本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種調(diào)控Hh信號通路抑制HL-60細(xì)胞的檢測方法。

背景技術(shù)：

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSC).是造血微環(huán)境(hematopoietic microenvironment，HM)的核心組成成分。骨髓造血微環(huán)境中的骨髓基質(zhì)細(xì)胞能調(diào)節(jié)急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的增殖、存活、耐藥。因此，除了直接針對急性髓系白血病的治療外，阻斷白血病與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的相互作用將為白血病的治療提供新的策略。Hedgehog(HH)蛋白屬于分泌蛋白家族，廣泛表達(dá)于哺乳動物，非哺乳動物等多個物種，參與調(diào)控多種腫瘤形成，器官成熟、血管生成，干細(xì)胞分化，免疫細(xì)胞以及胚胎發(fā)育。Hh信號可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)來創(chuàng)造適合腫瘤生存的微環(huán)境，進(jìn)而為腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造環(huán)境。然而，骨髓造血微環(huán)境能否通過Hh信號影響HL-60細(xì)胞的存活仍然不清楚?，F(xiàn)有技術(shù)不清楚HH信號通路在骨髓基質(zhì)細(xì)胞對白血病細(xì)胞生長中是否有作用，所以，本發(fā)明探究骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的HH信號對HL-60細(xì)胞的存活的影響。

HM是由基質(zhì)細(xì)胞(即成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，周圍的網(wǎng)狀細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞)和造血細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性因子、膜結(jié)合因子構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，它們協(xié)同支持正常造血。BMSC是骨髓造血微環(huán)境重要組成成分，骨髓造血微環(huán)境中的BMSC調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，此外BMSC作為白血病細(xì)胞的“避難所”有助于白血病細(xì)胞耐藥和體內(nèi)微小殘留病灶形成。因此，除了針對白血病細(xì)胞的治療，闡明白血病細(xì)胞和BMSC相互作用的機制，將為白血病治療提供新的治療策略。Hh信號通路參與調(diào)控器官成熟、血管生成、干細(xì)胞分化、免疫細(xì)胞以及胚胎發(fā)育，Hh信號通路的異常激活參與多種腫瘤發(fā)生，包括基底細(xì)胞癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，前列腺癌，近年研究發(fā)現(xiàn)Hh信號通路在BMSC對慢性淋巴細(xì)胞性白血病，多發(fā)性骨髓瘤的保護(hù)中起重要作用。那么在BMSC對AML的保護(hù)作用中，該信號通路是否發(fā)揮作用呢？骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子(如GM-CSF、M-CSF、LIF等)促進(jìn)骨髓前體細(xì)胞的增殖，支持長期造血，因此HS-5細(xì)胞能很好地體外模擬骨髓造血微環(huán)境。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控Hh信號通路抑制HL-60細(xì)胞的檢測方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)不清楚HH信號通路在骨髓基質(zhì)細(xì)胞對白血病細(xì)胞生長中是否有作用，骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的HH信號對HL-60細(xì)胞的存活的影響的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種調(diào)控Hh信號通路抑制HL-60細(xì)胞的檢測方法，所述調(diào)控Hh信號通路抑制HL-60細(xì)胞的檢測方法包括：

采用試劑盒檢測不同實驗組間HL-60細(xì)胞的增殖；將HL-60細(xì)胞接種于有或無骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5的96孔板內(nèi),用酶標(biāo)儀測各孔的吸光度OD值,繪制HL-60細(xì)胞的增殖曲線；

采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測各組HL-60細(xì)胞凋亡率；將HL-60細(xì)胞接種于有或無HS-5細(xì)胞的24孔板內(nèi)，每日固定時相收集對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測；

采用半定量RT-PCR方法檢測各實驗組Hedgehog信號通路組成成分GLI 1基因及凋亡基因BCL-2、BCL-XL的表達(dá)；提取總HL-60細(xì)胞RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH基因擴增；

采用免疫熒光法檢測GLI 1蛋白的表達(dá)，收集HL-60細(xì)胞單獨培養(yǎng)組；HL-60+GANT61 10μmol/L培養(yǎng)組；HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組；HL-60+HS-5+GANT6110μmol/L培養(yǎng)組各組48h時HL-60細(xì)胞，PBS液洗，風(fēng)干，兔抗人GLI1抗體孵育；FITC熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗，孵育，PBS液洗，封固，共聚焦顯微鏡下分析。

