“腫瘤”表示異常組織團(tuán)，其無明顯原因的來自先前存在的體細(xì)胞，沒有預(yù)期功能，特征在于自發(fā)和無限生長的傾向。腫瘤與炎性或其他腫脹完全不同，因為腫瘤內(nèi)的細(xì)胞在其形態(tài)和其他特征方面是異常的。異常細(xì)胞，即通常組成腫瘤的細(xì)胞種類，與正常細(xì)胞的不同之處在于經(jīng)歷下列改變中的一種或更多種：(1)肥大，或單個細(xì)胞大小的增加；(2)增生或指定區(qū)域內(nèi)細(xì)胞數(shù)目的增加；(3)退行性變化，或細(xì)胞生理特征向更原始或未分化類型的退化。腫瘤可以是良性的，例如脂肪瘤，血管瘤，骨瘤，軟骨瘤，和腺瘤。惡性腫瘤的實(shí)例是癌（諸如乳腺瘤，呼吸道和胃腸道、內(nèi)分泌腺和生殖泌尿系統(tǒng)的癌），肉瘤（在結(jié)締組織中，包括纖維組織，脂肪（脂）組織，肌肉，血管，骨，和軟骨），癌肉瘤（在上皮和結(jié)締組織兩者中），白血病和淋巴瘤，神經(jīng)組織（包括腦）瘤，和黑色素瘤（著色皮膚細(xì)胞的癌癥）。本發(fā)明結(jié)合蛋白抗腫瘤的使用還可以結(jié)合本領(lǐng)域已知的任何其他腫瘤療法諸如放療，光動力療法，化療或手術(shù)。

藥物組合物包括如上所述的結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體，賦形劑或穩(wěn)定劑(remington'spharmaceuticalsciences16thedition,osol,a.ed.[1980])。技術(shù)人員已知的合適載體，賦形劑或穩(wěn)定劑是鹽水，ringer's溶液，葡萄糖溶液，hank's溶液，非揮發(fā)油，油酸乙酯，5%葡萄糖鹽溶液，增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，緩沖劑和防腐劑。其他合適的載體包括自身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受組合物的個體有害的抗體的任何載體，諸如蛋白，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚氨基酸和氨基酸共聚物。藥物組合物還可以是組合制劑，包括其他的活性劑，諸如抗癌劑或抗血管生成劑(例如人vegf-axxxb；優(yōu)選的，人vegf-a165b)。

優(yōu)選的用于治療眼病的藥物組合物包括如上所述的結(jié)合蛋白和去污劑諸如聚山梨酯20(例如約0.04%)，緩沖劑諸如組氨酸，磷酸鹽或乳酸和糖諸如蔗糖或海藻糖。優(yōu)選的，這類組合物包括如上所述的結(jié)合蛋白和pbs。所述藥物組合物可以局部施用，或局部施用到眼睛的一部分或注射到眼中，例如注射入結(jié)膜下，眼球周圍或眼球后間隙或直接注射入眼?？蛇x的，可以通過腸胃外施用將所述組合物全身施用。優(yōu)選的，通過玻璃體內(nèi)注射將所述藥物組合物應(yīng)用于眼。還優(yōu)選的，所述藥物組合物被局部應(yīng)用于眼，并作為滴眼劑。滴眼劑可用于角膜(眼中心的澄清部分)，從而允許分子滲入眼中。為了治療感染眼睛后部的疾病，最希望當(dāng)在結(jié)膜下或眼球周圍注射時結(jié)合蛋白能夠穿透鞏膜。結(jié)合蛋白的施用可以在調(diào)節(jié)眼睛表面以提高分子穿透的預(yù)備步驟之后進(jìn)行。優(yōu)選的，通過穿透增強(qiáng)子調(diào)節(jié)上皮層諸如角膜上皮以允許例如上文描述的分子的足量和快速穿透。本發(fā)明結(jié)合蛋白抗眼病的使用還可以結(jié)合本領(lǐng)域已知的任何其他療法諸如光動力療法。

用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌或消毒的。這可以通過過濾除菌膜進(jìn)行過濾方便地實(shí)現(xiàn)。

可以制備緩釋制劑。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，可以使用眼內(nèi)植入物來提供本發(fā)明的結(jié)合蛋白。緩釋制劑的合適實(shí)例包括固態(tài)疏水多聚體(包含本發(fā)明多肽)的半滲透基質(zhì)，所述基質(zhì)采用成形產(chǎn)品的形式，例如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯，水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯），或聚(乙烯醇))，聚丙交酯，l-谷氨酸和gamma-乙基-l-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的亞乙基-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物諸如luprondepot?(由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的注射用微球)，和聚-d-(-)-3-羥丁酸。

