專利名稱：促甲狀腺素受體的抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促甲狀腺素受體(TSH受體或TSHR)的結(jié)合配偶體(例如單克隆或重組抗體)及其用途。
背景技術(shù)：
促甲狀腺素或促甲狀腺激素(TSH)是一種垂體激素，它在調(diào)節(jié)甲狀腺的功能中起關(guān)鍵作用。它的釋放被在下丘腦中形成的TRH激素(促甲狀腺素釋放激素)所刺激，且TSH控制重要的甲狀腺激素甲狀腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)的形成和釋放。基于反饋機(jī)制，血清中的甲狀腺激素含量控制TSH的釋放。T3與T4通過(guò)甲狀腺細(xì)胞的形成被TSH通過(guò)以下過(guò)程所刺激，在該過(guò)程中由垂體釋放的TSH結(jié)合到甲狀腺細(xì)胞膜的TSH受體上。
在突眼性甲狀腺腫(一種常見(jiàn)的自身免疫病)中，形成了TSH受體抗體(TRAb)，并且這些自身抗體以模擬TSH的作用方式結(jié)合到TSH受體上，從而刺激甲狀腺產(chǎn)生高水平的甲狀腺激素。這些自身抗體據(jù)稱具有刺激活性。在一些患者中，自身抗體與TSH受體結(jié)合但不刺激甲狀腺激素的產(chǎn)生，并被描述為具有阻斷活性(J Sanders，Y Oda，S-A Roberts，M Maruyama，J Furmaniak，B Rees Smith；“理解促甲狀腺素受體的結(jié)構(gòu)與功能間的相互關(guān)系(Understanding the thyrotrophin receptorfunction-structure relationship)”，Ballière’s Clinical Endocrinology andMetabolism；TF Davies編輯1997；11(3)451～479；Ballière Tindall出版，倫敦)。
TSH受體抗體的測(cè)定在對(duì)突眼性甲狀腺腫及其它甲狀腺病癥的診斷和控制中非常重要。目前使用三種類型的分析方法來(lái)測(cè)定TSH受體抗體
(a)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析，它測(cè)定TSH受體抗體抑制TSH結(jié)合于TSH受體制備物的能力；(b)生物分析，它測(cè)定TSH受體抗體刺激細(xì)胞在培養(yǎng)物中表達(dá)TSH受體的能力；和(c)TSH受體制備物與TSH受體抗體的免疫沉淀。
用這樣的分析方法測(cè)定TSH受體抗體在參考文獻(xiàn)中已有描述J Sanders，Y Oda，S-A Roberts，M Maruyama，J Furmaniak，B ReesSmith；“理解促甲狀腺素受體結(jié)構(gòu)與功能間的相互關(guān)系”，Ballière’sClinical Endocrinology and Metabolism；TF Davies編輯1997；11(3)451～479；Ballière Tindall出版，倫敦；J Sanders，Y Oda，S Roberts，A Kiddie，T Richards，J Bolton，VMcGrath，S Walters，D Jaskólski，J Furmaniak，B Rees Smith；TSH受體自身抗體與125I標(biāo)記的TSH受體間的相互作用(The interaction of TSHreceptor autoantibodies with125I-labelled TSH receptor)；Journal of ClinicalEndocrinology and Metabolism；1999；84(10)3797～3802。
多年以來(lái)一直認(rèn)為源自患者淋巴細(xì)胞的TSH受體的人單克隆抗體，對(duì)于理解突眼性甲狀腺腫的發(fā)病機(jī)理和發(fā)展新的測(cè)定TSH受體抗體的方法例如在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中替代TSH，將成為有價(jià)值的制劑。并且因?yàn)榛颊叩难錞SH受體抗體通常是有效的甲狀腺刺激物(TSH激動(dòng)劑)，所以當(dāng)包含TSH受體的組織(如甲狀腺組織或甲狀腺癌組織)需要刺激的時(shí)候，刺激人單克隆TSH受體抗體對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用將是有價(jià)值的。此外，由于一些患者的血清TSH受體抗體是有效的TSH拮抗物(阻斷抗體)，所以當(dāng)包含TSH受體的組織(如甲狀腺組織或甲狀腺癌組織)的活性需要失活或要使其對(duì)TSH、TSH受體抗體或其它刺激物無(wú)應(yīng)答性的時(shí)候，作為TSH拮抗物的人單克隆TSH受體抗體對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用將是有價(jià)值的。
也認(rèn)為在這樣的體外和/或體內(nèi)應(yīng)用中，人單克隆TSH受體抗體相對(duì)于TSH的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)將是抗體可被相對(duì)容易地操縱。例如，可對(duì)單克隆抗體的TSH受體結(jié)合區(qū)進(jìn)行操縱來(lái)改變它們的特性，例如親和力和生物學(xué)特性，包括它們的TSH激動(dòng)劑或拮抗物活性程度。此外，單克隆抗體較TSH在體內(nèi)的半衰期將長(zhǎng)得多，這可以在某些體內(nèi)應(yīng)用中具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。此外，抗體的半衰期可以容易地被操縱，例如抗體Fab片段的半衰期較完整IgG的半衰期短得多。這些TSH受體抗體的一般特性在出版物中被描述，如B Rees Smith，SM Mclachlan，J Furmaniak，“促甲狀腺素受體的自身抗體(Autoantibodies to the thyrotropin receptor)”，Endocrine Reviews 1988，9106～121；B Rees Smith，KJ Dorrington，DSMunro，“長(zhǎng)效甲狀腺刺激物γG-球蛋白亞基的甲狀腺刺激特性(Thethyroid stimulating properties of long-acting thyroid stimulator γG-globulinsubunits)”，Biochimica et Biophysica Acta 1969，192277～285；KJDorrington，DS Munro，“長(zhǎng)效甲狀腺刺激物(The long acting thyroidstimulator)”；Clinical Pharmacology and Therapeutics 1966，7788～806。
人單克隆TSH受體抗體更進(jìn)一步的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是它們?cè)阼b定或提供新型的TSH受體抗體結(jié)合位點(diǎn)方面的用途。例如，通過(guò)產(chǎn)生針對(duì)結(jié)合TSH受體的人單克隆TSH受體抗體區(qū)的抗體。以這種方式產(chǎn)生的一些抗獨(dú)特型抗體有可能作為新的配體用于TSH受體抗體、TSH和相關(guān)化合物的分析。此外它們可能是體內(nèi)調(diào)節(jié)TSH受體抗體、TSH和相關(guān)化合物的作用的有效試劑。
用單克隆抗體來(lái)鑒定和提供新型的抗體結(jié)合位點(diǎn)的其它方法是熟知的。例如如下述文獻(xiàn)所描述的那樣，通過(guò)噬菌體展示的隨機(jī)肽文庫(kù)的抗體篩選的方法JC Scott與GP Smith“用表位文庫(kù)尋找多肽配體(Searchingfor peptide ligands with an epitope library)”，Science，1990，249(4967)386～390和MA Myers、JM Davies、JC Tong、J Whisstock、M Scealy、IR MacKay、MJ Rowley，“通過(guò)多肽噬菌體展示和分子模建來(lái)鑒定的糖尿病自身抗原GAD65上的構(gòu)象性表位(Conformational epitopes on thediabetes autoantigen GAD65identified by peptide phage display andmolecular modelling)”，免疫學(xué)雜志(Journal of Immunology)，2000，1653830～3838。也可進(jìn)行非肽化合物和非肽化合物文庫(kù)的抗體篩選。
用這些程序鑒定和提供的新型TSH受體抗體結(jié)合位點(diǎn)也可在TSH受體抗體、TSH及相關(guān)化合物的分析中，作為新的配體發(fā)揮作用。此外，它們可以是體內(nèi)調(diào)節(jié)TSH受體抗體、TSH及相關(guān)化合物的作用的有效試劑。
考慮到人單克隆TSH受體抗體的潛在價(jià)值，多年來(lái)已付出大量努力來(lái)產(chǎn)生這樣的抗體(參見(jiàn)，例如B Rees Smith，SM McLachlan，J Furmaniak，“促甲狀腺素受體的自身抗體”，Endocrine Reviews 1988，9106～121)。然而到目前為止，這些努力都是不成功的(參見(jiàn)，例如SM McLachlan，BRapoport，“TSH受體的人單克隆自身抗體—我們尋找的目標(biāo)及為何我們要尋找它(Monoclonal，human autoantibodies to the TSH receptor-TheHoly Grail and why are we looking for it)”，臨床內(nèi)分泌學(xué)與代謝雜志(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism)，1996，813152～3154和JHW van der Heijden，TWA de Bruin，KAFM Gludemans，J de Kruif，JP Banga，T Logtenberg，“半合成文庫(kù)方法用于獲得突眼性甲狀腺腫的促甲狀腺素受體的人單克隆自身抗體的局限性”(Limitations of thesemisynthetic library approach for obtaining human monoclonalautoantibodies to the thyrotropin receptor of graves’disease)，臨床與試驗(yàn)免疫學(xué)(Clinical and Experimental Immunology)，1999，118205～212)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供TSH受體的結(jié)合配偶體，它能夠以與TSH受體自身抗體與TSH受體間的相互作用相當(dāng)?shù)姆绞脚cTSH受體發(fā)生相互作用，特別是本發(fā)明的目的是提供TSH受體的人單克隆抗體，它們之間所顯示出的相互作用可以與存在于甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)性突眼性甲狀腺腫患者血清中的所見(jiàn)到的TSH受體抗體與TSH受體的相互作用相比擬；以及還提供了其重組體制備物。本文描述的發(fā)明中已克服了生產(chǎn)人單克隆TSH受體抗體的相當(dāng)大的困難。尤其是描述了具有在甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)性突眼性甲狀腺腫患者血清中所發(fā)現(xiàn)的自身抗體的特性的人單克隆TSH受體抗體的成功生產(chǎn)。我們已生產(chǎn)的人TSH受體單克隆抗體(本文稱為hMAb TSHR 1)以高親和力結(jié)合到TSH受體上，通過(guò)這樣的方式以致于少量的抗體抑制標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSH受體上，且少量可充當(dāng)有效的甲狀腺刺激物。抗體的Fab片段與重組體Fab制備物如同完整IgG一樣，是類似的有效的甲狀腺刺激物及標(biāo)記的TSH結(jié)合的抑制劑。單克隆Fab和/或完整IgG可以用125I或生物素標(biāo)記，并顯示其結(jié)合到TSH受體上。這樣的結(jié)合被患者血清中的TSH受體自身抗體所抑制。
因此，本發(fā)明提供了一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
特別地，本發(fā)明提供了一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自人單克隆抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
特別地，本發(fā)明提供了一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自人重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
特別地，本發(fā)明提供了一種人單克隆抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
特別地，本發(fā)明提供了一種人重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。特別是本發(fā)明提供了與TSH受體反應(yīng)的人重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。
根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體，尤其是根據(jù)本發(fā)明的與TSH受體反應(yīng)的人單克隆或重組抗體，可以通過(guò)其抑制TSH結(jié)合到TSH受體上的能力和/或其刺激TSH受體的能力而被進(jìn)一步地表征，已顯示兩者分別與得自突眼性甲狀腺腫患者血清中所存在的TSH受體自身抗體的抑制和刺激特性相當(dāng)。
更特別地，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體，尤其是根據(jù)本發(fā)明的人單克隆或重組抗體，可以通過(guò)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性來(lái)表征，所述抑制活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672的約120個(gè)單位/mg，或該單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。
更特別地，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體，尤其是根據(jù)本發(fā)明的人單克隆或重組抗體，可以進(jìn)一步通過(guò)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性而進(jìn)行表征，所述刺激活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg，或這樣的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體，尤其是根據(jù)本發(fā)明的人單克隆或重組抗體，可以通過(guò)以下來(lái)表征(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672約的30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg；或該單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。
在根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體包含或源自與TSH受體反應(yīng)的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，尤其是在例如與TSH受體反應(yīng)的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)Fab片段的情況下，優(yōu)選這樣的結(jié)合配偶體可以用對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性來(lái)表征，所述抑制活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg。
在根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體包含或源自與TSH受體反應(yīng)的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，尤其是在例如與TSH受體反應(yīng)的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)Fab片段的情況下，還優(yōu)選該結(jié)合配偶體可以用對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性來(lái)表征，所述刺激活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約50個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約100個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672的約200個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約400個(gè)單位/mg。
在根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體包含或源自與TSH受體反應(yīng)的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，尤其是在例如與TSH受體反應(yīng)的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)Fab片段的情況下，仍優(yōu)選采用以下方式來(lái)表征該結(jié)合配偶體(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約50個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約100個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約200個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約400個(gè)單位/mg。
在一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供了一種TSH受體的結(jié)合配偶體(典型的是人單克隆抗體)，該結(jié)合配偶體優(yōu)選能與TSH受體相結(jié)合從而刺激TSH受體，且它包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)選自如SEQ ID NO.1所示的VH區(qū)(重鏈可變區(qū))，和包含一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
因此，在本發(fā)明的第一實(shí)施方案中，提供了一種TSH受體的結(jié)合配偶體(典型的是人單克隆抗體)，該結(jié)合配偶體優(yōu)選能與TSH受體相結(jié)合從而刺激TSH受體，且它包含如SEQ ID NO.1所示的抗體VH區(qū)。
因此，在本發(fā)明的第二實(shí)施方案中，提供了一種TSH受體的結(jié)合配偶體(典型的是人單克隆抗體)，該結(jié)合配偶體優(yōu)選能與TSH受體相結(jié)合從而刺激TSH受體，且它包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR，該VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
可以理解根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體可以基本上如前所述那樣包含抗體VH區(qū)，而不包含抗體VL區(qū)(輕鏈可變區(qū))。已知單免疫球蛋白區(qū)，尤其是VH區(qū)，能以特殊的方式結(jié)合靶抗原?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體可以包含與抗體VL區(qū)配對(duì)的抗體VH區(qū)，以使用現(xiàn)有技術(shù)中熟知的的技術(shù)(Biochim.Biophys.Acta，192(1969)277～285；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，第10026～10030頁(yè)，1992年11月)來(lái)提供抗體結(jié)合位點(diǎn)，該抗體結(jié)合位點(diǎn)包含針對(duì)TSH受體的VH和VL區(qū)。
然而在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，提供了一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體優(yōu)選能與TSH受體相結(jié)合從而刺激TSH受體，并且它包含抗體VH區(qū)，選自由以下組成的組如SEQ ID NO.1所示的VH區(qū)和含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；和/或抗體VL區(qū)，選自由以下組成的組如SEQ ID NO.6所示的VL區(qū)和含有一個(gè)或多個(gè)VLCDR的VL區(qū)，所述VLCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選基本上如前所述的結(jié)合配偶體包含與基本上如前所述的抗體VL區(qū)配對(duì)的基本上如前所述的抗體VH區(qū)，來(lái)提供同時(shí)含有針對(duì)TSH受體的VH和VL區(qū)的抗體結(jié)合位點(diǎn)，盡管當(dāng)進(jìn)一步討論時(shí)，抗體VH區(qū)或抗體VL區(qū)可能是獨(dú)立地用于結(jié)合TSH受體。因此，可以理解，基本上如前所述的結(jié)合配偶體可包含基本上如前所述的抗體VH區(qū)而不包含抗體VL區(qū)。因此，還可理解，基本上如前所述的結(jié)合配偶體可包含基本上如前所述的抗體VL區(qū)而不包含抗體VH區(qū)。可選地，基本上如前所述的結(jié)合配偶體可以包含與基本上如前所述的抗體VL區(qū)配對(duì)的抗體VH區(qū)，來(lái)提供同時(shí)含有針對(duì)TSH受體的VH和VL區(qū)的抗體結(jié)合位點(diǎn)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案可包括基本上如前所述的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含如SEQ ID NO.1所示的抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)與SEQ ID NO.6所示的VL區(qū)配對(duì)，來(lái)提供同時(shí)包含針對(duì)TSH受體的VH和VL區(qū)的抗體結(jié)合位點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)想，基本上如前所述的VH區(qū)可以與除文中特別提到的VL區(qū)以外的VL區(qū)配對(duì)。也可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步地設(shè)想，基本上如前所述的VL區(qū)可以與除文中特別提到的VH區(qū)以外的VH區(qū)配對(duì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了TSH受體的基本上如前所述的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體能結(jié)合到TSH受體上從而刺激TSH受體，且它可包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)包含含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；和/或抗體VL區(qū)，該抗體VL區(qū)包含含有一個(gè)或多個(gè)VLCDR的VL區(qū)，該VLCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
上述的一個(gè)或多個(gè)CDR可獲自前述的VH和VL區(qū)并可被插入到合適的閱讀框內(nèi)。例如，基本上如前所述的一個(gè)或多個(gè)CDR的氨基酸序列可以被插入到與文中特別揭示的hMAb TSHR 1不同的抗體的閱讀框區(qū)域內(nèi)，這些抗體因此插入了一個(gè)或多個(gè)CDR并能結(jié)合到TSH受體上，優(yōu)選基本上如前所述來(lái)刺激TSH受體。可選地，本發(fā)明可以提供能與TSH受體結(jié)合的多肽，從而基本上如前所述來(lái)刺激TSH受體；并且所述多肽包含文中特別揭示的一個(gè)或多個(gè)CDR所表示的氨基酸以及任選地連同另外的氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象，這些另外的氨基酸可以加強(qiáng)文中所述的一個(gè)或多個(gè)CDR對(duì)TSH受體的結(jié)合親和力或可以基本上不影響多肽對(duì)TSH受體的結(jié)合特性。
本發(fā)明還包括文中所述的特異性人單克隆抗體、VH區(qū)、CDR和文中所揭示的多肽的變異體、類似物、衍生物和片段，該變異體，類似物、衍生物和片段基本上如前所述保留了與TSH受體發(fā)生相互作用的能力(例如刺激TSH受體)。
文中所用術(shù)語(yǔ)“變異體”、“類似物”、“衍生物”和“片段”可以被表征為抗體、抗體片段或多肽，它們基本上保留了與具有如SEQ ID NO.1所示的VH區(qū)和如SEQ ID NO.6所示的VL區(qū)的人單克隆抗體相同的生活學(xué)功能和活性，尤其是其對(duì)于TSH受體的結(jié)合特性。適宜地，文中所述的變異體、類似物、衍生物和片段，及所述片段的變異體、類似物和衍生物具有氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象，其中具有如SEQ ID NO.1所示的VH區(qū)和如SEQ ID NO.6所示的VL區(qū)的人單克隆抗體的許多或幾個(gè)氨基酸殘基(例如5～10、1～5或1～3)被取代，缺失或添加，或它們的任意組合。在這些中優(yōu)選沉默取代、添加和缺失，它們不改變或者基本上不改變具有如SEQ ID NO.1所示的VH區(qū)和如SEQ ID NO.6所示的VL區(qū)的人單克隆抗體的生物學(xué)活性或功能?？蓛?yōu)選保守性取代，這在下文中有更詳細(xì)的介紹。
更為特別地，根據(jù)本發(fā)明的具有如SEQ ID NO.1所示的VH區(qū)和如SEQ ID NO.6所示的VL區(qū)的人單克隆抗體的變異體、類似物、衍生物可以是那些其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)所取代的變異體、類似物、衍生物，或那些其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基或其類似物的變異體、類似物、衍生物。這樣的變異體、類似物，衍生物據(jù)認(rèn)為是在本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本文的教導(dǎo)所能獲知的范圍內(nèi)。
最典型地，變異體、類似物、衍生物是通過(guò)保守氨基酸取代而不同于具有如SEQ ID NO.1所示的VH區(qū)和如SEQ ID NO.6所示的VL區(qū)的基準(zhǔn)人單克隆抗體的變異體、類似物、衍生物。這樣的取代是用另外的具有類似特性的氨基酸取代給定的氨基酸。在以下氨基酸中進(jìn)行相互的替換被視為典型的保守取代在脂肪族氨基酸A(丙氨酸)、V(纈氨酸)、L(亮氨酸)和I(異亮氨酸)中；在羥基殘基S(絲氨酸)和T(蘇氨酸)中；在酸性殘基D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)中；在酰胺殘基N(天冬酰胺)和Q(谷氨酰胺)中；在堿性殘基K(賴氨酸)和R(精氨酸)中；及在芳香族殘基F(苯丙氨酸)和Y(酪氨酸)中。
應(yīng)意識(shí)到，文中所用術(shù)語(yǔ)“片段”尤其涉及文中特別所述的抗體片段，并形成本發(fā)明的一個(gè)重要方面。這樣，如本發(fā)明所提供的人單克隆或重組抗體可以作為以下任意片段而被提供(i)由VL、VH、CL和CH1區(qū)組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1區(qū)組成的Fd片段；(iii)由VL和VH區(qū)組成的Fv片段；(iv)由VH區(qū)組成的dAb(域抗體)片段；(v)獨(dú)立的CDR區(qū)；(vi)F(ab′)2片段，其為含有兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；和(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH區(qū)和VL區(qū)通過(guò)連接肽連接起來(lái)，這使得這兩個(gè)區(qū)聯(lián)合起來(lái)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。
可選地，根據(jù)本發(fā)明的人單克隆或重組抗體可以包含完整的IgG抗體，由此抗體包括可變區(qū)和恒定區(qū)。
本發(fā)明還提供了能與TSH受體結(jié)合的另外的結(jié)合配偶體，它能與TSH受體的基本上如上所述的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆抗體)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，所述另外的結(jié)合配偶體不包含TSH。優(yōu)選地，該另外的結(jié)合配偶體可以包含另外的具有針對(duì)TSH受體表位區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)的抗體，且它能與基本上如上所述的TSH受體的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆抗體)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上。合適的所述另外的結(jié)合配偶體可以包含鼠單克隆抗體，優(yōu)選它可基本上由實(shí)施例中所述的技術(shù)生產(chǎn)出來(lái)，所述技術(shù)通過(guò)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)用TSH受體對(duì)鼠進(jìn)行免疫。
本發(fā)明還可以提供能結(jié)合到TSH受體上的另外的結(jié)合配偶體，它可以包含或源自與TSH受體反應(yīng)的人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段。尤其是，該另外的結(jié)合配偶體可以包含另外的具有針對(duì)TSH受體表位區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)的抗體，該另外的抗體能與TSH受體相結(jié)合，且它可與TSH受體的基本上如上所述的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆抗體)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上。合適的所述另外的結(jié)合配偶體可以通過(guò)合適的誘變技術(shù)，如點(diǎn)突變或類似技術(shù)，源自如文中所述的特異性結(jié)合配偶體hMAb TSHR 1，來(lái)獲得TSH受體的另外的結(jié)合配偶體，它可以與如上所述的結(jié)合配偶體(例如hMAb TSHR 1)競(jìng)爭(zhēng)性地與TSH受體相互作用。
優(yōu)選地，TSH受體的另外的結(jié)合配偶體可以包含單克隆或重組抗體，且能用對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性來(lái)表征，所述抑制活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg，或抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。還優(yōu)選本發(fā)明的另外的結(jié)合配偶體，也可以通過(guò)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性來(lái)表征，所述刺激活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672的約240個(gè)單位/mg，或抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。
更優(yōu)選本發(fā)明的所述的另外的結(jié)合配偶體可以通過(guò)以下來(lái)表征(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約60個(gè)單位/mg，更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg，或更優(yōu)選至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg；或其一個(gè)或多個(gè)片段。
提供根據(jù)本發(fā)明的另外的結(jié)合配偶體的優(yōu)選的鼠單克隆抗體包含在實(shí)施例進(jìn)一步制備的9D33，9D33具有如圖9～12和序列19～38所示的氨基酸和多核苷酸序列。因此根據(jù)本發(fā)明，提供了TSH受體的另外的結(jié)合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)，它包含如SEQ ID NO.19所示的抗體VH區(qū)。
本發(fā)明所提供的另外的結(jié)合配偶體也可以被表征為包含抗體VH區(qū)，所述抗體VH區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22。
應(yīng)意識(shí)到，根據(jù)本發(fā)明的另外的結(jié)合配偶體可以包含基本上如前所述的抗體VH區(qū)而不含有抗體VL區(qū)。已知單免疫球蛋白區(qū)，尤其是VH區(qū)，能以特殊的方式結(jié)合靶抗原?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明的另外的結(jié)合配偶體采用現(xiàn)有技術(shù)中公知的技術(shù)(Biochim.Biophys.Acta，192(1969)277～285；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，10026～10030，1992年11月)可以包含與抗體VL區(qū)配對(duì)的抗體VH區(qū)，來(lái)提供同時(shí)包含針對(duì)TSH受體的VH和VL區(qū)的抗體結(jié)合位點(diǎn)。
然而在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，還提供了TSH受體的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)選自由以下組成的組如SEQ ID NO.19所示的VH區(qū)和含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21或SEQ ID NO.22；和/或抗體VL區(qū)，該抗體VL區(qū)選自由以下組成的組如SEQ ID NO.24所示的VL區(qū)和含有一個(gè)或多個(gè)VLCDR的VL區(qū)，所述VLCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.26或SEQ ID NO.27。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選基本上如前所述的另外的結(jié)合配偶體包含與基本上如前所述的抗體VL區(qū)配對(duì)的基本上如前所述的抗體VH區(qū)，來(lái)提供同時(shí)含有針對(duì)TSH受體的VH和VL區(qū)的抗體結(jié)合位點(diǎn)，盡管如進(jìn)一步討論的那樣，抗體VH區(qū)或抗體VL區(qū)，可以獨(dú)立地用于結(jié)合TSH受體。因此，應(yīng)意識(shí)到，基本上如前所述的另外的結(jié)合配偶體可以包含基本上如前所述的抗體VH區(qū)而不包含抗體VL區(qū)。因此，還應(yīng)意識(shí)到，基本上如前所述的另外的結(jié)合配偶體可以包含基本上如前所述的抗體VL區(qū)而不包含抗體VH區(qū)?？蛇x地，基本上如前所述的另外的結(jié)合配偶體可以包含與基本上如上所述的抗體VL區(qū)配對(duì)的抗體VH區(qū)，來(lái)提供同時(shí)含有針對(duì)TSH受體的VH和VL區(qū)的抗體結(jié)合位點(diǎn)。
因此根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案可以包括基本上如前所述的另外的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含與SEQ ID NO.24所示的抗體VL區(qū)配對(duì)的如SEQ ID NO.19所示的抗體VH區(qū)，來(lái)提供同時(shí)包含針對(duì)TSH受體的VH和VL區(qū)的抗體結(jié)合位點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)想，基本上如前所述的VH區(qū)可以與除文中特別提到的VL區(qū)以外的VL區(qū)配對(duì)。也可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步地設(shè)想，基本上如前所述的VL區(qū)可以與除文中特別提到的VH區(qū)以外的VH區(qū)配對(duì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了TSH受體的基本上如前所述的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體能結(jié)合到TSH受體上從而抑制對(duì)TSH受體的刺激，且它可包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)包含含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；和/或抗體VL區(qū)，該抗體VL區(qū)包含
含有一個(gè)或多個(gè)VLCDR的VL區(qū)，所述VLCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27。
上述的一個(gè)或多個(gè)CDR可獲自前述的VH和VL區(qū)并被插入到合適的閱讀框內(nèi)。例如，基本上如前所述的一個(gè)或多個(gè)CDR的氨基酸序列可以被插入到與文中特別揭示的9D33不同的抗體的閱讀框區(qū)域內(nèi)，這些抗體因此插入了一個(gè)或多個(gè)CDR并能結(jié)合到TSH受體上?？蛇x地，本發(fā)明可以提供能與TSH受體結(jié)合的多肽，其包含如本發(fā)明特別揭示的一個(gè)或多個(gè)CDR所表示的氨基酸以及任選地連同另外的氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象，所述另外的氨基酸可以加強(qiáng)文中所述的一個(gè)或多個(gè)CDR對(duì)TSH受體的結(jié)合親和力或可以基本不影響多肽對(duì)TSH受體的結(jié)合特性。
應(yīng)意識(shí)到，此處所用術(shù)語(yǔ)“片段”尤其涉及文中特別所述的抗體的片段，并形成本發(fā)明的一個(gè)重要方面。這樣，根據(jù)本發(fā)明的另外的結(jié)合配偶體可以作為以下任意片段來(lái)提供(i)由VL、VH、CL和CH1區(qū)組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1區(qū)組成的Fd片段；(iii)由VL和VH區(qū)組成的Fv片段；(iv)由VH區(qū)組成的dAb片段；(v)獨(dú)立的CDR區(qū)；(vi)F(ab′)2片段，其為含有兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；和(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH區(qū)和VL區(qū)通過(guò)連接肽連接起來(lái)，這使得這兩個(gè)區(qū)聯(lián)合起來(lái)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。
可選地，根據(jù)本發(fā)明的鼠單克隆或重組抗體，例如9D33，可以包含整個(gè)IgG抗體，由此抗體包括可變區(qū)和恒定區(qū)。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，該多核苷酸包含(i)如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQID NO.9所示的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列；(ii)編碼TSH受體的基本上如前所述的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆抗體)，或編碼TSH受體的基本上如前所述的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆抗體)的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列；
(iii)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼序列與(i)中任意序列不同的核苷酸序列；(iv)包含(i)中任意序列的等位突變的核苷酸序列；(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中任意序列的片段并編碼基本上如前所述的人單克隆抗體的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、獨(dú)立的CDR區(qū)、F(ab′)2片段或scFv片段的核苷酸序列；(vi)由于核苷酸堿基的突變、缺失或取代而不同于(i)中任意序列并編碼TSH受體的基本上如前所述的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆抗體)，或編碼TSH受體的基本上如前所述的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆抗體)的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，該多核苷酸包含(i)如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列；(ii)編碼基本上如前所述的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)，或編碼基本上如前所述的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列；(iii)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼序列不同于(i)中任意序列的核苷酸序列；(iv)包含(i)中任意序列的等位突變的核苷酸序列；(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中任意序列的片段并編碼基本上如前所述的鼠單克隆抗體的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、獨(dú)立的CDR區(qū)、F(ab′)2片段或scFv片段的核苷酸序列；(vi)由于核苷酸堿基的突變、缺失或取代而與(i)中任意序列不同并編碼TSH受體的基本上如前所述的另外的結(jié)合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)，或編碼TSH受體的基本上如前所述的另外的結(jié)合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的變異體多核苷酸，在其全長(zhǎng)內(nèi)與相應(yīng)的(i)中任意多核苷酸序列適合有至少70％的同一性，最優(yōu)選的是在其全長(zhǎng)內(nèi)包含與(i)中任意多核苷酸序列具有至少80％同一性的區(qū)域的多核苷酸，尤其優(yōu)選的是在其全長(zhǎng)內(nèi)與(i)中任意多核苷酸序列有至少90％同一性的多核苷酸，在這些特別優(yōu)選的多核苷酸中，格外優(yōu)選那些具有至少95％同一性的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了具有生物學(xué)功能的載體系統(tǒng)，它攜帶有基本上如前所述的多核苷酸，且它能將多核苷酸引入宿主微生物的基因組中。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，及通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體。宿主細(xì)胞可進(jìn)行遺傳工程改造而插入多核苷酸并表達(dá)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體。
hMAb TSHR 1的氨基酸序列，hMAb TSHR 1為本發(fā)明的人單克隆抗體；及編碼hMAb TSHR 1的氨基酸序列的核苷酸序列；9D33的氨基酸序列，9D33為鼠單克隆抗體，它代表本發(fā)明的另外的結(jié)合配偶體；及編碼9D33的氨基酸序列的核苷酸序列；均顯示于下述的序列表中并可按以下分配。
序列描述和