進(jìn)一步，所述實驗組為：HL-60細(xì)胞單獨培養(yǎng)組；HL-60+GANT61 10μmol/L培養(yǎng)組；HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組；HL-60+HS-5+GANT61 10μmol/L培養(yǎng)組。

進(jìn)一步，采用試劑盒檢測不同實驗組間HL-60細(xì)胞的增殖方法具體包括：

將HL-60細(xì)胞按4×10⁴ml^-1接種于有或無骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5的96孔板內(nèi),100μl/孔,設(shè)定3個復(fù)孔；對照組僅接種骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5；每日固定時相點取1個96孔板，每孔加入10μl CCK 8溶液作用2h，用酶標(biāo)儀測450nm處各孔的吸光度OD值,繪制HL-60細(xì)胞的增殖曲線。

進(jìn)一步，采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率方法包括：

將HL-60細(xì)胞按5×10⁵ml^-1接種于有或無HS-5細(xì)胞的24孔板內(nèi)，每日固定時相收集對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，離心去上清液；用Annexin結(jié)合液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/mL，向細(xì)胞懸液加5μl AnnexinⅤ-FITC混勻，4℃避光孵育15min，加入10μl PI，4℃避光孵育5min，上流式細(xì)胞儀檢測。

進(jìn)一步，RT-PCR檢測HL-60細(xì)胞中Hedgehog信號通路成分和抑凋亡基因表達(dá)方法包括：

RT-PCR法檢測48h的HL-60細(xì)胞GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的表達(dá)；提取總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH基因擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統(tǒng)拍照，照片用Image J進(jìn)行mRNA表達(dá)分析和灰度掃描。

進(jìn)一步，免疫熒光法檢測GLI 1表達(dá)方法包括：

收集HL-60細(xì)胞單獨培養(yǎng)組；HL-60+GANT61 10μmol/L培養(yǎng)組；HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組；HL-60+HS-5+GANT61 10μmol/L培養(yǎng)組各組48h時HL-60細(xì)胞，冷PBS洗2次，100μL細(xì)胞混懸液均勻滴加至多聚賴氨酸包被的載玻片上風(fēng)干，4％多聚甲醛固定30分鐘，PBS液洗3次，5分鐘/次，0.5％Triton X-100透膜處理10分鐘，PBS液洗3次，5分鐘/次，10％山羊血清37℃封閉1h，1∶100的兔抗人GLI1抗體4℃孵育過夜，PBS液洗3次，5分鐘/次，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記1:150的山羊抗兔二抗室溫避光孵育1h,PBS液洗3次，5分鐘/次，終濃度為0.1mg/L PI室溫避光孵育1分鐘，PBS液洗3次，5分鐘/次，封固，共聚焦顯微鏡下分析。

進(jìn)一步，調(diào)控Hh信號通路抑制HL-60細(xì)胞的檢測方法還包括：采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較符合正態(tài)分布采用LSD-t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

進(jìn)一步，骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5為：3×10⁴ml^-1,培養(yǎng)24h。

進(jìn)一步，HS-5細(xì)胞為：1×10⁵ml^-1,培養(yǎng)48h。

進(jìn)一步，GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的RNA分別為：

F5’-TCCTACCAGAGTCCCAAGTTTC-3’、F5’-GAGGAGCTCTTCAGGGACGG-3’、

F5’-ATGGCAGCAGTAAAGCAAGCG-3’、F5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；

逆轉(zhuǎn)錄為cDNA分別為：

R5’-CCAGAATAGCCACAAAGTCCAG-3’、R5’-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3’、R5’-TCATTTCCGACTGAAGAGTGA-3’、R5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3；

GLI1的擴增條件為：95℃5min，94℃30s,58.3℃30s,72℃45s,循環(huán)30次；

BCL-2的擴增條件為：95℃3min，94℃40s,60℃40s,72℃40s,循環(huán)30次；

BCL-XL的擴增條件為：95℃5min，94℃30s,64.5℃30s,72℃45s,循環(huán)30次；

GAPDH的擴增條件為：95℃5min，94℃30s,59℃30s,72℃30s,循環(huán)30次。

本發(fā)明提供的骨髓基質(zhì)細(xì)胞對HL-60細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和抑制凋亡的作用，以GLI為靶點的Hedgehog信號通路抑制劑GANT61 10μmol/L可以逆轉(zhuǎn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的這些作用。共培養(yǎng)體系中HL-60細(xì)胞GLI 1蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)，抑凋亡基因BCL-2和BCL-XL的mRNA表達(dá)上調(diào)。本發(fā)明骨髓基質(zhì)細(xì)胞對急性髓系白血病細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機制可能是骨髓基質(zhì)細(xì)胞激活急性髓系白血病細(xì)胞中的Hedgehog信號通路進(jìn)而上調(diào)下游靶基因BCL-2和BCL-XL的表達(dá)。

