專利名稱：用于治療胰島素抵抗及與之相關(guān)的疾病的SorCS1樣藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SorCSl樣藥劑(如SorCSl及其片段與變體)在制備治療、減輕或延遲患者胰島素抵抗的藥物中的應用。本發(fā)明進一步涉及SorCSl樣藥劑(如SorCSl及其片段與變體)在敏化胰島素受體中的應用。本發(fā)明還涉及SorCSl基因剔除小鼠作為胰島素抵抗的動物模型的應用。
背景技術(shù)：
胰島素抵抗綜合征代謝紊亂，總體上被稱作代謝綜合征或胰島素抵抗綜合征在工業(yè)化國家的傳播已經(jīng)達到了流行性疾病的程度。胰島素抵抗綜合征是指一組結(jié)果，包括葡萄糖耐受不良、月巴胖、脂質(zhì)成分變化(血脂異常)和高血壓，它們促進2型糖尿病、心血管疾病、癌癥、多囊卵巢疾病和其他疾病的發(fā)展。在所有這些疾病中，病理生理學的核心部分在于胰島素抵抗。這種綜合征的潛在原因是超重/肥胖、身體不活動和一系列目前還未明確界定的遺傳多態(tài)性(參見1+2)。對該綜合征的生活方式干預及病理的藥理治療僅在一定程度上有效，當前急需新的治療方法。胰島素和胰島素抵抗胰島素是一種由胰腺中胰島的￠-細胞產(chǎn)生的激素。當血液葡萄糖水平升高時刺激胰島素釋放，通過位于靶組織(尤其是位于脂肪組織、骨骼肌和肝臟)細胞膜中的葡萄糖轉(zhuǎn)運體的胰島素依賴性刺激作用將葡萄糖從血液中除去。胰島素通過結(jié)合并激活膜結(jié)合性的胰島素受體(IR)，由此引發(fā)一連串細胞內(nèi)信號事件來表現(xiàn)它的生物活性，它調(diào)節(jié)多種生物過程，如葡萄糖和脂質(zhì)代謝、基因表達、蛋白質(zhì)合成，以及非代謝過程，如細胞生長和分化。IR激活的多樣化效應是通過胰島素結(jié)合時聚集的多組分信號復合體來調(diào)節(jié)。這樣，IR固有的蛋白質(zhì)-絡(luò)氨酸激酶活性導致幾種絡(luò)氨酸殘基發(fā)生自體磷酸化，接著包括IR底物(IRS)蛋白質(zhì)和含Scr-同源-2(Shc)的蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)底物進行募集和磷酸化。這啟動了兩種主要信號通路的激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT/蛋白激酶B (PKB)通路，它負責大多數(shù)代謝活動，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT4移位至細胞膜與刺激糖原合成；以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，它調(diào)節(jié)一些基因的表達并與(PI3K)-AKT通路配合以控制細胞生長和分化(參見3-8)。胰島素刺激葡萄糖清除的能力在看似健康的人群中是不斷變化的，胰島素最敏感和胰島素最抵抗的人之間存在>600%的差異。然而，在對胰島素最抵抗的人群中有三分之一面臨更大的患有幾種異常情況和臨床綜合征的風險，包括2型糖尿病、心血管疾病、高血壓、中風、非酒精性脂肪肝、多囊卵巢疾病和某些形式的癌癥(參見9)。某些個體被稱為“胰島素抵抗者”，因為他們的組織表現(xiàn)得好像血流中沒有足夠的胰島素，這表現(xiàn)為肝臟、脂肪組織和骨骼肌中的胰島素反應和葡萄糖攝取降低。胰島素抵抗、的第一反應是胰島素的代償性產(chǎn)生和分泌，以彌補機體降低的敏感性，導致高胰島素血癥。這樣，高胰島素水平和組織從血流中清除葡萄糖的反應性降低成為胰島素抵抗的特征。胰島素抵抗是導致一系列代謝變化的主要事件，包括代償性高胰島素血癥、血脂異常、胰腺e細胞代償機能減退以及高血糖癥(參見6-8)。
2型糖尿病和胰島素抵抗2型糖尿病(非-胰島素依賴性糖尿病)是一種與死亡率和發(fā)病率風險增大相關(guān)的復雜疾病。它的發(fā)病率穩(wěn)步增加，該疾病目前在世界范圍內(nèi)影響超過I. 5億人口，使其成為公眾關(guān)心的主要問題。該疾病是一種原型復雜的多基因疾病，帶有強烈的可遺傳成分，但是也深受環(huán)境因素如肥胖的影響。2型糖尿病的發(fā)病機制包括肝臟和外周組織中胰島素抵抗的逐步發(fā)展，伴隨胰腺P細胞的胰島素分泌缺陷，導致明顯的高血糖癥(血液中葡萄糖含量異常高)。胰島素抵抗的第一反應是代償性產(chǎn)生和分泌胰島素，以彌補機體降低的敏感性，導致高胰島素血癥，并產(chǎn)生個體的前期糖尿病。然而，當胰島素抵抗個體的胰腺不能產(chǎn)生足夠的激素以補償增加的需求時，P細胞將最終被耗盡并衰退，導致高血糖癥和明顯的2型糖尿病(參見4和5)。因此，2型糖尿病僅在不能維持P細胞代償性胰島素反應的主體中產(chǎn)生。這些主體具有“敏感的”胰島，與之相對的是“穩(wěn)固的”胰島一一種由遺傳和/或后天獲得的因素如肥胖所決定的狀況(