可以使用技術(shù)人員已知的任何合適方法施用藥學(xué)組合物。優(yōu)選的施用途徑是腸胃外。在腸胃外施用中，本發(fā)明的藥物將與上文所述的藥學(xué)上可接受的賦形劑一起被配制為單位劑量的注射形式，諸如溶液，懸液或乳液。施用的劑量和方式將取決于待治療的個體和具體疾病。通常，施用藥物組合物使得給予本發(fā)明結(jié)合蛋白的劑量為1μg/kg到20mg/kg，更優(yōu)選的10μg/kg到5mg/kg，最優(yōu)選的0.1到2mg/kg。優(yōu)選的，其作為快速濃注劑量給藥。還可以使用連續(xù)輸注，包括通過滲透性微型泵的連續(xù)皮下輸送。這樣的話，藥物組合物的輸注劑量為5到20μg/kg/分鐘，更優(yōu)選的7到15μg/kg/分鐘。尤其是，通過注射入眼睛來施用藥物組合物，使得給予本發(fā)明結(jié)合蛋白的劑量為0.1mg到10mg每次注射，更優(yōu)選的0.3到6mg每次注射，最優(yōu)選的1mg到4mg每次注射。此外，通過滴眼劑給眼睛施用藥物組合物，使得施用于眼的單滴溶液包含本發(fā)明結(jié)合蛋白的濃度為10到120mg/ml，更優(yōu)選的20到100mg/ml，最優(yōu)選的40到80mg/ml。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，如上所述抑制vegf-axxx活性的結(jié)合蛋白，可以與抑制plgf活性的結(jié)合蛋白或小分子(具有與上述針對vegf-axxx的相同plgf抑制水平)聯(lián)用。該實(shí)施方案基于以下事實(shí)：在vegf-axxx水平增加的位置發(fā)現(xiàn)plgf是生成血管的。此外，如上所述抑制vegf-axxx活性的結(jié)合蛋白，可以與抑制以下物質(zhì)活性的結(jié)合蛋白或小分子聯(lián)用：血小板衍生生長因子(pdgf)，vegf-c或蛋白vegf家族的其他成員，腫瘤壞死因子alpha(tnfalpha)，delta-配體樣4(dii4)，白介素6(il-6)，神經(jīng)氈蛋白或促血管生成素2(ang2)。

本發(fā)明還提供新的治療方法。一方面，提供治療視網(wǎng)膜病的方法，所述方法包括給需要其的患者施用治療有效量的本發(fā)明結(jié)合蛋白，尤其是抑制人vegf-axxx和人vegfr-2相互作用、但不抑制vegf-axxxb和人vegfr-2相互作用的結(jié)合蛋白，并且所述結(jié)合蛋白抑制vegfr-2介導(dǎo)的血管生成。

本發(fā)明還涉及使用所述結(jié)合蛋白抑制細(xì)胞中vegf-a生物活性或抑制vegfr-2介導(dǎo)的生物活性的方法。細(xì)胞可以位于體內(nèi)或離體，并且可以是，例如，活生物體的細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品中的細(xì)胞。該方法包括將所述細(xì)胞與本文公開的vegf-a/vegfr-2相互作用抑制結(jié)合蛋白中的任一種按照足以抑制這類生物活性的量和時間進(jìn)行接觸。