本發(fā)明采用人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60與HS-5細(xì)胞體外建立共培養(yǎng)模式，模擬體內(nèi)白血病細(xì)胞與其周圍的造血微環(huán)境的相互作用，研究造血微環(huán)境對白血病細(xì)胞凋亡的影響及作用的可能機制，為探索以阻斷二者相互作用為靶標(biāo)的白血病治療藥物的研制奠定理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的各實驗組中HL-60細(xì)胞增殖情況圖；

圖中：HL-60VS HL-60+HS-5，^*p<0.05；HL-60+HS-5+GANT61VS HL-60+HS-5，^#p<0.05；

圖2是本發(fā)明實施例提供的不同處理組對HL-60細(xì)胞凋亡率的比較圖；

圖中：A、HL-60；B、HL-60+HS-5；C、HL-60+HS-5+GANT61；D.、HL-60+GANT61培養(yǎng)組。

圖3是本發(fā)明實施例提供的不同實驗組HL-60細(xì)胞GLI 1、BCL-XL、BCL-2mRNA表達(dá)情況圖；

圖中：1為HL-60；2為HL-60+GANT61；3為HL-60+HS-5+GANT61；4為HL-60+HS-5；HL-60VS HL-60+HS-5，^*p<0.05；HL-60+HS-5+GANT61VS HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組比較，^#p<0.05；

圖4是本發(fā)明實施例提供的激光共聚焦觀察HL-60細(xì)胞GLI 1表達(dá)狀況(×400)圖；

圖中：HL-60VS HL-60+HS-5比較，^*p<0.05；HL-60+HS-5+GANT61 VS HL-60+HS-5比較，^#p<0.05。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實施例提供的調(diào)控Hh信號通路抑制HL-60細(xì)胞的檢測方法，包括：

采用試劑盒檢測不同實驗組間HL-60細(xì)胞的增殖；將HL-60細(xì)胞接種于有或無骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5的96孔板內(nèi),用酶標(biāo)儀測各孔的吸光度OD值,繪制HL-60細(xì)胞的增殖曲線；

采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測各組HL-60細(xì)胞凋亡率；將HL-60細(xì)胞接種于有或無HS-5細(xì)胞的24孔板內(nèi)，每日固定時相收集對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測；

采用半定量RT-PCR方法檢測各實驗組Hedgehog信號通路組成成分GLI 1基因及凋亡基因BCL-2、BCL-XL的表達(dá)；提取總HL-60細(xì)胞RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH基因擴增；

采用免疫熒光法檢測GLI 1蛋白的表達(dá)，收集HL-60細(xì)胞單獨培養(yǎng)組；HL-60+GANT61 10μmol/L培養(yǎng)組；HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組；HL-60+HS-5+GANT6110μmol/L培養(yǎng)組各組48h時HL-60細(xì)胞，PBS液洗，風(fēng)干，兔抗人GLI1抗體孵育；FITC熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗，孵育，PBS液洗，封固，共聚焦顯微鏡下分析。

GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的RNA序列分別為：

SEQ ID NO1：F5’-TCCTACCAGAGTCCCAAGTTTC-3’、

SEQ ID NO2：F5’-GAGGAGCTCTTCAGGGACGG-3’、

SEQ ID NO3：F5’-ATGGCAGCAGTAAAGCAAGCG-3’、

SEQ ID NO4：F5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；

逆轉(zhuǎn)錄為cDNA分別為：

SEQ ID NO5：R5’-CCAGAATAGCCACAAAGTCCAG-3’、

SEQ ID NO6：R5’-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3’、

SEQ ID NO7：R5’-TCATTTCCGACTGAAGAGTGA-3’、

SEQ ID NO8：R5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。

下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)描述。

1材料與方法

1.1藥物和試劑GANT61為Selleck公司產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；Cell Counting Kit 8(CCK 8試劑盒)購自日本同仁化學(xué)研究所(Dojindo)；AnnexinV FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。Trizol購自于invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于Thermo Fisher Scientific公司，GLI 1抗體購買與Abcam公司。

