本發(fā)明涉及測(cè)量體內(nèi)血液特性的檢測(cè)方法，具體是促甲狀腺激素受體抗體的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)又稱(chēng)膜受體抗體，是直接作用于甲狀腺細(xì)胞膜上的TSH受體的抗體，屬免疫球蛋白IgG，根據(jù)其作用可分為以下3類(lèi):①甲狀腺刺激性抗體(TSAb)，又稱(chēng)甲狀腺刺激免疫球蛋白(TSI)，與甲狀腺濾泡膜上的TSH受體結(jié)合，刺激甲狀腺腫大，增強(qiáng)其功能活性，是導(dǎo)致Graves病的主要病因。②甲狀腺功能抑制性抗體(TFIAb):又稱(chēng)甲狀腺功能抑制性免疫球蛋白(TFII)，與TSH受體結(jié)合后，可抑制甲狀腺功能，引起甲低。③甲狀腺生長(zhǎng)刺激免疫球蛋白(TGI):可刺激甲狀腺腫大，但不影響其功能。(1)TRAb對(duì)Graves病的診斷、治療和預(yù)后的估計(jì)均具有重要的意義。Graves病患者TRAb陽(yáng)性率可達(dá)95％以上，故可作為Graves病的診斷依據(jù)。應(yīng)用抗甲狀腺藥物治療時(shí)，隨著病情的緩解，TRAb的活性可明顯下降，當(dāng)血中甲狀腺激素水平正常后，若TRAb逐漸下降，以至轉(zhuǎn)陰，則停藥后復(fù)發(fā)的可能性?。蝗糁委熀骉RAb持續(xù)陽(yáng)性，則說(shuō)明治療效果欠佳，停藥后復(fù)發(fā)的可能性大。(2)TRAb在甲減和自身免疫性甲狀腺炎患者也可出現(xiàn)陽(yáng)性，有助于以上疾病的病因?qū)W診斷。

抗甲狀腺受體抗體的檢測(cè)方法很多，包括放射免疫分析法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，羅氏公司開(kāi)發(fā)的電化學(xué)發(fā)光法等方法，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種免疫熒光法檢測(cè)促甲狀腺激素受體抗體的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決已知技術(shù)中促甲狀腺激素受體抗體的檢測(cè)方法存在漏檢的缺陷，而提供一種準(zhǔn)確性高，快速，簡(jiǎn)便的應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)促甲狀腺激素受體抗體的方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的試劑盒內(nèi)裝有檢測(cè)用的陰性對(duì)照血清，陽(yáng)性對(duì)照血清，濃縮磷酸緩沖液，封片劑，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗人球蛋白等試劑及生物薄片，生物薄片為取自大鼠甲狀腺細(xì)胞制成，包被在載片的反應(yīng)區(qū)內(nèi)；測(cè)定方法為：在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加待測(cè)血清，經(jīng)孵育、漂洗、甩干后，加入FITC標(biāo)記的羊抗人球蛋白，經(jīng)孵育、漂洗、甩干后，在熒光顯微鏡下，甲狀腺細(xì)胞膜上形成FITC標(biāo)記的羊抗人球蛋白熒光復(fù)合物，并產(chǎn)生黃綠色熒光，本發(fā)明方法在靈敏度、特異性等指標(biāo)均高于現(xiàn)有的方法。

發(fā)明內(nèi)容

一.盒體

本發(fā)明的試劑盒為六面體形狀，由盒蓋與盒底組成，特征在于盒底內(nèi)在靠近長(zhǎng)邊的任意一條邊設(shè)置有放置試劑瓶的瓶架；瓶架上設(shè)有多個(gè)放置試劑瓶的孔；盒底的中間設(shè)有一個(gè)將盒底分成放置試劑與放置生物載片兩部分的擋片，包括方形盒體(1)及與其一側(cè)邊彎折連體的盒蓋(2)，其特征在于：盒體(1)內(nèi)設(shè)置試劑架(3)，試劑架上有4個(gè)相同孔徑的插孔(4)，插孔內(nèi)放有FITC標(biāo)記的羊抗人球蛋白(9)，陰性對(duì)照血清(10)，陽(yáng)性對(duì)照血清(11)，封片劑(12)，盒底的中間設(shè)有一個(gè)將盒底分成放置緩沖液試劑(8)與放置生物薄片(5)兩部分的紙質(zhì)擋片(6)，生物載片(5)外面塑料包裝(7)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明試劑盒的示意圖；

