一種emsa方法及其探針和該探針的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，尤其設及一種EMSA方法及其探針和該探針的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 凝膠遷移或電泳遷移率檢測巧lectro曲oretic mobility shift assay,EMSA)是 研究啟動子結合蛋白的經(jīng)典方法，是一種用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用的技術。 EMSA基本過程是將畔或33P標記或非放射性標記的包含特異的DNA位點的DNA片段與DNA結 合蛋白共同解育后進行電泳分析，蛋白-DNA復合物通過EMSA與游離DNA分離開來，蛋白質(zhì)阻 礙與其所結合的DNA片段的移動性。因此，游離DNA比DNA-蛋白質(zhì)復合物移動的更快，凝膠的 圖像可W掲示游離和結合的標記的DNA的位置。EMSA不僅簡單、迅速、靈敏度高;且可W用競 爭性試驗來評價蛋白和核酸結合的特性。目前，EMSA可W用于檢測DNA結合蛋白、RNA結合蛋 白，并可通過加入特異性抗體來檢測特定的蛋白質(zhì)，EMSA還可W結合蛋白雙向電泳及質(zhì)譜 技術進行未知蛋白的鑒定分析。
[0003] 隨著EMSA技術的不斷完善，其在生命科學研究及醫(yī)學領域中扮演的角色愈加重 要。Jiang X等用EMSA方法證明了API能夠結合在啟動子的功能區(qū)域，并且調(diào)控LoVo細胞的 PPARdelta的表達（Jiang,X. ,et al. .Transcription factor API binds the functional region of the promoter and regulates gene expression of human PPARdelta in Lo Vo cell. Tumour Biol ,2013.6(:34) :p. 3619-3625) Jatanin 是參與微管切斷 ATP 酶家族 成員的蛋白質(zhì)，它的兩種異源二聚體結構由KATNAl和KATBl編碼，而Elkl能夠與微管相互作 用，Selcuk E等用EMSA方法證明Elkl能夠結合KATB1啟動子，調(diào)控其表達（Selcuk，E.， D.Canbaz and A.Et,Katanin-p80gene promoter characterization and regulation via Elkl. PLoS One ,2013.7(8):p. e69423)。凝膠阻滯電泳分析顯示青葛素激活PXR與 CYP3A4 DNA結合的能力，表明CYP3A4的誘導是由青葛素通過PXR的活化所介導化u，D.，et al..Artemisinin protects against dextran sulfate-sodium-induced inflammatory bowel disease,which is associated with activation of the pregnane X receptor.E；ur J Pharmacol,2014(738C):p.273-284)。
[0004] 現(xiàn)如今的研究中，EMSA探針主要是合成生物素標記的單鏈探針，再通過變性、復性 實驗得到的雙鏈探針。如Kim JR等運用生物公司合成的3'末端被生物素標記的正、反單鏈 EMSA探針，并在室溫下復性得到雙鏈探針化im,J. ,S.Mathew and P.Mathew,Blimp-1/ PRDMlregulates the transcription of human CSl(SLAMF7)gene in NK and B cells. Immunobiology,2015.221(1) :p.31-39)。又如Grycov自A等、Hsu FT等亦分別通過設 計合成包含轉(zhuǎn)錄因子結合位點的單鏈EMSA探針，之后通過低溫復性得到雙鏈探針，進而開 展填！膠遷移率實驗（Aneta,G. ,D.Aneta and D . Zdenek , Impurities contained in 曰ntifung曰1 drug ketocon曰zole 曰re potent 曰ctiv曰tors of hum曰n 曰ryl hydroc曰rbon receptor.TOXICOLOGY LETTERS,2015.239(2):p.67-72;Hsu,F.,B.Qiang and C.John, Synergistic Effect of Sorafenib and Radiation on Human Oral Carcinoma in vivo.SCIENTIFIC 贓PORTS,2015.5)。
[000引上述EMSA探針的合成方法具有3點較明顯的缺點：（1)通過復性得到的雙鏈探針的 比例難W保證，容易造成實驗結果的假陰性；（2)復性不徹底的單鏈探針的顯影亮度遠高于 蛋白-DNA復合物結合條帶的顯影亮度，造成假陰性，且雙鏈探針比例較低影響陽性結果的 顯影;（3)需要合成大量的單鏈探針，成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種EMSA探針，本發(fā)明的第二個目的是提 供該探針的制備方法，本發(fā)明的第Ξ個目的是提供使用該探針的EMSA方法。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0008] 一種EMSA探針，包含第一條鏈，所述第一條鏈包含轉(zhuǎn)錄因子結合序列和位于其5' 及3'端的接頭序列。
