本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及eLtaS蛋白作為預(yù)防和治療胰島素抵抗相關(guān)疾病的藥物靶點(diǎn)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胰島素抵抗(insulinresistanc，IR)是指胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，臨床研究發(fā)現(xiàn)，約25％的正常人群存在胰島素抵抗，約75％的糖耐量低減(IGT)人群存在胰島素抵抗，II型糖尿病患者胰島素抵抗的發(fā)生率為85％左右。胰島素抵抗是多種病理變化的始動(dòng)因素，是II型糖尿病、肥胖、高血壓、高脂血癥、高膽固醇、冠心病、胰島素抵抗綜合征、葡萄糖耐量受損、高胰島素血癥等代謝綜合征的共同發(fā)病基礎(chǔ)，會(huì)招致多種器官損害和功能傷害，最后導(dǎo)致動(dòng)脈硬化、腎病、心臟病變、腦血管病變、高尿酸、痛風(fēng)、脂代謝紊亂、非酒精性脂肪肝等合并癥。對(duì)胰島素抵抗的有效控制有助于包括胰島素抵抗綜合征、II型糖尿病、心腦血管病和代謝綜合征等相關(guān)疾病的臨床防治，但目前針對(duì)上述疾病主要采取綜合治療方法，包括飲食控制、運(yùn)動(dòng)療法、使用胰島素增敏劑降低血糖以及利用藥物控制血壓和血脂等，由于缺乏消除其根本致病原因——胰島素抵抗的有效靶點(diǎn)，導(dǎo)致現(xiàn)有治療方法療效有限，而且現(xiàn)有藥物也存在諸多副作用。目前研究認(rèn)為多種因素參與了胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，包括遺傳因素、肥胖、血漿游離脂肪酸水平增高、炎癥因子水平升高等等，但是，目前導(dǎo)致胰島素抵抗的機(jī)制并未明確解析，從而導(dǎo)致拮抗胰島素抵抗的可選的藥物靶點(diǎn)及有效的治療藥物非常有限，缺乏直接拮抗胰島素抵抗進(jìn)而從源頭防治其所致疾病的有效方法。尋找并確認(rèn)直接導(dǎo)致胰島素抵抗的關(guān)鍵分子并進(jìn)一步拮抗其功能，將為胰島素抵抗導(dǎo)致的相關(guān)疾病的治療提供新的途徑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何預(yù)防胰島素抵抗相關(guān)疾病。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了抑制eLtaS蛋白活性和/或表達(dá)量的物質(zhì)在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的功能可為如下A1)至A14)中的至少一種：A1)預(yù)防和/或治療胰島素抵抗；A2)預(yù)防胰島素抵抗相關(guān)疾病；A3)治療胰島素抵抗相關(guān)疾??；A4)促進(jìn)胰島素與膜受體蛋白結(jié)合；A5)促進(jìn)胰島素與靶細(xì)胞結(jié)合；A6)提高胰島素介導(dǎo)的受體磷酸化；A7)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路；A8)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵分子的活化；A9)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力；A10)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的糖攝取能力；A11)促進(jìn)胰島素的降糖作用；A12)降低血清中甘油三酯的濃度；A13)降低餐后血糖濃度；A14)提高糖耐量。eLtaS蛋白作為藥物靶點(diǎn)在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述產(chǎn)品的功能可為如下A1)至A14)中的至少一種：A1)預(yù)防和/或治療胰島素抵抗；A2)預(yù)防胰島素抵抗相關(guān)疾??；A3)治療胰島素抵抗相關(guān)疾??；A4)促進(jìn)胰島素與膜受體蛋白結(jié)合；A5)促進(jìn)胰島素與靶細(xì)胞結(jié)合；A6)提高胰島素介導(dǎo)的受體磷酸化；A7)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路；A8)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵分子的活化；A9)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力；A10)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的糖攝取能力；A11)促進(jìn)胰島素的降糖作用；A12)降低血清中甘油三酯的濃度；A13)降低餐后血糖濃度；A14)提高糖耐量。上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品可為藥物。上述應(yīng)用中，所述A5)中，所述靶細(xì)胞可為HepG2細(xì)胞或C2C12細(xì)胞。上述應(yīng)用中，所述A10)中，所述胰島素可為外源胰島素或內(nèi)源胰島素。上述應(yīng)用中，所述A12)中，所述降低血清中甘油三酯的濃度可為降低哺乳動(dòng)物血清中甘油三酯的濃度。上述應(yīng)用中，所述A13)中，所述降低餐后血糖濃度可為降低哺乳動(dòng)物餐后血糖濃度。上述應(yīng)用中，所述A14)中，所述提高糖耐量可為提高哺乳動(dòng)物糖耐量。eLtaS蛋白在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述產(chǎn)品的功能可為如下C1)至C13)中的至少一種：C1)制備胰島素抵抗的動(dòng)物模型；C2)制備胰島素抵抗相關(guān)疾病的動(dòng)物模型；C3)抑制胰島素與膜受體蛋白結(jié)合；C4)抑制胰島素與靶細(xì)胞結(jié)合；C5)降低胰島素介導(dǎo)的受體磷酸化；C6)抑制胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路；C7)抑制胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵分子的活化；C8)抑制胰島素介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力；C9)抑制胰島素介導(dǎo)的糖攝取能力；C10)抑制胰島素的降糖作用；C11)提高血清中甘油三酯的濃度；C12)提高餐后血糖濃度；C13)降低糖耐量。