1.2細(xì)胞株及培養(yǎng)條件骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5和急性髓系白血病細(xì)胞HL-60購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)均采用含10％胎牛血清的RPMI 1640，在37℃，5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞取生長良好，細(xì)胞存活率(臺盼藍(lán)拒染法)＞95％的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3方法

實驗設(shè)4組:HL-60細(xì)胞單獨培養(yǎng)組；HL-60+GANT61 10μmol/L培養(yǎng)組；HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組；HL-60+HS-5+GANT61 10μmol/L培養(yǎng)組。

1.3.1骨髓基質(zhì)細(xì)胞對HL-60細(xì)胞增殖特性的影響將HL-60細(xì)胞按4×10⁴ml^-1接種于有或無骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5(3×10⁴ml^-1,培養(yǎng)24h)的96孔板內(nèi),100μl/孔,設(shè)定3個復(fù)孔。對照組僅接種骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5。每日固定時相點取1個96孔板，每孔加入10μl CCK 8溶液作用2h，用酶標(biāo)儀測450nm處各孔的吸光度(OD)值,繪制HL-60細(xì)胞的增殖曲線。

1.3.2AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率將HL-60細(xì)胞按5×10⁵ml^-1接種于有或無HS-5細(xì)胞(1×10⁵ml^-1,培養(yǎng)48h)的24孔板內(nèi)，每日固定時相收集對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，離心去上清液。用Annexin結(jié)合液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/mL，向細(xì)胞懸液加5μl AnnexinⅤ-FITC混勻，4℃避光孵育15min，加入10μl PI，4℃避光孵育5min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.3RT-PCR檢測HL-60細(xì)胞中Hedgehog信號通路成分和抑凋亡基因表達(dá)RT-PCR法檢測48h的HL-60細(xì)胞GLI1，BCL-2、BCL-XL和GAPDH的表達(dá)。按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行上述基因擴增，擴增條件見(表1)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統(tǒng)拍照，照片用Image J進(jìn)行mRNA表達(dá)分析和灰度掃描。

表1RT-PCR基因信息匯總

1.3.4免疫熒光法檢測GLI 1表達(dá)收集各組48h時HL-60細(xì)胞，冷PBS洗2次，100μL細(xì)胞混懸液均勻滴加至多聚賴氨酸包被的載玻片上風(fēng)干，4％多聚甲醛固定30分鐘，PBS液洗3次，5分鐘/次，0.5％Triton X-100透膜處理10分鐘，PBS液洗3次，5分鐘/次，10％山羊血清37℃封閉1h，兔抗人GLI 1抗體(1∶100)4℃孵育過夜，PBS液洗3次，5分鐘/次，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗(1:150)室溫避光孵育1h,PBS液洗3次，5分鐘/次，終濃度為0.1mg/L PI室溫避光孵育1分鐘，PBS液洗3次，5分鐘/次，封固，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.5采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較符合正態(tài)分布采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1HL-60細(xì)胞增殖曲線通過CCK 8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示(圖1)：與HS-5共培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞生長速度比單獨懸浮培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞快，24h無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，48、72、96h(p<0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與HS-5共培養(yǎng)的HL-60生長速度比GANT61 10μmol/L處理的共培養(yǎng)中的HL-60細(xì)胞快，同樣24h無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，48、72、96h(p<0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60凋亡率的影響

由表2可知，24、48、72h時，HL-60細(xì)胞培養(yǎng)組中HL-60細(xì)胞凋亡率均高于HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組HL-60凋亡率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；24、48、72h時，HL-60+HS-5+GANT61培養(yǎng)組中HL-60細(xì)胞凋亡率均高于HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組HL-60細(xì)胞凋亡率，24h兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，而48、72h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；24、48、72h時，HL-60+GANT61 10μmol/L培養(yǎng)組中HL-60細(xì)胞凋亡率與HL-60細(xì)胞單獨培養(yǎng)組中凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。

綜合表2和圖2可知，HS-5細(xì)胞抑制HL-60細(xì)胞凋亡，然后用GANT61抑制Hedgehog信號通路可以逆轉(zhuǎn)此作用。

表2.不同處理組對HL-60細(xì)胞早期凋亡率的比較(n＝3，)