對(duì)于hMAb TSHR 1氨基酸序列SEQ ID NO.1 VHSEQ ID NO.2 VHCDRISEQ ID NO.3 VHCDRIISEQ ID NO.4 VHCDRIIISEQ ID NO.5 重鏈可變區(qū)和相鄰恒定區(qū)SEQ ID NO.6 VLSEQ ID NO.7 VLCDRI
SEQ ID NO.8VLCDRIISEQ ID NO.9VLCDRIII核苷酸序列SEQ ID NO.10 VHSEQ ID NO.11 VHCDRISEQ ID NO.12 VHCDRIISEQ ID NO.13 VHCDRIIISEQ ID NO.14 重鏈可變區(qū)和相鄰恒定區(qū)SEQ ID NO.15 VLSEQ ID NO.16 VLCDRISEQ ID NO.17 VLCDRIISEQ ID NO.18 VLCDRIII對(duì)于9D33氨基酸序列SEQ ID NO.19 VHSEQ ID NO.20 VHCDRISEQ ID NO.21 VHCDRIISEQ ID NO.22 VHCDRIIISEQ ID NO.23 重鏈可變區(qū)和相鄰恒定區(qū)SEQ ID NO.24 VLSEQ ID NO.25 VLCDRISEQ ID NO.26 VLCDRIISEQ ID NO.27 VLCDRIIISEQ ID NO.28 輕鏈可變區(qū)和相鄰恒定區(qū)核苷酸序列SEQ ID NO.29 VHSEQ ID NO.30 VHCDRISEQ ID NO.31 VHCDRIISEQ ID NO.32 VHCDRIII
SEQ ID NO.33 重鏈可變區(qū)和相鄰恒定區(qū)SEQ ID NO.34 VLSEQ ID NO.35 VLCDRISEQ ID NO.36 VLCDRIISEQ ID NO.37 VLCDRIIISEQ ID NO.38 輕鏈可變區(qū)和相鄰恒定區(qū)圖1顯示了hMAb TSHR1 IgG和Fab對(duì)標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSHR包被的試管上的抑制；對(duì)照IgG為GAD65的人單克隆自身抗體；圖2顯示hMAb TSHR1 IgG和Fab、豬TSH(70個(gè)單位/mg；pTSH)、重組人TSH(6.7個(gè)單位/mg；hTSH)和對(duì)照單克隆抗體((MAb甲狀腺過(guò)氧化物酶的人單克隆自身抗體(2G4))的甲狀腺刺激活性；基底＝只在不含NaCl的Hanks緩沖鹽溶液存在下產(chǎn)生的cAMP；圖3顯示淋巴細(xì)胞供體血清對(duì)TSH結(jié)合到TSHR上的抑制的影響和對(duì)TSHR轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的環(huán)腺苷酸的刺激的影響。在結(jié)合抑制測(cè)定中，將血清在健康獻(xiàn)血者血清池中稀釋；對(duì)于刺激測(cè)定，將血清在不含NaCl的Hanks緩沖鹽溶液中稀釋；健康獻(xiàn)血者血清(n＝3)給出的應(yīng)答范圍為1.1×基底～1.3×基底；圖3a表示對(duì)根據(jù)本發(fā)明的TSHR自身抗體的ELISA與以前的測(cè)定進(jìn)行比較；尤其是基于TSH-生物素的ELISA，如J Bolton、J Sanders、YOda、C Chapman、R Konno、J Furmaniak、B Rees Smith所述，“通過(guò)ELISA測(cè)定甲狀腺刺激激素受體自身抗體”，臨床化學(xué)，1999，第45卷，第2285～2287頁(yè)；和原始RIA，如K Southgate、FM Creagh、M Teece、C Kingswood、B Rees Smith所述“用于測(cè)定未提取的血清中的TSH受體抗體的受體測(cè)定(A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies inunextracted serum)”，1984，臨床內(nèi)分泌學(xué)(Clinical Endocrinology)，第20卷，第539～543頁(yè)；圖3b表示對(duì)根據(jù)本發(fā)明的TSHR自身抗體的ELISA與基于TSH-生物素的ELISA進(jìn)行比較，所述基于TSH-生物素的ELISA如J Bolton、JSanders、Y Oda、C Chapman、R Konno、J Furmaniak、B Rees Smith所述，“通過(guò)ELISA測(cè)定甲狀腺刺激激素受體自身抗體”，臨床化學(xué)，1999，第45卷，第2285～2287頁(yè)；比較了來(lái)自72位突眼性甲狀腺腫患者的血清；y＝1.1154×-13.032，r＝0.99；參考圖4、5、6和7，也可以看出上述hMAb TSHR1的序列，其中圖4顯示了hMAb TSHR1重鏈的核苷酸序列，以及相鄰的恒定區(qū)，其中圖4a給出了核苷酸序列本身；圖4b給出了標(biāo)注了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定區(qū)的核苷酸序列；圖5顯示了hMAb TSHR1重鏈的氨基酸序列，以及相鄰的恒定區(qū)，其中圖5a給出了氨基酸序列本身；圖5b給出了標(biāo)注了CDRI、CDRII、CDRIII和恒定區(qū)的氨基酸序列；圖6顯示了hMAb TSHR1輕鏈的核苷酸序列，其中圖6a顯示了核苷酸序列本身；圖6b給出了標(biāo)注了PCR引物、CDRI、CDRII和CDRIII區(qū)的核苷酸序列；圖7顯示了hMAb TSHR1輕鏈的氨基酸序列，其中圖7a給出了氨基酸序列本身；圖7b給出了標(biāo)注了CDRI、CDRII、CDRIII區(qū)的氨基酸序列。
從以上可以意識(shí)到，對(duì)于hMAb TSHR1的VH鏈，如圖4b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區(qū)的核苷酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO.11、12和13所示的VHCDRI、VHCDRII和VHCDRIII序列；如圖5b所示的CDRI，CDRII和CDRIII區(qū)的氨基酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO.2、3和4所示的VHCDRI，VHCDRII和VHCDRIII序列。從以上還可以意識(shí)到，對(duì)于hMAb TSHR1的VL鏈，如圖6b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區(qū)的核苷酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO.16、17和18所示的VLCDRI、VLCDRII和VLCDRIII序列；如圖7b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區(qū)的氨基酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO.7、8和9所示的VLCDRI、VLCDRII和VLCDRIII序列。
分析hMAb TSHR1 Fab的晶體結(jié)構(gòu)(通過(guò)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定)使得用簡(jiǎn)并的PCR引物測(cè)定的HC和LC核苷酸序列能夠被改進(jìn)。具體地，鑒定了核苷酸115～120的HC測(cè)序人工產(chǎn)物。測(cè)序顯示為cacgtg(轉(zhuǎn)錄成氨基酸His Val)，但是晶體結(jié)構(gòu)更可靠地顯示為氨基酸Gln Leu(相應(yīng)的堿基為cagctg)，改進(jìn)序列如附圖和序列表所示。晶體結(jié)構(gòu)分析還使得尤其是在簡(jiǎn)并PCR引物區(qū)域中的HC和LC衍生氨基酸序列能被改進(jìn)。當(dāng)通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)LC aa 2為Pro的情況下，而從晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)為Thr。當(dāng)通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)HC aa 2為Met的情況在，而從晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)為Val。此外，這些改進(jìn)的序列由附圖和序列表所示。
上述9D33序列還可參見(jiàn)圖9、10、11和12，其中圖9表示9D33的重鏈核苷酸序列，以及相鄰的恒定區(qū)，其中圖9a給出了核苷酸序列本身；圖9b給出了標(biāo)注了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定區(qū)的核苷酸序列；圖10顯示了9D33重鏈的氨基酸序列，以及相鄰的恒定區(qū)，其中圖10a給出了氨基酸序列本身；圖10b給出了標(biāo)注了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定區(qū)的氨基酸序列；圖11顯示了9D33輕鏈的核苷酸序列，其中圖11a給出了核苷酸序列本身；圖11b給出了注釋了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定區(qū)的核苷酸序列；圖12表示9D33輕鏈的氨基酸序列，其中圖12a給出了氨基酸序列本身；圖12b給出了注釋了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定區(qū)的氨基酸序列。
從以上可以意識(shí)到，對(duì)于9D33的VH鏈，如圖9b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區(qū)的核苷酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO.30、31和32所示的VHCDRI、VHCDRII和VHCDRIII序列；如圖10b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區(qū)的氨基酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO.20、21和22所示的VHCDRI、VHCDRII和VHCDRIII序列。從以上還可以意識(shí)到，對(duì)于9D33的VL鏈，如圖11b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區(qū)的核苷酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO.35、36和37所示的VLCDRI、VLCDRII和VLCDRIII序列；圖12b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區(qū)的氨基酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO.25、26和27所示的VLCDRI、VLCDRII和VLCDRIII序列。
本發(fā)明還提供了一種方法，該方法提供基本上如前所述的TSH受體的人單克隆抗體，該方法包括(i)由受試者提供淋巴細(xì)胞源，關(guān)于對(duì)TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制，該受試者具有大于約0.04個(gè)NIBSC 90/672單位/mL血清的TSH受體抗體活性；(ii)從所述(i)的淋巴細(xì)胞源分離淋巴細(xì)胞；(iii)無(wú)限增殖所分離的淋巴細(xì)胞；和(iv)克隆該無(wú)限增殖的淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生無(wú)限增殖化克隆，該無(wú)限增殖化克隆分泌基本上如前所述的TSH受體的人單克隆抗體。
可選地，可將提供基本上如前所述的TSH受體的人單克隆抗體的方法定義為包括以下步驟的方法(i)由受試者提供淋巴細(xì)胞源，關(guān)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，該受試者具有大于約0.1個(gè)NIBSC 90/672單位/mL血清的TSH受體抗體活性；(ii)從所述(i)的淋巴細(xì)胞源分離淋巴細(xì)胞；(iii)無(wú)限增殖所分離的淋巴細(xì)胞；和(iv)克隆該無(wú)限增殖的淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生無(wú)限增殖化克隆，該無(wú)限增殖化克隆分泌基本上如前所述的TSH受體的人單克隆抗體。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的方法包括從外周血、甲狀腺組織、脾臟組織、淋巴結(jié)或骨髓，最典型地是從外周血分離淋巴細(xì)胞。典型地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法的淋巴細(xì)胞源可以進(jìn)一步地表征為其得自這樣的受試者，該受試者的血清TSH受體抗體水平關(guān)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制，為高于約0.1個(gè)NIBSC 90/672單位/mL；或更典型地關(guān)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制，為高于約0.2個(gè)NIBSC 90/672單位/mL；或關(guān)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制，更典型地為高于約0.3個(gè)NIBSC 90/672單位/mL；優(yōu)選關(guān)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制，處于約0.3～0.5個(gè)NIBSC90/672單位/mL的范圍或更大?？蛇x地或此外，用于根據(jù)本發(fā)明的方法的淋巴細(xì)胞源可以典型地進(jìn)一步地表征為其得自這樣的受試者，該受試者的血清TSH受體抗體水平關(guān)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，為高于約0.2個(gè)NIBSC 90/672單位/mL；或更典型地關(guān)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，為高于約0.5個(gè)NIBSC90/672單位/mL；優(yōu)選關(guān)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，處于約0.5～1.0個(gè)NIBSC 90/672單位/mL的范圍或更大。從上述可意識(shí)到，從其中分離淋巴細(xì)胞的受試者的對(duì)TSH受體的免疫反應(yīng)優(yōu)選應(yīng)處于高活性階段。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的方法包括用EB病毒感染所分離的淋巴細(xì)胞，和適當(dāng)?shù)貙⑦@樣無(wú)限增殖化的淋巴細(xì)胞與鼠/人細(xì)胞系融合。適當(dāng)?shù)?，根?jù)本發(fā)明的方法還包括例如在分析系統(tǒng)中通過(guò)對(duì)125ITSH結(jié)合到TSH受體上的抑制，篩選所得到的TSH受體抗體克隆，該系統(tǒng)具有至少約1個(gè)NIBSC 90/672單位/L的靈敏度。
本發(fā)明還提供了制備TSH受體的人重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段的方法，該方法包括通過(guò)基本上如前所述的方法克隆和表達(dá)如本發(fā)明提供的TSH受體的人單克隆抗體，或由其衍生的一個(gè)或多個(gè)片段。
本發(fā)明還提供了獲自基本上如前所述的方法的TSH受體的人單克隆或重組抗體。優(yōu)選這樣獲得的本發(fā)明的TSH受體的人單克隆或重組抗體，可用對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性來(lái)表征，所述抑制活性至少為約15個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約30個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約120個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或這樣的人單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。
更特別地，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的這樣的人單克隆或重組抗體，可用對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性來(lái)進(jìn)一步表征，所述刺激活性至少為約30個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約120個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約240個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或這樣的人單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的這樣的人單克隆或重組抗體，可以通過(guò)以下來(lái)表征(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為約15個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約30個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約120國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為約30國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約120國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約240國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg；或這樣的人單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。
還優(yōu)選本發(fā)明的這樣獲得的人單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，尤其例如其一個(gè)或多個(gè)Fab片段，可以用對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性來(lái)表征，所述抑制活性至少為約30國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約120國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約240國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg。還優(yōu)選這樣的一個(gè)或多個(gè)片段可用對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性表征，所述刺激活性至少為約50國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約100國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為200單位國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672約/mg，或更優(yōu)選至少為約400國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg。
更優(yōu)選，這樣的一個(gè)或多個(gè)Fab片段可由以下來(lái)表征(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為約30國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約120國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約240國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg；和
(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為約50國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約100國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約200國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約400國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg。
基本上如前所述的方法可以進(jìn)一步包括另外的步驟，借此可將所獲得的人單克隆或重組抗體經(jīng)由合適的進(jìn)一步的操作技術(shù)(如適當(dāng)?shù)恼T變技術(shù)，例如點(diǎn)突變或類似技術(shù))，來(lái)進(jìn)一步獲得TSH受體的另外的結(jié)合偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物能與基本上如文中所述的結(jié)合配偶體(例如hMAbTSHR 1)競(jìng)爭(zhēng)性地與TSH受體發(fā)生相互作用。這樣的進(jìn)一步的操作技術(shù)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)這樣的進(jìn)一步操作技術(shù)所獲得的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體。
優(yōu)選這樣的另外的TSH受體的結(jié)合配偶體可以包含單克隆或重組抗體，且可用對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性來(lái)表征，所述抑制活性至少為約15國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約30國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約120國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或其一個(gè)或多個(gè)片段。也還可以優(yōu)選本發(fā)明的這樣的另外的結(jié)合配偶體可用對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性來(lái)表征，所述刺激活性至少為約30國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約120國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約240國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或其一個(gè)或多個(gè)片段。
還更優(yōu)選本發(fā)明的這樣的另外的結(jié)合配偶體，可通過(guò)以下來(lái)表征(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為約15國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約30國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或更優(yōu)選至少為約120國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為約30國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約60國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，更優(yōu)選至少為約120國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg，或甚至更優(yōu)選至少為約240國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672單位/mg；或其一個(gè)或多個(gè)片段。
根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體(典型的是人單克隆或重組抗體)可以用于診斷或治療。
相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)可被應(yīng)用于篩選方法中來(lái)檢測(cè)患者血清中的TSH受體的自身抗體，也可被應(yīng)用于診斷方法中。這樣，根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)可被用于替代或補(bǔ)充至今所描述的競(jìng)爭(zhēng)劑以用于篩選方法中來(lái)檢測(cè)TSH受體的自身抗體，也可被用于診斷方法中。相似地，根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)可被用于替代或補(bǔ)充至今所描述的競(jìng)爭(zhēng)劑以用于試劑盒中來(lái)用以檢測(cè)TSH受體的自身抗體。
因此，本發(fā)明還提供了一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體相互作用；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)TSH受體的的所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發(fā)明的用于檢測(cè)上述自身抗體的方法在靈敏性水平上尤其有利，所述靈敏性水平可以通過(guò)使用該方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。這可以參考實(shí)施例和附圖得以進(jìn)一步說(shuō)明，其中附圖3a表示基于hMAb TSHR1-生物素的TSH自身抗體的檢測(cè)與以前的檢測(cè)之間的比較曲線圖。根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672的可檢測(cè)濃度，基于hMAb TSHR1-生物素的檢測(cè)的靈敏度明顯優(yōu)異。這在對(duì)72個(gè)突眼性甲狀腺腫患者血清的研究中被確認(rèn)，如圖3b所示。
因此，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體相互作用；其中所述結(jié)合分子的相互作用為所述樣品中的自身抗體滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L。
(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)本發(fā)明的TSH受體的所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
上述靈敏度還可以根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)方法或試劑盒獲得，所述檢測(cè)方法和試劑盒使用TSH受體的人或非人多克隆抗體、TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段，或?qū)SH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結(jié)合配偶體，這些通常顯示出對(duì)TSH受體足夠的親和力以便提供規(guī)定的靈敏度的方法或試劑盒。這樣的多克隆抗體、TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段在本領(lǐng)域中已熟知。例如，TSH的超活性類似物在自然(Nature)，生物技術(shù)(Biotechnology)，第14卷，1995年10月，第1257～1263頁(yè)有描述，盡管該文章沒(méi)有像本發(fā)明現(xiàn)在所提供的一樣披露這樣的超活性TSH在方法或試劑盒中的用途。
因此，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含TSH受體的人或非人多克隆抗體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述多克隆抗體相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述多克隆抗體；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含對(duì)TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH的結(jié)合配偶體；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的用途，以用于在獲自受試者的體液樣品中檢測(cè)TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，其中所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L。
