專利名稱：金銀花水提物在制備改善胰島素抵抗藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及制備改善胰島素抵抗，治療胰島素 抵抗綜合癥的藥物。
二背景技術(shù)：
胰島素抵抗是由于胰島素的作用器官(靶器官)-主要是骨骼肌、脂肪組織 及肝臟對(duì)胰島素的敏感性及反應(yīng)性降低或喪失，因而正常量的胰島素產(chǎn)生低于正 常的生理效應(yīng)，或者說(shuō)要達(dá)到正常生理效應(yīng)需要高于正常量的胰島素。出現(xiàn)胰島 素抵抗時(shí)，為保證體內(nèi)血糖達(dá)到正常水平，人體正常的胰島B細(xì)胞往往要分泌 更多的胰島素，來(lái)彌補(bǔ)單位數(shù)量胰島素降糖能力的不足，從而保證血糖水平正常。 久而久之，B細(xì)胞功能受損，則胰島素的分泌代償能力下降，就會(huì)出現(xiàn)糖耐量低 減，甚至2型糖尿病。
隨著對(duì)胰島素抵抗研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到胰島素抵抗不但能夠?qū)?致糖尿病，而且也是發(fā)生糖尿病各種并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)。有研究表明，嚴(yán)格控制 血糖可以顯著的降低眼睛、神經(jīng)、腎臟并發(fā)癥的發(fā)生率，但不能阻礙并發(fā)癥的發(fā) 生和發(fā)展，尤其是心腦血管并發(fā)癥。胰島素抵抗不但是糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制， 還與一些代謝疾病有關(guān)，這些疾病包括:中心性肥胖、糖代謝異常、2型糖尿病、 脂代謝紊亂(高甘油三酯血癥和/或高密度脂蛋白降低)、高血壓、微量白蛋白尿、 冠心病等，胰島素抵抗是這些疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。人們把這些以胰島素抵抗為 基礎(chǔ)的各種疾病的總和，稱為胰島素抵抗綜合征。因而針對(duì) 糾正胰島素的抵抗有著重要意義。
過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體y輔激活因子l(peroxisome proliferators-activated receptor-y coactivator-l ,PGC-1)是近年來(lái)倍受關(guān)注的輔激活因子.研究表 明,PGC-1參與適應(yīng)性產(chǎn)熱調(diào)節(jié)、肝糖異生、脂肪酸e氧化等代謝調(diào)節(jié)。生理狀 態(tài)下，PGC-la與GR和HNF4ct結(jié)合促進(jìn)肝糖異生，以維持空腹或長(zhǎng)期禁食狀態(tài)下 的血糖穩(wěn)定。病理狀態(tài)下肝臟PGC-la表達(dá)異常增高,激活糖異生關(guān)鍵酶(PEPCK， G6Pase， FBPase)。使肝糖輸出增加，空腹血糖升高,在肝臟胰島素抵抗的形成中
發(fā)揮了重要作用。PGC-1 a是肝糖異生的主要調(diào)節(jié)者并且是胰島素-環(huán)腺苷一磷 酸軸的關(guān)鍵靶點(diǎn)。相反的，胰島素抑制肝糖異生。肝臟中胰島素通過(guò) PI3K/PKB/FKHR調(diào)節(jié)通路負(fù)調(diào)節(jié)PGC-la表達(dá).
金銀花為忍冬科，忍冬屬植物忍冬及同屬植物紅腺忍冬,山銀花或毛花柱忍
冬的干燥花蕾或帶初開的花，味甘,性寒。金銀花是中醫(yī)中治療消渴癥(糖尿病)
藥方中的一味藥.研究表明金銀花單味中藥及有效成分有降低血糖的作用。目前
金銀花降低血糖的分子機(jī)制尚不明確。
中醫(yī)理論強(qiáng)調(diào)"陰陽(yáng)調(diào)和"，認(rèn)為疾病是由于寒熱失調(diào)所引起的，這些理論體
系過(guò)于抽象，缺少現(xiàn)代分子生物學(xué)研究支持。因此，我們運(yùn)用分子生物學(xué)手段探
討金銀花提取物下調(diào)肝臟中的PGC-la ，從而抑制糖異生，降低血糖，改善胰島
素抵抗的作用機(jī)制，為糖尿病的治療提供新的藥物研制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是利用金銀花水提取物，制備改善胰島素抵抗，降低 血糖，治療胰島素綜合征的藥物。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案
l.本發(fā)明所述改善胰島素抵抗，降低血糖的藥物為金銀花水溶性提取物，其 主要成分包括揮發(fā)油(芳樟醇、雙花醇)等，有機(jī)酸(綠原酸、異綠原酸、 咖啡酸、棕櫚酸等)，黃酮類、皂苷類等。
2. 金銀花水提取物的制備過(guò)程將金銀花按每克金銀花加入20-25毫升水， 文火煎煮20分鐘，藥液冷卻至室溫，將水煎液蒸餾凍干處理，后將凍干粉 溶于蒸餾水中，密閉保存于4'C。