注：HL-60VS HL-60+HS-5比較，^*p<0.05；

HL-60VS HL-60+GANT61，^#p<0.05；

HL-60+HS-5+GANT61VS HL-60+HS-5，^$p<0.05；

2.3RT-PCR檢測48h時不同實驗組中HL-60細(xì)胞中Hedgehog信號通路成分和抑凋亡基因mRNA表達(dá)情況；

結(jié)果(圖3)示：與HS-5共培養(yǎng)的HL-60的GLI 1、BCL-2、BCL-XL mRNA比GANT61 10μmol/L處理的共培養(yǎng)中的HL-60細(xì)胞、單獨懸浮培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞表達(dá)高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。

2.4細(xì)胞免疫熒光檢測HL-60細(xì)胞中GLI1蛋白的表達(dá)水平

從(圖4)中可以看出，與HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組中的HL-60細(xì)胞相比，HL-60細(xì)胞單獨培養(yǎng)組中熒光強度減弱，HL-60+HS-5+GANT61培養(yǎng)組中HL-60細(xì)胞中的熒光強度比HL-60+HS-5細(xì)胞培養(yǎng)組中的HL-60細(xì)胞弱。

3.討論

Moshaver B等應(yīng)用CFSE熒光標(biāo)記法研究發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5具有促進(jìn)HL-60和原代AML增殖的作用，本實驗應(yīng)用CCK-8法檢測骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5對HL-60細(xì)胞增殖的影響，同樣發(fā)現(xiàn)HS-5細(xì)胞確實可以促進(jìn)HL-60細(xì)胞的增殖，Garrido等研究報道骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5抑制AML細(xì)胞自發(fā)及化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，Konopleva等應(yīng)用無血清及阿糖胞苷誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)鼠基質(zhì)細(xì)胞MS-5具有抑制HL-60凋亡的作用。本發(fā)明無血清預(yù)處理HL-60細(xì)胞48h后，建立共培養(yǎng)體系，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)HS-5細(xì)胞具有抑制HL-60細(xì)胞凋亡的作用。Hh信號通路最早由Nusslein-Volhard和Wieschaus E在1980年進(jìn)行遺傳篩選影響果蠅胚胎形成的因素中發(fā)現(xiàn)。Hh-GLI信號通路包括分泌型信號糖蛋白配體Hh、跨膜蛋白受體Patched(PTCH)以及與G蛋白偶聯(lián)的磷酸化受體Smoothened(Smo)組成的復(fù)合體和膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物(glioma-associated oncogene homolog，GLI)等蛋白成分，GLI是有鋅指結(jié)構(gòu)核轉(zhuǎn)錄因子，哺乳動物有3個GLI的同源基因GLI-1，GLI-2和GLI-3，分別編碼GLI-1，GLI-2和GLI-3蛋白，GLI-3是一個主要的轉(zhuǎn)錄抑制因子，GLI 2存在于全長的活性形式和截短的抑制形式，GLI l僅有活化Hh信號通路的作用，哺乳動物中Hh信號通路的活化還需要初級纖毛的參與。哺乳動物中，當(dāng)Hh配體不存在時，PTCH受體表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)膜，抑制SMO的表達(dá)及初級纖毛定位，從而抑制SMO活性，然后具有抑制作用的GLI 2(GLI-R)片段特別是GLI 3(GLI-3R)片段細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，充分抑制信號通路活化；當(dāng)Hh配體與PTCH受體結(jié)合時，PTCH受體對SMO的抑制作用被解除，促進(jìn)有活性作用的Gli轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，激活下游靶基因表達(dá)，如GLI 1。GLI 1既是Hh信號通路的組成成分，又是信號的轉(zhuǎn)錄靶基因，因此GLI 1可作為信號通路激活的標(biāo)記基因，以此來判斷通路激活的程度。所以本發(fā)明選取檢測GLI 1mRNA和蛋白表達(dá)情況來判斷信號通路活化狀況。Hh信號通路的異?；罨瘏⑴c多種實體腫瘤的發(fā)生，然而Hh信號通路在惡性血液病的發(fā)生中還存在很大爭論。Zhao和Dierks表明BCR-ABL⁺CML干細(xì)胞中存在SMO高表達(dá)導(dǎo)致Hh信號通路活化，抑制SMO可減少CML干細(xì)胞存活，從而使白血病發(fā)病率降低。然而Hofmann等表明Smoothened(SMO)失活對正常造血無影響，包括外周血數(shù)目，干或祖細(xì)胞的數(shù)目或細(xì)胞周期狀態(tài)，造血細(xì)胞集落形成能力，此外，Hh信號通路在MLL-AF9誘導(dǎo)的AML的發(fā)生中沒有起作用。Gao等發(fā)現(xiàn)條件性降低和升高SMO的表達(dá)對正常造血干細(xì)胞的自我更新和功能沒有影響，而且T-ALL的發(fā)生不依賴Hedgehog信號通路。Wellbrock等應(yīng)用Gli為靶點的Hedgehog信號通路特異性抑制劑GANT61和shRNA在體內(nèi)外分析Hh信號通路與AML的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AML患者存在Hh信號通路的異?；罨珿LI的表達(dá)是一個不良的預(yù)后因素，可能是一種新的藥物靶點。Pan等發(fā)現(xiàn)以SMO為靶點的特異性Hh信號通路抑制劑cyclopamine，對HL-60細(xì)胞的增殖和凋亡無影響，然而GANT61 30μmol/L,48h時明顯抑制其增殖、促進(jìn)其凋亡，并且與雷帕霉素具有協(xié)同殺傷作用。本發(fā)明中應(yīng)用GANT61處理的共培養(yǎng)組中HL-60細(xì)胞的增殖速度慢于共培養(yǎng)組中HL-60細(xì)胞的增殖，而且凋亡率也高于共培養(yǎng)組。說明GANT61可以逆轉(zhuǎn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60的保護(hù)作用，同時可推測Hh信號通路在BMSC對急性髓系白血病細(xì)胞的保護(hù)作用中發(fā)揮作用。Hegde等表明cyclopamine能夠抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞對B-CLL細(xì)胞的保護(hù)作用，從而說明Hh信號通路參與這種保護(hù)作用。Dierks等結(jié)果同樣支持上述觀點。為驗證Hh信號通路同樣參與骨髓微環(huán)境對急性髓系白血病的保護(hù)作用，本發(fā)明應(yīng)用RT-PCR和免疫熒光技術(shù)檢測GLI 1在實驗組中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組中的HL-60細(xì)胞GLI 1較HL-60細(xì)胞單獨懸浮培養(yǎng)的高，用GANT61處理共培養(yǎng)組后的GLI 1表達(dá)量比共培養(yǎng)組中的HL-60細(xì)胞低，說明Hh信號通路在BMSC對急性髓系白血病細(xì)胞的保護(hù)作用中發(fā)揮作用。BCL-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，線粒體是其調(diào)控內(nèi)在凋亡途徑的靶點。本發(fā)明檢測BCL-2家族中的抑凋亡基因BCL-2和BCL-XL,結(jié)果與GLI 1在各組中的表達(dá)相一致。Moshaver B和Konopleva實驗表明BMSC可以上調(diào)AML細(xì)胞BCL-2的表達(dá)進(jìn)而抑制其凋亡，支持本發(fā)明結(jié)果。