本發(fā)明還提供了TSH受體的人或非人多克隆抗體的用途，以用于在獲自受試者的體液樣品中檢測(cè)TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，其中所述多克隆抗體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L。
本發(fā)明還提供了TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段的用途，以用于在獲自受試者的體液樣品中檢測(cè)TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，其中所述TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L。
本發(fā)明還更提供了對(duì)TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結(jié)合配偶體的用途，以用于在獲自受試者的體液樣品中檢測(cè)TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，其中所述結(jié)合配偶體與TSH受體間相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L。
可以意識(shí)到，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合對(duì)的結(jié)合分子可以是抗原-抗體(例如，[TSH受體或表位]-[單克隆或重組TSH受體抗體])、抗獨(dú)特型抗體-單克隆或重組TSH受體抗體、或新TSH受體抗體結(jié)合成員-單克隆或重組TSH受體抗體。優(yōu)選該結(jié)合對(duì)的結(jié)合分子是抗原-抗體，也就是，[TSH受體或其一個(gè)或多個(gè)表位]-[單克隆或重組TSH受體抗體]，其中表位可以是“獨(dú)立式”或存在于大量的支架多肽或其類似物中。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)將所述樣品與以下接觸(i)全長(zhǎng)TSH受體，或其一個(gè)或多個(gè)表位，或含有一個(gè)或多個(gè)TSH受體表位的多肽，和(ii)根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述接觸在允許TSH受體與針對(duì)TSH受體進(jìn)行應(yīng)答而產(chǎn)生的自身抗體相互作用的條件下，以允許所述TSH受體或其所述一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽，與存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體或所述TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)相互作用；和
(c)監(jiān)測(cè)所述TSH受體，或其所述一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽與存在于所述樣品中的所述的自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以使用一種或多種競(jìng)爭(zhēng)劑，該競(jìng)爭(zhēng)劑與以下兩類物質(zhì)之間的相互作用發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，其中一類物質(zhì)為多克隆抗體、TSH或其一種或多種變異體、類似物、衍生物或片段、或如本發(fā)明提供的具體方法實(shí)施方案中基本上如上所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體；另一類物質(zhì)為結(jié)合對(duì)的第二分子、或TSH受體、或其一個(gè)或多個(gè)表位或該多肽。這樣的競(jìng)爭(zhēng)劑可以包含TSH、或與該TSH受體反應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)單克隆，例如與TSH受體反應(yīng)的鼠單克隆。
優(yōu)選地，上面提及的根據(jù)本發(fā)明的方法，進(jìn)一步包括為根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是單克隆或重組抗體)和上述適當(dāng)?shù)囊环N或多種競(jìng)爭(zhēng)劑提供標(biāo)記方法，合適的標(biāo)記方法包括酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、熒光標(biāo)記、染色或類似方法。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，以用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體相互作用；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)TSH受體的所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(c)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，以用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)根據(jù)本發(fā)明的所述TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(c)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，以用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含TSH受體的人或非人多克隆抗體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述多克隆抗體相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672的0.4U/L；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述多克隆抗體；和(c)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，以用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含TSH或其一種或多種變異體、類似物、衍生物或片段，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段；和(c)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，以用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含對(duì)TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測(cè)到的自身抗體的滴度基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH受體的結(jié)合配偶體；和(c)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
可意識(shí)到，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合對(duì)的結(jié)合分子可以是抗原-抗體(例如，[TSH受體或表位]-[單克隆或重組TSH受體抗體])，抗獨(dú)特型抗體-單克隆或重組TSH受體抗體，或新TSH受體抗體結(jié)合成員-單克隆或重組TSH受體抗體。優(yōu)選該結(jié)合對(duì)的結(jié)合分子是抗原-抗體，也就是，[TSH受體或其一個(gè)或多個(gè)表位]-[單克隆或重組TSH受體抗體]，其中表位可以是“獨(dú)立式”或存在于大量的支架多肽或其類似物中。
本發(fā)明優(yōu)選提供一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與對(duì)于TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)全長(zhǎng)TSH受體，或其一個(gè)或多個(gè)表位，或含有一個(gè)或多個(gè)TSH受體表位的多肽；(b)根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地人單克隆或重組抗體)；(c)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品、所述TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽，與所述TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)接觸的單元，所述接觸在允許TSH受體與針對(duì)TSH受體的應(yīng)答而產(chǎn)生的自身抗體相互作用的條件下，以允許所述TSH受體或其所述一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽，與存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或TSH受體的所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的相互作用；和(d)監(jiān)測(cè)所述TSH受體或其所述一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽與存在于所述樣品中的所述的自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步包含一種或多種競(jìng)爭(zhēng)劑，該競(jìng)爭(zhēng)劑在兩類物質(zhì)的相互作用發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，所述一類物質(zhì)為分別如上所述的多克隆抗體、TSH或其一種或多種突變體、類似物、衍生物或片段、或TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，另一類物質(zhì)為結(jié)合對(duì)的第二分子、或TSH受體、或其一個(gè)或多個(gè)表位或該多肽。這樣的競(jìng)爭(zhēng)劑可以包含TSH，或與TSH受體反應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)單克隆，例如與TSH受體反應(yīng)的鼠單克隆。
適當(dāng)?shù)?，上面提及的根?jù)本發(fā)明的試劑盒還包含根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的標(biāo)記單元，其中合適的一種或多種競(jìng)爭(zhēng)劑如上所述，恰當(dāng)?shù)臉?biāo)記方法基本上如前所述。
在存在TSH受體的自身抗體的情形下，在如前述的一種方法或試劑盒中，TSH受體與TSH受體的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的結(jié)合將會(huì)降低。
根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)還可以被用于基本上如前所述的關(guān)于TSH和相關(guān)配基的檢測(cè)方法和試劑盒中。
因此，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)TSH和相關(guān)配基的方法，所述方法包括(a)提供被懷疑含有或含有TSH或相關(guān)配基的樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體相互作用；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH或相關(guān)配基，或(ii)所述TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的TSH或相關(guān)配基的相互作用，從而提供在所述樣品中存在TSH或相關(guān)配基的指示。
本發(fā)明還提供了一種用于測(cè)定TSH或相關(guān)配基的試劑盒，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體相互作用；(b)用于將被懷疑含有或含有TSH或相關(guān)配基的樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH或相關(guān)配基，或(ii)所述TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(c)檢測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的TSH或相關(guān)配基的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在TSH或相關(guān)配基的指示。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種鑒定TSH受體的另外的結(jié)合配偶體的方法，該TSH受體的另外的結(jié)合配偶體能結(jié)合到TSH受體上并與基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，該另外的結(jié)合配偶體不包含TSH，該方法包括(a)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體相互作用；(b)提供待測(cè)定的另外的結(jié)合分子，該結(jié)合分子作為TSH受體的潛在的另外的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合分子與(a)的所述結(jié)合對(duì)的第一分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上；(c)將(b)的所述另外的結(jié)合分子與(a)的所述的一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，從而允許(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)(b)的所述另外的結(jié)合分子，或(ii)(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子；和(d)監(jiān)測(cè)(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與(b)的所述另外的結(jié)合分子的相互作用，從而評(píng)估(b)的所述另外的結(jié)合分子是否與(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到TSH受體上。
本發(fā)明還提供一種鑒定TSH受體的另外的結(jié)合配偶體的試劑盒，該另外的結(jié)合配偶體能結(jié)合到TSH受體上并與基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，該另外的結(jié)合配偶體不包含TSH，該試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體相互作用；(b)用于將(a)的所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子與待測(cè)定的另外的結(jié)合分子接觸的單元，所述另外的結(jié)合分子用作TSH受體的潛在的另外的結(jié)合配偶體，其與(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，以允許(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)所述的另外的結(jié)合分子，或(ii)(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子；和(c)監(jiān)測(cè)(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與所述另外的結(jié)合分子的相互作用的單元，從而評(píng)估所述另外的結(jié)合分子是否與(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上。
根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的進(jìn)一步的應(yīng)用是用于鑒定和提供新類型的TSH受體的抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種鑒定TSH受體的一個(gè)或多個(gè)表位區(qū)的方法，該方法包括將基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)與全長(zhǎng)TSH受體或其一個(gè)或多個(gè)片段接觸，以使所述TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與所述全長(zhǎng)TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)片段相互作用，并鑒定與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體相互作用的所述全長(zhǎng)TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)片段的氨基酸。適當(dāng)?shù)?，?duì)結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與TSH受體的選擇片段和全長(zhǎng)TSH受體之間的相互作用進(jìn)行分析，以鑒定與結(jié)合配偶體相互作用的TSH受體的氨基酸。
此外，本發(fā)明允許針對(duì)本發(fā)明的單克隆TSH受體抗體的結(jié)合TSH受體區(qū)域的抗體的產(chǎn)生。以這種方式產(chǎn)生的這樣的抗獨(dú)特型抗體可作為潛在的新配基用于測(cè)定TSH受體自身抗體、TSH和相關(guān)化合物。同樣它們也可以是有效的用于調(diào)節(jié)TSH受體自身抗體、TSH和相關(guān)化合物的作用的體內(nèi)試劑。因此，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了針對(duì)基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的結(jié)合區(qū)而產(chǎn)生的一種或多種抗獨(dú)特型抗體，其制備方法在實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步的描述。
其它用單克隆抗體來(lái)鑒定和提供新類型的抗體結(jié)合位點(diǎn)的方法是已知的。例如，采用如下述文獻(xiàn)所描述的噬菌體展示的隨機(jī)肽文庫(kù)的抗體篩選，JC Scott和GP Smith“用表位文庫(kù)尋找肽配基”，Science，1990，249(4967)386～390和MA Myers，JM Davies，JC Tong，J Whisstock，M Scealy，IR MacKay，MJ Rowley，“通過(guò)肽噬菌體展示和分子模建鑒定的糖尿病自身抗原GAD65上的構(gòu)象性表位”(Conformational epitopes onthe diabetes autoantigen GAD65identified by peptide phage display andmolecular modelling)，免疫學(xué)雜志(Journal of Immunology)，2000，1653830～3838。也可進(jìn)行非肽化合物和非肽化合物文庫(kù)的抗體篩選。
用這些方法鑒定和提供的新類型的TSH受體的抗體結(jié)合位點(diǎn)還可以在TSH受體自身抗體、TSH和相關(guān)化合物的測(cè)定中用作有用的新配基。此外，它們還可以是用于調(diào)節(jié)TSH受體自身抗體、TSH和相關(guān)化合物的作用的有效的體內(nèi)試劑。
基本上如前所述的根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)也被可效地用于治療中。因此，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了治療方法，該治療方法包括施用基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)、包含基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的藥物組合物(同時(shí)含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑)；以及還涉及基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)在制備藥物或組合物中的用途。
TSH受體的結(jié)合配偶體，尤其是獲自患者淋巴細(xì)胞的根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的人單克隆抗體，對(duì)于理解突眼性甲狀腺腫疾病的發(fā)病機(jī)理和發(fā)展測(cè)定TSH受體自身抗體的新方法是有價(jià)值的試劑，例如基本上如前所述那樣，在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中用作TSH的替代物。同樣，當(dāng)含有TSH受體的組織(例如甲狀腺組織或甲狀腺癌組織)需要刺激時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的刺激性結(jié)合配偶體具有體內(nèi)應(yīng)用價(jià)值。因此，本發(fā)明提供了一種用于刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織的藥物或組合物。尤其是，根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的刺激性結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)可用于腫瘤學(xué)，尤其是用于甲狀腺癌的診斷、控制和治療。
可替換地，根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體可以是有效的TSH或自身抗體的拮抗劑(阻斷性抗體)且當(dāng)含有TSH受體的組織(例如甲狀腺組織或甲狀腺癌組織)的活性需要失活或需要使其對(duì)TSH、TSH受體自身抗體或其他刺激物沒(méi)有反應(yīng)性的時(shí)候，根據(jù)本發(fā)明的這樣的阻斷性TSH受體抗體對(duì)體內(nèi)應(yīng)用很有價(jià)值。
本發(fā)明還提供了基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，以及一種或多種另外的試劑的組合，所述另外的試劑使含有TSH受體的組織對(duì)TSH、TSH受體自身抗體或其他刺激物失活或不具有反應(yīng)性。典型地，該一種或多種另外的試劑獨(dú)立于TSH受體而發(fā)生作用。
一種特別的治療性應(yīng)用，是在于治療與對(duì)TSH受體的自體免疫相關(guān)的眼眶后組織(retro orbital tissue of eye)疾病，其中TSH受體自身抗體結(jié)合需要失活或抑制，及應(yīng)用與TSH受體相互作用的阻斷性抗體，例如9D33，來(lái)抑制TSH受體自身抗體結(jié)合，因而在這類疾病的治療中有著重要治療應(yīng)用。需要抑制TSH受體自身抗體結(jié)合的自體免疫疾病的治療，所述自體免疫疾病例如上面討論的與對(duì)TSH受體的自體免疫相關(guān)的眼眶后組織疾病，可以選擇性地使用針對(duì)如本發(fā)明所提供的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體的抗獨(dú)特型抗體，如這里所述，所述的這樣的抗獨(dú)特型抗體形成本發(fā)明的一個(gè)重要方面且其進(jìn)一步的制備細(xì)節(jié)由實(shí)施例提供。
因此，更具體地，本發(fā)明提供了TSH受體的另外的結(jié)合配偶體在與對(duì)TSH受體的自體免疫相關(guān)的眼眶后組織疾病的治療中的用途，該另外的結(jié)合配偶體基本上抑制基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)結(jié)合到TSH受體上。本發(fā)明進(jìn)一步提供了另外的TSH受體的結(jié)合配偶體在制備治療與TSH受體的激活和/或刺激相關(guān)的眼眶后組織疾病的藥物中的用途，該另外的結(jié)合配偶體基本上抑制基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)結(jié)合到TSH受體上。還提供了一種治療與對(duì)TSH受體的自體免疫相關(guān)的眼眶后組織疾病的方法，該方法包括對(duì)患有或易感這樣的疾病的患者施用治療有效量的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體基本上抑制基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)結(jié)合到TSH受體上。用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的另外的結(jié)合配偶體優(yōu)選含有阻斷性抗體，該阻斷性抗體可基本上抑制本發(fā)明所提供的結(jié)合配偶體，就像該TSH受體自身抗體結(jié)合一樣，結(jié)合到TSH受體上，并且優(yōu)選這樣的抗體可以包含文中所述的9D33。
本發(fā)明還提供了針對(duì)本發(fā)明的結(jié)合配偶體和另外的結(jié)合配偶體的結(jié)合區(qū)而產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體在與對(duì)TSH受體的自體免疫相關(guān)的眼眶后組織疾病的治療中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了針對(duì)本發(fā)明的結(jié)合配偶體和另外的結(jié)合配偶體的結(jié)合區(qū)而產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體在制備治療與TSH受體的激活和/或刺激相關(guān)的眼眶后組織疾病的藥物中的用途。還提供了一種治療與對(duì)TSH受體的自體免疫相關(guān)的眼眶后組織疾病的方法，該方法包括對(duì)患有或易感這樣的疾病的患者施用治療有效量的抗獨(dú)特型抗體，該抗獨(dú)特型抗體是針對(duì)本發(fā)明的結(jié)合配偶體和另外的結(jié)合配偶體的結(jié)合區(qū)而產(chǎn)生的。
如本發(fā)明所提供的單克隆抗體相對(duì)于TSH在所述體外和/或體內(nèi)應(yīng)用中的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是這樣的抗體可以被相對(duì)容易地操縱。例如對(duì)根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的TSH受體結(jié)合區(qū)進(jìn)行操縱，來(lái)改變其特性，例如親和力和生物學(xué)特性，包括TSH激動(dòng)劑或拮抗劑的活性程度。此外，根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體相對(duì)于TSH在體內(nèi)具有長(zhǎng)得多的半衰期，這將在體內(nèi)應(yīng)用中具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。另外，抗體的半衰期能夠被操縱，例如抗體Fab片段相對(duì)于完整IgG具有短得多的半衰期。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包括那些適于口服、非腸道注射和局部施用的藥物組合物，盡管最佳的途徑取決于患者的狀況和正在治療的具體疾病。待施用給患者的基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的精確施用量將由主治醫(yī)生來(lái)決定，盡管使用的劑量將取決于很多的因素，包括患者的年齡和性別、正在治療的具體病情和基本上如前所述的給藥途徑。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種刺激甲狀腺組織，和/或含有TSH受體的組織的方法，該方法包括對(duì)需要這種刺激的患者施用診斷有效量或治療有效量的基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)。
