技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種評(píng)估個(gè)體心力衰竭的方法，包括步驟：a)測(cè)量從個(gè)體獲得的樣品中標(biāo)識(shí)物胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7(IGFBP-7)的濃度，b)任選地測(cè)量樣品中一種或更多種其他的心力衰竭標(biāo)識(shí)物的濃度，并通過(guò)比較步驟(a)中確定的濃度以及任選地在步驟(b)中確定的濃度與對(duì)照樣品中確立的該標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物的濃度，來(lái)評(píng)估心力衰竭。此外還公開(kāi)IGFBP-7作為標(biāo)識(shí)物蛋白在評(píng)估心力衰竭中的用途，包括IGFBP-7的標(biāo)識(shí)物組合，以及用于測(cè)量IGFBP-7的試劑盒。

背景技術(shù)：

心力衰竭(HF)是一種主要的并日趨嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。例如，在美國(guó)，大約5百萬(wàn)患者患有HF并且每年超過(guò)550000患者被首次診斷為HF(引自美國(guó)心臟協(xié)會(huì)，心臟病和中風(fēng)統(tǒng)計(jì)：更新至2005年，達(dá)拉斯、德克薩斯，美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(2005))。類(lèi)似的美國(guó)統(tǒng)計(jì)表明對(duì)于每年1200萬(wàn)至1500萬(wàn)個(gè)診所就診和650萬(wàn)個(gè)住院病例，HF是主要原因。從1990至1999年，每年以HF作為主要診斷結(jié)論住院治療的患者數(shù)量從大約81萬(wàn)增長(zhǎng)至超過(guò)100萬(wàn)，以HF作為主要或第二診斷結(jié)論的人數(shù)從240萬(wàn)增至360萬(wàn)。在2001年，接近53000名患者死于HF作為主因的疾病。心力衰竭主要是老年人的狀況，因此普遍認(rèn)為“人群的老齡化”也促使HF發(fā)生率增加。在年齡大于65歲的人群中HF的發(fā)生率每1000人近10人。僅僅在美國(guó)，2005年由HF引起的直接和間接損失總共估計(jì)約$279億，并且每年在治療HF的藥物上花費(fèi)大約$29億(參照上述引用的AHA-統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù))。

心力衰竭

心力衰竭的特征是心臟泵出身體所需血液的量的能力的喪失。衰竭不是意味心臟停止泵送，而是指不能如其應(yīng)該的那樣有效地泵出血。

NYHA[紐約心臟協(xié)會(huì)]和ACC/AHA[美國(guó)心臟病學(xué)協(xié)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)]都建立了HF的功能分類(lèi)以判斷該疾病的進(jìn)程。NYHA分類(lèi)方案有四類(lèi)疾病狀態(tài)：類(lèi)別1為在任何程度的行為下無(wú)癥狀，類(lèi)別2為在重體力行為下有癥狀，類(lèi)別III和IV分別在輕度行為和無(wú)行為下有癥狀。

在四階段的ACC/AHA方案中，階段A為無(wú)癥狀但有發(fā)展HF的危險(xiǎn)。階段B有心臟功能紊亂的證據(jù)而無(wú)癥狀。在階段C中，有心臟功能紊亂的證據(jù)并伴有癥狀。在階段D中，受試者盡管受到最大程度的治療但仍有癥狀。

HF的病原學(xué)

在醫(yī)學(xué)上，必須將心力衰竭(HF)理解為一種復(fù)合病。它可能由觸發(fā)事件的出現(xiàn)所引起，比如心肌梗死(心臟病發(fā)作)，或者是其他病因的后續(xù)，比如高血壓、糖尿病或心臟畸形例如心瓣病。心肌梗死或其他的HF病因?qū)е滦呐K泵送能力的初始減退，例如通過(guò)損壞心肌引起。由于一種或更多種代償機(jī)制的活化，這種泵送能力的減退可能不會(huì)立刻被注意。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HF的進(jìn)展與患者的血液動(dòng)力狀態(tài)無(wú)關(guān)。因此，由疾病所引起損害性變化已經(jīng)出現(xiàn)并發(fā)展，而患者甚至仍無(wú)癥狀。事實(shí)上，在HF早期過(guò)程中維持正常心血管功能的代償機(jī)制可能實(shí)際上最終促進(jìn)了疾病的進(jìn)展，例如對(duì)心臟和它的容量施加有害作用以維持循環(huán)中充足的血流水平。