圖14)。識別能恢復葡萄糖代謝及治療胰島素抵抗的肽/蛋白很有希望成為新的治療目標，用于潛在地結(jié)合對2型糖尿病、代謝綜合征和其他以胰島素抵抗為特征的疾病的治療。SorCSl 受體SorCSl是哺乳動物的VpslOp-域(VpslOp-D)受體家族的五個成員之一,該受體家族還包括分選蛋白(Sortilin)、SorLA、SorCS2和SorCS3。它們都是I型跨膜受體，具有與VpslOp高度同源性的N端VpslOp-D特征性的結(jié)構(gòu)特征，VpslOp是酵母中的一種分選蛋白
(10)。目前該受體家族的生理功能尚不清楚，但是最近的研究結(jié)果顯示，分選蛋白和SorLA作為神經(jīng)元存活和死亡的調(diào)控物發(fā)揮著重要的作用(11，12)。令人感興趣的是，分選蛋白也與調(diào)節(jié)葡萄糖攝取的胰島素相關(guān)，因為它可促進葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT4從細胞內(nèi)室向血漿膜轉(zhuǎn)移(13，14)。SorCSl在VpslOp-D受體中是獨特的，因為它以幾種不同的剪接變體存在，表示為S0rCSl-a、b、c、c+和d，它們編碼相同的細胞外和跨膜部分，以及不同長度和序列的細胞質(zhì)域(10，11)。本發(fā)明人和其他人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，除了神經(jīng)系統(tǒng)以外，SorCSl還在脂肪組織、骨骼肌和胰腺的3細胞；參與葡萄糖代謝的所有組織中表達。而且，每種剪接變體表現(xiàn)出不同的組織分布以及亞細胞表達模式，表明尾變體可能涉及不同的生物活性(15-17)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人采用細胞研究研究了 SorCSl及其不同剪接變體對治療小鼠胰島素抵抗的影響，以及SorCSl及不同剪接變體對胰島素受體表達的影響，因此本發(fā)明的主要方面涉及用于治療個體中胰島素抵抗和/或與胰島素抵抗相關(guān)的疾病的SorCSl樣藥劑，其中所述藥劑能夠在SorCSl結(jié)合位點與胰島素受體(IR)結(jié)合并且能夠敏化胰島素受體。SorCSl是哺乳動物Vps IOp-域(VpslOp-D)受體家族的五個成員之一,該受體家族還包括分選蛋白、SorLA、SorCS2和SorCS3 (圖I)。鼠科SorCSl在VpslOp-D受體中是獨特的，因為它以幾種不同的剪接變體存在，表示為mS0rCSl-a、b、c、c+和d(圖2)。簡言之，本發(fā)明人證實了在缺乏所有mSorCSl剪接變體的基因剔除小鼠中，老的雄性小鼠是高胰島素但是是前期糖尿病，而老的SorCSl基因剔除的雌性小鼠是高血糖和高胰島素，二者均是年齡相關(guān)性糖尿病，這是由于轉(zhuǎn)基因小鼠中胰島素抵抗的結(jié)果。而且，本發(fā)明人已經(jīng)示出了，鼠科SorCSl與胰島素受體結(jié)合，并且mSorCSl調(diào)節(jié)胰島素受體的表達此外，本發(fā)明涉及編碼上述用于治療個體胰島素抵抗或者與胰島素抵抗相關(guān)疾病的多肽的核酸序列、以及包括所述核酸的用于治療目的的載體、宿主細胞和包裝細胞系。本發(fā)明的另一方面涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包括一種或多種上述藥劑；或者上述分離的核酸序列；或者上述表達載體；或者上述宿主細胞的組分；或者上述包裝細胞系；或者它們的結(jié)合。此外，本發(fā)明又一方面涉及一種治療胰島素抵抗或者與胰島素抵抗相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向有需要的個體施予治療有效量的上述藥劑；或者上述分離的核酸序列；或者上述表達載體；或者上述宿主細胞的組分；或者上述包裝細胞系，或者它們的結(jié)合。另一方面，本發(fā)明涉及一種上調(diào)有需要的患者中的胰島素受體或其片段或變體的方法，所述方法包括向有需要的個體施予治療有效量的上述藥劑；或者上述分離的核酸序列；或者上述表達載體；或者上述宿主細胞的組分；或者上述包裝細胞系；或者它們的結(jié)