本發(fā)明提供治療患有對vegf-axxx或vegfr-2的抑制產(chǎn)生應(yīng)答的狀況的受試者的方法。這類方法包括給所述受試者施用有效量的本文所述結(jié)合蛋白。狀況可以是特征為不當(dāng)血管生成的狀況。狀況可以是高增殖(hyperproliferative)狀況。適于治療的狀況（或病癥）的實(shí)例包括自身免疫病，炎性病癥，視網(wǎng)膜?。ㄓ绕涫窃鲋承砸暰W(wǎng)膜?。?，和癌癥，尤其是上述疾病的一種。本文描述的任一種結(jié)合蛋白可用于制備治療下述病癥的藥物，尤其是選自以下組的病癥∶自身免疫病，炎性病癥，視網(wǎng)膜病，和癌癥。適于治療的優(yōu)選狀況（或病癥）是第一線轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌，復(fù)發(fā)的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，輔助(adjuvant)結(jié)腸癌，輔助her2-陰性乳腺癌，輔助her2-陽性乳腺癌，輔助非小細(xì)胞肺癌，彌散性大b細(xì)胞淋巴瘤，第一線晚期胃癌，第一線her2-陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌，第一線her2-陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌，第一線轉(zhuǎn)移性卵巢癌癥，胃腸間質(zhì)腫瘤，高風(fēng)險類癌瘤，激素難治性前列腺癌，新診斷的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，轉(zhuǎn)移性頭和頸部癌癥，復(fù)發(fā)的鉑敏感性卵巢癌，第二線轉(zhuǎn)移性乳腺癌，泛發(fā)性小細(xì)胞肺癌，非鱗狀、非小細(xì)胞肺癌以及先前治療的cns轉(zhuǎn)移瘤和復(fù)發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌（nsclc），結(jié)腸直腸癌和胰腺癌，晚期卵巢癌（aoc），具有征兆性惡性腹水的aoc患者和非霍奇金氏淋巴瘤。

本發(fā)明的重組結(jié)合蛋白可以通過以下數(shù)種方法獲得和/或進(jìn)一步發(fā)展，諸如噬菌體表面展示(wo90/02809,wo07/006665)或細(xì)菌細(xì)胞表面展示(wo93/10214)，核糖體展示(wo98/48008)，質(zhì)粒展示(wo93/08278)或使用共價的rna-重復(fù)蛋白雜合構(gòu)建體(wo00/32823)，或胞內(nèi)表達(dá)和挑選/篩選諸如通過蛋白互補(bǔ)測定(wo98/341120)。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

用于本發(fā)明重組結(jié)合蛋白的挑選/篩選的錨蛋白重復(fù)蛋白庫可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方案(wo02/020565,binz,h.k.etal.,jmb,332,489-503,2003,和binzetal.,2004,在上述引文中)獲得。用于vegf-axxx特異性darpins挑選的這類文庫的使用在實(shí)施例1中給出。類似的，上文描述的錨蛋白重復(fù)序列基序可以用于構(gòu)建錨蛋白重復(fù)蛋白的庫(其可用于vegf-axxx特異性darpins的挑選或篩選)。此外，利用標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)(例如wo02/020565,binzetal.,2003,在上述引文中，和binzetal.,2004,在上述引文中)，本發(fā)明的重復(fù)結(jié)構(gòu)域可以從本發(fā)明的重復(fù)組件和合適的加帽組件模塊化組裝(forrer,p.,etal.,febsletters539,2-6,2003)。

本發(fā)明不局限于在實(shí)施例描述的具體實(shí)施方案?？梢园凑杖缦滤龅囊话愀攀鍪褂煤吞幹闷渌麃碓?。

實(shí)施例

下文公開的所有起始原料和試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以商購獲得或利用公知的技術(shù)制備。

材料

化學(xué)制劑購自fluka(switzerland)。寡核苷酸購自microsynth(switzerland)。除非另有說明，dna聚合酶、限制性內(nèi)切酶和緩沖液購自newenglandbiolabs(usa)或fermentas(lithuania)?？寺【旰偷鞍咨删晔谴竽c桿菌xl1-blue(stratagene,usa)。vegf變體購自r&dsystems(minneapolis,usa)，或在中國倉鼠卵巢細(xì)胞或巴斯德畢赤酵母中產(chǎn)生并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行純化(rennel,e.s.etal.,europeanj.cancer44,1883-94,2008；2008；pichia表達(dá)系統(tǒng)購自invitrogen)。生物素化的vegf變體通過化學(xué)法獲得，利用標(biāo)準(zhǔn)的生物素化試劑和方法將生物素部分偶聯(lián)到純化的vegf變體的伯胺(pierce,usa)。

分子生物學(xué)

除非另有說明，根據(jù)描述的方案(sambrookj.,fritsche.f.andmaniatist.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory1989,newyork)實(shí)施方法。