本發(fā)明還同時(shí)提供了基本上如前所述的TSH受體的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)與一種或多種另外試劑的組合以同時(shí)、獨(dú)立、或順序使用以用于刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織，所述另外的試劑能刺激甲狀腺組織，和/或含有TSH受體的組織。優(yōu)選這樣的一種或多種另外的試劑包含重組人TSH和/或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段，或該片段的變異體、類似物或衍生物。可選地，這樣的一種或多種另外的試劑可以獨(dú)立地結(jié)合到TSH受體上。
根據(jù)本發(fā)明的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)也可以被用作需要含有TSH受體抗體的患者血清的替代源，來(lái)用于商業(yè)性試劑盒中。此外，TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)也可以根據(jù)本發(fā)明被提供在需要含有規(guī)定濃度的TSH受體的一種或多種抗體的制備物中，以這種方式，可以提供具有規(guī)定活性例如對(duì)TSH受體的刺激活性的制備物。任選地，這樣的制備物還可以進(jìn)一步含有一種或多種另外的人單克隆抗體，例如對(duì)GAD、TPO等的單克隆抗體。
提供以下示例性解釋用以幫助理解文中所用的某些術(shù)語(yǔ)。提供這些解釋是為了方便，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
TSH受體的結(jié)合配偶體，描述的是一種具有對(duì)TSH受體的結(jié)合特異性的分子。文中所說(shuō)的結(jié)合配偶體可以天然來(lái)源的，或全部或部分合成產(chǎn)生的。這樣的結(jié)合配偶體具有結(jié)構(gòu)域或區(qū)，它特異性地結(jié)合到TSH受體的一個(gè)或多個(gè)表位區(qū)，并因此與其互補(bǔ)。尤其是，文中所述的結(jié)合配偶體可以是TSH受體的單克隆或重組抗體，更具體地，可以是TSH受體的人單克隆或重組抗體。
C區(qū)，表示在抗體分子中氨基酸序列相對(duì)恒定的區(qū)域。
CDR，表示互補(bǔ)決定區(qū)，其同時(shí)存在于抗體分子的重鏈和輕鏈上并代表序列變異性最大的區(qū)域。CDR代表可變區(qū)的約15％～20％并代表抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
FR，表示閱讀框區(qū)域，并代表不存在于CDR中的其它輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。
HC，表示抗體分子的部分重鏈，該部分重鏈含有重鏈可變區(qū)和IgG恒定區(qū)的第一區(qū)。
宿主細(xì)胞，是指已被外源多核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或能被其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
同一性，如本領(lǐng)域所已知，通過(guò)對(duì)序列進(jìn)行比較所決定兩個(gè)或多個(gè)多肽序列之間，或兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間的關(guān)系。
LC，表示抗體分子的輕鏈序列。
NIBSC 90/672，是針對(duì)甲狀腺刺激抗體的一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。該針對(duì)甲狀腺刺激活性抗體的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)由包含來(lái)自單個(gè)病人的一批凍干血漿蛋白質(zhì)的安瓿組成，所述患者具有高水平的TSH受體自身抗體。已經(jīng)在國(guó)際合作研究中評(píng)估了該制備物，并顯示出其同時(shí)擁有甲狀腺刺激活性和甲狀腺受體結(jié)合活性。在1995年的第46界會(huì)議中，WHO(世界衛(wèi)生組織)的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)專家委員會(huì)確定代碼為90/672的制備物作為甲狀腺刺激抗體的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。每安瓿包含含有0.02M磷酸鹽緩沖液和透析的人血漿蛋白質(zhì)的1.0ml溶液的凍干殘余物，根據(jù)定義每安瓿為0.1個(gè)國(guó)際單位(100/1000國(guó)際單位)。
文中所述用人單克隆抗體“刺激TSH受體”，是指它能結(jié)合到TSH受體上的能力及因此發(fā)揮作用的能力，例如作為上述結(jié)合到TSH受體上的結(jié)果而產(chǎn)生環(huán)狀A(yù)MP。這樣的刺激與所見(jiàn)到的TSH或TSH受體自身抗體結(jié)合到TSH受體上的反應(yīng)是類似的，并且以這種方式，文中所述人單克隆抗體基本上提供與所見(jiàn)到的TSH或TSH受體自身抗體結(jié)合到TSH受體上的相同或相似的結(jié)合反應(yīng)。
V區(qū)，表示抗體分子中氨基酸序列的高度可變的區(qū)域。
VH區(qū)，表示抗體分子重鏈中的可變區(qū)或結(jié)構(gòu)域。
VL區(qū)，表示抗體分子輕鏈中的可變區(qū)或結(jié)構(gòu)域。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在將通過(guò)以下附圖和實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但這不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例材料與方法淋巴細(xì)胞的分離和人單克隆TSH受體自身抗體的克隆血液獲自突眼性甲狀腺腫病和I型糖尿病患者，所述患者具有高水平的TSH受體的血清自身抗體(TRAb)。該研究已經(jīng)獲得倫理委員會(huì)的同意。在Ficoll-Paque(Amersham Biosciences，chalfont St Giles，HP8 4SP，UK)上從20mL血樣中分離外周血淋巴細(xì)胞，然后用EB病毒(EBV)(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)-ECACC；Porton Down，SP4 0JG，UK)感染，并如以前描述的那樣，在鼠巨噬細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)(N Hayakawa、LDKE Premawardhana、MPowell、M Masuda、C Arnold、J Sanders、M Evans、S Chen、JC Jaume、S Baekkeskov、B Rees Smith、J Furmaniak；“谷氨酸脫羧酶的人單克隆抗體的分離和表征(Isolation and characterization of human monoclonalautoantibodies to glutamic acid decarboxylase)”；自體免疫(Autoimmunity)2002；35343～355)。隨后將由EBV無(wú)限增殖的B淋巴細(xì)胞與鼠/人雜交細(xì)胞系K6H6/B5融合(WL Carroll，K Thilemans，J Dilley，R Levy；“鼠人異種雜交瘤作為融合配偶體與人B細(xì)胞瘤融合(Mouse×humanheterohybridomas as fusion partners with human B cell tumors)”；免疫學(xué)方法雜志(Journal of Immunological Methods)1986；8961～72)，并以5個(gè)細(xì)胞/孔有限稀釋進(jìn)行克隆兩次，最后以0.5個(gè)細(xì)胞/孔有限稀釋克隆一次，以獲得單克隆(BJ Bolton，NK Spurr.“B淋巴細(xì)胞(B-lymphocytes)”，RI Freshney，MG Freshney(編輯)；無(wú)限增殖細(xì)胞的培養(yǎng)(Culture of immortalized cells)，Wiley-Liss，New York 1996；283～297)。原始細(xì)胞及隨后的克隆通過(guò)對(duì)125I-TSH結(jié)合到溶液化的TSH受體上的抑制來(lái)篩選TSH受體自身抗體(參見(jiàn)下文)。生產(chǎn)TSH受體自身抗體的單克隆在組織培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)。
單克隆TSH受體抗體制備物的生產(chǎn)、純化和標(biāo)記鼠TSH受體MAb如以前所述進(jìn)行生產(chǎn)(Y Oda、J Sanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B ReesSmith；“用單克隆抗體對(duì)人促甲狀腺素受體進(jìn)行表位分析(Epitopeanalysis of the human thyrotropin(TSH)receptor using monoclonalantibodies)”；甲狀腺(Thyroid)2000；101051～1059)，也可以用克隆到pcDNA3.1中的全長(zhǎng)TSHR cDNA來(lái)免疫鼠而制備(UA Hasan、AMAbai、DR Harper、BW Wren、WJW Morrow；“核酸免疫與第三代疫苗相關(guān)的概念和技術(shù)(Nucleic acid immunizationConcepts and techniquesassociated with third generation vaccines)”免疫學(xué)方法雜志(Journal ofImmunological Methods)1999；2291～22)。
將IgG在Prosep A(Millipore UK Ltd.；Watford，WD18 8YH，UK)上，依照生產(chǎn)商的使用說(shuō)明用親和層析法從組織培養(yǎng)物上清液中純化出來(lái)，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)測(cè)定其純度。
人重鏈同種型用徑向擴(kuò)散法確定(The Binding Site，Birmingham，B29 6AT，UK)。人輕鏈同種型通過(guò)用抗人kappa(κ)鏈和抗人lambda(λ)鏈特異性鼠單克隆抗體(Sigma-Aldrich有限公司；Gillingham，SP84XT，UK)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡來(lái)確認(rèn)。
經(jīng)純化的IgG制備物用汞合木瓜蛋白酶(Sigma-Aldrich)處理，酶/蛋白質(zhì)比例界于1∶10到1∶100之間(取決于特定的單克隆抗體)，并通過(guò)Prosep A柱以從Fab制備物中除去任何完整的IgG或Fc片段(Y Oda、J Sanders、S Roberts、M Maruyama、R Kato、M Perez、VB Petersen、NWedlock、J Furmaniak、B Rees Smith；“TSH受體抗體的結(jié)合特性(Bindingcharacteristics of antibodies to the TSH receptor)”，分子內(nèi)分泌學(xué)雜志(Journal of Molecular Endocrinology)1998；20233～244)。完整的IgG在Fab制備物中用SDS-PAGE是不可檢測(cè)的。單克隆抗體的IgG和Fab制備物如以前所述用125I標(biāo)記(Y Oda、J Sanders、S Roberts、M Maruyama、R Kato、M Perez、VB Petersen、N Wedlock、J Furmaniak、B Rees Smith；“TSH受體抗體的結(jié)合特性”，分子內(nèi)分泌學(xué)雜志1998；20233～244)。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明，IgG制備物用生物素酰肼(Pierce RockfordIL61105 USA)進(jìn)行標(biāo)記。獲得人單克隆TSH受體自身抗體的Fab片段的晶體，且采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定它們的晶體結(jié)構(gòu)。
患者對(duì)來(lái)自突眼性甲狀腺腫患者不同疾病時(shí)期的血清進(jìn)行了研究。所研究的患者血清顯示出對(duì)125I標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制(參見(jiàn)下文)。此外，研究了來(lái)自兩名阿狄森氏病患者的血清(A1和A2)，所述患者具有高水平21-OH的自身抗體(113和1970個(gè)單位/mL，RSR試劑盒)；和來(lái)自兩名1型糖尿病患者的血清(D1和D2)，所述患者具有高水平的GAD65(3700和37.5單位/mL，RSR試劑盒)。該研究得到了患者的同意。還研究了來(lái)自健康獻(xiàn)血者的血清(購(gòu)自Golden WestBiologicals，Vista，CA 92083，USA)。TRAb第一國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)制備物(90/672)獲自國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)與控制學(xué)會(huì)(National Institute for Biological Standardsand Control，NIBSC；Potters Bar，EN6 3QH，UK)。
對(duì)125I-TSH和125I-鼠TSHR MAb結(jié)合到TSH受體上的抑制如以前所述，用TSH受體包被的試管進(jìn)行結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)(J Sanders、Y Oda、S Roberts、A Kiddie、T Richards、J Bolton、V McGrath、S Walters、D Jaskolski、J Furmaniak、B Rees Smith；TSH受體自身抗體與125I標(biāo)記的TSH受體間的相互作用(The interaction of TSH receptor autoantibodieswith125I-labeled TSH receptor)；Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism(臨床內(nèi)分泌學(xué)和代謝雜志)1999；843797～3802)(試劑來(lái)自RSR Ltd.)。簡(jiǎn)而言之，將100μL樣品(組織培養(yǎng)物上清液、經(jīng)純化的IgG或Fab片段、患者血清或NIBSC 90/672標(biāo)準(zhǔn))在TSH受體包被的試管中，于室溫下輕搖孵育兩小時(shí)。抽吸后，將試管用1mL測(cè)定緩沖液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl PH7.8、0.1％ Triton X-100)洗滌兩次，然后添加100μL的125I-TSH或125I-MAb(5×104cpm)，并于室溫下振蕩孵育1小時(shí)。然后將試管用1mL測(cè)定緩沖液洗滌兩次，抽吸并在gamma(γ)計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
結(jié)合的抑制通過(guò)下式計(jì)算 所用對(duì)照物質(zhì)是培養(yǎng)基、健康鮮血者血清池或其它指出的物質(zhì)。
甲狀腺刺激活性的分析單克隆自身抗體制備物和患者血清對(duì)表達(dá)hTSH受體的CHO細(xì)胞(大約50,000個(gè)受體/每個(gè)細(xì)胞)中環(huán)腺苷酸(或cAMP)產(chǎn)生的刺激能力(Y Oda、J Sanders、S Roberts、M Maruyama、R Kato、M Perez、VBPetersen、N Wedlock、J Furmaniak、B Rees Smith；“TSH受體抗體的結(jié)合特性”，分子內(nèi)分泌學(xué)雜志1998；20233～244)，根據(jù)文獻(xiàn)“R Latif，P Graves，TF Davies，人促甲狀腺素受體的寡聚化作用(Oligomerizationof the human thyrotropin receptor)，生物化學(xué)雜志(Journal of BiologicalChemistry)2001；27645217～45224”中所述的方法實(shí)施。簡(jiǎn)而言之，將CHO細(xì)胞接種到96孔板中(30,000細(xì)胞/孔)，并在含10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen Ltd；Paisley PA4 9RF，UK)中孵育24小時(shí)。隨后將培養(yǎng)物在不含有胎牛血清的DMEM中繼續(xù)孵育24小時(shí)。然后移走DMEM，加入待測(cè)TSH、IgG、Fab和血清(100μL稀釋在不含NaCl的含1g/L葡萄糖、20mmol/L Hepes、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤pH7.4的Hank’s緩沖鹽溶液中)并在37℃孵育1小時(shí)。移走待測(cè)溶劑后，將細(xì)胞溶解并用Biotrak酶免疫測(cè)定系統(tǒng)(Amersham Bioscience；Chalfont St Giles，HP84SP，UK)測(cè)定環(huán)腺苷酸。在一些實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定患者血清和TSHR的鼠單克隆抗體對(duì)TSH或hMAb TSHR1的刺激活性的抑制能力。這通過(guò)將(a)TSH或hMAb TSHR1獨(dú)自的刺激效應(yīng)與(b)在患者血清或鼠單克隆抗體存在下的TSH或hMAb TSHR1的刺激效應(yīng)進(jìn)行比較來(lái)完成。
可變區(qū)基因分析總RNA是由產(chǎn)生克隆的TSH受體自身抗體的1×107個(gè)細(xì)胞，用酸性苯酚胍法(P Chomczynski，N Sacchi；“采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取的RNA分離的一步法(Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)”；AnalyticalBiochemistry(分析生物化學(xué))1987；162156～159)制備；用寡脫氧胸苷酸(dT)磁珠制備mRNA(Dynal Biotech Ltd.；Wirral，CH62 3QL，UK)。用來(lái)自Invitrogen Ltd.；Paisley PA4 9RF，UK的試劑進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。
用醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)的V-base數(shù)據(jù)庫(kù)(www.mrccpe.cam.ac.uk)推薦的序列設(shè)計(jì)正義鏈寡核苷酸引物。對(duì)人IgG1重鏈和lambda輕鏈具有特異性的反義引物是基于編碼DNA序列的恒定區(qū)。正義引物和反義引物兩者都包括額外的5’限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)序列來(lái)促進(jìn)PCR產(chǎn)物的克隆。IgG1重鏈和lambda輕鏈用成套的合適引物進(jìn)行RT-PCR發(fā)應(yīng)。所有的引物都由Invitrogen Ltd.合成。RT反應(yīng)在50℃進(jìn)行10分鐘，隨后馬上進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR(15秒94℃，30秒55℃，30秒72℃)。將RT-PCR產(chǎn)物克隆到pUC18和用Promega UK Ltd.；Southampton SO16 7NS，UK的Wizard試劑盒制備的DNA中，通過(guò)Sanger-Coulson法(F Sanger、SNicklen、AR Coulsen；“用鏈終止抑制劑進(jìn)行DNA測(cè)序(DNA sequencingwith chain terminating inhibiors)”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)研究院年報(bào)(Preceedingsof the National Academy of sciences of the USA，1977；745463～5467)進(jìn)行測(cè)序。用Ig blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi)將V區(qū)序列與人Ig基因的可得到序列進(jìn)行比較。
免疫沉淀測(cè)定(IPA)將編碼全長(zhǎng)TSH受體的cDNA置于pYES2(Invitrogen)中T7啟動(dòng)子的下游，并用于體外TnT系統(tǒng)(Promega UK Ltd.)中以生產(chǎn)如前所述的用35S-甲硫氨酸標(biāo)記的TSH受體(L Prentice、J Sanders、M Perez、RKato、J Sawicka、Y Oda、D Jaskolski、J Furmaniak、B Rees Smith；“促甲狀腺素(TSH)自身抗體不顯示出結(jié)合到在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生的TSH受體上(Thyrotropin(TSH)receptor autoantibodies do not appear tobind to the TSH receptor produced in an in vitro transcription/translationsystem)”；臨床內(nèi)分泌學(xué)和代謝雜志(Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism)1997；821288～1292)。簡(jiǎn)而言之，加入稀釋在HSB(150mmol/L Tris-HCL pH8.3，200mmol/L NaCl和10mg/ml含有1％Tween 20的牛血清白蛋白)中的50μL的35S標(biāo)記的TSH受體(25,000～30,000cpm)以使50μL的等份的經(jīng)稀釋待測(cè)樣品加倍，并在室溫孵育2小時(shí)。然后免疫復(fù)合物通過(guò)添加蛋白A瓊脂糖(Sigma-Aldtich)而沉淀并在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
TSH受體制備物與蛋白質(zhì)印跡在CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)全長(zhǎng)人TSH受體，將其用1％ Triton X-100提取，如以前所述用TSH受體單克隆抗體親和層析法純化(Y Oda、JSanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B Rees Smith；“用單克隆抗體對(duì)人促甲狀腺素(TSH)受體進(jìn)行表位分析”；甲狀腺2000；101051～1059)。
將純化的CHO細(xì)胞產(chǎn)生的TSH受體在9％SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，將其印跡雜交到硝酸纖維素上，如以前所述與待測(cè)抗體反應(yīng)(YOda、J Sanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B Rees Smith；“用單克隆抗體對(duì)人促甲狀腺素(TSH)受體進(jìn)行表位分析”；甲狀腺2000；101051～1059)。
用TSH受體肽進(jìn)行表位分析各自長(zhǎng)度為25個(gè)氨基酸的覆蓋了人TSH受體的整個(gè)胞外區(qū)的26個(gè)肽由J Morris博士惠贈(zèng)(JC Morris、ER Bergert、DJ McCormik，“人促甲狀腺素受體的結(jié)構(gòu)-功能研究，用合成的人TSH受體肽抑制標(biāo)記的促甲狀腺素(TSH)的結(jié)合(Structure-fuction studies of the human thyrotropinreceptor.Inhibition of binding of labeled thyrotropin(TSH)by synthetichuman TSH receptor peptides”；生物化學(xué)雜志1993；26810900～10905)。將結(jié)合到M21-OH5Mab(S Chen、J Sawicka、L Prentice、JF Sanders、HTanaka、V Petersen、C Betterle、M Volpato、S Roberts、M Powell、B ReesSmith、J Furmaniak；“用一組單克隆抗體分析類固醇21-羥化酶上的自身抗體表位(Analysis of autoantibody epitopes on steroid 21-hydroxylase usinga panal of monoclonal antibodies)”；臨床內(nèi)分泌學(xué)和代謝雜志(Journal ofClinical Endocrinology and Metabolism)1998；832977～2986)上的人21-OH肽(C1，SSSRVPYKDRARLPL)用作陽(yáng)性對(duì)照，將GAD65的人單克隆抗體(N Hayakawa、LDKE Premawardhana、M Powell、M Masuda、C Arnold、J Sanders、M Evans、S Chen、JC Jaume、S Baekkeskov、B ReesSmith、J Furmaniak；“谷氨酸脫羧酶的人單克隆抗體的分離和表征”；自體免疫2002；35343～355)用作陰性對(duì)照。如以前所述，進(jìn)行肽ELISA(Y Oda、J Sanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B Rees Smith；“用單克隆抗體對(duì)人促甲狀腺素(TSH)受體進(jìn)行表位分析”；甲狀腺2000；101051～1059)。
單克隆TSHR自身抗體制備物與包被到塑料試管上或ELISA板的孔上的TSH受體的相互作用(a)125I標(biāo)記的自身抗體將包括患者血清的待測(cè)樣品(100μl)在TSH受體包被的試管(RSRLtd.)中，于室溫輕搖孵育2小時(shí)。抽吸后，將試管用1mL測(cè)定緩沖液洗滌兩次，然后加入100μL的已標(biāo)記的自身抗體制備物(30,000cpm)，并于室溫下振蕩孵育1小時(shí)。然后將試管用1mL測(cè)定緩沖液洗滌兩次，抽吸并在gamma計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。對(duì)125I標(biāo)記的自身抗體結(jié)合的抑制用對(duì)TSH結(jié)合的抑制的公式計(jì)算(見(jiàn)上)。
(b)生物素標(biāo)記的單克隆自身抗體和生物素標(biāo)記的TSH使用以前描述的方法(J Bolton、J Sanders、Y Oda、C Chapman、RKonno、J Furmaniak和B Rees Smith；“通過(guò)ELISA測(cè)定甲狀腺刺激激素受體自身抗體(Measurement of thyroid-stimulating hormone receptorautoantibodies by ELISA)”；臨床化學(xué)(Clinical Chemistry)1999；452285～2287)。簡(jiǎn)而言之，在ELISA板振蕩器上，將包括患者血清的待測(cè)樣品(75μl)在TSH受體包被的ELISA板的孔(RSR Ltd.)中，振蕩(振蕩200次/每分鐘)孵育2小時(shí)。然后移走待測(cè)樣品，并用測(cè)定緩沖液洗滌所述孔兩次。然后加入生物素標(biāo)記的單克隆TSH受體自身抗體(100μl中1ng)或生物素標(biāo)記的豬TSH(RSR Ltd.；100μl中5ng)并將其于室溫下繼續(xù)孵育25分鐘但不振蕩。將所述孔洗滌一次，并加入100μl的鏈親和素-過(guò)氧化物酶(RSR Ltd.；100μl中10ng)并于室溫下繼續(xù)孵育20分鐘但不振蕩。然后，將所述孔洗滌三次，加入過(guò)氧化物酶底物四甲基聯(lián)苯胺(RSR Ltd.；100μl)。于室溫下不振蕩地孵育30分鐘后，加入50μl的0.5M H2SO4以終止底物的反應(yīng)，在ELISA平板讀數(shù)器上讀取每孔在450nm處的吸光度。對(duì)生物素?；腗Ab或TSH結(jié)合的抑制用如下計(jì)算的指標(biāo)表示
單克隆自身抗體結(jié)合到TSH受體包被的試管的斯卡查德分析將50μl測(cè)定緩沖液中的非標(biāo)記IgG或Fab，和50μl的125I標(biāo)記的hMAb IgG或Fab(測(cè)定緩沖液中30,000cpm)在室溫下輕搖孵育2小時(shí)，用1mL的測(cè)定緩沖液洗滌兩次，并在gamma計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。對(duì)結(jié)合的IgG或Fab的濃度相對(duì)于結(jié)合的/游離的IgG或Fab的濃度進(jìn)行制圖(GScatchard；“蛋白質(zhì)對(duì)小分子和離子的吸引(The attraction of proteins forsmall molecules and ions)”，紐約科學(xué)研究院年報(bào)(Annals of the New YorkAcademy of Sciences)1949；51660～672)以得出締合常數(shù)。