口 o另一方面，本發(fā)明涉及一種敏化胰島素受體的方法，所述方法包括施予一種VpslOp域受體,所述VpslOp域受體選自a) SorCSlb) SorCS2c) SorCS3d)分選蛋白，和e) SorLA,由此可用于治療胰島素抵抗或者與胰島素抵抗相關(guān)疾病的方法中。與胰島素抵抗相關(guān)的疾病具體選自胰島素抵抗綜合征、2型糖尿病、糖耐受受損、代謝綜合癥、聞血糖癥、聞膜島素血癥、動脈硬化、聞膽固醇血癥、聞甘油二酷血癥、聞脂血癥、血脂異常、肥胖、中心性肥胖、多囊卵巢綜合征、凝血過快、高血壓、微蛋白尿、胰島素抵抗綜合征(IRS)、2型糖尿病、糖耐受受損、代謝綜合征、高血糖癥和高胰島素血癥。本發(fā)明的又另一方面涉及一套試劑盒，包括-本文所述的藥物組合物；-用于施予所述藥物組合物的醫(yī)療器械或其他工具；-如何使用該套試劑盒的說明。在另一方面，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因的基因剔除小鼠，其中內(nèi)源性VpslOp域受體SorCSl基因被打斷，以消除功能化SorCSl受體的表達，并且其中所述小鼠相對于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈蟊憩F(xiàn)出胰島素應答下降。在另一個重要的方面，本發(fā)明涉及一種篩選SorCSl樣藥劑降低血糖水平的能力的方法，所述方法包括步驟
a)提供權(quán)利要求69所述的第一和第二轉(zhuǎn)基因小鼠；b)向所述第一轉(zhuǎn)基因小鼠施予候選藥劑，和c)向所述第二轉(zhuǎn)基因小鼠施予生理溶液，和d)施予所述藥劑后，在預定的時間間隔，如15分鐘、30分鐘、60分鐘、2和4小時，分別從b)和c)的小鼠采取血液樣品；和e)比較d)樣品的血糖水平；其中施予所述候選藥劑的所述第一轉(zhuǎn)基因小鼠的血糖相對于沒有施予所述候選藥劑的所述第二轉(zhuǎn)基因小鼠降低，表明該候選藥劑降低了血糖水平。在另一個重要的方面，本發(fā)明涉及一種篩選SorCSl樣藥劑降低血糖水平的能力的方法，所述方法包括步驟a)提供第一和第二野生型小鼠；和b)向所述第一小鼠施予權(quán)利要求I的藥劑，和c)向所述第二小鼠施予生理溶液，和d)施予所述藥劑后，在預定的時間間隔，如15分鐘、30分鐘、60分鐘、2和4小時，分別從b)和c)的小鼠采取血液樣品；和e)比較d)樣品的血糖水平；其中施予所述候選藥劑的所述第一野生型小鼠的血糖相對于沒有施予所述候選藥劑的所述第二野生型小鼠降低，表明該候選藥劑降低了血糖水平。本發(fā)明另一方面涉及一種一旦激活表達，就能夠以組織特異性方式編碼可溶性和/或全長SorCSl的轉(zhuǎn)基因小鼠。本發(fā)明再一方面涉及一種能夠加強SorCSl或其片段或變體與胰島素受體之間的結(jié)合能力的藥劑在治療胰島素抵抗和/或與胰島素抵抗相關(guān)疾病中的用途。附圖簡要說明圖I :Vpsl0p-域受體家族。顯示了它們的結(jié)構(gòu)組織。圖2 mSorCSl的剪接變體。A)導致產(chǎn)生不同細胞質(zhì)尾區(qū)的鼠科SorCSl基因的組織。B)mSorCSl胞質(zhì)域的氨基酸序列。圖3 :不同mSorCSl剪接變體的表達。用特異性引物對RT-PCR從不同組織的mRNA獲得的片段，用于鑒定SorCSl的細胞外部分(外)或五種尾變體中的每一種(a、b、c、c+和d)。圖4 mSorCSl基因剔除小鼠的產(chǎn)生。A)通過在胚胎干細胞中進行同源重組產(chǎn)生mSorCSl基因剔除小鼠的方案。B)mSorCSl mRNA表達的分析，顯示了缺乏所有mSorCSl剪接變體的轉(zhuǎn)錄。C)皮層的Western blot分析,顯示mSorCSl基因剔除(KO)小鼠中缺乏mSorCSl 蛋白。圖5 :不同年齡的A)雄性和B)雌性小鼠的平均血糖。動物禁食過夜(16h)，通過眼眶采血獲得血液樣品，并且在自動監(jiān)測儀上快速測量血漿葡萄糖。、
圖6 10-50周齡的雌性野生型和SorCSl基因剔除小鼠的血漿胰島素水平。動物禁食過夜(16h)，通過眼眶采血獲得血液樣品，并且使用超靈敏小鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定血漿胰島素水平。圖7 =SorCSl基因剔除小鼠和野生型同窩出生小鼠的葡萄糖耐受測試。59周齡的小鼠禁食過夜(16h)，并經(jīng)腹腔注射葡萄糖無菌鹽水溶液推劑(2mg/g體重)。注射后的O、
15、30、60和120min時通過眼眶采血獲得血液樣品，并且測量血漿A)葡萄糖和B)胰島素水平。數(shù)據(jù)為每組四只小鼠的平均值土SEM。圖8 :西方型飲食的野生 型小鼠中空腹血漿葡萄糖和胰島素水平升高。將雌性