上述應(yīng)用中，所述C1)或所述C2)中，所述動(dòng)物可為C57BL/6J小鼠。上述應(yīng)用中，所述C4)中，所述靶細(xì)胞可為HepG2細(xì)胞或C2C12細(xì)胞。上述應(yīng)用中，所述C9)中，所述胰島素可為外源胰島素或內(nèi)源胰島素。上述應(yīng)用中，所述C11)中，所述提高血清中甘油三酯的濃度可為提高哺乳動(dòng)物血清中甘油三酯的濃度。上述應(yīng)用中，所述C12)中，所述提高餐后血糖濃度可為提高哺乳動(dòng)物餐后血糖濃度。上述應(yīng)用中，所述C13)中，所述降低糖耐量可為降低哺乳動(dòng)物糖耐量。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的產(chǎn)品，其含有抑制eLtaS蛋白活性和/或表達(dá)量的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的功能可為如下A1)至A14)中的至少一種：A1)預(yù)防和/或治療胰島素抵抗；A2)預(yù)防胰島素抵抗相關(guān)疾病；A3)治療胰島素抵抗相關(guān)疾病；A4)促進(jìn)胰島素與膜受體蛋白結(jié)合；A5)促進(jìn)胰島素與靶細(xì)胞結(jié)合；A6)提高胰島素介導(dǎo)的受體磷酸化；A7)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路；A8)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵分子的活化；A9)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力；A10)促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的糖攝取能力；A11)促進(jìn)胰島素的降糖作用；A12)降低血清中甘油三酯的濃度；A13)降低餐后血糖濃度；A14)提高糖耐量。上述產(chǎn)品中，所述A5)中，所述靶細(xì)胞可為HepG2細(xì)胞或C2C12細(xì)胞。上述產(chǎn)品中，所述A10)中，所述胰島素可為外源胰島素或內(nèi)源胰島素。上述產(chǎn)品中，所述A12)中，所述降低血清中甘油三酯的濃度可為降低哺乳動(dòng)物血清中甘油三酯的濃度。上述產(chǎn)品中，所述A13)中，所述降低餐后血糖濃度可為降低哺乳動(dòng)物餐后血糖濃度。上述產(chǎn)品中，所述A14)中，所述提高糖耐量可為提高哺乳動(dòng)物糖耐量。所述產(chǎn)品可為藥物。上述任一所述eLtaS蛋白可為a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)在a1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。上述任一所述胰島素抵抗相關(guān)疾病可為如下B1)至B16)中的至少一種：B1)胰島素抵抗綜合征；B2)代謝綜合征；B3)肥胖；B4)高血糖；B5)糖尿病；B6)冠心??；B7)高血壓；B8)高血脂；B9)高膽固醇；B10)脂代謝紊亂；B11)心腦血管疾??；B12)高胰島素血癥；B13)高尿酸；B14)葡萄糖耐量受損；B15)非酒精性脂肪肝；B16)痛風(fēng)。上述任一所述哺乳動(dòng)物可為鼠或人。所述鼠具體可為C57BL/6J小鼠。實(shí)驗(yàn)證明，eLtaS蛋白可抑制胰島素與膜受體蛋白結(jié)合、抑制胰島素與靶細(xì)胞結(jié)合、降低胰島素介導(dǎo)的受體磷酸化、抑制胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵分子的活化、抑制胰島素介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力、抑制胰島素介導(dǎo)的糖攝取能力、抑制胰島素的降糖作用、提高血清中甘油三酯的濃度、提高餐后血糖濃度、降低糖耐量等等。因此，eLtaS蛋白可作為預(yù)防和治療胰島素抵抗相關(guān)疾病的藥物靶點(diǎn)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例2步驟一的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2為實(shí)施例3步驟一的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3為實(shí)施例3步驟二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4為實(shí)施例4步驟一的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5為實(shí)施例4步驟二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6為實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖7為實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8為實(shí)施例7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖9為實(shí)施例8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖10為實(shí)施例9步驟二中1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖11為實(shí)施例9步驟二中2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖12為實(shí)施例9步驟二中3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖13為實(shí)施例9步驟二中4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。胰島素、完全免疫佐劑和不完全免疫佐劑均為Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)依次為I2767、F5881和F5506。2-NDBG為T(mén)hermoFisher公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為N13195。proteinA樹(shù)脂、TMB顯色液、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、限制性?xún)?nèi)切酶XhoI和ProteinIsoNi-NTAResin均為北京全式金生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)依次為DP301-01、HE101-01、EP101-01、JE201-01、X201-01和DP101-01。