一些發(fā)生在HF期間的更重要的病理生理變化有(i)下丘腦-垂體-腎上腺軸的活化，(ii)全身性?xún)?nèi)皮功能紊亂和(iii)心肌重塑。

(i)專(zhuān)門(mén)針對(duì)拮抗下丘腦-垂體-腎上腺軸活化的治療包括β-腎上腺素能阻滯劑(B阻滯劑)、血管緊張素轉(zhuǎn)變酶(ACE)抑制劑、某些鈣通道阻滯劑、硝酸鹽和內(nèi)皮素-1阻滯劑。鈣通道阻滯劑和硝酸鹽雖然產(chǎn)生臨床改善，卻沒(méi)有明確顯示出能延長(zhǎng)生存期，而作為醛甾酮拮抗藥，B阻滯劑和ACE抑制劑已經(jīng)表現(xiàn)出了明顯的延長(zhǎng)壽命的作用。使用內(nèi)皮素-1阻滯劑的實(shí)驗(yàn)研究也已展示出有用的效果。

(ii)全身性?xún)?nèi)皮功能紊亂是HF的一種公知特征，在左心室功能紊亂體征出現(xiàn)時(shí)會(huì)明顯表現(xiàn)。內(nèi)皮功能紊亂對(duì)于心肌微循環(huán)與心臟肌細(xì)胞的密切關(guān)系十分重要。該跡象暗示微血管功能紊亂對(duì)于肌細(xì)胞功能紊亂以及導(dǎo)致進(jìn)行性心肌衰竭的形態(tài)學(xué)變化有明顯作用。

依據(jù)潛在的病理生理學(xué)，有跡象暗示內(nèi)皮功能紊亂可能由NO的相對(duì)缺乏所引起，而NO的相對(duì)缺乏可以歸結(jié)為依賴(lài)NADH氧化酶引起的血管O₂生成增加和隨后的NO過(guò)度清除。潛在的提高O₂生成的作用因子包括升高的交感緊張性、新腎上腺素、血管緊張素II、內(nèi)皮素-1和TNF-α。此外，相對(duì)于TNF-α的水平，一種關(guān)鍵的抗炎性細(xì)胞因子IL-10的水平顯示不相稱(chēng)的低?，F(xiàn)在人們認(rèn)為T(mén)NF-α與相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子包括IL-6和可溶性TNF-α受體的水平升高，通過(guò)降低心肌收縮性、雙心室膨大、血壓過(guò)低而在HF的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并且可能涉及內(nèi)皮細(xì)胞活化和功能紊亂。同時(shí)對(duì)于至今仍不可解釋的在嚴(yán)重HF患者中肌肉消瘦現(xiàn)象，人們認(rèn)為T(mén)NF-α也可能在其中發(fā)揮作用。在對(duì)少數(shù)患者使用可溶性TNF受體進(jìn)行治療的初步研究中，通過(guò)對(duì)生活質(zhì)量指數(shù)的測(cè)量，表明有助于改善NYHA功能分類(lèi)和患者健康。