設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白文庫

n2c和n3c設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白文庫被描述(wo02/20565；binzetal.2003,在上述引文中；binzetal.2004,在上述引文中)。n2c和n3c中的數(shù)字描述加帽組件n端和c端之間存在的隨機(jī)重復(fù)組件的數(shù)目。用于定義重復(fù)單位和組件內(nèi)位置的命名法是基于binzetal.2004,在上述引文中，改變是重復(fù)組件和重復(fù)單位的邊界遷移一個氨基酸位置。例如，binzetal.2004(在上述引文中)的重復(fù)組件的位置1對應(yīng)于本文重復(fù)組件的位置2，所以binzetal.2004(在上述引文中)的重復(fù)組件的位置33對應(yīng)于本文下一個重復(fù)組件的位置1。

所有dna序列都通過測序確認(rèn)，所有描述蛋白的計算分子量都通過質(zhì)譜確認(rèn)。

實(shí)施例1∶具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的包括重復(fù)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白的挑選

利用核糖體展示(hanes,j.andplückthun,a.,pnas94,4937-42,1997)，許多設(shè)計的具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的錨蛋白重復(fù)蛋白(darpins)選自binz等2004(在上述引文中)描述的n2c或n3cdarpin文庫。通過粗提物elisa評價挑選的克隆對特異性(vegf-axxx)和非特異性(mbp，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白)靶標(biāo)的結(jié)合，表明vegf-axxx結(jié)合蛋白被成功挑選(圖1)。seqidno:14到40構(gòu)成所選結(jié)合蛋白的氨基酸序列，所述結(jié)合蛋白包括具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。所選結(jié)合劑的序列分析顯示某些挑選的結(jié)合劑家族固有的特定錨蛋白重復(fù)序列基序。具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域中存在的這類錨蛋白重復(fù)序列基序提供于seqidno:1到13。

通過核糖體展示挑選vegf-axxx特異性錨蛋白重復(fù)蛋白

通過核糖體展示(hanesandplückthun,在上述引文中)進(jìn)行vegf-axxx特異性錨蛋白重復(fù)蛋白的挑選，使用狗vegf-a164或人vegf-a165作為靶蛋白，如所述的設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白文庫(wo02/020565,binzetal.,2003,在上述引文中和binzetal.,2004,在上述引文中)和確立的方案(zahnd,c.,amstutz,p.andplückthun,a.,nat.methods4,69-79,2007)。使用確立的方案(binzetal.2004,在上述引文中)，利用n2c和n3cdarpin文庫對狗或人vegf變體(包括生物素化的變體，固定于neutravidin或鏈霉親和素)進(jìn)行核糖體展示挑選循環(huán)。每輪挑選后逆轉(zhuǎn)錄(rt)-pcr循環(huán)的數(shù)目恒定的從40減少到30，以適應(yīng)結(jié)合劑富集得到的產(chǎn)出。對狗vegf的4輪初步挑選得到納摩親和力darpins的混合物，這通過單個克隆的elisa和spr測量顯示。為了發(fā)現(xiàn)具有進(jìn)一步改善的親和力的darpins，對固定于neutravidin或鏈霉親和素的生物素化人或狗vegf進(jìn)行額外的解離速率篩選(off-rateselections)，采用第二輪和第三輪初始核糖體展示挑選后的混合物，然后是對人vegf的結(jié)合速率篩選(on-rateselection)。

如粗提物elisa所示，挑選的克隆特異性結(jié)合vegf-axxx

使用標(biāo)準(zhǔn)步驟，利用darpin表達(dá)細(xì)胞的粗制大腸桿菌提取物，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)鑒定特異性結(jié)合vegf-axxx的所選單個darpins。所選克隆被克隆入pqe30(qiagen)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌xl1-blue(stratagene)，然后在包含1ml生長培養(yǎng)基(2yt包含1%葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素)的96深孔板(單孔中每個克隆)中37℃生長過夜。將100μl過夜培養(yǎng)物接種到新的96深孔板中的1ml新鮮2yt(包含50μg/ml氨芐青霉素)。在37℃溫育2h后，利用iptg(1mm終濃度)誘導(dǎo)表達(dá)并持續(xù)3h。收集細(xì)胞，重懸于100μlb-perii(pierce)，并在室溫振蕩條件下溫育15分鐘。然后，添加900μlpbs-tb(pbs添加0.2%bsa,0.1%tween20,ph7.4)，通過離心去除細(xì)胞碎片。將100μl每種裂解的克隆加入neutravidin包被的maxisorp板的孔(包含通過它們的生物素部分固定的vegf-axxx變體或無關(guān)mbp)，并在室溫溫育1h。用pbs-t(pbs添加0.1%tween20,ph7.4)徹底清洗后，使用單克隆抗rgs(his)4抗體(34650,qiagen)作為一抗和綴合堿性磷酸酶的多克隆山羊抗小鼠抗體(a3562,sigma)作為第二試劑通過標(biāo)準(zhǔn)elisa法將板顯色。然后使用4-硝基苯基磷酸二鈉(4npp,fluka)作為堿性磷酸酶的底物檢測結(jié)合。在405nm測量顯色。用于鑒定結(jié)合vegf-axxx的darpins的示例性粗提物elisa的結(jié)果顯示于圖1。通過這種粗制細(xì)胞提取物elisa篩選數(shù)百個克隆顯示，超過上百個不同的darpins具有對vegf-axxx的特異性。挑選這些結(jié)合蛋白用于進(jìn)一步分析。挑選的特異性結(jié)合vegf-axxx的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的實(shí)例提供于seqidno:14到40。