A)+C)和雄性B)+D)野生型和SorCSl基因剔除小鼠從10周齡到50周齡喂以高熱量西方型飲食(WD)。在50周齡時將動物禁食過夜(16h)，通過眼眶采血獲得血液樣品，并且測量血漿葡萄糖A)+B)和血漿胰島素水平C)+D)。數(shù)據(jù)是每組中4-10只小鼠的平均值土SEM。圖9 :喂給西方型飲食的野生型和基因剔除小鼠的腹部脂肪組織將雌性A)和雄性B)野生型和SorCSl基因剔除小鼠從10周齡到50周齡喂以高能量西方型飲食(WD)。在研究結(jié)束時，處死動物并且分離及稱重腹部脂肪(脂肪組織)。數(shù)據(jù)是每組中4至10只小鼠的平均值土SEM。圖10 :肌肉和脂肪組織中IR、磷酸化IR(pY-IR)和Glut4的表達。將50周齡的雌性SorCSl基因剔除小鼠(-/-)和野生型(+/+)對照小鼠禁食過夜，腹腔注射胰島素無菌鹽水溶液(10單位/kg體重)，并在15分鐘后處死。通過western blotting分析A)脂肪和
B)肌肉組織(100yg)，以抗-IR、抗-IR-pY、抗-Glut和抗-肌動蛋白作為內(nèi)參。圖11 =SorCSl和胰島素受體之間的物理相互作用。A)將以指定受體轉(zhuǎn)染的CHO細胞(僅以IRa和IRb瞬態(tài)轉(zhuǎn)染)用胰島素刺激并且以IR進行免疫沉淀，分別采用a-SorCSl-Ieu和a-IR通過western blotting進行分析。B)表面等離子體共振試驗(BIAcore)顯示SorCSl的可溶性全長細胞外部分與固定的可溶性胰島素受體(IR)的直接相互作用。Kd估計約5nM。圖12 :以SorCSl轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的胰島素受體表達。將來自CHO細胞及穩(wěn)定表達 mSorCSl-A、mSorCSl-B、mSorCSl-C、mSorCSl-D 和 msol. SorCSl (SorCSl 的細胞外部分)的CHO細胞的細胞裂解物進行SDS-PAGE和Western blot分析，以抗-IR、抗-SorCSl-Ieu和抗-肌動蛋白作為內(nèi)參。圖13 :細胞膜上IR和SorCSl的表達。將CHO細胞及穩(wěn)定表達mSorCSl-A、mSorCSl-B和mSorCSl_C的CHO細胞進行表面生物素化，隨后進行SDS-PAGE和Western印跡分析，以抗-IR、抗-SorCSl-Ieu和抗-肌動蛋白作為內(nèi)參。Bio泳道包含生物素化的表面蛋白，Intra泳道包含細胞內(nèi)蛋白，而細胞裂解物(Iysat)用作輸入對照。圖14 :人2型糖尿病的發(fā)展階段。圖表(黑線)顯示T2D發(fā)展期間血糖濃度增加，顯示了在frank糖尿病發(fā)作之前，從正常到前期糖尿病的變化。此外，該圖表上(虛線)還顯示了 T2D發(fā)展期間的胰島素水平，表明前期糖尿病狀態(tài)期間胰島素增加，以補償胰島素抵抗，而在frank糖尿病發(fā)作時由于P細胞衰竭，胰島素釋放顯著減少。圖15 20天齡的野生型和基因剔除小鼠中胰島的胰島素免疫染色。將胰腺切除，固定在多聚甲醛上，冷凍切片，然后以抗胰島素抗體免疫染色。代表性圖像如圖所示。圖16 =SorCSl 的比對源自人(homosapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、乳牛(Bos Taurus)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、狗(Canis lupus familiaris)和雞(GalIusgallus)的SorCSl序列比對。序列同一丨I"生如表2所示。表2 :人SorCSl的序列同一性
權(quán)利要求
1.一種治療個體中胰島素抵抗和/或與胰島素抵抗相關(guān)疾病的SorCSI樣藥劑，其中所述藥劑能夠與胰島素受體在SorCSl結(jié)合位點結(jié)合并且能夠敏化胰島素受體。
2.如權(quán)利要求I所述的藥劑，其中所述胰島素受體是人胰島素受體。
3.如前面任一項權(quán)利要求所述的藥劑，其中所述胰島素受體上的結(jié)合位點是包括如下限定的一個或多個序列的肽的結(jié)合位點SEQ ID NO 1 氨基酸 103-124SEQ ID NO 1 氨基酸 125-143SEQ ID NO 1 氨基酸 144-162SEQ ID NO 1 氨基酸 197-218SEQ ID NO 1 氨基酸 391-409SEQ ID NO : I 氨基酸 661-684SEQ ID NO 1 氨基酸 763-783SEQ ID NO : I 氨基酸 859-876。
4.如前面任一項權(quán)利要求所述的藥劑，其中所述胰島素受體上的結(jié)合位點包括如下限定的一個或多個序列SEQ ID NO 56 氨基酸 100-120SEQ ID NO 56 氨基酸 127-150SEQ ID NO 56 氨基酸 284-310SEQ ID NO 56 氨基酸 362-379SEQ ID NO 56 氨基酸 593-610SEQ ID NO 56 氨基酸 629-652SEQ ID NO :56 氨基酸 749-772。