(iii)心肌重塑是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，伴隨著從無(wú)癥狀向有癥狀的心力衰竭轉(zhuǎn)變，并可被描述成心肌層內(nèi)的一系列適應(yīng)性改變，像心室形狀、質(zhì)量和體積的改變(Piano，M.R.等，J.Cardiovasc.Nurs.14(2000)1-23；Molkentin，J.D.，Ann.Rev.Physiol.63(2001)391-426)。心肌重塑的主要內(nèi)容是肌細(xì)胞生物學(xué)的改變，如肌細(xì)胞肥大，因?yàn)閴乃阑蚣?xì)胞程序性死亡而引起的肌細(xì)胞損失，細(xì)胞外基質(zhì)的改變和左心室腔的幾何學(xué)改變?，F(xiàn)在還不清楚心肌重塑是否只是暴露于長(zhǎng)時(shí)間神經(jīng)激素刺激產(chǎn)生的毒性效應(yīng)數(shù)年之后發(fā)生的終末器官效應(yīng)，或者是否心肌重塑獨(dú)立地促使心力衰竭的進(jìn)展。迄今證據(jù)暗示適當(dāng)?shù)闹委熆梢詼p緩或停止心肌重塑的進(jìn)展。

標(biāo)識(shí)物和疾病狀態(tài)

如上所述，肌細(xì)胞肥大可能代表發(fā)展至HF的最初步驟之一。肌細(xì)胞肥大的特征為某些編碼收縮蛋白的基因，如p-肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白T(TnT)，和一些非收縮蛋白，如A型和B型利尿鈉肽的表達(dá)升高，同時(shí)還有細(xì)胞體積增加和細(xì)胞骨架變化(Piano，M.R.等，J.Cardiovasc.Nurs.14(2000)1-23；Molkentin，J.D.，Ann.Rev.Physiol.63(2001)391-426)。

對(duì)于人類(lèi)和動(dòng)物模型心力衰竭的研究表明心力衰竭的后期階段肌細(xì)胞功能降低。現(xiàn)已暗示肌細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制涉及鈣處理網(wǎng)絡(luò)、肌微絲和細(xì)胞支架的改變(de Tombe，P.P.，Cardiovasc.Res.37(1998)367-380)。例如，在心力衰竭的人類(lèi)和動(dòng)物模型中，肌漿網(wǎng)鈣-三磷酸腺苷酶的酶活性降低，而肌膜Na+/Ca 2+交換器的mRNA和蛋白水平都增加。而且，在心力衰竭的人類(lèi)和動(dòng)物模型中都具有TnT的同種型轉(zhuǎn)換、肌鈣蛋白I(TnI)磷酸化減少、肌纖維肌動(dòng)球蛋白三磷酸腺苷酶活性降低和微管形成增加。

最開(kāi)始，導(dǎo)致心肌重塑的心臟改變意味著補(bǔ)償心肌層病變部分以維持身體對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)物的需要。但是，心力衰竭的代償期是有限的，于是在最后，衰竭的心臟不能維持足夠滿(mǎn)足身體需求的心輸出量。于是有從代償期向代償失調(diào)期的轉(zhuǎn)變。在代償失調(diào)期內(nèi)，心臟中的變化級(jí)聯(lián)效應(yīng)會(huì)持續(xù)但不再有利，使患者進(jìn)入心力衰竭進(jìn)程直到慢性狀態(tài)并最終死亡。

根據(jù)“ACC/AHA 2005成年人慢性心力衰竭的診斷和管理的更新指南”(S.Hunt等，www.acc.org＝ACC/AHA實(shí)踐指南)，在心力衰竭范圍內(nèi)該疾病現(xiàn)在被分為四個(gè)階段，如上所述。在階段A和B，會(huì)發(fā)現(xiàn)個(gè)體處于心力衰竭發(fā)展的危險(xiǎn)中，而階段C和D表示這些患者組顯示了心力衰竭的體征和癥狀。A至D不同階段的詳細(xì)定義如上述參考資料所示，此處通過(guò)援引包括入。

心力衰竭的診斷方法

評(píng)價(jià)HF患者唯一最有效的診斷試驗(yàn)是全面的2維超聲心電圖聯(lián)同多普勒流量研究，以確定是否心肌層、心臟瓣膜或心包出現(xiàn)異常，涉及哪些腔室。必須考慮三個(gè)基本問(wèn)題：1)LVEF是維持還是減少，2)LV結(jié)構(gòu)是正常還是異常，3)是否還有其他可以解釋臨床表現(xiàn)的結(jié)構(gòu)異常，如瓣膜、心包或右心室的異常？該信息應(yīng)該由EF的數(shù)值預(yù)期、心室尺度和/或體積的測(cè)量、壁厚度的測(cè)量和腔室的幾何結(jié)構(gòu)以及局部室壁活動(dòng)的評(píng)價(jià)來(lái)量化。應(yīng)該評(píng)估右心室的大小以及收縮性能。此外還應(yīng)該半定量地確定心房的大小并測(cè)量左心房的尺度和/或體積。