從具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的所選重復(fù)結(jié)構(gòu)域推定重復(fù)序列基序

通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的序列分析工具進(jìn)一步分析所選重復(fù)結(jié)構(gòu)域(具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性)的氨基酸序列(wo02/020565；forreretal.,2003,在上述引文中；forrer,p.,binz,h.k.,stumpp,m.t.andplückthun,a.,chembiochem,5(2),183-189,2004)。但是，與wo02/020565(其中使用天然存在的重復(fù)基序推導(dǎo)重復(fù)序列基序)不同，本文從挑選的具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)單位推導(dǎo)出重復(fù)序列基序。從而確定包括常見重復(fù)序列基序的所選重復(fù)結(jié)構(gòu)域的家族。具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的重復(fù)結(jié)構(gòu)域中存在的這類重復(fù)序列基序提供于seqidno:1到13。

darpins的高水平和可溶性表達(dá)

為了進(jìn)一步分析，將在所述粗制細(xì)胞提取物elisa中顯示特異性vegf-axxx結(jié)合的挑選克隆在大腸桿菌xl1-blue細(xì)胞中表達(dá)，并通過標(biāo)準(zhǔn)步驟使用它們的his標(biāo)簽進(jìn)行純化。使用25ml靜止過夜培養(yǎng)物(lb，1%葡萄糖，100mg/l氨芐青霉素；37℃)接種1升培養(yǎng)物(相同培養(yǎng)基)。在a(600)=0.7時，用0.5mmiptg誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并在37℃溫育4h。將培養(yǎng)物離心，所獲沉淀重懸于40mltbs500(50mmtris–hcl,500mmnacl,ph8)并進(jìn)行超聲處理。將裂解物再次離心，向所獲上清中添加甘油(10%(v/v)終濃度)和咪唑(20mm終濃度)。根據(jù)制造商的說明書(qiagen,germany)，在ni-氮川三乙酸柱(2.5ml柱體積)上純化蛋白。根據(jù)sds-15%page估算，從1升大腸桿菌培養(yǎng)物可以純化出高達(dá)200mg的高可溶性darpins(具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性)，其純度>95%。這種純化的darpins用于進(jìn)一步表征。

實(shí)施例2∶在球體生長測定中確定挑選的具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的darpins的ic50值

向埋入膠原基質(zhì)的huvec球體添加vegf-axxx導(dǎo)致球體生芽。添加vegf-axxx的抑制劑將阻斷芽形成，這可以通過芽的數(shù)目和長度在統(tǒng)計上定量。通過添加不同濃度的抑制劑和恒定量的vegf，可以確定ic50。

vegf-axxx特異性darpins對球體生芽的抑制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟(korffetal.,在上述引文中)完成球體生長測定。挑選具有對vegf-axxx的特異性的darpins，并按實(shí)施例1所述純化到>96%純度。人臍靜脈細(xì)胞在單層培養(yǎng)中生長到匯合。胰酶消化后，將細(xì)胞懸液置于懸滴條件以形成球體，即大約500個有組織聚集的huvecs。將球體埋入膠原基質(zhì)，并用vegf-a165刺激以起始芽生長。另外添加生芽抑制劑以觀察它們對生芽抑制的作用。使用圖形軟件定量每個球體的芽數(shù)目和芽長度。

來自2個示例性球體生芽測定的結(jié)果顯示于圖2a(具有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的darpin#30)和圖2b(darpinnc，沒有對vegf-axxx的結(jié)合特異性的陰性對照darpin；例如darpine3_5(binzetal.,2005,在上述引文中))。在該測定各種表現(xiàn)最好的darpins顯示范圍為10到50pm的ic50值，而平行實(shí)驗中avastin?，lucentis?和macugen?顯示范圍為150到500pm的ic50值。