5.如前面任一項權(quán)利要求所述的藥劑，其中所述藥劑選自 j)分離的SorCSl多肽，選自 iv)氨基酸序列，包括SEQID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 ； v)a)的氨基酸序列的生物活性序列變體，其中所述變體與所述SEQID NO: I具有至少70%的序列同一性；或 vi)i或ii任一項的生物活性片段，其中所述片段包括a)至b)任一項的至少5個連續(xù)氨基酸，并且在至少5個氨基酸的重疊范圍中與所述SEQ ID NO: I具有至少70%的序列同一性，其中所述生物活性是敏化胰島素受體。
6.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽是選自SEQID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 的序列的天然產(chǎn)生的等位基因變體。
7.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽包括選自SEQID NO 5U0U5,21、27、33、37、39、43和47的氨基酸序列。
8.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽是其中所述的變體多肽，其中在選擇的序列中指定的任意氨基酸被改變以提供保守性替代。
9.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽與具有選自SEQID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 的序列的蛋白質(zhì)有至少70%的序列同一性。
10.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽與具有選自SEQID NO U2,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 的序列的蛋白質(zhì)有至少75%的序列同一性。
11.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽與具有選自SEQID NO U2,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 的序列的蛋白質(zhì)有至少80%的序列同一性。
12.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽與具有選自SEQID NO U2,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 的序列的蛋白質(zhì)有至少85%的序列同一性。
13.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽與具有選自SEQID NO U2,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 的序列的蛋白質(zhì)有至少90%的序列同一性。
14.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽與具有選自SEQID NO U2,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 的序列的蛋白質(zhì)有至少95%的序列同一性。
15.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽與具有選自SEQID NO U2,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 的序列的蛋白質(zhì)有至少98%的序列同一性。
16.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽與具有選自SEQID NO U2,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 51 的序列的蛋白質(zhì)有至少99%的序列同一性。
17.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽選自SEQID NO :1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、14。