對(duì)于EF保持或減少的患者來(lái)說(shuō)，在進(jìn)行超聲波心動(dòng)描記術(shù)時(shí)獲得的非侵襲性血液動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)是重要的附加關(guān)聯(lián)。綜合二尖瓣輸入模型、肺靜脈輸入模型和二尖瓣環(huán)流速的組合定量提供了關(guān)于LV充盈和左房壓特征的數(shù)據(jù)。三尖瓣回流梯度的評(píng)定聯(lián)同測(cè)量下腔靜脈的尺度和它在呼吸過(guò)程的反應(yīng)可提供對(duì)收縮肺動(dòng)脈壓和中心靜脈壓的估算。

心搏量可以聯(lián)合尺度測(cè)量和LV流出道的脈沖多普勒加以確定。但是，在沒(méi)有HF時(shí)這些參數(shù)的任何一項(xiàng)都可能出現(xiàn)異常。所有的參數(shù)都不是與HF有必然的特異關(guān)聯(lián)；然而總體正常的充盈模型可排除臨床HF。

一種臨床觀點(diǎn)認(rèn)為，該疾病在代償和早期的代償失調(diào)期無(wú)臨床癥狀(階段A完全無(wú)癥狀，階段B有結(jié)構(gòu)上的心臟病變但沒(méi)有HF的體征和癥狀，參考ACC/AHA實(shí)踐指南)。直到徹底進(jìn)入代償失調(diào)期(即依照ACC/AHA指南的階段C和D)疾病的外部體征(如氣促)才會(huì)出現(xiàn)?，F(xiàn)行的診斷方式基于階段C和D的患者的外部癥狀。

一般地，使用能影響心力衰竭特異機(jī)制的藥物對(duì)心力衰竭患者進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)治療。沒(méi)有診斷性試驗(yàn)可以可靠地反映那些特異機(jī)制并幫助醫(yī)師為適當(dāng)?shù)幕颊哌x擇適當(dāng)?shù)乃幬?和劑量)(例如，ACE抑制劑、AT II、β阻滯劑等等)。

用標(biāo)識(shí)物預(yù)診斷HF

僅由生化標(biāo)識(shí)物對(duì)具有心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的患者進(jìn)行早期評(píng)估是可能的，因?yàn)橛邪l(fā)展心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體在那個(gè)階段是仍然沒(méi)有HF臨床癥狀的?，F(xiàn)在尚無(wú)確定的生化標(biāo)識(shí)物能在該疾病癥狀發(fā)生前進(jìn)行可靠鑒定。現(xiàn)在到診斷出HF的時(shí)候，這個(gè)疾病已經(jīng)有了深度發(fā)展。

近年來(lái)利尿鈉肽家族，尤其是心房利尿鈉肽家族和腦利尿鈉肽家族被證明在評(píng)估HF中有重要價(jià)值。

HF的預(yù)后和需求

至少部分因?yàn)闇蟮脑\斷，50％的HF患者在診斷后兩年之內(nèi)死亡。5年生存率小于30％。急切需要一種輔助心力衰竭早期診斷的新生化標(biāo)識(shí)物。

在心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體，即，無(wú)心力衰竭臨床癥狀的個(gè)體的早期評(píng)估中的改進(jìn)是被證明是正確的(warranted)。

最近幾年確立了以B型利尿鈉肽標(biāo)識(shí)物作為一種很好的手段來(lái)監(jiān)測(cè)HF患者的疾病進(jìn)程并評(píng)估他們心臟血管并發(fā)癥，如心臟病發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。