TSH受體結(jié)合到用單克隆TSH受體自身抗體包被的試管上將包括患者血清的待測(cè)樣品(100μl)和去污劑溶解的TSH受體(20μl)在室溫孵育1小時(shí)。然后將50μl(兩等份)的孵育混合物加入塑料試管(Nunc Maxisorp)中，該試管已經(jīng)用單克隆TSH受體自身抗體Fab所包被(200μl的10μg/mL Fab，4℃過(guò)夜，隨后進(jìn)行洗滌和后包被)。在室溫輕搖孵育1小時(shí)后，洗滌試管，加入100μl(40,000cpm)125I標(biāo)記的TSH受體C末端單克隆抗體4E31(J Sanders、Y Oda、A Kiddie、TRichards、J Bolton、V McGrath、S Walters、D Jaskolski、J Furmaniak、BRees Smith；TSH受體自身抗體與125I標(biāo)記的TSH受體間的相互作用；臨床內(nèi)分泌學(xué)和代謝雜志1999；843797～3802)，并繼續(xù)再輕搖孵育1小時(shí)。然后，洗滌試管并對(duì)125I進(jìn)行計(jì)數(shù)。
在E Coli(大腸桿菌)中克隆和表達(dá)重組hMAb TSHR1 Fab將hMAb TSHR1重鏈的RT-PCR產(chǎn)物(參見(jiàn)可變區(qū)基因分析部分)用XhoI和SpeI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，將hMAb TSHR1輕鏈的PCR產(chǎn)物用ScaI和XbaI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，將重鏈和輕鏈cDNA均克隆到Immunozap H/L載體中(Stratagene Europe；Amsterdam，Netherlands)(I Matthews，G Sims，S Ledwidge，D Stott，D Beeson，N Willcox，AVincent；“患有肌無(wú)力的經(jīng)產(chǎn)婦女中的乙酰膽堿受體抗體被胎兒抗原免疫的證據(jù)(Antibodies to acetylcholine receptor in parous women withmyastheniaevidence for immunization by fetal antigen)”，LaboratoryInvestigation(實(shí)驗(yàn)室研究)2002；821～11)，并位于lacZ啟動(dòng)子的控制下。將質(zhì)粒DNA用Qiagen midi質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen Ltd.；Crawley，RH10 9AX，UK)制備，hMAb TSHR1重鏈和輕鏈cDNA的存在通過(guò)Sanger-Coulson法(F Sanger、S Nicklen、AR Coulsen；“用鏈終止抑制劑進(jìn)行DNA測(cè)序”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)研究院年報(bào)1977；745463～5467)測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到2個(gè)不同的E Coli菌株中(a)XL1-BlueMRF’(Stratagene)和(b)HB2151(Amersham Biosciences)，并在LB氨芐青霉素(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，100μg/ml的終濃度氨芐青霉素)瓊脂平板(15g/L瓊脂)上于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將預(yù)培養(yǎng)物(于3mL的LB氨芐青霉素+1％葡萄糖中的一個(gè)菌落)在37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。在葡萄糖的存在下，重組Fab的產(chǎn)生受到抑制。將過(guò)夜孵育后的預(yù)培養(yǎng)以1/100(50ml LB氨芐青霉素中0.5mL)稀釋，并于37℃培養(yǎng)直至OD600為0.4～0.6。將這些培養(yǎng)物置于30℃振蕩20分鐘。然后，加入異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)直至終濃度為1mmol/L，將培養(yǎng)物繼續(xù)于30℃振蕩孵育過(guò)夜(16小時(shí))。然后，將培養(yǎng)物于4℃、3000rpm離心30分鐘，并回收培養(yǎng)物上清液和沉淀。將沉淀通過(guò)渦旋而重懸在1mL冰浴TES緩沖液(0.2mol/L Tris-HCl pH8.0，0.5mol/LEDTA和0.5mol/L蔗糖)中。再加入1.5mL在水中稀釋5倍的冰浴TES緩沖液，將混合物再次渦旋并在冰上孵育30分鐘，隨后再次離心以提供第二次上清液或周質(zhì)成分(PF)。將培養(yǎng)物上清液和PF通過(guò)0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾，并過(guò)夜?jié)B析到pH為7.5的10mmol/L Tris和50mmol/L NaCl中。還制備來(lái)自以下細(xì)胞的上清液和PF未轉(zhuǎn)化的XL-1 Blue MRF’和HB2151細(xì)胞，用培養(yǎng)時(shí)含葡萄糖但不含IPTG(即，未誘導(dǎo)的)的hMAbTSHR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的XL1-Blue MRF’(XL-1 Blue MRF’/hMAb TSHR1)和用hMAb TSHR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的HB2151(HB2151/hMAb TSHR1)。對(duì)培養(yǎng)物上清液和PF進(jìn)行以下分析(a)它們抑制TSH結(jié)合到TSHR上的能力，(b)它們?cè)诒磉_(dá)TSHR的CHO細(xì)胞中刺激環(huán)腺苷酸生產(chǎn)的能力，和(c)通過(guò)放射性免疫測(cè)定的總重組Fab濃度。在該分析中，將稀釋在測(cè)定緩沖液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl Ph7.8、0.1％ TritonX-100)中的校準(zhǔn)物和包括培養(yǎng)物上清液和PF(100μL，兩份)的待測(cè)物質(zhì)于室溫在用Fab特異性羊抗人IgG(來(lái)自Sigma Aldrich，Poole，BH124QH，UK)包被的塑料試管中孵育1小時(shí)。然后將試管用測(cè)定緩沖液(2×1mL)洗滌兩次，加入100μL的125I標(biāo)記的hMAb TSHR1 Fab(30,000cpm)，然后在室溫孵育。1小時(shí)后，再次洗滌(2×1mL)試管并對(duì)125I進(jìn)行計(jì)數(shù)。將結(jié)合的計(jì)數(shù)針對(duì)校準(zhǔn)物(5ng/mL～500ng/mL)中的Fab(雜交瘤產(chǎn)生的hMAb TSHR1 Fab)的濃度進(jìn)行制圖且從該校準(zhǔn)曲線讀出各種待測(cè)物質(zhì)中的重組Fab的濃度。該分析的檢測(cè)限是5ng/mL～10ng/mL的Fab。
重組4B4(谷氨酸脫羧酶或GAD的人MAb)和重組雜交Fab(混合的hMAb TSHR1和4B4的HC和LC)的克隆和表達(dá)重組4B4 Fab(N Hayakawa、LDKE Premawardhana、M Powell、MMasuda、C Arnold、J Sanders、M Evans、S Chen、JC Jaume、S Baekkeskov、B Rees Smith、J Furmaniak，谷氨酸脫羧酶的人單克隆抗體的分離和表征，自體免疫2002；第35卷，第343～355頁(yè)中詳細(xì)描述了4B4)且通過(guò)將各自的HC和LC克隆到Immunozap H/L載體中并如上述重組體hMAbTSHR1 Fab那樣在HB2151細(xì)胞中被表達(dá)來(lái)生產(chǎn)重組雜交Fab。對(duì)培養(yǎng)物上清液和周質(zhì)成分進(jìn)行以下分析(a)它們抑制TSH結(jié)合到TSHR上的能力，(b)它們?cè)诒磉_(dá)TSHR的CHO細(xì)胞中刺激環(huán)腺苷酸產(chǎn)生的能力，和(c)如上述的總重組體Fab濃度。此外，按照如下所述測(cè)定GAD Ab活性。
培養(yǎng)物上清液和周質(zhì)成分中的重組GAD Ab Fab活性的測(cè)定使用基于以下情況的測(cè)定GAD Ab Fab制備物抑制125I標(biāo)記的GAD(來(lái)自RSR Ltd.，Cardiff，CF23 8HE，UK)結(jié)合到GAD的人單克隆抗體(4B4)上的能力。在該測(cè)定中，將稀釋在GAD Ab測(cè)定緩沖液(150mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.1體積％Tween 20、1g/L牛血清白蛋白和0.5g/L NaN3)中的待測(cè)樣品(50μL，兩份)與125I標(biāo)記的GAD(50μL GAD Ab測(cè)定緩沖液中30,000cpm)于室溫孵育1小時(shí)。然后，加入50μL的4B4 IgG(在GAD Ab測(cè)定緩沖液中為0.1μg/mL)，并繼續(xù)在室溫孵育24小時(shí)。然后，將固相蛋白A(在GAD Ab測(cè)定緩沖液中，為50μL；來(lái)自RSR Ltd.)加入到4B4 IgG-125I標(biāo)記的GAD的沉淀復(fù)合物中(蛋白A不與Fab和125I標(biāo)記的GAD的復(fù)合物反應(yīng))。在使與蛋白A的反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)后，通過(guò)離心使沉淀物沉淀(4℃，1500g離心30分鐘)，用1mL的GAD Ab測(cè)定緩沖液洗滌并對(duì)125I進(jìn)行計(jì)數(shù)。在沒(méi)有4B4 IgG的情況下，125I標(biāo)記的GAD結(jié)合是所加入的總cpm的4％～5％。
hMAb TSHR1的抗獨(dú)特型抗體的生產(chǎn)將6～8周齡BALB/c鼠用完全弗氏佐劑中的50μg hMAb TSHR1 Fab進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫，隨后在25天后用不完全弗氏佐劑中的50μg hMAbTSHR1 Fab進(jìn)行第二次腹膜內(nèi)免疫，并在移走脾臟前4天進(jìn)行再一次的50μg hMAb TSHR1 Fab注射。將來(lái)自抗體陽(yáng)性鼠的脾臟細(xì)胞(見(jiàn)下述)與鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合并如上述分離的TSHR MAb的方法分離單克隆抗體。通過(guò)對(duì)125I-hMAb TSHR1 Fab結(jié)合到TSHR包被的試管上的抑制來(lái)測(cè)定鼠血清和培養(yǎng)孔中的抗獨(dú)特型抗體的水平。尤其是，將60μL待測(cè)樣品(兩等份，在測(cè)定緩沖液中稀釋，所述測(cè)定緩沖液為50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH7.8、0.1％ Triton X-100)與60μL125I-hMAb TSHR1Fab(稀釋在測(cè)定緩沖液中，為30,000cpm)于室溫下孵育1小時(shí)。將100μL的混合物轉(zhuǎn)移到具有20μL起始緩沖液(見(jiàn)上)的兩個(gè)同樣的由TSHR包被的試管(RSR Ltd.)中，并于室溫繼續(xù)再振蕩孵育兩小時(shí)。然后，將試管用2×1mL測(cè)定緩沖液洗滌并對(duì)125I進(jìn)行計(jì)數(shù)。從待測(cè)樣品對(duì)標(biāo)記的hMAb TSHR1 Fab結(jié)合到TSHR包被的試管上的抑制能力明顯看出與hMAb TSHR1反應(yīng)的抗獨(dú)特型抗體的存在。
結(jié)果獲自20mL患者血液的淋巴細(xì)胞(30×106)以1×106個(gè)細(xì)胞/孔鋪在48孔平板上，所述孔中具有在鼠巨噬細(xì)胞飼養(yǎng)層上的200μL EBV上清液。在EBV感染后第11天，監(jiān)測(cè)上清液對(duì)125I-TSH結(jié)合的抑制。發(fā)現(xiàn)一個(gè)孔的結(jié)合抑制呈陽(yáng)性，到第16天抑制水平升高至超過(guò)90％并維持這一水平直到第24天，此后，該水平下降。使培養(yǎng)物展平并在EBV感染后第21、23、26和27天與K6H6/B5細(xì)胞融合；總共進(jìn)行了7個(gè)融合實(shí)驗(yàn)。每一融合在3塊96孔板(即，總共21塊板)間鋪板，并獲得一個(gè)孔，該孔穩(wěn)定生產(chǎn)具有125I-TSH結(jié)合抑制活性的抗體。隨后進(jìn)行3輪的再克隆以獲得生產(chǎn)人單克隆抗體的單克隆，該抗體抑制被標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSH受體上。將該人單克隆TSH受體自身抗體稱為hMAb TSHR1，且屬于具有l(wèi)ambda輕鏈的IgG1亞型。
不同濃度的hMAb TSHR1 IgG和Fab抑制被標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSH受體上的能力如圖1所示。如圖1所示，低至1ng/mL的這些制備物對(duì)TSH結(jié)合的抑制超過(guò)用1000ng/mL所獲得的抑制的90％。如圖2所示，TSMAb TSHR1 IgG和Fab同樣刺激用TSH受體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的環(huán)腺苷酸的產(chǎn)生。低至1ng/mL的hMAb TSHR1 IgG或Fab引起對(duì)環(huán)腺苷酸的強(qiáng)烈刺激。用0.1ng/mL的豬TSH和10ng/mL的人TSH也觀察到了相似的抑制水平。對(duì)于來(lái)自最初淋巴細(xì)胞供體的血清(在獲取用于淋巴細(xì)胞分離的血樣的同時(shí)獲取的)抑制被標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSH受體上的能力，和刺激TSH受體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的環(huán)腺苷酸產(chǎn)生的能力的比較如圖3所示。TSH結(jié)合的抑制可以用稀釋500倍的血清檢測(cè)到，然而對(duì)環(huán)腺苷酸的刺激可以用稀釋5000倍的血清檢測(cè)到。
125I-標(biāo)記的hMAb TSHR1 IgG結(jié)合到TSH受體包被的試管上，斯卡查德分析顯示締合常數(shù)為5×1010/mol。該結(jié)合被來(lái)自突眼性甲狀腺腫患者的血清所抑制，該患者具有TSH受體自身抗體(可以通過(guò)對(duì)TSH受體結(jié)合的抑制來(lái)檢測(cè))(表1)。125I-標(biāo)記的hMAb TSHR1 Fab也結(jié)合到TSH受體包被的試管上(進(jìn)行斯卡查德分析，締合常數(shù)＝4.5×1010/mol)，且該結(jié)合被TSH受體自身抗體陽(yáng)性的突眼性甲狀腺腫患者的血清所抑制(表2)。此外，去污劑溶解的制備物能夠結(jié)合到用hMAb TSHR1包被的塑料試管上，且該結(jié)合可以被含有TSH受體自身抗體的血清所抑制(表3)。
如表4所示，hMAb TSHR1-生物素結(jié)合到TSH受體包被的ELISA板上且該結(jié)合被國(guó)際參考制備物NIBSC 90/672和來(lái)自突眼性甲狀腺腫患者的血清所抑制。在來(lái)自健康獻(xiàn)血者的血清中沒(méi)有觀察到對(duì)結(jié)合的抑制。圖3a表示基于hMAb TSHR1-生物素的TSHR自身抗體的檢測(cè)與以前的檢測(cè)之間的比較曲線圖?；趆MAb TSHR1-生物素的測(cè)定靈敏度明顯超過(guò)根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672可檢測(cè)的濃度。這在對(duì)來(lái)自72個(gè)突眼性甲狀腺腫患者的血清進(jìn)行的研究中得以確認(rèn)，如圖3b所示。在該研究中，健康獻(xiàn)血者血清(n＝100)和來(lái)自非甲狀腺疾病的患者的血清(n＝43)分別給出了達(dá)10％的對(duì)hMAb TSHR1結(jié)合的抑制和達(dá)11％的對(duì)TSH結(jié)合的抑制。
hMAb TSHR1 IgG既沒(méi)有在蛋白質(zhì)印跡分析中與全長(zhǎng)TSH受體制備物反應(yīng)，也沒(méi)有在免疫沉淀反應(yīng)或TSH受體肽ELISA中與125S標(biāo)記的全長(zhǎng)TSH受體反應(yīng)。該反應(yīng)性的缺乏表明hMAb TSHR1與TSH受體上的構(gòu)象表位而不是線性表位發(fā)生反應(yīng)。
對(duì)編碼hMAb TSHR1的基因進(jìn)行序列分析，表明重鏈V區(qū)基因?qū)儆赩H5家族，D基因?qū)儆贒6-13家族，J基因?qū)儆贘H5家族；對(duì)于輕鏈，V基因區(qū)來(lái)自VL1-11種系，J基因區(qū)來(lái)自JL3b種系。重鏈核苷酸和氨基酸序列分別如圖4和圖5所示，輕鏈核苷酸和氨基酸序列分別如圖6和圖7所示。這些序列是用簡(jiǎn)并PCR引物測(cè)定的HC和LC核苷酸序列的改進(jìn)。具體地，鑒定了核苷酸115～120的HC測(cè)序人工構(gòu)造體。測(cè)序顯示為cacgtg(轉(zhuǎn)錄成氨基酸His Val)，而其晶體結(jié)構(gòu)更可靠地顯示氨基酸為GlnLeu(相應(yīng)的堿基為cagctg)。晶體結(jié)構(gòu)分析還使得HC和LC來(lái)源的氨基酸序列，尤其是在簡(jiǎn)并PCR引物區(qū)中的氨基酸序列得以改進(jìn)。在通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)LC的氨基酸2為Pro的情況下，但通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)為Thr。在通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)HC的氨基酸2為Met的情況下，但通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)為Val。
在抑制被標(biāo)記的TSH結(jié)合方面對(duì)hMAb TSHR1 IgG制備物和TSH受體自身抗體的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的比較如表5所示。這使得當(dāng)在血清中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，hMAb TSHR1 IgG的特異性活性估測(cè)為NIBSC 90/672的138個(gè)單位/mg蛋白質(zhì)；當(dāng)在測(cè)定緩沖液中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，估測(cè)為NIBSC 90/672的163個(gè)單位/mg(兩者的平均值＝150個(gè)單位/mg)。hMAb TSHR1 Fab制備物在血清和測(cè)定緩沖液中分別為288和309個(gè)單位/mg(二者的平均值＝300個(gè)單位/mg)。表6顯示了對(duì)淋巴細(xì)胞供體血清和供體血清IgG進(jìn)行的相似的分析?？梢?jiàn)供體血清含有的平均值為NIBSC 90/672的0.38個(gè)單位/mL(在血清和測(cè)定緩沖液中分別為0.36和0.4)，供體血清IgG具有的特異性活性的平均值為0.059個(gè)單位/mg蛋白質(zhì)。將這些結(jié)果總結(jié)在表7中，與hMAb TSHR1 IgG的特異性活性(150個(gè)單位/mg)進(jìn)行比較，表明單克隆抗體IgG在抑制TSH結(jié)合方面的活性比淋巴細(xì)胞供體血清IgG的活性高于2500倍。
關(guān)于不同IgG和血清制備物在被TSH受體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中刺激環(huán)腺苷酸的活性方面的最初評(píng)價(jià)也在表7中示出。對(duì)環(huán)腺苷酸的刺激測(cè)定的特征在于，測(cè)定中和測(cè)定間的變化性相當(dāng)大。這涉及幾個(gè)因素，包括在最初接種到96孔板中的細(xì)胞的數(shù)目和質(zhì)量的不同，及接種的細(xì)胞在隨后48小時(shí)期間生長(zhǎng)率的不同。因此，對(duì)hMAb TSHR1 IgG和Fab、淋巴細(xì)胞供體血清、血清IgG和NIBSC 90/672的測(cè)定重復(fù)進(jìn)行，結(jié)果概括在表8中。在刺激測(cè)定中hMAb TSHR1 IgG的特異性活性為318個(gè)單位/mg，與之相比，淋巴細(xì)胞供體血清IgG的特異性活性為0.1個(gè)單位/mg；即單克隆自身抗體IgG在刺激環(huán)腺苷酸生產(chǎn)方面大約是供體血清IgG的3000倍。該值與對(duì)TSH結(jié)合的抑制測(cè)定所觀測(cè)到值為2500倍合理吻合(參見(jiàn)上述表5和表6)。表9表示hMAb TSHR1 IgG和Fab和淋巴細(xì)胞供體血清IgG的TSH受體刺激效應(yīng)的進(jìn)一步分析。
豬TSH和hMAb TSHR1 IgG在表達(dá)TSH受體的CHO細(xì)胞中對(duì)環(huán)腺苷酸生產(chǎn)的刺激可以另外參見(jiàn)表10所示的結(jié)果。
用參考制備物NIBSC 90/672刺激環(huán)腺苷酸生產(chǎn)測(cè)定中所觀察到的典型結(jié)果如表11所示。
表12和13表示不同的E.Coli培養(yǎng)物上清液分別在抑制被標(biāo)記的TSH結(jié)合和刺激環(huán)腺苷酸生產(chǎn)方面的效應(yīng)。轉(zhuǎn)化的(用hMAb TSHR1質(zhì)粒)和IPTG誘導(dǎo)的兩個(gè)E.Col菌株培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組hMAb TSHR Fab量足以用作TSH結(jié)合的有效抑制劑(表12)和環(huán)腺苷酸生產(chǎn)的有效刺激劑(表13)。對(duì)照培養(yǎng)物上清液(來(lái)自未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和被轉(zhuǎn)化但未被誘導(dǎo)的細(xì)胞)不產(chǎn)生可檢測(cè)水平的結(jié)合抑制(表12)或刺激(表13)活性。
在其它的對(duì)照組實(shí)驗(yàn)中，對(duì)重組人抗體Fab進(jìn)行分析，所述重組人抗體Fab通過(guò)克隆和表達(dá)GAD的人單克隆抗體(4B4)的HC和LC而產(chǎn)生。對(duì)培養(yǎng)物上清液和周質(zhì)成分進(jìn)行測(cè)定，表明重組4B4 Fab不具有可檢測(cè)的對(duì)TSH結(jié)合的抑制活性(表14和15)或TSHR刺激活性(表16和17)。此外，由(a)hMAb TSHR1 HC和4B4 LC(b)hMAb TSHR1LC和4B4 HC組成的雜合Fab在任何測(cè)定中都不顯示與TSHR的相互作用(表14～17)。在這些不同的重組Fab制備物中GAD Ab活性的測(cè)定僅能夠在用4B4 HC和4B4 LC轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中檢測(cè)到GAD Ab的表達(dá)(表18和19)。重組hMAb TSHR1 Fab不顯示可檢測(cè)到的GAD Ab活性，由4B4和hMAb TSHR1 HC和LC組成的混合物構(gòu)成的重組Fab雜合體也不顯示可檢測(cè)到的GAD Ab活性(表18和19)。
hMAb TSHR1對(duì)用TSHR轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的環(huán)腺苷酸生成的刺激能力被含有TSHR自身抗體的患者血清所抑制，所述TSHR自身抗體擔(dān)當(dāng)TSH拮抗劑(圖8)。此外，TSHR的鼠單克隆抗體(9D33)能阻斷hMAb TSHR1刺激活性(表20)，然而另一TSHR鼠MAb(2B4)是無(wú)效的(表20)。然而，2B4能夠如9D33那樣阻斷TSH的刺激活性(表21)。表22顯示2B4和9D33抑制125I標(biāo)記的TSH和125I標(biāo)記的hMAbTSHR1結(jié)合到TSHR塑料試管上的能力。9D33能夠非常有效地抑制標(biāo)記的TSH的結(jié)合和標(biāo)記的hMAb TSHR1的結(jié)合(10μg/mL時(shí)高于50％的抑制)。2B4是標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSHR上的有效的抑制劑(1μg/mL時(shí)高于80％的抑制)，但對(duì)hMAb TSHR1結(jié)合(1μg/mL時(shí)11％的抑制)或?qū)?D33結(jié)合(1μg/mL時(shí)22％的抑制)僅有較小的效應(yīng)。標(biāo)記的9D33與TSHR包被的試管的結(jié)合被來(lái)自突眼性甲狀腺腫患者的含有TSHR自身抗體的血清所抑制(通過(guò)對(duì)標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSHR上的抑制來(lái)測(cè)定)，但是健康獻(xiàn)血者血清和來(lái)自其它自體免疫疾病患者的血清幾乎沒(méi)有效應(yīng)或沒(méi)有效應(yīng)(表23)。標(biāo)記的9D33與TSHR的結(jié)合被具有TSH激動(dòng)劑或拮抗劑特性的TSHR自身抗體(表24)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672(表25)所抑制。斯卡查德分析表明9D33和2B4對(duì)包被到塑料試管上的TSH受體分別具有2×1010/mol和1×1010/mol的親和力。
用hMAb TSHR1 Fab免疫鼠導(dǎo)致在鼠的血清中產(chǎn)生抗體(多克隆抗體)，該抗體能夠以這樣的方式結(jié)合到hMAb TSHR1 Fab上從而抑制Fab結(jié)合到TSHR上的能力(表26)。此外，從用hMAb TSHR1 Fab免疫的鼠的脾臟細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體也能抑制Fab結(jié)合到TSHR上(表27)。
我們所有的分析表明人單克隆自身抗體hMAb TSHR1具有存在于淋巴細(xì)胞供體血清中的TSH受體自身抗體的TSH受體結(jié)合和甲狀腺刺激特性。如上詳述那樣，單克隆抗體也能被制備為重組Fab制備物。
結(jié)論(a)我們已經(jīng)制備了TSH受體的人單克隆自身抗體，它與供體患者的血清中的TSH受體自身抗體具有相似的特性。該單克隆抗體也被制備為重組Fab制備物。
(b)單克隆抗體IgG和Fab和重組Fab制備物是有效的甲狀腺刺激物和標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSH受體上的有效抑制劑。
(c)標(biāo)記的MAb IgG、Fab制備物與TSH受體的結(jié)合被來(lái)自突眼性甲狀腺腫患者的TSH受體自身抗體陽(yáng)性血清所抑制，但未被健康獻(xiàn)血者血清或來(lái)自其它自體免疫疾病患者的血清所抑制?；趯?duì)標(biāo)記的hMAb TSHR1結(jié)合到TSH受體上的抑制的用于TSHR自身抗體的測(cè)定系統(tǒng)比迄今為止所描述的其它測(cè)定的靈敏度更高。
(d)用作TSH拮抗劑的TSH受體自身抗體和用作TSH激動(dòng)劑的TSH受體自身抗體抑制標(biāo)記的hMAb TSHR1結(jié)合到TSH受體上。
(e)包被到塑料試管上的hMAb TSHR1制備物結(jié)合TSH受體，且這種結(jié)合被在不同患者血清中的TSH受體自身抗體所抑制。
(f)還發(fā)現(xiàn)抑制hMAb TSHR1結(jié)合到TSHR上的鼠單克隆抗體(9D33)也阻斷hMAb TSHR1和TSH的刺激活性。
(g)已制備了hMAb TSHR1的鼠多克隆和單克隆抗體，該多克隆和單克隆抗體以這樣的方式結(jié)合hMAb TSHR1以阻止其結(jié)合到TSHR受體上。因此這些抗獨(dú)特型抗體與TSHR競(jìng)爭(zhēng)hMAb TSHR1，這樣，它們?cè)谛枰猅SHR自身抗體的結(jié)合配偶體的應(yīng)用中可以是TSHR的有用替代物。
(h)這些結(jié)果表明hMAb TSHR1和/或其衍生物和/或其競(jìng)爭(zhēng)劑可在以下情況中用作TSH的替代物(i)對(duì)TSH受體自身抗體、TSH和相關(guān)配基的測(cè)定。
(ii)各種體內(nèi)應(yīng)用，包括提供TSH激動(dòng)劑和拮抗劑活性。
(iii)鑒定和提供新類型的TSH受體自身抗體結(jié)合位點(diǎn)。
表1 患者血清對(duì)125I-標(biāo)記的hMAb TSHR1 IgG結(jié)合到TSH受體上的影響及其與對(duì)125I-標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSH受體上的影響的比較