3. 金銀花提取物在制備改善胰島素抵抗，降低血糖治療胰島素抵抗綜合癥藥 中的應(yīng)用。金銀花水提取物刺激ob/ob鼠肝臟PGC-1 a的表達(dá)按50g/kg 體重灌胃11 13周齡ob/ob鼠， 連續(xù)灌胃五天，第六天予ITT實(shí)驗(yàn)，第 七天測(cè)血糖、采取小鼠眼內(nèi)眥靜脈血測(cè)胰島素，處死小鼠分離肝臟。同時(shí) 以生理鹽水灌胃作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示用金銀花提取物灌胃小鼠，能顯 著降低ob/ob鼠肝中PGC-1 a的表達(dá)。灌胃第五天小鼠血糖較對(duì)照組明顯 降低，胰島素耐量實(shí)驗(yàn)顯示胰島素抵抗改善。
本發(fā)明的有益效果是為中藥治療胰島素抵抗綜合征提供了現(xiàn)代分子生物學(xué)
的理論依據(jù)。本發(fā)明首次闡明了金銀花水提物具有降低肝臟PGC-la表達(dá)的效應(yīng)、 降低血糖、改善胰島素抵抗。目前中醫(yī)和現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究還沒有很好的結(jié) 合起來(lái)，中藥作用的調(diào)節(jié)途徑和靶位點(diǎn)更是知之甚少。本研究室首次提出金銀花 能降低病理狀態(tài)肝臟中PGC-la，而對(duì)正常情況下PGC-la無(wú)影響，金銀花降低 血糖可能通過(guò)降低降低肝臟中的PGC-la，下調(diào)肝糖異生的酶的生成，從而改善 胰島素抵抗，降低血糖，可制備改善胰島素抵抗，治療胰島素綜合征的藥物。
四

圖1 金銀花對(duì)ob/ob mice肝臟中PGC-1咖RNA表達(dá)水平的影響
A、提取肝臟組織中RNA,經(jīng)過(guò)RT后，用Real Time PCR檢測(cè)肝臟中PGC-la的
表達(dá)
P=0. 013029 〈0.05。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間有顯著性差異
結(jié)果金銀花能降低ob/ob mice肝臟中的PGC-la mRNA水平。
圖2金銀花對(duì)ob/ob mice肝臟中PGC-1蛋白表達(dá)水平的影響
提取肝臟組織中總蛋白后，用W""V^檢測(cè)肝臟中PGC-la蛋白水平 的表達(dá)
對(duì)照組ob/ob小鼠1-4，灌生理鹽水
實(shí)驗(yàn)組ob/ob小鼠5-8,灌金銀花水煎液濃縮物
圖3為金銀花提取物對(duì)ob/ob鼠血糖的影響
圖4， 5為金銀花提取物對(duì)ob/ob鼠胰島素耐量實(shí)驗(yàn)的影響
圖4給藥前ob/ob小鼠胰島素耐量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
圖5為給藥后ob/ob小鼠胰島素耐量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
五具體實(shí)施例方式
將金銀花按每克加入25毫升水，文火煎煮20分鐘，藥液冷卻至室溫，將水 煎液冷干處理，后將凍干粉溶于蒸餾水中獲得水提取物。灌胃小鼠，測(cè)血糖、進(jìn) 行胰島素耐量實(shí)驗(yàn)
用real-time PCR和Westblot方法測(cè)定PGC-la的表達(dá)，結(jié)果證明金銀花提取
物可減低ob/ob鼠肝臟組織中PGC-la的表達(dá)。胰島素耐量實(shí)驗(yàn)提示給予金銀花 水提液可改善ob/ob鼠胰島素抵抗 材料與來(lái)源
試劑，Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶和Tag酶等試劑均購(gòu)于大連寶 生物工程有限公司。PGC-la抗體購(gòu)自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC。
手術(shù)器械剪刀，彎頭小鑷等購(gòu)自江蘇思來(lái)科技有限公司。
其它器材Heidolph DIAX900勻槳器；ABI Prism 7000 Sequence Detection System PCR儀；ob/ob鼠購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物中心
實(shí)施例
1.金銀花水提取物的制備將金銀花按每克金銀花加入25毫升水，文火煎 煮20分鐘，藥液冷卻至室溫，將水煎液冷干處理，后將凍干粉溶于蒸餾水中， 密閉保存于4'C。