然而，對(duì)于其他很多方面的診斷單一的標(biāo)識(shí)物是不夠的。

NT-proBNP的低值對(duì)于HF或LVD的排除具有很高的陰性預(yù)測(cè)值，在上述的和其他的研究(參考：Triepels R.H.，等Clin.Chem.49，Suppl.A(2003)37-38)中心力衰竭的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在50-60％的范圍內(nèi)。因此一種用于評(píng)估個(gè)體心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)識(shí)物具有很高的臨床/實(shí)際重要性，它獨(dú)立地對(duì)于HF具有高的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，或者協(xié)同NT-proBNP并且與單獨(dú)的NT-proBNP比較起來(lái)對(duì)于HF具有更好的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。

為了使這個(gè)重要并急需的臨床診斷領(lǐng)域取得更深遠(yuǎn)的技術(shù)進(jìn)步，一種輔助評(píng)估心力衰竭患者的標(biāo)識(shí)物意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

現(xiàn)在人們發(fā)現(xiàn)并確定了標(biāo)識(shí)物胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7(IGFBP-7)能輔助評(píng)估心力衰竭。在一個(gè)實(shí)施方式中它可以有助于評(píng)估個(gè)體是否具有發(fā)展心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。在進(jìn)一步的方面中，它可以輔助評(píng)估疾病的進(jìn)展。在另一個(gè)實(shí)施方式中，它可以輔助預(yù)測(cè)心力衰竭的發(fā)作。在另一個(gè)實(shí)施方式中，它能輔助評(píng)估并選擇一種適當(dāng)?shù)闹委煼桨敢灶A(yù)防或治療心力衰竭。

在此公開(kāi)的是一種評(píng)估個(gè)體心力衰竭的方法，包括步驟：測(cè)量從該個(gè)體獲得的樣品中標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的濃度，任選地測(cè)量樣品中一種或更多種其他心力衰竭標(biāo)識(shí)物的濃度，通過(guò)將IGFBP-7的濃度和任選地一種或更多種其他標(biāo)識(shí)物的濃度與對(duì)照樣品中確定的該標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物的濃度進(jìn)行比較來(lái)評(píng)估心力衰竭。

該發(fā)明也涉及蛋白IGFBP-7作為標(biāo)識(shí)物分子在心力衰竭評(píng)估中的用途。

還公開(kāi)了包括IGFBP-7和一種或更多種其他心力衰竭標(biāo)識(shí)物的標(biāo)識(shí)物組合在評(píng)估心力衰竭中的用途。

同時(shí)提供試劑盒，其用于進(jìn)行體外評(píng)估心力衰竭的方法，該方法包括步驟：測(cè)量樣品中標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的濃度，任選地測(cè)量樣品中一種或更多種其他的心力衰竭標(biāo)識(shí)物的濃度，通過(guò)將IGFBP-7的濃度和任選地一種或更多種其他標(biāo)識(shí)物的濃度與參考群體中確定的該標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物的濃度進(jìn)行比較以評(píng)估心力衰竭，該試劑盒包括特異性測(cè)定IGFBP-7需要的試劑和任選地特異性測(cè)定所述一種或更多種其他心力衰竭標(biāo)識(shí)物的需要的試劑。

本發(fā)明其他方面和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)隨后的描述而變得明顯。然而應(yīng)該明白，當(dāng)指本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式時(shí)，僅是以例示方式提供詳細(xì)描述和特定實(shí)施例，因?yàn)閺脑撛敿?xì)描述中在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。

發(fā)明詳述

在第一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種評(píng)估個(gè)體心力衰竭的方法，包括步驟：a)測(cè)量從該個(gè)體獲得的樣品中標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的濃度，b)任選地測(cè)量樣品中一種或更多種其他心力衰竭標(biāo)識(shí)物的濃度，c)通過(guò)將步驟(a)中確定的濃度和任選地步驟(b)中確定的濃度與對(duì)照樣品中確定的該標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物的濃度比較以評(píng)估心力衰竭。