G1～G11是來(lái)自具有突眼性甲狀腺腫病史的患者的血清。
G9血清具有高水平的TSH阻斷(即TSH拮抗劑活性)。
G10和G11具有高水平的甲狀腺刺激活性。
G10是淋巴細(xì)胞供體血清。
/10、/20等表示在健康獻(xiàn)血者血清的池中的稀釋因子。
N1～N10是來(lái)自健康獻(xiàn)血者的血清。
D1來(lái)自1型糖尿病患者(谷氨酸脫羧酶抗體呈陽(yáng)性)。
A1和A2來(lái)自阿狄森氏病的患者(類固醇21-羥化酶自身抗體呈陽(yáng)性)。
在存在健康獻(xiàn)血者血清池時(shí)，大約25％的125I-標(biāo)記的MAb IgG結(jié)合到TSHR包被的試管上。
表2 患者血清對(duì)125I-標(biāo)記的hMAb TSHR1 Fab結(jié)合到TSH受體上的影響及其與對(duì)125I-標(biāo)記的TSH結(jié)合到TSH受體上的影響的比較

表3 TSHR與用hMAb TSHR1 Fab包被的塑料試管的結(jié)合和用含有TSHR自身抗體的血清抑制TSHR結(jié)合

1用TSHR C-末端的125I-標(biāo)記的鼠單克隆抗體來(lái)檢測(cè)TSHR結(jié)合；總cpm＝39,000/試管表4 患者血清樣品對(duì)生物素標(biāo)記的hMAb TSHR1和生物素標(biāo)記的TSH結(jié)合到用TSHR包被的ELISA板孔上的影響

HBD＝健康獻(xiàn)血者血清U/mL是NIBSC 90/672的單位血清P1～P7來(lái)自突眼性甲狀腺腫患者表5 用WHO參考制備物NIBSC 90/672和hMAB TSHR1 IgG和Fab制備物抑制TSH結(jié)合

1健康獻(xiàn)血者血清池，在僅有該血清池存在的條件下，14.9％的總cpm結(jié)合到TSHR上；在僅有緩沖液存在的條件下，14.7％的總cpm結(jié)合到TSHR上。
22G4是甲狀腺過(guò)氧化物酶的人單克隆自身抗體。
表6 用淋巴細(xì)胞供體血清和供體血清IgG抑制TSH結(jié)合

1健康獻(xiàn)血者血清池血清，在僅有該血清池存在的條件下，14.7％的總cpm結(jié)合到TSHR上；在僅有緩沖液存在的條件下，16.3％的總cpm結(jié)合到TSHR上。
2所示單位是NIBSC 90/672國(guó)際TSHR自身抗體參考制備物。
表7 hMAb TSHR1、淋巴細(xì)胞供體血清和IgG制備物的特異性活性

1所示單位是NCBSC 90/672。
2該值是在血清和測(cè)定緩沖液中所獲得的結(jié)果的平均值(參見(jiàn)表5和6)。
表8 在多個(gè)對(duì)環(huán)腺苷酸的刺激的測(cè)定中確定的hMAb TSHR1、淋巴細(xì)胞供體血清和血清IgG的特異性活性的概要


表9 在環(huán)腺苷酸刺激測(cè)定中對(duì)hMAb TSHR1 IgG和Fab及淋巴細(xì)胞供體血清IgG的影響的進(jìn)一步分析

12G4是甲狀腺過(guò)氧化物酶的人單克隆自身抗體。
表10 TSH和hMAb TSHR1 IgG在對(duì)環(huán)腺苷酸的刺激的測(cè)定中的加和效應(yīng)