C2C12細(xì)胞為北京協(xié)和細(xì)胞資源中心的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為3111C0001CCC000099。表面等離子共振傳感器和CM5傳感芯片均為GEHealthcare公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為BiacoreT200和29104988。C57BL/6J小鼠為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為213。制備兔抗eLtaS抗體的步驟具體如下：(1)取1mg實(shí)施例1純化獲得的eLtaS蛋白，加入1mLpH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液進(jìn)行溶解，再加入1mL完全免疫佐劑，進(jìn)行混合，得到混合液1；取0.5mg實(shí)施例1純化獲得的eLtaS蛋白，加入1mLpH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液進(jìn)行溶解，再加入1mL不完全免疫佐劑，進(jìn)行混合，得到混合液2；(2)取健康的大耳白兔，背部皮下多點(diǎn)注射混合液1；(3)取完成步驟(2)三周后的大耳白兔，背部皮下多點(diǎn)注射混合液2；(4)取完成步驟(3)兩周后的大耳白兔，背部皮下多點(diǎn)注射混合液2；(5)取完成步驟(4)一周后的大耳白兔，利用動(dòng)脈插管收取大耳白兔血液并分離血清，然后利用proteinA樹(shù)脂純化，獲得兔抗eLtaS抗體。封閉液：含5％(5mg/100mL)BSA的pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液。洗滌液：含0.5‰(0.5mg/1000mL)吐溫-20的pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液。Hfq蛋白和載體pET-28(a)均記載于如下文獻(xiàn)中：劉玉，吳娜，高亞萍等.金黃色葡萄球菌Hfq蛋白體外聚體生成和生物學(xué)功能的研究[J].軍事醫(yī)學(xué),2009,33(1):24-28.金黃色葡萄球菌8325-4記載于如下文獻(xiàn)中：LiuYetal.HfqisaglobalregulatorthatcontrolsthepathogenicityofStaphylococcusaureus.PLoSOne.2010Sep29；5(9).HepG2細(xì)胞記載于如下文獻(xiàn)中：LiuYetal.VCP/p97，down-regulatedbymicroRNA-129-5p，couldregulatetheprogressionofhepatocellularcarcinoma.PLoSOne.2012；7(4)：e35800.實(shí)施例1、eLtaS蛋白的表達(dá)和純化一、重組質(zhì)粒pET-eLtaS的構(gòu)建1、根據(jù)生物信息網(wǎng)站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上公布的金黃色葡萄球菌NCTC8325的全基因組的核苷酸序列(GI號(hào)為87201381)，設(shè)計(jì)并合成引物F：5’-CCGGAATTCTCTGAAGATGACTTAACAAA-3’(下劃線(xiàn)為限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI的酶切識(shí)別序列)和引物R：5’-CCGCTCGAGTTATTTTTTAGAGTTTGCTT-3’(下劃線(xiàn)為限制性?xún)?nèi)切酶XhoI的酶切識(shí)別序列)。2、提取金黃色葡萄球菌8325-4的基因組DNA并以其為模板，采用步驟1合成的引物F和引物R進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán))，然后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收約1300bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3、取步驟2回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和限制性?xún)?nèi)切酶XhoI酶切，回收約1300bp的DNA片段。4、用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和限制性?xún)?nèi)切酶XhoI酶切載體pET-28(a)，回收5335bp的載體骨架。5、將DNA片段和載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pET-eLtaS。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pET-eLtaS進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pET-28(a)的限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和XhoI識(shí)別序列間的小片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子。重組質(zhì)粒pET-eLtaS表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為eLtaS蛋白)。二、eLtaS蛋白的表達(dá)和純化1、將重組質(zhì)粒pET-eLtaS導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌，命名為BL21(DE3)-pET-eLtaS。2、將BL21(DE3)-pET-eLtaS單菌落接種于含100mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)，得到0D600為0.6的培養(yǎng)菌液1。向培養(yǎng)菌液1中加入IPTG，得到培養(yǎng)菌液2(培養(yǎng)菌液2中，IPTG的濃度為0.1mM)；然后37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)6h，得到培養(yǎng)菌液3。3、取培養(yǎng)菌液3，5000rpm離心10min，收集菌體。4、取步驟3收集的菌體，用10mLpH7.2、0.01M的PBS緩沖液重懸，得到菌懸液；然后對(duì)該菌懸液進(jìn)行超聲處理。