18.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽選自SEQID NO :16、17、18、19、20、22、26、28、29、30、31和 32。
19.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽是被糖基化的。
20.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽是在氨基酸殘基位點184、352、.433、765、776、816、847、908 和 929 處被糖基化的。
21.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽是可溶性多肽，是權(quán)利要求17所述序列的片段。
22.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述糖基化片段具有選自SEQID NO:5、10和15的序列。
23.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽是在氨基酸殘基位點184，352，.433，775，815，846，907 和 929 處被糖基化的。
24.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽是可溶性多肽，是權(quán)利要求18所述序列的片段。
25.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述糖基化片段具有選自SEQID NO 2U.27和33的序列。
26.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽包括以下的一個或多個序列 SEQ ID NO 1 氨基酸 103-124SEQ ID NO 1 氨基酸 125-143SEQ ID NO 1 氨基酸 144-162SEQ ID NO 1 氨基酸 197-218SEQ ID NO 1 氨基酸 391-409SEQ ID NO 1 氨基酸 661-684SEQ ID NO 1 氨基酸 763-783SEQ ID NO 1 氨基酸 859-876 或它們的變體，其中所述變體與所述一個或多個序列具有至少70%的序列同一性。
27.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽能夠形成至少一個分子內(nèi)胱氨酸橋。
28.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，包括通過至少一個分子內(nèi)胱氨酸橋連接的所述蛋白質(zhì)的二聚體。
29.如前面任一項權(quán)利要求所述的多肽，進一步包括一親和標簽，例如多聚組氨酸標簽、GST標簽、HA標簽、Flag標簽、C-myc標簽、HSV標簽、V5標簽、麥芽糖結(jié)合蛋白標簽、纖維素結(jié)合域標簽。
30.如前面任一項權(quán)利要求所述的藥劑，其中所述藥劑選自抗體、反義RNA、反義DNA、有機小分子和siRNA。
31.如權(quán)利要求30所述的藥劑，其中所述抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、源化抗體、單鏈抗體、重組抗體。
32.如權(quán)利要求30或31所述的藥劑，其中所述抗體是抗胰島素受體抗體。
33.一種核酸序列，編碼如權(quán)利要求5-32任一項限定的多肽，用于治療個體中胰島素抵抗或者與胰島素抵抗相關(guān)的疾病。
34.一種載體，包括如權(quán)利要求33限定的至少一個核酸分子，用于治療個體中胰島素抵抗或者與胰島素抵抗相關(guān)的疾病。
35.如權(quán)利要求34所述的載體，進一步包括有效地與所述核酸分子連接的啟動子。
36.如權(quán)利要求35所述的載體，其中所述啟動子選自CMV、人UbiC、RSV、Tet-可調(diào)控啟動子、Mo-MLV-LTR、Mxl、EF-l a、PDGF P 和 CaMK II。
37.如權(quán)利要求34至36所述的載體，其中所述載體選自源自逆轉(zhuǎn)錄病毒科家族的載體，包括慢病毒、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV0
38.如權(quán)利要求34至37所述的載體，其中所述載體選自甲病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、桿狀病毒、單純皰疹病毒、冠狀病毒、牛乳頭狀瘤病毒、Mo-MLV,優(yōu)選腺相關(guān)病毒。