如在此使用的，下列每一個(gè)術(shù)語(yǔ)都具有與在本節(jié)中的它相關(guān)的意義。

在此使用的冠詞“一”是指一或超過(guò)一(即至少一)的該冠詞的語(yǔ)法客體。例如，“一種抗體”表示一種抗體或一種以上的抗體。

“一或更多”表示1至50個(gè)，優(yōu)選1到20，也優(yōu)選2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)識(shí)物”或“生化標(biāo)識(shí)物”指一種分子，該分子作為用于分析患者的測(cè)試樣品的靶標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方式中，這些分子靶標(biāo)的實(shí)例是蛋白質(zhì)或多肽。在本發(fā)明中用作標(biāo)識(shí)物的蛋白或多肽預(yù)計(jì)包括所述蛋白天然存在的片段，特別是免疫學(xué)可檢測(cè)的片段。免疫學(xué)可檢測(cè)的片段優(yōu)選包含所述標(biāo)識(shí)物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20個(gè)連續(xù)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到細(xì)胞釋放的蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)中存在的蛋白會(huì)被損壞，比如在炎癥階段，并且可被降解或者裂解成這樣的片段。某些標(biāo)識(shí)物以非活性的形式合成，隨后可能通過(guò)蛋白水解被活化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，蛋白質(zhì)或其片段也可以作為復(fù)合物的一部分存在。這些復(fù)合物也可能用作本發(fā)明意義上的標(biāo)識(shí)物。此外，或可選的，標(biāo)識(shí)物多肽可以帶有翻譯后修飾。翻譯后修飾的實(shí)例有糖基化、?；?或磷酸化等等。

術(shù)語(yǔ)“評(píng)估心力衰竭”是指按照本發(fā)明的方法將輔助醫(yī)師評(píng)估個(gè)體是否具有發(fā)展心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，或輔助醫(yī)師在HF診斷相關(guān)的一個(gè)或幾個(gè)其他的領(lǐng)域評(píng)估HF患者。評(píng)估HF個(gè)體優(yōu)選的診斷相關(guān)領(lǐng)域?yàn)樾牧λソ叩姆制?、急性和慢性心力衰竭的鑒別診斷、判斷疾病進(jìn)程的風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)選擇適當(dāng)?shù)乃幬铩⒅委煼磻?yīng)的監(jiān)視和隨訪(fǎng)HF患者。

本發(fā)明意義上的“心力衰竭標(biāo)識(shí)物”是一種標(biāo)識(shí)物，如果該標(biāo)識(shí)物與標(biāo)識(shí)物IGFBP-7相結(jié)合能為研究中的診斷疑難增加HF評(píng)估的相關(guān)信息。對(duì)評(píng)估HF而言，將所述標(biāo)識(shí)物納入一種已包含標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的標(biāo)識(shí)物組合，如果在給定特異性下的敏感性或如果在給定敏感性下的特異性可被分別提高，該信息被認(rèn)為是相關(guān)的或具有附加價(jià)值。優(yōu)選地，在敏感性或特異性方面的提高分別是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的，具有p＝0.05、0.02、0.01或更小的顯著性水平。優(yōu)選地，一種或更多種心力衰竭的其他標(biāo)識(shí)物選自利尿鈉肽標(biāo)識(shí)物、心臟肌鈣蛋白標(biāo)識(shí)物和炎癥標(biāo)識(shí)物。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“樣品”指一種為了進(jìn)行體外評(píng)價(jià)而獲取的生物樣品。在本發(fā)明方法中，樣品或患者樣品優(yōu)選地可包含任何體液。優(yōu)選的試驗(yàn)樣品包括血液、血清、血漿、尿液、唾液和關(guān)節(jié)液。優(yōu)選樣品是全血、血清、血漿或關(guān)節(jié)液，血漿或血清是最方便的樣品種類(lèi)。技術(shù)人員將會(huì)知道，任何這樣的評(píng)估在體外進(jìn)行。然后丟棄患者樣品?；颊邩悠穬H僅用于本發(fā)明的體外方法并且患者樣品中的物質(zhì)不會(huì)回輸給患者身體。一般地，樣品是液體樣品，例如，全血、血清或血漿。