超聲參數(shù)：超聲頻率30％；超聲10s，停5s，超聲總時(shí)間為30min。5、取完成步驟4的體系，12000rpm離心10min，收集上清液。6、將步驟5收集的上清液和ProteinIsoNi-NTAResin混合并孵育10min，然后棄上清，用含20mM咪唑的pH7.2、0.01M的PBS緩沖液洗滌3次。7、完成步驟6后，用含500mM咪唑的pH7.2、0.01M的PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集過(guò)柱后溶液，即為eLtaS蛋白。實(shí)施例2、eLtaS蛋白和胰島素的特異性結(jié)合和親和力測(cè)定一、eLtaS蛋白和胰島素特異性結(jié)合1、取酶標(biāo)板，用胰島素作為包被原進(jìn)行包被(用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋胰島素，設(shè)置包被濃度為10μg/mL，每孔加入100μL)。2、完成步驟1后，向酶標(biāo)板每孔加入200μL封閉液，用封口膜封好酶標(biāo)板，37℃封閉90min，然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μL洗滌液，每次洗滌3min)，拍干。3、完成步驟2后，每孔加入100μL不同濃度的eLtaS蛋白溶液(由pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋eLtaS蛋白得到的，濃度為0M、5.0×10-6M、1.0×10-5M或1.5×10-5M)，用封口膜封好酶標(biāo)板，37℃孵育60min；然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μL洗滌液，每次洗滌3min)，拍干。4、完成步驟3后，每孔加入100μL濃度為1μg/mL的兔抗eLtaS抗體溶液，用封口膜封好酶標(biāo)板，37℃繼續(xù)孵育60min；然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μL洗滌液，每次洗滌3min)，拍干。兔抗eLtaS抗體溶液由pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋兔抗eLtaS抗體得到的。5、完成步驟4后，每孔加入100μLHRP標(biāo)記羊抗兔的稀釋液，用封口膜封好酶標(biāo)板，37℃繼續(xù)孵育30min；然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μL洗滌液，每次洗滌3min)，拍干；最后加入100μLTMB顯色液，5min后，測(cè)量在450nm處的吸光值。HRP標(biāo)記羊抗兔的稀釋液為用封閉液稀釋HRP標(biāo)記羊抗兔至40000倍體積得到的。HRP標(biāo)記羊抗兔為Jackson公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為111-035-046。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，eLtaS蛋白和胰島素能夠特異性結(jié)合。二、eLtaS蛋白和胰島素的親和力測(cè)定采用表面等離子共振傳感器測(cè)定eLtaS蛋白和胰島素的親和力。具體步驟如下：1、由GEHealthcare公司將胰島素鍵合到表面等離子共振傳感器的CM5傳感芯片上，得到鍵合胰島素的芯片。2、用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋eLtaS蛋白，得到濃度為1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM或31.25nM的eLtaS蛋白溶液。3、完成步驟1和步驟2后，將不同濃度的eLtaS蛋白溶液依次(濃度由小到大)以恒定的流速流過(guò)鍵合胰島素的芯片的表面。通過(guò)表面等離子共振傳感器自帶的軟件，得到eLtaS蛋白和胰島素的解離常數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，eLtaS蛋白和胰島素的親和力為3.884×10-8M。表1目標(biāo)蛋白分析蛋白kon(M-1S-1)Kdis(S-1)KD(M)胰島素eLtaS蛋白9.469×1043.649×10-33.884×10-8實(shí)施例3、eLtaS蛋白抑制胰島素與膜受體蛋白結(jié)合一、競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法1、取酶標(biāo)板，用胰島素作為包被原進(jìn)行包被(用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋胰島素，設(shè)置包被濃度為10μg/mL，每孔加入100μL)。2、完成步驟1后，向酶標(biāo)板每孔加入200μL封閉液，用封口膜封好酶標(biāo)板，37℃封閉90min，然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μL洗滌液，每次洗滌3min)，拍干。3、完成步驟2后，每孔加入100μL濃度為10μg/mL的膜受體蛋白溶液和100μL不同濃度的eLtaS蛋白溶液(由pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋eLtaS蛋白得到的，濃度為0μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL或5.0μg/mL)，用封口膜封好酶標(biāo)板，37℃孵育60min；然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μL洗滌液，每次洗滌3min)，拍干。膜受體蛋白溶液由pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋膜受體蛋白得到的。膜受體蛋白為北京義翹神州生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為11081-H08H-50。4、完成步驟3后，每孔加入100μL濃度為1μg/mL的鼠抗膜受體蛋白抗體溶液，用封口膜封好酶標(biāo)板，37℃繼續(xù)孵育60min；然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μL洗滌液，每次洗滌3min)，拍干。鼠抗膜受體蛋白抗體溶液由封閉液稀釋鼠抗膜受體蛋白抗體得到的。鼠抗膜受體蛋白抗體為CellSignalingTechnology公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為3020S。