39.一種分離的宿主細胞,所述宿主細胞是用權(quán)利要求34至38任一項的至少一種載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導，用于治療個體中胰島素抵抗或者與胰島素抵抗相關(guān)的疾病。
40.如權(quán)利要求39所述的分離的宿主細胞，所述宿主細胞選自釀酒酵母、大腸桿菌、曲霉和Sf9昆蟲細胞。
41.如權(quán)利要求40所述的分離的宿主細胞，所述宿主細胞選自人、貓、豬、猴、狗、小鼠和大鼠的哺乳動物細胞。
42.如權(quán)利要求41所述的分離的宿主細胞，其中所述哺乳動物細胞選自肌肉細胞、肝細胞、脂肪細胞和胰腺細胞、如a細胞、0細胞和5細胞。
43.如權(quán)利要求41或42所述的分離的宿主細胞，所述宿主細胞選自CH0、CH0-K1、HEI193T、HEK293、C0S、PC12、HiB5、RN33b 和 BHK 細胞。
44.一種能夠產(chǎn)生感染病毒顆粒的包裝細胞系，用于治療個體中胰島素抵抗或者與胰島素抵抗相關(guān)的疾病，所述病毒顆粒包括源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組，包括5’逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRURNA結(jié)合位點、包裝信號、可操作地連接編碼權(quán)利要求4至32任一項所述多肽的多核苷酸序列的啟動子、第二鏈DNA合成的源、以及3’逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR。
45.如權(quán)利要求44所述的包裝細胞系，其中所述基因組源自慢病毒，并且LTR是慢病毒。
46.一種治療胰島素抵抗或與胰島素抵抗相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向有需要的個體施予治療有效量的 a)權(quán)利要求I至32任一項所述的藥劑；或 b)權(quán)利要求33所述的分離的核酸序列；或 c)權(quán)利要求34至38任一項所述的表達載體；或 d)權(quán)利要求39至43任一項所述的宿主細胞的組分；或 e)權(quán)利要求44至45任一項所述的包裝細胞系,或 f)a)至e)任兩項或更多項的結(jié)合。
47.一種在有需要的個體中上調(diào)胰島素受體或其片段或變體的方法，所述方法包括施予治療有效量的 a)權(quán)利要求I至32任一項所述的藥劑；或 b)權(quán)利要求33所述的分離的核酸序列；或 c)權(quán)利要求34至38任一項所述的表達載體；或 d)權(quán)利要求39至43任一項所述的宿主細胞的組分；或 e)權(quán)利要求44至45任一項所述的包裝細胞系,或 f)a)至e)任兩項或更多項的結(jié)合。
48.一種藥物組合物，包括以下一項或多項的結(jié)合 a)權(quán)利要求I至32任一項所述的藥劑；或b)權(quán)利要求33所述的分離的核酸序列；或 c)權(quán)利要求34至38任一項所述的表達載體；或 d)權(quán)利要求39至43任一項所述的宿主細胞的組分；或 e)權(quán)利要求44至45任一項所述的包裝細胞系,或 f)a)至e)任兩項或更多項的結(jié)合。
49.如權(quán)利要求48所述的藥物組合物，包括第二活性成分。
50.如權(quán)利要求48至49所述的藥物組合物，包括藥學上可接受的載體。
51.如權(quán)利要求48至50任一項所述的藥物組合物，其中所述組合物的pH為pH4和pH 10之間。
52.如權(quán)利要求48至51任一項所述的藥物組合物，其被配制為通過注射、栓劑、口服、舌下含片或噴劑、經(jīng)皮給藥、吸入給藥或用植入的生物相容性膠囊局部給藥。
53.如權(quán)利要求52所述的藥物組合物，其中所述注射包括椎管內(nèi)靜脈注射、肌肉注射、脊柱注射、腹腔注射、皮下注射，經(jīng)推注或連續(xù)給藥。
54.如權(quán)利要求48至53任一項所述的藥物組合物，其中給藥以間隔30分鐘至24小時進行。
55.如權(quán)利要求48至54任一項所述的藥物組合物，其中給藥以間隔I至6小時進行。
56.如權(quán)利要求48至55任一項所述的藥物組合物，其中治療的持續(xù)期為6至72小時。
57.如權(quán)利要求48至56任一項所述的藥物組合物，其中治療的持續(xù)期為終生。
58.如權(quán)利要求48至57任一項所述的藥物組合物，其中活性成分的劑量為10ii g至500mg/kg體重之間。