綜上所述，本發(fā)明表明骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5可以促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞HL-60增殖，抑制其凋亡，這些作用可能是通過激活HL-60細(xì)胞中Hh信號通路進(jìn)而上調(diào)抑凋亡基因BCL-2、BCL-XL實驗，本發(fā)明體外初步探索BMSC對AML增殖和凋亡的影響及可能作用機制，為AML的治療提供新的治療策略。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110> 申請人名稱 石河子大學(xué)

<120>一種調(diào)控Hh信號通路抑制HL-60細(xì)胞的檢測方法

<160>8

<210> 1

<211>22

<212> RNA

<213>人工序列

<400> RNA序列TCCTACCAGAGTCCCAAGTTTC

<210> 2

<211>20

<212> RNA

<213>人工序列

<400> RNA序列GAGGAGCTCTTCAGGGACGG

<210> 3

<211>21

<212> RNA

<213>人工序列

<400> RNA序列ATGGCAGCAGTAAAGCAAGCG

<210> 4

<211>20

<212> RNA

<213>人工序列

<400> RNA序列ACCACAGTCCATGCCATCAC

<210> 5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400> DNA序列CCAGAATAGCCACAAAGTCCAG

<210>6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> DNA序列GGTGCCGGTTCAGGTACTCA

<210> 7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400> DNA序列TCATTTCCGACTGAAGAGTGA

<210>8

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> DNA序列TCCACCACCCTGTTGCTGTA。