5、完成步驟4后，每孔加入100μLHRP標(biāo)記羊抗鼠的稀釋液，用封口膜封好酶標(biāo)板，37℃繼續(xù)孵育30min；然后棄上清，用洗滌液洗滌(洗滌5次，每次加入300μL洗滌液，每次洗滌3min)，拍干；最后加入100μLTMB顯色液，5min后，測(cè)量在450nm處的吸光值。HRP標(biāo)記羊抗鼠的稀釋液為用封閉液稀釋HRP標(biāo)記羊抗鼠至40000倍體積得到的。HRP標(biāo)記羊抗鼠為Jackson公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為115-005-174。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，eLtaS蛋白能夠抑制胰島素與膜受體蛋白結(jié)合。二、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值，每次重復(fù)的步驟如下：1、用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋eLtaS蛋白，分別得到濃度為1000nM的eLtaS蛋白溶液甲、濃度為100nM的eLtaS蛋白溶液乙、濃度為10nM的eLtaS蛋白溶液丙和濃度為1nM的eLtaS蛋白溶液丁。2、取100μL濃度為1.0×106/mL的HepG2細(xì)胞懸浮液或濃度為1.0×106/mL的C2C12細(xì)胞懸浮液，加入1μLeltaS蛋白溶液(eLtaS蛋白溶液甲、eLtaS蛋白溶液乙、eLtaS蛋白溶液丙或eLtaS蛋白溶液丁)和100nMFITC標(biāo)記的胰島素，獲得培養(yǎng)體系。將該培養(yǎng)體系在15℃的條件下培養(yǎng)90min。FITC標(biāo)記的胰島素是按照FITC標(biāo)記試劑盒的說(shuō)明書(shū)記載的方法，對(duì)胰島素進(jìn)行標(biāo)記獲得的。FITC標(biāo)記試劑盒為T(mén)hermoFisher公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為F10240。3、完成步驟2后，離心，收集細(xì)胞。4、取所述細(xì)胞，用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液充分洗滌，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胰島素的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3(縱坐標(biāo)為細(xì)胞FITC熒光強(qiáng)度，各個(gè)曲線(xiàn)表示的是不同濃度的eLtaS蛋白加入后細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化)。結(jié)果表明，eLtaS蛋白能夠抑制胰島素與HepG2細(xì)胞或C2C12細(xì)胞結(jié)合。實(shí)施例4、eLtaS蛋白抑制胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的活化一、eLtaS蛋白降低胰島素介導(dǎo)的受體磷酸化1、用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋eLtaS蛋白，得到濃度為400nM的eLtaS蛋白溶液a、濃度為2000nM的eLtaS蛋白溶液b和濃度為10000nM的eLtaS蛋白溶液c。2、用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋胰島素，得到濃度為1000nM的胰島素溶液。3、取24孔板，先加入400μL濃度為1.0×106/mL的HepG2細(xì)胞懸浮液或濃度為1.0×106/mL的C2C12細(xì)胞懸浮液，再加入50μL胰島素溶液和50μLeLtaS蛋白溶液(eLtaS蛋白溶液a、eLtaS蛋白溶液b或eLtaS蛋白溶液c)，獲得培養(yǎng)體系。將該培養(yǎng)體系在37℃的條件下培養(yǎng)15min。4、取完成步驟3的體系，離心，收集細(xì)胞。5、取步驟4收集的細(xì)胞，裂解，得到裂解液。6、取步驟5得到的裂解液，以IRβ抗體，以HRP標(biāo)記羊抗鼠為二抗，進(jìn)行westernblot。7、取步驟5得到的裂解液，以pIRβ抗體為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗兔為二抗，進(jìn)行westernblot。按照上述步驟3-7的方法，將“胰島素溶液”替換為水，將“eLtaS蛋白溶液”替換為水，其它步驟均不變，作為空白對(duì)照。按照上述步驟3-7的方法，將“eLtaS蛋白溶液”替換為水，其它步驟均不變，作為陰性對(duì)照。IRβ抗體和pIRβ抗體均為CellSignalingTechnology公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為3020S和3026S。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4(eLtaS為eLtaS蛋白)。結(jié)果表明，eLtaS蛋白降低胰島素介導(dǎo)的受體磷酸化。二、eLtaS蛋白抑制胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵分子的活化1、用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋eLtaS蛋白，得到濃度為10000nM的eLtaS蛋白溶液。2、用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液稀釋胰島素，得到濃度為1000nM的胰島素溶液。3、取24孔板，先加入400μL濃度為1.0×106/mL的HepG2細(xì)胞懸浮液或濃度為1.0×106/mL的C2C12細(xì)胞懸浮液，再加入50μL胰島素溶液和50μLeLtaS蛋白溶液，獲得培養(yǎng)體系。將該培養(yǎng)體系在37℃的條件下培養(yǎng)15min。4、取完成步驟3的體系，離心，收集細(xì)胞。5、取步驟4收集的細(xì)胞，裂解，得到裂解液。6、取步驟5得到的裂解液，以IRS-1抗體、pIRS-1抗體、AkT抗體、pAkT抗體、GSK-3β抗體、pGSK-3β抗體、ErK抗體或pErK抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔為二抗，進(jìn)行westernblot。按照上述步驟3-6的方法，將“胰島素溶液”替換為水，將“eLtaS蛋白溶液”替換為水，其它步驟均不變，作為空白對(duì)照。按照上述步驟3-6的方法，將“eLtaS蛋白溶液”替換為水，其它步驟均不變，作為陰性對(duì)照。