59.一種敏化胰島素受體的方法，所述方法包括向胰島素受體或個體施予選自如下的VpslOp-域受體a)SorCSlb)SorCS2c)SorCS3 d)分選蛋白，和e)SorLA, 或它們的生物活性片段。
60.如權(quán)利要求1-32任一項所述的藥劑，如權(quán)利要求33所述的核酸，如權(quán)利要求34-38任一項所述的載體，如權(quán)利要求39-43任一項所述的宿主細胞，如權(quán)利要求44-45任一項所述的包裝細胞系，如權(quán)利要求46-47任一項所述的方法,或者如權(quán)利要求48至58任一項所述的藥物組合物，其中所述與胰島素抵抗相關(guān)的疾病選自胰島素抵抗綜合征、2型糖尿病、糖耐受受損、代謝綜合征、高血糖、高胰島素血癥、動脈硬化、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、高脂血癥、血脂異常、肥胖、中心性肥胖、多囊卵巢綜合征、血凝過快、高血壓、微量白蛋白尿、以及它們的任意結(jié)合。
61.如權(quán)利要求60所述的藥劑，其中所述與胰島素抵抗相關(guān)的疾病選自胰島素抵抗綜合征、2型糖尿病、糖耐受受損、代謝綜合征、高血糖、高胰島素血癥。
62.一套試劑盒，包括 -如權(quán)利要求48至58任一項所限定的藥物組合物，-用于施加所述藥物組合物的醫(yī)療器械或其他工具， -關(guān)于如何使用該套試劑盒的說明。
63.如權(quán)利要求62所述的一套試劑盒，包括第二活性成分。
64.一種轉(zhuǎn)基因的基因剔除小鼠，其中內(nèi)源性VpslOp-域受體SorCSl基因被打斷以消除功能性SorCSl受體的表達，并且其中所述小鼠相對于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈蟊憩F(xiàn)出對胰島素的反應減小。
65.如權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述打斷包括在外域、跨膜結(jié)構(gòu)域、或細胞質(zhì)域缺失編碼起始密碼子的SorCSl受體基因核苷酸序列或小鼠SorCSl受體區(qū)域。
66.一種篩選權(quán)利要求I所述的SorCSl樣藥劑降低血糖水平的能力的方法，其中所述方法包括步驟 f)提供權(quán)利要求64的第一和第二轉(zhuǎn)基因小鼠； g)向所述第一轉(zhuǎn)基因小鼠施予候選藥劑，和 h)向所述第二轉(zhuǎn)基因小鼠施予生理溶液，和 i)施予所述藥劑后，在預定的時間間隔，如15分鐘、30分鐘、60分鐘、2和4小時，分別米取小鼠b)和c)的血液樣品,和 j)比較d)的樣品中的血糖水平；其中施予所述候選藥劑的所述第一轉(zhuǎn)基因小鼠的血糖水平相對于未施予所述候選藥劑的所述第二轉(zhuǎn)基因小鼠降低，表明所述候選藥劑降低了血糖水平。
67.一種篩選權(quán)利要求I所述SorCSl樣藥劑降低血糖水平的能力的方法，其中所述方法包括步驟 f)提供第一和第二野生型小鼠；和 g)向所述第一小鼠施予權(quán)利要求I所述的藥劑，和 h)向所述第二小鼠施予生理溶液，和 i)施予所述藥劑后，在預定的時間間隔，如15分鐘、30分鐘、60分鐘、2和4小時，分別米取小鼠b)和c)的血液樣品,和 j)比較d)的樣品中的血漿葡萄糖水平；其中施予所述候選藥劑的所述第一野生型小鼠的血糖水平相對于未施予所述候選藥劑的所述第二野生型小鼠降低，表明所述候選藥劑降低了血糖水平。
68.一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其一旦表達激活后，能夠以組織特異性方式編碼可溶性和/或全長 SorCSl0
69.如權(quán)利要求68所述的小鼠，其中所述組織選自肝臟、肌肉、胰腺和脂肪組織。
70.能夠增強SorCSl或其片段或變體與胰島素受體之間的結(jié)合活性的藥劑在用于治療胰島素抵抗和/或與胰島素抵抗相關(guān)的疾病中的用途。
71.如權(quán)利要求70所述的藥劑，其中所述藥劑選自多肽、抗體、反義RNA、反義DNA、有機小分子和siRNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及SorCS1樣藥劑，包括SorCS1、編碼SorCS1及其片段的表達的核酸分子以及含有所述核酸的載體，以及表達SorCS1和所述片段的細胞，在治療胰島素抵抗中的用途。
文檔編號A61P3/04GK102647995SQ201080035738
公開日2012年8月22日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者卡倫-瑪麗·彼澤森, 安德斯·尼克爾 申請人:奧胡斯大學