[0009] 優(yōu)選地，所述接頭序列為回文序列。
[0010] 優(yōu)選地，所述接頭序列的長度為8-15nt。
[0011] 優(yōu)選地，所述接頭序列的長度為12nt。
[0012] 優(yōu)選地，所述接頭序列經(jīng)生物素標記和LNA修飾。
[0013] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄因子結合序列含有簡并序列。
[0014] 更優(yōu)選地，所述接頭序列為GGGTCTAGACCC。
[0015] 更優(yōu)選地，所述接頭序列為GCATCATGATGC。
[0016] 更優(yōu)選地，所述接頭序列為GGGCTAGCCC。
[0017] 更優(yōu)選地，所述第一條鏈的序列為GGGTCTAGACCCGTGTC服KCTRGGGTCTAGACCC，其中 H=A/C/T，K=G/T，R=A/G。
[0018]更優(yōu)選地，所述第一條鏈的序列為 GCATCATGATGCAGTTGGAAATYCCTCCCAGGCGCATCATGATGCo
[0019] 更優(yōu)選地，所述第一條鏈的序列為 GGGCTAGCCCTCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTCGGGCTAGCCC。
[0020] 優(yōu)選地，所述EMSA探針包含與第一條鏈探針互補的第二條鏈。
[0021] 一種EMSA探針的制備方法，包含W下步驟：
[0022] 合成模板鏈和生物素標記且LNA修飾的引物，所述模板鏈包含轉(zhuǎn)錄因子結合序列 和位于其5'及3'端的接頭序列，所述接頭序列為回文序列，所述引物的核巧酸序列與接頭 序列的核巧酸序列相同；采用該引物W模板鏈為模板進行PCR擴增合成雙鏈EMSA探針。
[0023] 優(yōu)選地，所述PCR反應體系為：1μΜ模板鏈化L，10yM Biotin-LNA-Oligo化L，dNTP Mix 4]iL，DNA Polymerase 0.2扣L，10XPCR reaction buffer f5yL，d地2〇to 50μ1^;所述 PCR 反應條件為：94°C5min; 95°C10sec，55°C20sec，72°C8sec，35 循環(huán)；72°C10min。
[0024] 一種EMSA方法，使用上述EMSA探針進行EMSA。
[0025] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0026] (1)不采用傳統(tǒng)的兩條單鏈探針復性得到雙鏈探針的方法，而是由單鏈探針PCR制 得雙鏈探針，不會出現(xiàn)由于復性不徹底造成的假陰性，也克服了單鏈自由探針帶來的顯影 誤差；
[0027] (2)轉(zhuǎn)錄因子結合位點一般具有核巧酸序列多態(tài)性，傳統(tǒng)方法制備EMSA探針時需 要分開合成互補探針并分開退火，成本高，操作繁瑣;而本發(fā)明探針制備方法在保證堿基互 補配對的基礎上，通過設計合成簡并堿基模板可W制備多類型探針組，大大降低了探針的 制備成本，簡化了制備過程；
[0028] (3)與需要合成大量單鏈探針、每個單鏈探針都需要進行生物素標記的現(xiàn)有技術 相比，本發(fā)明僅需合成少量單鏈探針和生物素標記的引物，大大降低了成本，縮短了標記時 間，對于EMSA在生產(chǎn)、研發(fā)中的應用及臨床疾病檢測上的運用具有非常重要的意義。
【附圖說明】
[0029] 圖1為EMSA探針中第一條鏈的結構示意圖。
[0030] 圖2為實施例1的EMSA探針電泳圖。
[0031 ]圖3為實施例1的EMSA結果圖。
[0032] 圖4為對比例1的EMSA結果圖。
[0033] 圖5為實施例2的EMSA探針電泳圖。
[0034] 圖6為實施例2的EMSA結果圖。
[00巧]圖7為對比例2的EMSA結果圖。
[0036] 圖8為實施例3的EMSA探針電泳圖。
[0037] 圖9為實施例3的EMSA結果圖。
[003引圖10為對比例3的EMSA結果圖。
[0039] 其中，P1為蛋白-探針-抗體超遷移條帶，P2為蛋白-探針遷移條帶，P3為自由探針 (未結合蛋白的探針)條帶;Probe表示標記探針，NE表示目的轉(zhuǎn)綠因子的核蛋白，WT Probe 表示未標記探針，Mut Probe表示未標記的突變探針，Anti-TF表示目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗 體。
【具體實施方式】
[0040] 為了更好的說明本發(fā)明，下面結合附圖和具體實施例做進一步說明。本發(fā)明中所 用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領域所熟知的，在此不再寶述。
[0041] 本發(fā)明中模板鏈中的轉(zhuǎn)錄因子結合序列是參考轉(zhuǎn)錄因子結合序列數(shù)據(jù)庫 transcription factor binding site,TFBS)，包括TRANSFAC、JASPAR、町T)B、TR畑、TRED、 PAZAR、MAPPER等，區(qū)分物種特異性獲得目的轉(zhuǎn)錄因子結合序列。具