IRS-1抗體、pIRS-1抗體、AkT抗體、pAkT抗體、GSK-3β抗體、pGSK-3β抗體、ErK抗體和pErK抗體均為CellSignalingTechnology公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)依次為2390S、2386S、4685S、4060S、9315S、9322S、9102S和4370S。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5(eLtaS為eLtaS蛋白，為空白對(duì)照，為陰性對(duì)照)。結(jié)果表明，eLtaS蛋白抑制胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵分子(如IRS-1，AkT，GSK3β，ErK)的活化。因此，eLtaS蛋白抑制胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵分子的活化。實(shí)施例5、eLtaS蛋白抑制胰島素介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)1、取激光共聚焦培養(yǎng)皿，加入DMEM培養(yǎng)基和C2C12細(xì)胞，得到培養(yǎng)體系甲；培養(yǎng)體系甲中，C2C12細(xì)胞的濃度為1.0×105/mL。2、完成步驟1后，取所述培養(yǎng)體系甲，待C2C12細(xì)胞貼壁后，37℃培養(yǎng)4h。3、向完成步驟2的體系中加入2-NDBG、胰島素和eLtaS蛋白，得到培養(yǎng)體系乙；培養(yǎng)體系乙中，2-NDBG的濃度為100μM，胰島素的濃度為100nM，eLtaS蛋白的濃度為40nM或200nM；將培養(yǎng)體系乙在37℃的條件下培養(yǎng)15min。4、取完成步驟3的體系，先用胰酶消化，然后收集細(xì)胞。5、取步驟4收集的細(xì)胞，先用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液洗滌3次，再用4％(4g/100mL)多聚甲醛水溶液固定，最后使用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)2-NBDG攝入水平。按照上述步驟，將步驟3替換為步驟c，其它步驟均不變，作為陰性對(duì)照。步驟c為：向完成步驟2的體系中加入2-NDBG和胰島素，得到培養(yǎng)體系丙；培養(yǎng)體系丙中，2-NDBG的濃度為100μM，胰島素的濃度為100nM；將培養(yǎng)體系丙在37℃的條件下培養(yǎng)15min。按照上述步驟，將步驟3替換為步驟d，其它步驟均不變，作為空白對(duì)照。步驟d為：向完成步驟2的體系中加入2-NDBG，得到培養(yǎng)體系丁；培養(yǎng)體系丁中，2-NDBG的濃度為100μM；將培養(yǎng)體系丁在37℃的條件下培養(yǎng)15min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6(eLtaS為eLtaS蛋白，從左至右依次為空白對(duì)照、陰性對(duì)照、eLtaS蛋白的濃度為40nM和eLtaS蛋白的濃度為200nM)。結(jié)果表明，eLtaS蛋白能夠有效抑制C2C12細(xì)胞中胰島素介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)施例6、eLtaS抑制胰島素介導(dǎo)的糖攝取1、取6孔板，加入DMEM培養(yǎng)基和HepG2細(xì)胞，得到培養(yǎng)體系；該培養(yǎng)體系中，HepG2細(xì)胞的濃度為1.0×105/mL。2、完成步驟1后，取所述培養(yǎng)體系，待HepG2細(xì)胞貼壁后，37℃培養(yǎng)4h。3、向完成步驟2的體系中加入2-NDBG、胰島素和eLtaS蛋白，得到培養(yǎng)體系；該培養(yǎng)體系中，2-NDBG的濃度為100μM，胰島素的濃度為100nM，eLtaS蛋白的濃度為40nM或200nM；將培養(yǎng)體系乙在37℃的條件下培養(yǎng)15min。4、取完成步驟3的體系，先用胰酶消化，然后收集細(xì)胞。5、取步驟4收集的細(xì)胞，先用pH7.2、0.01mol/LPBS緩沖液洗滌3次，再用胰酶消化并收集細(xì)胞，再用4％(4g/100mL)多聚甲醛水溶液固定，最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2-NBDG攝入水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7(縱坐標(biāo)為細(xì)胞NBDG熒光強(qiáng)度，eLtaS為eLtaS蛋白)。結(jié)果表明，eLtaS能夠有效抑制HepG2細(xì)胞中胰島素介導(dǎo)的糖攝取。實(shí)施例7、胰島素耐量實(shí)驗(yàn)1、將20只8周齡體重為18～22g的健康C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成eLtaS組和對(duì)照組(每組10只)，禁食6h。2、完成步驟1后，測(cè)量血糖濃度(即第0min的血糖濃度)，進(jìn)一步得到eLtaS組第0min的血糖濃度和對(duì)照組第0min的血糖濃度。3、完成步驟1后，分別進(jìn)行如下處理：eLtaS組：腹腔注射胰島素(注射劑量為0.5U/kg)和eLtaS蛋白(注射劑量為100μgeLtaS蛋白/只)；對(duì)照組：腹腔注射胰島素(注射劑量為0.5U/kg)和Hfq蛋白(注射劑量為100μgHfq蛋白/只)。4、檢測(cè)完成步驟3后第10min、第20min、第30min或第60min的血糖濃度，進(jìn)一步得到eLtaS組注射胰島素不同時(shí)間的血糖濃度和對(duì)照組注射胰島素不同時(shí)間的血糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果表明，eLtaS蛋白能夠明顯抑制外源胰島素的降糖作用。實(shí)施例8、葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)1、將20只8周齡體重為18～22g的健康C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成eLtaS組和對(duì)照組(每組10只)，禁食6h后，分別進(jìn)行如下處理：eLtaS組：腹腔注射eLtaS蛋白(注射劑量為100μgeLtaS蛋白/只)；對(duì)照組：腹腔注射Hfq蛋白(注射劑量為100μgHfq蛋白/只)。2、完成步驟1后第120min，測(cè)量血糖濃度(即第0min的血糖濃度)，進(jìn)一步得到eLtaS組第0min的血糖濃度和對(duì)照組第0min的血糖濃度。