“將……濃度與對(duì)照樣品中確定的濃度進(jìn)行比較”的表述僅用于進(jìn)一步的舉例對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的內(nèi)容。對(duì)照樣品可以是內(nèi)部對(duì)照或外部對(duì)照樣品。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用內(nèi)部對(duì)照樣品，即在受試樣品中評(píng)估標(biāo)識(shí)物水平，并在取自于同一個(gè)受試者的一個(gè)或更多個(gè)其他樣品中也評(píng)估該標(biāo)識(shí)物水平以確定所述標(biāo)識(shí)物水平是否有任何的變化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用外部對(duì)照樣品。對(duì)于外部對(duì)照樣品，來(lái)自該個(gè)體的樣品中標(biāo)識(shí)物的存在或數(shù)量將與另一個(gè)體中該標(biāo)識(shí)物的存在或數(shù)量進(jìn)行比較，后者個(gè)體已知正患有或已知具有某種給定狀況的風(fēng)險(xiǎn)，或者個(gè)體已知沒(méi)有給定狀況，即“正常個(gè)體”。例如，在患者樣品中的標(biāo)識(shí)物水平可與HF中與特定病程有關(guān)的已知水平相比較。通常，樣品標(biāo)識(shí)物水平直接或間接與診斷相關(guān)，并且例如該標(biāo)識(shí)物水平用于確定個(gè)體是否具有HF的風(fēng)險(xiǎn)?？蛇x擇地，例如，樣品的標(biāo)識(shí)物水平可以與已知與在HF患者治療時(shí)的反應(yīng)、急性和慢性心力衰竭鑒別診斷、選擇適當(dāng)?shù)乃幬镏委烪F的指導(dǎo)、鑒別疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)或隨訪(fǎng)HF患者有關(guān)的標(biāo)識(shí)物水平相比較。根據(jù)計(jì)劃的診斷用途，選擇適當(dāng)?shù)膶?duì)照樣品并且確定其中標(biāo)志物的對(duì)照或參考值。技術(shù)人員將理解在一個(gè)實(shí)施方式中這些對(duì)照樣品是從參考群體獲得的，該群體年齡匹配并且沒(méi)有混雜的疾病。同時(shí)技術(shù)人員明了，在對(duì)照樣品中確定的標(biāo)識(shí)物絕對(duì)值將由所用的試驗(yàn)方法決定。從來(lái)自于適當(dāng)參考群體的100位明確表征的個(gè)體的優(yōu)選樣品被用于確定對(duì)照(參考)值。還優(yōu)選的是，參考群體也可以被選擇由20、30、50、200、500或1000個(gè)個(gè)體組成。健康個(gè)體代表優(yōu)選的參考群體以確定對(duì)照值。

從來(lái)自個(gè)體的樣品測(cè)定的IGFBP-7的提高的值是心力衰竭的指示。

對(duì)照組或?qū)φ杖后w中測(cè)得的IGFBP-7值用于例如確定截止值或參考范圍。高于該截止值或超出參考范圍和高端點(diǎn)的數(shù)值被認(rèn)為是升高了。

在一個(gè)實(shí)施方式中，固定的截止值被確定。選定該截止值以符合感興趣的診斷問(wèn)題。

在一個(gè)實(shí)施方式中，從對(duì)照組或?qū)φ杖后w中測(cè)量的IGFBP-7值用于確定參考范圍。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果測(cè)量值高于參考范圍的90％，IGFBP-7濃度被認(rèn)為升高。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中如果測(cè)量值高于參考范圍95％、96％、97％或97.5％，IGFBP-7濃度被認(rèn)為升高。

在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)照樣品為內(nèi)部對(duì)照樣品。在該實(shí)施方式中，從研究的個(gè)體中獲得系列樣品并比較標(biāo)識(shí)物水平。這樣可能對(duì)于比如評(píng)價(jià)治療效果是有用的。