實(shí)施例3∶通過表面等離子體共振分析確定darpin#27與avastin?相比的靶特異性

將狗vegf-a164或狗vegf-a164b固定于流動池，并分析darpin#27(seqidno:16)和avastin?與固定靶的相互作用。

表面等離子體共振(spr)分析

使用proteon裝置(biorad)測量spr。運(yùn)行緩沖液是20mmhepes,ph7.4,150mmnacl和0.005%tween20。將約1200ru的狗vegf-a164或狗vegf-a164b固定于glc芯片(biorad)。測量相互作用，60μl/min流速的5分鐘緩沖液流動，濃度為250nm的avastin?或darpin#27的100秒注射，以及具有緩沖液流動的數(shù)分鐘解離速率測量。從測量值減去未包被參照池的信號。

結(jié)果顯示于圖3a(avastin與狗vegf-a164的相互作用)，圖3b(avastin與狗vegf-a164b的相互作用)，圖3c(darpin#27與狗vegf-a164的相互作用)和圖3d(darpin#27與狗vegf-a164b的相互作用)。avastin與兩種固定的vegf同種型均明顯相互作用，而darpin#27只顯示與vegf-a164而非vegf-a164b的相互作用。

實(shí)施例4∶血管滲漏兔模型中darpin#30抑制vegf-a165的體內(nèi)功效

通過玻璃體內(nèi)注射將聚乙二醇化的darpin#30(seqidno:29)或lucentis?施用于兔的眼睛以檢測它們抑制血管滲漏(通過人vegf-a165的后續(xù)玻璃體內(nèi)的注射誘導(dǎo))的功效。

兔中血管滲漏抑制的測量

在第一天，通過玻璃體內(nèi)注射將pbs、聚乙二醇化的darpin#30(125μg)或等摩爾量的lucentis?(162μg)施用于每只兔的一只眼(治療眼)。在第4天或第30天，通過玻璃體內(nèi)注射500ng人vegf-a165攻擊每只兔的治療眼。在vegf-a165注射后48小時評價所有動物的兩只眼，通過靜脈注射鈉熒光素(50mg/kg動物體重，10%(w/v)溶于0.9%(w/v)鹽溶液)后1h測量所有眼睛中的熒光素含量。計算每只動物的治療眼與未治療眼的熒光量的比值。比值為1相當(dāng)于治療眼中不存在額外的熒光滲漏，比值大于1表示治療眼比未治療對照眼更多的熒光滲漏。

聚乙二醇化darpin的制備

利用單個cys殘基和馬來酰亞胺化學(xué)法將蛋白peg化是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以根據(jù)確立的方案(例如來自pierce)進(jìn)行。使用標(biāo)準(zhǔn)層析法將包括附加c端接頭(gggsgggsc，seqidno:41)的darpin#30純化到接近均質(zhì)。使用dtt將蛋白完全還原，并通過凝膠過濾進(jìn)行純化以去除dtt，將緩沖液更換為pbs。將溶于pbs的peg-馬來酰亞胺(甲氧基-聚(乙二醇)-氧代丙胺基-丙基馬來酰亞胺；nof,no.sunbrightme-200ma)與溶于pbs的darpin在室溫下混合2-4小時，其中peg-馬來酰亞胺大約15%摩爾過量。然后使用標(biāo)準(zhǔn)陰離子交換層析，將聚乙二醇化的darpin與未反應(yīng)的darpin和未反應(yīng)的peg部分分離。

結(jié)果顯示于圖4。在通過玻璃體內(nèi)注射施用聚乙二醇化的darpin#30和lucentis?后4天，它們能夠保護(hù)兔眼免于vegf-a165誘導(dǎo)的血管滲漏。盡管如此，只有聚乙二醇化的darpin#30，而不是lucentis?，在直至玻璃體內(nèi)注射后30天仍能夠保護(hù)兔眼免于vegf-a165誘導(dǎo)的血管滲漏。