3、完成步驟1后第120min，對(duì)eLtaS組的健康C57BL/6J小鼠和對(duì)照組的健康C57BL/6J小鼠分別腹腔注射葡萄糖(注射劑量為25g/kg)4、檢測(cè)完成步驟3后第5min、第10min、第15min、第20min、第30min、第45min或第60min的血糖濃度，進(jìn)一步得到eLtaS組注射葡萄糖不同時(shí)間的血糖濃度和對(duì)照組注射葡萄糖不同時(shí)間的血糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。結(jié)果表明，eLtaS蛋白抑制內(nèi)源胰島素的降糖作用。實(shí)施例9、轉(zhuǎn)eLtaS基因小鼠的獲得及代謝觀察一、eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得本發(fā)明的發(fā)明人委托賽業(yè)生物科技有限公司將分泌性細(xì)胞因子IL-2的信號(hào)肽與eLtaS蛋白的編碼基因(即eLtaS基因)融合，獲得重組質(zhì)粒；該重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子；然后將該重組質(zhì)粒顯微注射入受精卵(父親和母親均為C57BL/6J小鼠)，得到eLtaS轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)過(guò)鑒定，與C57BL/6J小鼠相比，eLtaS轉(zhuǎn)基因小鼠中eLtaS蛋白的表達(dá)量顯著增加。將eLtaS轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖到F4代，得到F4代eLtaS轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)過(guò)鑒定，與C57BL/6J小鼠相比，F(xiàn)4代eLtaS轉(zhuǎn)基因小鼠中eLtaS蛋白的表達(dá)量顯著增加。將F4代eLtaS轉(zhuǎn)基因小鼠命名為eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行下述步驟二的實(shí)驗(yàn)。二、eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠的代謝觀察1、多飲多食取4只8周齡的健康C57BL/6J小鼠和4只8周齡的健康eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠，置于相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)四周。培養(yǎng)過(guò)程中，每周測(cè)定每只小鼠的飲水量和進(jìn)食量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10(左圖為小鼠的平均每日飲水量；右圖為小鼠的平均每日進(jìn)食量；其中野生型為C57BL/6J小鼠，eltaS轉(zhuǎn)基因?yàn)閑ltaS轉(zhuǎn)基因小鼠)。結(jié)果表明，與C57BL/6J小鼠相比，eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)多飲多食表型。2、血清中甘油三酯的濃度升高取6只8周齡的健康C57BL/6J小鼠和10只8周齡的健康eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠的血清，利用甘油三酯ELISA檢測(cè)試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為E1003)測(cè)定血清中甘油三酯的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11(野生型為C57BL/6J小鼠，eltaS轉(zhuǎn)基因?yàn)閑ltaS轉(zhuǎn)基因小鼠)。結(jié)果表明，與C57BL/6J小鼠相比，eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠血清中甘油三酯的濃度顯著升高。3、餐后血糖水平顯著升高(1)取5只8周齡的健康C57BL/6J小鼠和5只8周齡的健康eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠，禁食6h后，測(cè)量血糖濃度(即第0min的血糖濃度)。(2)完成步驟(1)后，自由進(jìn)食1h，測(cè)量血糖濃度(即第60min的血糖濃度)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖12(左圖為C57BL/6J小鼠，右圖為eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠)。結(jié)果表明，與C57BL/6J小鼠相比，eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠餐后血糖濃度顯著升高。4、糖耐量顯著降低(1)將20只8周齡的健康C57BL/6J小鼠作為野生型組。將20只8周齡的健康eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠作為eltaS轉(zhuǎn)基因組。野生型組和eltaS轉(zhuǎn)基因組禁食6h后，測(cè)量血糖濃度(即第0min的血糖濃度)，進(jìn)一步得到野生型組第0min的血糖濃度和eltaS轉(zhuǎn)基因組第0min的血糖濃度。(2)完成步驟(1)后，對(duì)各個(gè)小鼠分別腹腔注射葡萄糖(注射劑量為25g/kg)。(3)檢測(cè)完成步驟(2)后第5min、第10min、第15min、第30min、第45min、第60min、第90min或第120min的血糖濃度，進(jìn)一步得到野生型組注射葡萄糖不同時(shí)間的血糖濃度和eltaS轉(zhuǎn)基因組注射葡萄糖不同時(shí)間的血糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖13(野生型為野生型組，eltaS轉(zhuǎn)基因?yàn)閑ltaS轉(zhuǎn)基因組)。結(jié)果表明，與C57BL/6J小鼠相比，eltaS轉(zhuǎn)基因小鼠的糖耐量顯著降低。