1所顯示的值是非常相符的重復(fù)測(cè)定的平均值表11 NCBSC 90/672在環(huán)腺苷酸刺激測(cè)定中的效應(yīng)

表12 在兩個(gè)不同的大腸桿菌菌株(XL-1 Blue MRF’和HB2151細(xì)胞)中表達(dá)的重組hMAb TSHR1 Fab對(duì)125I-TSH結(jié)合到TSHR包被的試管上的抑制

1測(cè)定緩沖液＝50mmol/L Nacl、10mmol/L Tris-HCl pH7.82所有稀釋都在測(cè)定緩沖液中3對(duì)結(jié)合的抑制用以下公式計(jì)算 其中，A＝在待測(cè)樣品存在下的結(jié)合B＝在測(cè)定緩沖液存在下的結(jié)合表13 表達(dá)在兩個(gè)不同的大腸桿菌菌株(XL-1 Blue MRF’和HB2151細(xì)胞)中的重組hMAb TSHR1 Fab對(duì)由TSHR轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的cAMP產(chǎn)生的刺激

1測(cè)定緩沖液＝含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 2-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的Hank’s緩沖鹽溶液(不含NaCl)，pH7.42在測(cè)定緩沖液中稀釋3基底＝在僅有測(cè)定緩沖液的條件下產(chǎn)生的cAMP
表14 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab(一種GAD的人MAb)和重組雜合Fabs(兩種Fab的混合HC和LC)對(duì)125I-TSH結(jié)合到TSHR包被的試管上的抑制。在大腸桿菌HB2151細(xì)胞中表達(dá)。
周質(zhì)成分的測(cè)定

1對(duì)結(jié)合的抑制用以下公式計(jì)算 其中，A＝在待測(cè)樣品存在下的125I-TSH結(jié)合百分比B＝在測(cè)定緩沖液存在下的125I-TSH結(jié)合百分比a在未誘導(dǎo)的細(xì)胞中的TSHR Ab活性的檢測(cè)是由于啟動(dòng)子的組成活性，它在沒(méi)有IPTG的條件下提供低水平的Fab表達(dá)。
ud＝不可檢測(cè)表15 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab(一種GAD的人MAb)和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對(duì)125I-TSH結(jié)合到TSHR包被的試管上的抑制。在大腸桿菌HB2151細(xì)胞中表達(dá)。
培養(yǎng)物上清液的測(cè)定

1參見(jiàn)表14的腳注ud＝不可檢測(cè)表16 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab(一種GAD的人MAb)和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對(duì)在由TSHR轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的環(huán)腺苷酸產(chǎn)生的刺激。在大腸桿菌HB2151細(xì)胞中表達(dá)。
培養(yǎng)物上清液的測(cè)定

1測(cè)定緩沖液＝含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 2-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的Hank’s緩沖鹽溶液(不含NaCl)，pH7.42在測(cè)定緩沖液中稀釋3基底＝在僅有測(cè)定緩沖液的條件下產(chǎn)生的環(huán)腺苷酸a在未誘導(dǎo)的細(xì)胞中的環(huán)腺苷酸刺激活性的檢測(cè)是由于啟動(dòng)子的組成活性，它在沒(méi)有IPTG的條件下提供低水平的Fab表達(dá)?？傊亟MFab水平是不能檢測(cè)到的(檢測(cè)限＝5ng/mL～10ng/mL)，而對(duì)環(huán)腺苷酸的刺激的測(cè)定可以檢測(cè)到低至0.3ng/mL的hMAb TSHR1 Fab。
ud＝不可檢測(cè)表17 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab(一種GAD的人MAb)和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對(duì)在由TSHR轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的環(huán)腺苷酸產(chǎn)生的刺激。在大腸桿菌HB2151細(xì)胞中表達(dá)。
周質(zhì)成分的測(cè)定

ud＝不可檢測(cè)；1，2，3參見(jiàn)表16的腳注。
a在未誘導(dǎo)的細(xì)胞中的TSHR Ab活性的檢測(cè)是由于啟動(dòng)子的組成活性，它在沒(méi)有IPTG的條件下提供了低水平的表達(dá)。
表18 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對(duì)4B4 IgG(一種由雜交瘤產(chǎn)生的GAD的人MAb)結(jié)合到125I-GAD上的抑制。在大腸桿菌HB2151細(xì)胞中表達(dá)。
周質(zhì)成分的測(cè)定

1對(duì)結(jié)合的抑制用以下公式計(jì)算 其中，A＝在待測(cè)樣品存在下的125I-GAD結(jié)合B＝在測(cè)定緩沖液存在下的125I-GAD結(jié)合ud＝不可檢測(cè)表19 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對(duì)4B4 IgG(一種由雜交瘤產(chǎn)生的GAD的人MAb)結(jié)合到125I-GAD上的抑制。在大腸桿菌HB2151細(xì)胞中表達(dá)。
培養(yǎng)物上清液的測(cè)定

1參見(jiàn)表18腳注ud＝不可檢測(cè)表20 TSHR的鼠單克隆抗體對(duì)表達(dá)TSHR的CHO細(xì)胞中的對(duì)環(huán)腺苷酸生產(chǎn)的刺激的影響，所述刺激由hMAb TSHR1所誘導(dǎo)

1全部稀釋都在測(cè)定緩沖液中完成(該測(cè)定緩沖液＝含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 2-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的Hank’s緩沖鹽溶液(不含NaCl)，pH7.4)2基底＝在僅有測(cè)定緩沖液的條件下的環(huán)腺苷酸產(chǎn)生32G2是甲狀腺球蛋白的鼠單克隆抗體(100μg/mL的IgG制備物)42B4和9D33是TSHR的鼠單克隆抗體(100μg/mL的IgG制備物)
表21 TSHR的鼠單克隆抗體對(duì)表達(dá)TSHR的CHO細(xì)胞中的對(duì)cAMP產(chǎn)生的刺激的影響，所述刺激由pTSH所誘導(dǎo)

1，2，4參見(jiàn)表20的腳注。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，作為對(duì)照的甲狀腺球蛋白的鼠MAb(2G2 IgG 100μg/mL)顯示對(duì)pTSH(0.5ng/mL)刺激環(huán)腺苷酸產(chǎn)生沒(méi)有影響(pTSH加上測(cè)定緩沖液＝12.7×基底；pTSH加上2G2＝11.7×基底)。
表22 不同MAb對(duì)125I-TSH、125I-hMAb TSHR1或125I-9D33結(jié)合到TSHR包被的試管上的抑制

1所有稀釋均在健康獻(xiàn)血者血清池中(HBD池)2對(duì)結(jié)合的抑制用以下公式計(jì)算

其中，A＝在待測(cè)樣品存在下的結(jié)合百分比B＝在HBD池存在下的結(jié)合百分比作為對(duì)照的甲狀腺球蛋白的鼠MAb(2G2 0.001μg/mL～100μg/mL)對(duì)標(biāo)記的TSH、hMAb TSHR1或9D33的結(jié)合沒(méi)有影響表23 患者血清對(duì)125I-9D33和125I-TSH結(jié)合到TSHR包被的試管上的影響

1HBD池＝健康獻(xiàn)血者血清池G1～G20是來(lái)自突眼性甲狀腺腫患者的血清D1和D2來(lái)自1型糖尿病患者(對(duì)谷氨酸脫羧酶自身抗體呈陽(yáng)性)A1和A2來(lái)自阿狄森氏病患者(對(duì)類固醇21-羥化酶自身抗體呈陽(yáng)性)N1～N9來(lái)自單個(gè)健康獻(xiàn)血者2對(duì)結(jié)合的抑制用以下公式計(jì)算 其中，A＝在測(cè)試血清存在下的結(jié)合百分比B＝在健康獻(xiàn)血者血清池存在下的結(jié)合百分比表24 具有TSH激動(dòng)劑和TSH拮抗劑活性的患者血清對(duì)125I-9D33結(jié)合到TSHR包被的試管上的影響

1HBD池＝健康獻(xiàn)血者血清池，待測(cè)血清在該池中稀釋血清A和B具有TSH拮抗劑活性血清C和D具有TSH激動(dòng)劑活性2對(duì)結(jié)合的抑制利用表23中所用的公式進(jìn)行計(jì)算表25 NIBSC90/672對(duì)125I-9D33和125I-TSH結(jié)合到TSHR包被的試管上的影響

190/672稀釋在健康獻(xiàn)血者血清池中2對(duì)結(jié)合的抑制利用表23中所用的公式進(jìn)行計(jì)算表26 來(lái)自用hMAb TSHR1 Fab免疫的鼠的血清中的多克隆hMAbTSHR1抗獨(dú)特型抗體對(duì)125I-hMAb TSHR1 Fab結(jié)合到TSHR包被的試管上的抑制

1待測(cè)樣品稀釋在測(cè)定緩沖液中。在測(cè)定緩沖液存在下的結(jié)合為43％2對(duì)結(jié)合的抑制用以下公式計(jì)算

其中，A＝在待測(cè)樣品存在下的125I-hMAb TSHR1結(jié)合百分比B＝在測(cè)定緩沖液存在下的125I-hMAb TSHR1結(jié)合百分比表27 鼠單克隆抗特異型抗體7E51 IgG對(duì)125I-hMAb TSHR1 Fab結(jié)合到TSHR包被的試管上的抑制