圖2是本發(fā)明載片的示意圖。

1.盒體 2.盒蓋

3.試劑架 4.插孔

5.生物薄片 6.紙質(zhì)擋片

7.生物薄片塑料包裝 8.緩沖液

9.FITC標(biāo)記的羊抗人球蛋白 10.陰性對(duì)照血清

11.陽(yáng)性對(duì)照血清 12.封片劑

其中生物薄片(5)上5a、5b、5c為測(cè)試反應(yīng)區(qū)。

二.試劑盒配備的物品

本發(fā)明試劑盒的瓶架3上各放置有1瓶陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清、封片劑、FITC標(biāo)記的羊抗人球蛋白，盒底左部分放置有兩瓶50ml濃縮的磷酸鹽(含緩沖磷酸鹽10.2克)緩沖液，右部分放置有8張帶有包裝袋的生物薄片。

三、生物玻片的制作

本發(fā)明生物薄片5的材質(zhì)為聚苯乙烯，其尺寸與一般載片相似，其一面涂有聚賴(lài)氨酸涂層,載片上排列著3個(gè)方形的反應(yīng)區(qū)5a、5b、5c，反應(yīng)區(qū)在有涂層的一面向載片內(nèi)部凹陷，形成25μl容積的凹槽，每個(gè)反應(yīng)區(qū)的凹槽都包被有大鼠甲狀腺細(xì)胞冰凍切片，載片外部包有一層不透光的包裝袋，冰箱內(nèi)-15℃以下保存。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.本發(fā)明檢測(cè)方法取生物薄片放置室溫20min后，加入1：100PBS稀釋的待檢血清，20～37℃1～2h，0.01mol/L PBS洗2min 3次；滴加0.01mol/L PBS1:100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗人球蛋白，20～37℃1～2h，0.01mol/L PBS洗2min 4次；封片劑封片，熒光顯微鏡10ⅹ40倍視野下觀察；FITC在490～495nm激發(fā)，在520～530nm發(fā)射熒光，在甲狀腺細(xì)胞膜上如有黃綠色，則為陽(yáng)性。

2.電化學(xué)發(fā)光法

2.1儀器：Roche cobas e411電化學(xué)發(fā)光分析儀

2.2試劑促甲狀腺素受體抗體測(cè)定試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)德國(guó)羅氏診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為19045901，采用競(jìng)爭(zhēng)法原理，整個(gè)過(guò)程27分鐘完成。

2.3測(cè)定步驟：第一次孵育：50μL血清標(biāo)本和預(yù)處理緩沖液(PT1)以及預(yù)處理試劑緩沖液(PT2)一起孵育，PT1和PT2由可溶豬TSH受體(pTSHR)的免疫復(fù)合物前體物和生物素化抗豬TSH受體鼠單克隆抗體組成?；颊哐逯蠺RAb與TSH受體復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)。

第二次孵育：在孵育液中加入緩沖液，TRAb進(jìn)一步與TSH受體反應(yīng)。

第三次孵育：加入鏈霉親和素包被的微粒和釕復(fù)合物標(biāo)記的人甲狀腺刺激性單克隆抗體(M22)后，通過(guò)對(duì)被標(biāo)記的M22結(jié)合的抑制能力測(cè)定結(jié)合的TRAb。此完整的復(fù)合體在生物素和鏈親和素相互作用下形成固相。

將反應(yīng)液吸入檢測(cè)池中，檢測(cè)池中的微粒通過(guò)電磁作用吸附在電極表面。未結(jié)合的物質(zhì)通過(guò)Elecsys系統(tǒng)緩沖液除去。在電極上加以一定的電壓，使復(fù)合體化學(xué)發(fā)光，用光電倍增器檢測(cè)發(fā)光的強(qiáng)度。通過(guò)檢測(cè)儀的定標(biāo)曲線得到最后的檢測(cè)結(jié)果，定標(biāo)曲線是通過(guò)2定標(biāo)點(diǎn)和不同試劑濃度獲得的主曲線生成。

3.為了更好地理解本發(fā)明，下面通過(guò)用兩種檢測(cè)方法得出的結(jié)果來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明在檢測(cè)促甲狀腺素受體抗體方面的積極效果：

3.1研究對(duì)象2016年10月至2016年12月在我院甲狀腺患者101例,男性56例,女性45例,年齡40～60歲,平均48.5歲,病程4個(gè)月至5.7年,平均3.6年。

3.2促甲狀腺素受體抗體檢測(cè)方法：1.本發(fā)明檢測(cè)方法；2.電化學(xué)發(fā)光法。分別采用此兩種方法檢測(cè)101例甲狀腺患者促甲狀腺素受體抗體檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用兩種方法測(cè)定101例患者促甲狀腺素受體抗體。

表1兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較

表2兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較(％)

通過(guò)表1、表2可看本發(fā)明的測(cè)試方法在靈敏度,特異性,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，陰性預(yù)測(cè)值等指標(biāo)與電化學(xué)發(fā)光法比較各項(xiàng)指標(biāo)非常接近的，兩種方法測(cè)定結(jié)果陰陽(yáng)性符合率大于90％，因此，可以應(yīng)用本方法進(jìn)行甲狀腺素受體抗體檢測(cè)。