<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>eLtaS蛋白作為預(yù)防和治療胰島素抵抗相關(guān)疾病的藥物靶點(diǎn)的應(yīng)用<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1290<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus<400>1tctgaagatgacttaacaaaagtattaaattatacgaaacaacgtcaaacagagcctaac60ccagaatattatggggtggcaaagaagaaaaatattattaagattcatttagaaagtttc120caaaccttcttaattaataaaaaggttaatggtaaagaagtaacaccgtttttaaacaaa180ttatcaagtgggaaagagcaattcacatacttccctaactttttccatcaaacaggtcaa240ggtaaaacatctgactctgaatttacaatggataacagtttatacggtttaccgcaaggt300tctgccttttcattaaaaggagataatacgtatcagtcattaccagcaattttagatcaa360aagcaaggctacaaatctgatgtcatgcacggtgactataaaacattctggaacagagac420caagtatataaacactttggtatcgataaattctatgatgcaacatactatgacatgtca480gataaaaacgttgtaaacttaggcttgaaagacaaaattttctttaaagattctgctaat540tatcaagctaagatgaaatcaccattctattctcatttaattacattgactaaccactat600ccattcacattagatgaaaaggatgcaactattgagaaatcaaacacaggtgatgcaaca660gttgatggttatattcaaacagcacgttatttagacgaagcattagaagaatatattaat720gacttgaagaaaaaaggattatatgacaattcagtgattatgatttatggtgaccactat780ggtatctctgaaaaccataacaatgccatggaaaaactattaggtgaaaaaatcacaccg840gctaaatttacagatttaaacagaactggtttctggattaaaatccctggtaaatctggt900ggtatcaataatgaatatgctggtcaagtcgatgtaatgccaacaattttacatttggct960ggtatagatacgaagaactatttaatgttcggtactgatttattctctaaaggtcataat1020caagtagttccattcagaaatggtgactttataacaaaagattataaatatgttaatggt1080aagatttattctaataaaaataatgaactcataactactcaaccagctgatttcgaaaag1140aataaaaagcaagttgaaaaggatctcgaaatgagtgacaacgtgcttaatggtgatttg1200tttagattctacaaaaatccagacttcaaaaaggtaaatccttcgaagtataaatatgaa1260acaggacctaaagcaaactctaaaaaataa1290<210>2<211>429<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus<400>2SerGluAspAspLeuThrLysValLeuAsnTyrThrLysGlnArgGln151015ThrGluProAsnProGluTyrTyrGlyValAlaLysLysLysAsnIle202530IleLysIleHisLeuGluSerPheGlnThrPheLeuIleAsnLysLys354045ValAsnGlyLysGluValThrProPheLeuAsnLysLeuSerSerGly505560LysGluGlnPheThrTyrPheProAsnPhePheHisGlnThrGlyGln65707580GlyLysThrSerAspSerGluPheThrMetAspAsnSerLeuTyrGly859095LeuProGlnGlySerAlaPheSerLeuLysGlyAspAsnThrTyrGln100105110SerLeuProAlaIleLeuAspGlnLysGlnGlyTyrLysSerAspVal115120125MetHisGlyAspTyrLysThrPheTrpAsnArgAspGlnValTyrLys130135140HisPheGlyIleAspLysPheTyrAspAlaThrTyrTyrAspMetSer145150155160AspLysAsnValValAsnLeuGlyLeuLysAspLysIlePhePheLys165170175AspSerAlaAsnTyrGlnAlaLysMetLysSerProPheTyrSerHis180185190LeuIleThrLeuThrAsnHisTyrProPheThrLeuAspGluLysAsp195200205AlaThrIleGluLysSerAsnThrGlyAspAlaThrValAspGlyTyr210215220IleGlnThrAlaArgTyrLeuAspGluAlaLeuGluGluTyrIleAsn225230235240AspLeuLysLysLysGlyLeuTyrAspAsnSerValIleMetIleTyr245250255GlyAspHisTyrGlyIleSerGluAsnHisAsnAsnAlaMetGluLys260265270LeuLeuGlyGluLysIleThrProAlaLysPheThrAspLeuAsnArg275280285ThrGlyPheTrpIleLysIleProGlyLysSerGlyGlyIleAsnAsn290295300GluTyrAlaGlyGlnValAspValMetProThrIleLeuHisLeuAla305310315320GlyIleAspThrLysAsnTyrLeuMetPheGlyThrAspLeuPheSer325330335LysGlyHisAsnGlnValValProPheArgAsnGlyAspPheIleThr340345350LysAspTyrLysTyrValAsnGlyLysIleTyrSerAsnLysAsnAsn355360365GluLeuIleThrThrGlnProAlaAspPheGluLysAsnLysLysGln370375380ValGluLysAspLeuGluMetSerAspAsnValLeuAsnGlyAspLeu385390395400PheArgPheTyrLysAsnProAspPheLysLysValAsnProSerLys405410415TyrLysTyrGluThrGlyProLysAlaAsnSerLysLys420425當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3