序列表

<110>molecularpartnersag

binz,hanskaspar

forrer,patrik

stumpp,michaeltobias

<120>抑制vegf-a受體相互作用的結(jié)合蛋白

<130>p368a

<150>ep08168166.0

<151>2008-11-03

<160>41

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>1

xaaaspxaaxaaglyxaathrproleuhisleualaalaxaaxaagly

151015

hisleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>2

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>2

xaaaspxaaxaaglytrpthrproleuhisleualaalaxaaxaagly

151015

hisleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>3

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>3

xaaaspxaaxaaglyxaathrproleuhisleualaalaxaaxaagly

151015

hisleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

xaa

<210>4

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>4

xaaaspxaaxaaglytrpthrproleuhisleuxaaalaaspleugly

151015

xaaleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

xaa

<210>5

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>5

xaaaspxaaxaaglyxaathrproleuhisleualaalaxaaxaagly

151015

hisxaagluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>6

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>6

xaaaspxaaxaaglyxaathrproleuhisleualaalaxaaxaagly

151015

hisleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>7

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>7

xaaaspxaaxaaglytrpthrproleuhisleualaalaxaaxaagly

151015

hisleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>8

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>8

xaaaspxaaxaaglyxaathrproleuhisleualaalaxaaxaagly

151015

hisleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

xaa

<210>9

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>9

xaaaspxaaxaaglyxaathrproleuhisleuxaaalaxaaxaagly

151015

hisleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>10

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>10

xaaaspphelysxaaaspthrproleuhisleualaalaxaaxaagly

151015

hisxaagluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>11

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(6)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>11

xaaaspxaaleuxaaxaathrproleuhisleualaxaaxaaxaagly

151015

hisleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>12

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>12

xaaaspxaaxaaglyxaathrproleuxaaleualaalaxaaxaagly

151015

hisleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>13

<211>33

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)序列基序

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>13

xaaaspxaaxaaglytrpthrxaaleuhisleualaalaaspleugly

151015

xaaleugluilevalgluvalleuleulysxaaglyalaaspvalasn

202530

ala

<210>14

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>14

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

pheasptrpmetglytrpthrproleuhisleualaalahisglugly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alathraspvalserglytyrthrproleuhisleualaalaalaasp

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnthrlysaspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaasp

115120125

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>15

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>15

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargvalglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

pheasptrpmetglytrpthrproleuhisleualaalahisglugly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alathraspvalserglytyrthrproleuhisleualaalaalaasp

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnthrlysaspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaasp

115120125

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>16

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>16

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

pheasptrpmetglytrpthrproleuhisleualaalahisglugly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alathraspvalserglytyrthrproleuhisleualaalaalaasp

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnthrlysaspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyargleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaasp

115120125

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>17

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>17

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

pheasptrpmetglytrpthrproleuhisleualaalahisglugly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnglythraspvalasn

505560

alathraspvalserglytyrthrproleuhisleualaalaalaasp

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnthrlysaspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaasp

115120125

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>18

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>18

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

pheasptrpmetglytrpthrproleuhisleualaalahisglugly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alathraspvalserglytyrthrproleuhisleualaalaalaasp

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspval

859095

asnthrlysaspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaasp

115120125

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>19

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>19

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

pheasptrpmetglytrpthrproleuhisleualaalahisglugly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alathraspvalserglytyrthrproleuhisleualaalaalaasp

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspval

859095

asnthrlysaspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaasp

115120125

ileasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>20

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>20

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

pheasptrpmetglytrpthrproleuhisleualaalahisglugly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alathraspvalserglytyrthrproleuhisleualaalaalaasp

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspval

859095

asnthrthraspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaasp

115120125

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>21

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>21

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

pheasptyrmetglytrpthrproleuhisleualaalahisasngly

354045

hismetgluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

alaserasptyrserglytyrthrproleuhisleualaalaalaasp

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnthrlysaspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaasp

115120125

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>22

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>22

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

valasptyrileglytrpthrproleuhisleualaalaalatyrgly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrseralaaspvalasn

505560

alagluaspphealaglytyrthrproleuhisleualaalaserasn

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnthrlysaspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaasp

115120125

valasnthrglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>23

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>23

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargthrglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

thrasptyrmetglytrpthrproleuhisleualaalalysvalgly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

alagluasptyrasnglytyrthrproleuhisleualaalaalamet

65707580

glyhisleugluilealagluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnthrlysaspasnthrglytrpthrproleuhisleuseralaasp

100105110

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaasp

115120125

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>24

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>24

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

argaspserthrglytrpthrproleuhisleualaalaprotrpgly

354045

hisprogluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alaalaasppheglnglytrpthrproleuhisleualaalaalaval