2. 小鼠給藥及組織的分離保存實(shí)驗(yàn)用小鼠為SPF級(jí)的野生型雄性小鼠， 品系ob/ob鼠，11~13周齡。按50g/kg的藥量灌胃給藥，對(duì)照組小鼠用等體積的 生理鹽水灌胃， 連續(xù)灌胃五天，第六天予ITT實(shí)驗(yàn)，第七天采取小鼠眼內(nèi)眥 靜脈血測(cè)血糖，處死小鼠分離肝臟。同時(shí)以生理鹽水灌胃作為對(duì)照。生理鹽水漂 洗干凈，立即放于凍存管中，于液氮中保存?zhèn)溆谩?br> 3。 組織RNA的提取、RT-PCR和real-time PCR不同肝臟組織加適量Trizol 于HeidolphDIAX900組織勻漿器將組織充分勻漿(4檔100秒)，將勻漿液轉(zhuǎn)入 潔凈的1.5ml離心管中，室溫放置5分鐘后，12000g， 4"C離心5分鐘，取上清， 加入200u 1氯仿，強(qiáng)烈震蕩混勻，室溫放置5分鐘，12000g， 4。C離心15分鐘， 小心吸取上清至另一潔凈的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫 放置10分鐘，12000g， 4'C離心10分鐘，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀，室溫干 燥，20ixlDEPC水溶解，紫外分光法檢測(cè)濃度和純度。2ug RNA用于逆轉(zhuǎn)錄， 反應(yīng)體系為20u 1，含2u g RNA， lmM dNTP, 1 U/u 1 RNA酶抑制劑，2. 5 pmo1/ Ul 01ig(dT)18引物，0.5 U/yl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕混勻，42°C 1小時(shí)，冰 上放置2分鐘，所得cDNA可用于real-time PCR。 real-time PCR為20 ix 1反應(yīng) 體系，含2u 1 cDNA， 2 mM MgCl2, 0. 2 mM dNTP,各1 pmol/ix 1上、下游引物及 相應(yīng)的探針，0.025 U/ulTag酶，混勻。PCR反應(yīng)條件95°C5分鐘，95°C30
秒，6(TC60秒(40個(gè)循環(huán))72。C延伸3分鐘。引物序列，e-actin:上游引物 5，-ggc acc aca cct tct aca atg隱3'，下游引物5，-ggg gtg ttg aag gtc tea aac-3，， 探 針序歹'J: 5，- tgt ggc ccc tga gga gca ccc -3， ； PGC-1 ct :上游弓|物5，- tga cac aac gcg gac agaa-3，，下游弓l物5，-eggtgc att cct caatttca-3，， 探針序歹(J: 5,-tgagag accgctttgaagtttttg-3'。結(jié)果用ABI Prism 7000 SDS Software分析，見附圖1， 2，3。
4. ob/ob鼠血糖變化與胰島素耐量實(shí)驗(yàn) 給金銀花提取液前進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)，結(jié)果提示ob/ob鼠存在胰島素抵抗，
血糖均高于12mmol/L，存在高血糖。給予金銀花提取液五天后，血糖明顯減低， 第六天給予胰島素耐量試驗(yàn)，結(jié)果提示胰島素抵抗改善，見附圖4， 5。
權(quán)利要求
1.一種改善胰島素抵抗，降低血糖的藥物，其特征是金銀花的水溶性提取物，其主要成分為芳樟醇、雙花醇、綠原酸、異綠原酸、咖啡酸、棕櫚酸、黃酮類、皂苷類。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述金銀花水提物的制備方法，其特征是金銀花按每克金銀花加入20-25毫升水，加熱至沸騰，文火煎煮20分鐘，藥液冷卻至室溫， 將水煎液經(jīng)過(guò)蒸餾，凍干處理后將凍干粉溶于三蒸水中，密閉保存于4'C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述金銀花提取物在制備改善胰島素抵抗，降低血糖， 治療胰島素綜合癥藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及制備改善胰島素抵抗，治療胰島素抵抗綜合癥的藥物。本發(fā)明將金銀花按每克金銀花加入25毫升水，文火煎煮20分鐘，藥液冷卻至室溫，將水煎液冷干處理，后將凍干粉溶于蒸餾水中，密閉保存。按50g/kg體重灌胃11～13周齡ob/ob鼠，連續(xù)灌胃五天，第六天予ITT實(shí)驗(yàn)，第七天測(cè)血糖、采取小鼠眼內(nèi)眥靜脈血測(cè)胰島素，處死小鼠分離肝臟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示用金銀花提取物灌胃小鼠，能顯著降低ob/ob鼠肝中PGC-1α的表達(dá)。灌胃第五天小鼠血糖較對(duì)照組明顯降低，胰島素耐量實(shí)驗(yàn)顯示胰島素抵抗改善。本發(fā)明闡明了金銀花水提取物可降低PGC-1α在肝臟中的表達(dá)，可以制備成降低胰島素抵抗，治療糖尿病綜合癥的藥物。
文檔編號(hào)A61P5/48GK101352475SQ20081002467
公開日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2008年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日
發(fā)明者張紅杰, 張辰宇, 菁 李, 梁湘櫻, 陽(yáng) 項(xiàng) 申請(qǐng)人:南京大學(xué)