1參見(jiàn)表26的腳注序列表<110>RSR有限公司<120>促甲狀腺素受體的抗體及其用途<130>FCI05GB0399<150>GB 0227964.4<151>2002-11-29<150>GB 0302140.9<151>2003-01-29<150>GB 0315147.9<151>2003-06-27<160>38<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>121<212>PRT<213>人(human)<400>1Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Arg Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Lys Gly His Val Thr Val Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn Trp Gly100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>5<212>PRT<213>人<400>2Ser Tyr Trp Ile Asn1 5<210>3<211>17<212>PRT<213>人<400>3Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Lys1 5 10 15Gly<210>4<211>12<212>PRT<213>人<400>4Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn1 5 10<210>5<211>131<212>PRT<213>人<400>5Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Arg Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Lys Gly His Val Thr Val Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125Val Phe Pro130<210>6<211>111<212>PRT<213>人<400>6Leu Thr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Arg Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn20 25 30Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gln65 70 75 80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95Asp Ser Gln Leu Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly100 105 110<210>7<211>13<212>PRT<213>人<400>7Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn1 5 10<210>8<211>7<212>PRT<213>人<400>8Tyr Asp Asp Gln Leu Pro Ser1 5<210>9<211>11<212>PRT<213>人<400>9Thr Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asp Ser Gln Leu1 5 10<210>10<211>363<212>DNA<213>人<400>10caaatgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaggg gttctggata caggtttacc agctactgga tcaactgggt gcgccagctg120cccgggaaag gcctagagtg gatgggcagg attgatccta ctgactctta taccaactac180agtccatcct tcaaaggcca cgtcaccgtc tcagctgaca agtccatcaa cactgcctac240ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accggcatgt attactgtgc gaggctcgaa300
ccgggctata gcagcacctg gtccgtaaat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc360tca 363<210>11<211>15<212>DNA<213>人<400>11agctactgga tcaac 15<210>12<211>51<212>DNA<213>人<400>12aggattgatc ctactgactc ttataccaac tacagtccat ccttcaaagg c 51<210>13<211>36<212>DNA<213>人<400>13ctcgaaccgg gctatagcag cacctggtcc gtaaat 36<210>14<211>394<212>DNA<213>人<400>14caaatgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaggg gttctggata caggtttacc agctactgga tcaactgggt gcgccagctg120cccgggaaag gcctagagtg gatgggcagg attgatccta ctgactctta taccaactac180agtccatcct tcaaaggcca cgtcaccgtc tcagctgaca agtccatcaa cactgcctac240ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accggcatgt attactgtgc gaggctcgaa300ccgggctata gcagcacctg gtccgtaaat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc360tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccc394<210>15<211>333<212>DNA
<213>人<400>15ctgcctgtgc tgactcagcc accctcggtg tctggagccc ccaggcagag ggtcaccatc 60tcctgttctg gaaacagctc caacatcgga aataatgctg taaactggta ccagcagctc120ccaggaaagg ctcccaaact cctcatttat tatgatgatc aactgccctc aggggtctct180gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tccgcctccc tggccatccg tgggctccag240tctgaggatg aggctgatta ttactgtaca tcatgggatg acagcctgga tagtcaactg300ttcggcggag ggaccaggct gaccgtccta ggt 333<210>16<211>39<212>DNA<213>人<400>16tctggaaaca gctccaacat cggaaataat gctgtaaac39<210>17<211>21<212>DNA<213>人<400>17tatgatgatc aactgccctc a 21<210>18<211>33<212>DNA<213>人<400>18acatcatggg atgacagcct ggatagtcaa ctg 33<210>19<211>119<212>PRT<213>鼠(mouse)<400>19Asp Val Gln Ile Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Arg Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser115<210>20<211>5<212>PRT<213>鼠<400>20Thr Tyr Trp Met His1 5<210>21<211>17<212>PRT<213>鼠<400>21Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>22<211>10<212>PRT<213>鼠
<400>22Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>23<211>124<212>PRT<213>鼠<400>23Asp Val Gln Ile Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Arg Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro115 120<210>24<211>106<212>PRT<213>鼠<400>24Gly Val Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>25<211>10<212>PRT<213>鼠<400>25Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His1 5 10<210>26<211>7<212>PRT<213>鼠<400>26Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser1 5<210>27<211>9<212>PRT<213>鼠<400>27Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr1 5
<210>28<211>110<212>PRT<213>鼠<400>28Gly Val Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Leu Met Leu100 105 110<210>29<211>357<212>DNA<213>鼠<400>29gacgtccaga tccagcagcc tgggactgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgagactg 60tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gaagcagagg120cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactat180aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac240atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagaaactac300ggtagtggct actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
<210>30<211>15<212>DNA<213>鼠<400>30acctactgga tgcac 15<210>31<211>51<212>DNA<213>鼠<400>31gagattgatc cttctgatag ttatactaac tataatcaaa agttcaaggg c 51<210>32<211>30<212>DNA<213>鼠<400>32aactacggta gtggctacta ctttgactac 30<210>33<211>373<212>DNA<213>鼠<400>33gacgtccaga tccagcagcc tgggactgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgagactg 60tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gaagcagagg120cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactat180aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac240atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagaaactac300ggtagtggct actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc360aaaacaacac ccc 373<210>34<211>318<212>DNA<213>鼠<400>34ggcgttgaga tgacacagtc gccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc120acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc180ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggagactgaa240gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtggacgtt cggtggaggc300accaaactgg aaatcaaa 318<210>35<211>30<212>DNA<213>鼠<400>35agtgccagct caagtgtaag ttacatgcac 30<210>36<211>21<212>DNA<213>鼠<400>36gacacatcca aactggcttc t 21<210>37<211>27<212>DNA<213>鼠<400>37cagcagtgga gtagtaaccc gtggacg 27<210>38<211>331<212>DNA<213>鼠<400>38ggcgttgaga tgacacagtc gccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc120acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc180ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggagactgaa240gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtggacgtt cggtggaggc300accaaactgg aaatcaaacg gctgatgctg c 33權(quán)利要求
1.一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
2.一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自人單克隆抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
3.一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自人重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
4.一種人單克隆抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，該抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
5.一種人重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
6.一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自與TSH受體反應(yīng)的人重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。
7.如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體在對(duì)TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制方面，具有患者血清TSH受體自身抗體的特性。
8.如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體在對(duì)表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激方面，具有患者血清TSH受體自身抗體的特性。
9.如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體在對(duì)TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制方面和對(duì)表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激方面，具有患者血清TSH受體自身抗體的特性。
10.如權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于所述結(jié)合配偶體對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg。
11.如權(quán)利要求10所述的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于所述結(jié)合配偶體對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg。
12.如權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于所述結(jié)合配偶體對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg。
13.如權(quán)利要求12所述的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于所述結(jié)合配偶體對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg。
14.如權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)所述的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述結(jié)合配偶體的特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg。
15.如權(quán)利要求14所述的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述結(jié)合配偶體的特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg。
16.如權(quán)利要求1～15中任一項(xiàng)所述的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自與TSH受體反應(yīng)的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于，對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg。
17.如權(quán)利要求16所述的結(jié)合配偶體，其特征在于，該結(jié)合配偶體對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg。
18.如權(quán)利要求1～17中任一項(xiàng)所述的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自與TSH受體反應(yīng)的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于，對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約50個(gè)單位/mg。
19.如權(quán)利要求18所述的結(jié)合配偶體，其特征在于，該結(jié)合配偶體對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約400個(gè)單位/mg。
20.如權(quán)利要求1～19中任一項(xiàng)所述的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自與TSH受體反應(yīng)的單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約50個(gè)單位/mg。
21.如權(quán)利要求20所述的結(jié)合配偶體，其特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約400個(gè)單位/mg。
22.一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含抗體VH區(qū)，該抗體抗體VH區(qū)選自如SEQ ID NO.1所示的VH區(qū)或包含一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4。
23.一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含如SEQ ID NO.1所示的抗體VH區(qū)。
24.一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR，該VHCDR的氨基酸序列選自SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
25.一種TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)選自由以下組成的組如SEQ ID NO.1所示的VH區(qū)和含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；和/或抗體VL區(qū)，該抗體VL區(qū)選自由以下組成的組如SEQ ID NO.6所示的VL區(qū)和含有一個(gè)或多個(gè)VLCDR的VL區(qū)，所述VLCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
26.如權(quán)利要求25的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含與SEQ ID NO.6所示的抗體VL區(qū)配對(duì)的如SEQ ID NO.1所示的抗體VH區(qū)，以提供抗體結(jié)合位點(diǎn)；該結(jié)合配偶體同時(shí)包含針對(duì)TSH受體的所述VH和VL區(qū)。
27.如權(quán)利要求25的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)包含含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；和/或抗體VL區(qū)，該抗體VL區(qū)包含含有一個(gè)或多個(gè)VLCDR的VL區(qū)，所述VLCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
28.一種能結(jié)合到TSH受體上的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體與如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，所述另外的結(jié)合配偶體不包含TSH。
29.如權(quán)利要求28所述的另外的結(jié)合配偶體，其包含另外的抗體，該另外的抗體具有針對(duì)TSH受體表位區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，且該另外的結(jié)合配偶體與如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的結(jié)合配偶體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上。
30.如權(quán)利要求29所述的另外的結(jié)合配偶體，其包含或源自人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
31.如權(quán)利要求29所述的另外的結(jié)合配偶體，其包含或源自鼠單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)。
32.如權(quán)利要求28～31中任一項(xiàng)所述的另外的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述另外的結(jié)合配偶體的特征在于，對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg。
33.如權(quán)利要求32所述的另外的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述另外的結(jié)合配偶體的特征在于，對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg。
34.如權(quán)利要求28～33中任一項(xiàng)所述的另外的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述另外的結(jié)合配偶體的特征在于，對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg。
35.如權(quán)利要求34所述的另外的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述另外的結(jié)合配偶體的特征在于，對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672約240單位/mg。
36.如權(quán)利要求28～35中任一項(xiàng)所述的另外的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述另外的結(jié)合配偶體的特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg。
37.如權(quán)利要求36所述的另外的結(jié)合配偶體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述另外的結(jié)合配偶體的特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672約240單位/mg。
38.一種能結(jié)合到TSH受體上的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體與如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，所述另外的結(jié)合配偶體含有如SEQ ID NO.19所示的抗體VH區(qū)。
39.一種能結(jié)合到TSH受體上的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體與如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，所述另外的結(jié)合配偶體包含抗體，該抗體VH區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR，該VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22。
40.一種能結(jié)合到TSH受體上的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體與如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，所述另外的結(jié)合配偶體包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)選自由以下組成的組如SEQ ID NO.19所示的VH區(qū)和含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21或SEQ ID NO.22；和/或抗體VL區(qū)，該抗體VL區(qū)選自由以下組成的組如SEQ ID NO.24所示的VL區(qū)和含有一個(gè)或多個(gè)VLCDR的VL區(qū)，所述VLCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.26或SEQ ID NO.27。
41.如權(quán)利要求40所述的另外的結(jié)合配偶體，所述另外的結(jié)合配偶體包含與如SEQ ID NO.24所示的抗體VL區(qū)配對(duì)的如SEQ ID NO.19所示的抗體VH區(qū)，以提供抗體結(jié)合位點(diǎn)；所述另外的結(jié)合配偶體同時(shí)包含針對(duì)TSH受體的所述VH和VL區(qū)。
42.如權(quán)利要求40所述的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體包含抗體VH區(qū)，該抗體VH區(qū)包含含有一個(gè)或多個(gè)VHCDR的VH區(qū)，所述VHCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22；和/或抗體VL區(qū)，該抗體VL區(qū)包含含有一個(gè)或多個(gè)VLCDR的VL區(qū)，該VLCDR的氨基酸序列選自SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27。
43.一種多核苷酸，該多核苷酸包含(i)如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9所示的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列；(ii)編碼如權(quán)利要求22～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或編碼如權(quán)利要求22～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列；(iii)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼序列不同于(i)的任意序列的核苷酸序列；(iv)包含(i)的任意序列的等位變異的核苷酸序列；(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)的任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的任意序列的片段并編碼權(quán)利要求22～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、獨(dú)立的CDR區(qū)、F(ab′)2片段或scFv片段的核苷酸序列；(vi)由核苷酸堿基的突變、缺失或取代而不同于(i)的任意序列并編碼如權(quán)利要求22～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或編碼如權(quán)利要求22～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列。
44.一種多核苷酸，該多核苷酸包含(i)如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列；(ii)編碼如權(quán)利要求38～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體或編碼如權(quán)利要求38～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列；(iii)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼序列不同于(i)的任意序列的核苷酸序列；(iv)包含(i)的任意序列的等位變異的核苷酸序列；(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)的任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的任意序列的片段并編碼如權(quán)利要求38～42中任一項(xiàng)所述的另外的結(jié)合配偶體的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、獨(dú)立的CDR區(qū)、F(ab′)2片段或scFv片段的核苷酸序列；(vi)由核苷酸堿基的突變、缺失或取代而不同于(i)的任意序列并編碼如權(quán)利要求38～42中任一項(xiàng)所述的另外的結(jié)合配偶體或編碼如權(quán)利要求38～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體的抗體VH區(qū)、VL區(qū)或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列。
45.一種具有生物學(xué)功能的載體系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)攜帶有權(quán)利要求43或44所述的多核苷酸且能將該多核苷酸引入到宿主生物體的基因組中。
46.一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞用如權(quán)利要求43或44所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
47.一種提供TSH受體的人單克隆抗體的方法，該方法包括如下步驟(i)提供來(lái)自受試者的淋巴細(xì)胞源，所述受試者具有TSH受體抗體活性，在對(duì)TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制方面，所述TSH受體活性大于NIBSC 90/672的約0.04個(gè)單位/mL血清；(ii)從所述(i)的淋巴細(xì)胞源分離淋巴細(xì)胞；(iii)使所分離的淋巴細(xì)胞無(wú)限增殖；和(iv)克隆該無(wú)限增殖的淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生分泌TSH受體的人單克隆抗體的無(wú)限增殖化克隆，所述TSH受體的人單克隆抗體如權(quán)利要求1、2、4、7～27中任一項(xiàng)所述。
48.一種提供TSH受體的人單克隆抗體的方法，該方法包括如下步驟(i)提供來(lái)自受試者的淋巴細(xì)胞源，該受試者具有TSH受體抗體活性，在對(duì)表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性方面，所述TSH受體抗體活性大于NIBSC 90/672的約0.1個(gè)單位/mL血清；(ii)從所述(i)的淋巴細(xì)胞源分離淋巴細(xì)胞；(iii)使所分離的淋巴細(xì)胞無(wú)限增殖；和(iv)克隆該無(wú)限增殖的淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生分泌TSH受體的人單克隆抗體的無(wú)限增殖化克隆，所述TSH受體的人單克隆抗體如權(quán)利要求1、2、4、7～27中任一項(xiàng)所述。
49.如權(quán)利要求47或48所述的方法，該方法包括從外周血、甲狀腺組織、脾臟組織、淋巴結(jié)或者骨髓分離淋巴細(xì)胞。
50.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述的淋巴細(xì)胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特征，在對(duì)TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制方面，所述TSH受體抗體水平高于NIBSC 90/672的約0.1個(gè)單位/mL血清。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述的淋巴細(xì)胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特征，在對(duì)TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制方面，所述TSH受體抗體水平高于NIBSC 90/672的約0.2個(gè)單位/mL血清。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述的淋巴細(xì)胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特征，在對(duì)TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制方面，所述TSH受體抗體水平在NIBSC 90/672的約0.3個(gè)單位/mL血清～0.5個(gè)單位/mL血清的范圍內(nèi)。
53.如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述的淋巴細(xì)胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特征，在對(duì)表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性方面，所述TSH受體抗體水平高于NIBSC 90/672的約0.3個(gè)單位/mL血清。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述的淋巴細(xì)胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特征，在對(duì)表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性方面，所述TSH受體抗體水平高于NIBSC 90/672的約0.5個(gè)單位/mL血清。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述淋巴細(xì)胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特征，在對(duì)表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性方面，所述TSH受體抗體水平在NIBSC 90/672的約0.5個(gè)單位/mL血清～1.0個(gè)單位/mL血清的范圍內(nèi)。
56.如權(quán)利要求47～55中任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括用EB病毒感染分離的淋巴細(xì)胞，并將由此無(wú)限增殖化的淋巴細(xì)胞與鼠或人細(xì)胞系融合。
57.一種制備TSH受體的人重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段的方法，該方法包括克隆和表達(dá)TSH受體的人單克隆抗體或來(lái)自其的一個(gè)或多個(gè)片段。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中，所述TSH受體的人單克隆抗體通過(guò)權(quán)利要求47～56中任一項(xiàng)所述的方法制備。
59.一種TSH受體的人單克隆或重組抗體，該人單克隆或重組抗體分別獲自如權(quán)利要求47～58中任一項(xiàng)所述的方法。
60.如權(quán)利要求59所述的人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述人單克隆或重組抗體的特征在于，對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg。
61.如權(quán)利要求60的人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述人單克隆或重組抗體的特征在于，對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg。
62.如權(quán)利要求59～61中任一項(xiàng)所述的人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述人單克隆或重組抗體的特征在于，表達(dá)對(duì)于TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg。
63.如權(quán)利要求62的人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述人單克隆或重組抗體的特征在于，對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg。
64.如權(quán)利要求59～63中任一項(xiàng)所述的人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述人單克隆或重組抗體的特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約15個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg。
65.如權(quán)利要求64的人單克隆或重組抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述人單克隆或重組抗體的特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約120個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg。
66.如權(quán)利要求59～65中任一項(xiàng)所述的人單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于，對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg。
67.如權(quán)利要求66所述的一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于，對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg。
68.如權(quán)利要求59～67中任一項(xiàng)所述的人單克隆或重組抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于，對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約50個(gè)單位/mg。
69.如權(quán)利要求68所述的一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于，對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC90/672的約400個(gè)單位/mg。
70.如權(quán)利要求66～69中任一項(xiàng)所述的一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約30個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約50個(gè)單位/mg。
71.如權(quán)利要求70所述的一個(gè)或多個(gè)片段，其特征在于(i)對(duì)于TSH結(jié)合到TSH受體上的抑制活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約240個(gè)單位/mg；和(ii)對(duì)于表達(dá)TSH受體的細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)的刺激活性，至少為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的約400個(gè)單位/mg。
72.如權(quán)利要求47～58中任一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括另外的操作步驟，借此使所獲得的人單克隆或重組抗體經(jīng)過(guò)另外的操作技術(shù)來(lái)獲得如權(quán)利要求28～37中任一項(xiàng)所述的另外的結(jié)合配偶體。
73.如權(quán)利要求28～37中任一項(xiàng)所述的另外的結(jié)合配偶體，該另外的配偶體由權(quán)利要求72所述的方法獲得。
74.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
75.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
76.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有TSH受體的人或非人多克隆抗體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述多克隆抗體發(fā)生相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述多克隆抗體；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
77.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有TSH或其一個(gè)或多個(gè)突變體、類似物、衍生物或片段，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述TSH或其一個(gè)或多個(gè)突變體、類似物、衍生物或片段發(fā)生相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH或其一個(gè)或多個(gè)突變體、類似物、衍生物或片段；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
78.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含對(duì)TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，以允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH的配偶體；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
79.如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體在檢測(cè)獲自受試者的體液樣品中的TSH受體的自身抗體中的用途，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，其中所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度。
80.TSH受體的人或非人多克隆抗體在檢測(cè)獲自受試者的體液樣品中的TSH受體的自身抗體中的用途，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，其中所述多克隆抗體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度。
81.TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段在檢測(cè)獲自受試者的體液樣品中的TSH受體的自身抗體中的用途，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，其中所述TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度。
82.對(duì)TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結(jié)合配偶體在檢測(cè)獲自受試者的體液樣品中的TSH受體的自身抗體中的用途，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，其中所述結(jié)合配偶體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度。
83.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來(lái)自所述受試者的所述體液樣品；(b)在允許TSH受體與針對(duì)TSH受體進(jìn)行應(yīng)答而產(chǎn)生的自身抗體相互作用的條件下，將所述樣品與以下接觸(i)全長(zhǎng)TSH受體，或其一個(gè)或多個(gè)表位，或含有一個(gè)或多個(gè)TSH受體的表位的多肽，和(ii)如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或TSH受體的另外的結(jié)合配偶體，從而允許所述TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽，與存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體或如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體相互作用；和(c)監(jiān)測(cè)所述TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽與存在于所述樣品中的所述自身抗體間的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
84.如權(quán)利要求74～78、83中任一項(xiàng)所述的方法，該方法還應(yīng)用了在以下相互作用中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)的一種或多種競(jìng)爭(zhēng)劑，所述相互作用為分別由上述權(quán)利要求所限定的所述多克隆抗體，TSH或其一個(gè)或多個(gè)突變體、類似物、衍生物或片段，或所述TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與如權(quán)利要求74～78中任一項(xiàng)所定義的所述結(jié)合對(duì)的第二分子，或權(quán)利要求83中所述的TSH受體或其一個(gè)或多個(gè)表位，或所述多肽之間的相互作用。
85.一種用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的TSH受體的結(jié)合配偶體；和(c)用于監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
86.一種用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或TSH受體的另外的結(jié)合配偶體；和(c)用于檢測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
87.一種用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含TSH受體的人或非人多克隆抗體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述多克隆抗體發(fā)生相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述多克隆抗體；和(c)用于監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
88.一種用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段發(fā)生相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)TSH或其一個(gè)或多個(gè)變異體、類似物、衍生物或片段；和(c)用于監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
89.一種用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子包含對(duì)TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子包含結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用，其中所述結(jié)合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測(cè)到基本上相當(dāng)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(b)用于將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH受體的結(jié)合配偶體；和(c)用于監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
90.一種用于在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復(fù)自與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)全長(zhǎng)TSH受體，或其一個(gè)或多個(gè)表位，或含有TSH受體的一個(gè)或多個(gè)表位的多肽；(b)如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或TSH受體的另外的結(jié)合配偶體；(c)用于在允許TSH受體與針對(duì)TSH受體進(jìn)行應(yīng)答而產(chǎn)生的自身抗體發(fā)生相互作用的條件下，將來(lái)自所述受試者的所述體液樣品、所述TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽，與如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或TSH受體的另外的結(jié)合配偶體接觸的單元，從而允許所述TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽，與存在于樣品中的TSH受體的自身抗體，或與如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH結(jié)合配偶體或TSH受體的另外的結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用；和(d)用于監(jiān)測(cè)所述TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)表位或所述多肽，與存在于所述樣品中的所述的自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
91.如權(quán)利要求85～90中任一項(xiàng)所述的試劑盒，該試劑盒還包含在以下相互作用中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)的一種或多種競(jìng)爭(zhēng)劑，所述相互作用為分別由所述權(quán)利要求所限定的所述多克隆抗體，TSH或其一個(gè)或多個(gè)突變體、類似物、衍生物或片段，或所述TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與如權(quán)利要求85～89中任一項(xiàng)所定義的結(jié)合對(duì)的第二分子，或如權(quán)利要求90的所述TSH受體或其一個(gè)或多個(gè)表位，或所述多肽之間的相互作用。
92.一種測(cè)定TSH和相關(guān)配基的方法，所述方法包括(a)提供被懷疑含有或含有TSH或相關(guān)配基的樣品；(b)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用；(c)將所述樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH或相關(guān)配基，或(ii)如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體；和(d)監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的TSH或相關(guān)配基的相互作用，從而提供在所述樣品中存在TSH或相關(guān)配基的指示。
93.一種用于檢測(cè)TSH或相關(guān)配基的試劑盒，該試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用；(b)用于將被懷疑含有或含有TSH或相關(guān)配基的樣品與所述一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子接觸的單元，從而允許所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)存在于所述樣品中的TSH或相關(guān)配基，或(ii)如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體；和(c)用于監(jiān)測(cè)所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與存在于所述樣品中的TSH或相關(guān)配基的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在TSH或相關(guān)配基的指示。
94.一種鑒定TSH受體的另外的結(jié)合配偶體的方法，該另外的結(jié)合配偶體能結(jié)合到TSH受體上并與如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，該另外的結(jié)合配偶體不包含TSH，該方法包括(a)提供一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用；(b)提供待測(cè)的另外的結(jié)合分子，該另外的結(jié)合分子作為TSH受體的潛在的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體與(a)的所述結(jié)合對(duì)的第一分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上；(c)將(b)的所述的另外的結(jié)合分子與(a)的所述的一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子相接觸，從而允許(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)(b)的所述另外的結(jié)合分子，或(ii)(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子；和(d)監(jiān)測(cè)(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與(b)的所述另外的結(jié)合分子的相互作用，從而評(píng)估(b)的所述另外的結(jié)合分子是否與(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上。
95.一種用于鑒定TSH受體的另外的結(jié)合配偶體的試劑盒，該另外的結(jié)合配偶體能結(jié)合到TSH受體上并與如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上，該另外的結(jié)合配偶體不包含TSH，該試劑盒包含(a)一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子，其中所述結(jié)合對(duì)的第一分子含有如權(quán)利要求1～27中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體，所述結(jié)合對(duì)的第二分子含有結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與所述結(jié)合配偶體發(fā)生相互作用；(b)用于將(a)的所述的一對(duì)或多對(duì)結(jié)合分子與待測(cè)的另外的結(jié)合分子接觸的單元，所述另外的結(jié)合分子作為TSH受體的潛在的另外的結(jié)合配偶體，該另外的結(jié)合配偶體與(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上；從而允許(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與以下相互作用(i)所述另外的結(jié)合分子，或(ii)(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子；和(c)用于監(jiān)測(cè)(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第二分子與所述另外的結(jié)合分子的相互作用的單元，從而評(píng)估所述另外的結(jié)合分子是否與(a)的所述結(jié)合對(duì)的所述第一分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TSH受體上。
96.一種鑒定TSH受體的一個(gè)或多個(gè)表位區(qū)的方法，該方法包括將權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與全長(zhǎng)TSH受體或其一個(gè)或多個(gè)片段接觸，從而允許所述TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與所述全長(zhǎng)TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)片段相互作用；并鑒定與所述權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體相互作用的所述全長(zhǎng)TSH受體或所述其一個(gè)或多個(gè)片段的氨基酸。
97.一種或多種抗獨(dú)特型抗體，該抗獨(dú)特型抗體是針對(duì)權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體的結(jié)合區(qū)而產(chǎn)生的。
98.一種抗獨(dú)特型抗體，該抗獨(dú)特型抗體是根據(jù)實(shí)施例制備的7E51IgG。
99.一種鑒定抗體結(jié)合位點(diǎn)的方法，該方法包括用權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體來(lái)篩選噬菌體展示隨機(jī)文庫(kù)。
100.如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體用于治療中。
101.一種在受試者中治療與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體。
1 02.一種藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，同時(shí)含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
103.一種治療受試者中與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，該TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體刺激TSH受體。
104.如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體在制備用于刺激甲狀腺組織或含有TSH受體的組織的藥物中的用途。
105.如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體在制備用于治療甲狀腺癌的藥物中的用途。
106.一種刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織的方法，該方法包括給需要這種刺激的患者施用診斷有效量或治療有效量的如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體。
107.如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與能刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織的一種或更多種另外的試劑的組合，該組合用于在刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織中同時(shí)、單獨(dú)或順序使用。
108.如權(quán)利要求107所述的組合，其中所述一種或更多種另外的試劑包含重組人TSH和/或其一個(gè)或多個(gè)突變體、類似物、衍生物或片段，或這樣的片段的突變體、類似物、衍生物。
109.如權(quán)利要求108所述的組合，其中所述一種或更多種另外的試劑與結(jié)合到TSH受體上無(wú)關(guān)地發(fā)揮作用。
110.一種治療受試者中與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病的方法，包括給所述受試者施用治療有效量的如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，該TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體使TSH受體對(duì)TSH、TSH受體自身抗體或其它刺激物失活或無(wú)應(yīng)答。
111.如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體與能使含有TSH受體的組織對(duì)TSH、TSH受體自身抗體或其它刺激物失活或無(wú)應(yīng)答的一種或更多種另外的試劑的組合。
112.如權(quán)利要求111的組合，其中所述一種或更多種另外的試劑與TSH受體無(wú)關(guān)地發(fā)揮作用。
113.一種治療受試者中與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的如權(quán)利要求28～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體，借此所述另外的結(jié)合配偶體的施用基本上抑制TSH受體與存在于患者的循環(huán)中的自身抗體之間的相互作用，其中所述自身抗體與TSH受體的相互作用造成所述自體免疫疾病或與所述自體免疫疾病相關(guān)。
114.一種治療受試者中與TSH受體的免疫反應(yīng)相關(guān)的自體免疫疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的如權(quán)利要求97或98所述的抗獨(dú)特型抗體，借此所述抗獨(dú)特型抗體的施用基本上抑制TSH受體與存在于患者的循環(huán)中的自身抗體之間的相互作用，其中所述自身抗體與TSH受體的相互作用造成所述自體免疫疾病或與所述自體免疫疾病相關(guān)。
115.一種治療與對(duì)TSH受體的自體免疫相關(guān)的眼眶后組織疾病的方法，該方法包括給患有或被懷疑患有這種疾病的患者施用治療有效量的如權(quán)利要求28～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體。
116.一種治療與對(duì)TSH受體的自體免疫相關(guān)的眼眶后組織疾病的方法，該方法包括給患有或被懷疑患有這種疾病的患者施用治療有效量的如權(quán)利要求97或98所述的抗獨(dú)特型抗體。
117.如權(quán)利要求28～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的另外的結(jié)合配偶體在制備用于治療與TSH受體的激活和/或刺激相關(guān)的眼眶后組織疾病的藥物中的用途。
118.如權(quán)利要求97或98所述的抗獨(dú)特型抗體在制備用于治療與TSH受體的激活和/或刺激相關(guān)的眼眶后組織疾病的藥物中的用途。
119.如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體或另外的配偶體用作要求含有一種或多種TSH受體抗體的患者血清的替代源。
120.如權(quán)利要求1～42中任一項(xiàng)所述的TSH受體的結(jié)合配偶體或另外的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體或另外的配偶體用于要求含有規(guī)定濃度的一種或多種TSH受體抗體的制備物中。
全文摘要
本發(fā)明提供了TSH受體的結(jié)合配偶體，該結(jié)合配偶體包含或源自人單克隆或重組抗體，或其一個(gè)或多個(gè)片段，所述抗體或片段與TSH受體反應(yīng)；以及所述TSH受體的結(jié)合配偶體的用途、應(yīng)用它的診斷和治療方法和針對(duì)其的抗獨(dú)特型抗體。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1717418SQ200380104118
公開日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月29日
發(fā)明者簡(jiǎn)·桑德斯, 雅德維加·富爾馬尼亞克, 伯納德·里斯·史密斯 申請(qǐng)人:Rsr有限公司