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>25

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>25

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

argaspserthrglytrpthrproleuhisleualaalaprotrpgly

354045

hisprogluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alaalaasppheglnglytrpthrproleuhisleualaalaalaval

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>26

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>26

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnthr

202530

alaaspserthrglytrpthrproleuhisleualaalaprotrpgly

354045

hisprogluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alahisasptyrglnglytrpthrproleuhisleualaalathrleu

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>27

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>27

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnthr

202530

alaaspserthrglytrpthrproleuhisleuvalalaprotrpgly

354045

hisprogluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspvalasn

505560

thrhisasptyrglnglytrpthrproleuhisleualaalathrleu

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleuargtyrglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>28

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>28

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnthr

202530

alaaspserthrglytrpthrpromethisleualaalaprotrpgly

354045

hisprogluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspvalasn

505560

alaglnasppheglnglytrpthrproleuhisleualaalaalaile

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>29

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>29

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnthr

202530

alaaspserthrglytrpthrproleuhisleualavalprotrpgly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

alalysasppheglnglytrpthrproleuhisleualaalaalaile

65707580

glyhisglngluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>30

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>30

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargvalglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaaspglyalaaspvalasnala

202530

seraspphelysglyaspthrproleuhisleualaalaserglngly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

alatyraspmetleuglytrpthrproleuhisleualaalaaspleu

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnalaglnaspargpheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>31

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>31

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargvalglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

seraspphelysglyaspthrproleuhisleualaalaserglngly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnseralaaspvalasn

505560

alapheaspleuleuglytrpthrproleuhisleualaalaaspleu

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>32

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>32

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargvalglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

leuaspphelysglyaspthrproleuhisleualaalaalasergly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alahisaspmetleusertrpthrproleuhisleualaglyaspleu

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnalaglnaspargpheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>33

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>33

glyseraspleuglylyslysleuleuglualavalargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetthrasnglyalaaspvalasnala

202530

lysaspglnpheglyphethrproleuglnleualaalatyrasngly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

alapheaspilepheglytrpthrproleuhisleualaalaaspleu

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglyargthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>34

<211>127

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>34

glyseraspleuglylyslysleuleuglualavalargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

seraspasnglnglythrthrproleuhisleualaalaserhisgly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

aspalahisaspaspleuglytrpthrproleuhisleuseralaasp

65707580

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaasp

859095

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

100105110

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>35

<211>127

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>35

glyseraspleuglylyslysleuleuglualathrargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

seraspasnglnglythrthrproleuhisleualaalaserhisgly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

aspalahisaspaspleuglytrpthrproleuhisleualaalaasp

65707580

leuglyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaasp

859095

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

100105110

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>36

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>36

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargvalglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaaspglyalaaspvalasnala

202530

seraspphelysglyaspthrproleuhisleualaalaserglngly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

alatyraspmetleuglytrpthrproleuhisleualaalaaspleu

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnalaglnaspargpheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>37

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>37

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargvalglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnaspalaaspvalasnala

202530

seraspphelysglyaspthrproleuhisleualaalaserglngly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

alatyraspmetleuglytrpthrproleuhisleualaalaaspleu

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>38

<211>126

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>38

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnthr

202530

leuaspphelysseraspthrproleuhisleualaalaalasergly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

505560

alahisaspmetleusertrpthrproleuhisleualaglyaspleu

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspval

859095

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

100105110

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

115120125

<210>39

<211>159

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>39

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

lysaspiletyrglyargthrproleuhisleualaalaleuhisgly

354045

hisprogluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

alaasnasptyrtrpglythrthrserleuhisleuvalalailetrp

65707580

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

859095

asnalavalaspaspileglyglnthrproleuhisleualaalaala

100105110

trpglyhisleugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaasp

115120125

valasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserile

130135140

aspasnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>40

<211>158

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域

<400>40

glyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglygln

151015

aspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnala

202530

asnasptyraspglymetthrproleuhisleualaalametglugly

354045

hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn

505560

alaasnasphistyrglyphethrproleuhisleualatrpthrgly

65707580

argleugluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasn

859095

alaalaaspvalpheglyargthrproleuhisleualaalathrser

100105110

glyhisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspval

115120125

asnalaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileasp

130135140

asnglyasngluaspleualagluileleuglnlysalaala

145150155

<210>41

<211>9

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>gs接頭

<400>41

glyglyglyserglyglyglysercys

15