按照本發(fā)明的方法基于從個(gè)體獲得的液體樣品，并基于這些樣品中的IGFBP-7測(cè)量。在此使用的“個(gè)體”指單個(gè)人類(lèi)或非人類(lèi)生物體。因此在此描述的方法和組合物可應(yīng)用到人類(lèi)和動(dòng)物疾病。優(yōu)選的個(gè)體是人。

IGFBP-7

胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)和相應(yīng)的結(jié)合蛋白(BPs)

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)系統(tǒng)在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中有重要的作用。它包含兩個(gè)配體，IGF-I和IGF-II，兩個(gè)受體，1型和2型IGF受體，并且到1995年為止六個(gè)IGF-結(jié)合蛋白(IGFBPs)，IGFBP-1至-6(Jones，J.I.，等，Endocr.Rev.16(1995)3-34)。最近IGFBP家族的已經(jīng)擴(kuò)展至包括IGFBP-相關(guān)蛋白(IGFBP-rPs)，這些IGFBP-相關(guān)蛋白質(zhì)具有與IGFBPs明顯的結(jié)構(gòu)相似性(Hwa，V.，等，Endocr.Rev20(1999)761-787)。因此，IGFBP超家族包括六個(gè)普通的IGFBPs，其具有對(duì)IGFs的高親合力，以及至少10個(gè)IGFBP-rPs，這些蛋白不僅具有IGFBPs保守的氨基端結(jié)構(gòu)域而且對(duì)IGFs和胰島素顯示一定程度的親合力。IGFBP-rPs是一類(lèi)富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，它們控制多種的細(xì)胞功能，如細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞粘著和遷移，以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。此外這些蛋白可能參與如組織增生和分化、再生、血管生成、創(chuàng)傷修復(fù)、炎癥、纖維化和腫瘤生成的生物學(xué)過(guò)程(Hwa，V.等，Endocr.Rev 20(1999)761-787)。

IGF結(jié)合蛋白7(＝IGFBP-7)是30kDa的模塊糖蛋白，現(xiàn)已知可通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌(Ono，Y.，等，Biochem Biophys Res Comm 202(1994)1490-1496)。在該著作中，該分子也被命名為FSTL2；IBP 7；IGF結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)1；IGFBP7；IGFBP 7v；IGFBP rP1；IGFBP7；IGFBPRP1；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7前體；MAC25；MAC 25蛋白；PGI2刺激因子；以及PSF或前列腺環(huán)素刺激因子。Northern印跡研究顯示該基因在人類(lèi)組織，包括心臟、腦、胎盤(pán)、肝、骨骼肌和胰腺中廣泛表達(dá)(Oh，Y.，等，J.Biol.Chem.271(1996)30322-30325)。

IGFBP-7最初鑒定為在正常的柔腦膜和乳房上皮細(xì)胞中、與它們對(duì)應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中相比差異性表達(dá)的基因，并命名為腦膜瘤-關(guān)聯(lián)cDNA(MAC 25)(Burger A.M.，等，Oncogene 16(1998)2459-2467)。表達(dá)的蛋白作為腫瘤來(lái)源的粘著因子(后來(lái)重命名為血管調(diào)節(jié)素(angiomodulin))(Sprenger，C.C.，等，Cancer Res 59(1999)2370-2375)以及作為前列腺環(huán)素刺激因子(Akaogi，K.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 93(1996)8384-8389)被單獨(dú)純化。它也被報(bào)道為T(mén)1A12，在乳癌中下調(diào)的基因(StCroix，B.等，Science 289(2000)1197-1202)。

IGFBP-7的生物學(xué)功能還不能清楚地確定。初步的試驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定的爭(zhēng)議并涉及IGFBP-7的不同作用，比如腫瘤抑制作用(Sprenger，C.C.等，Cancer Res 59(1999)2370-2375)，腫瘤生長(zhǎng)促進(jìn)作用(Lopez-Bermejo，A.等，J.Clinical Endocrinology and Metabolism88(2003)3401-3408)，前列腺環(huán)素刺激作用(Akaogi，K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)8384-8389)以及涉及血管生成(Yamauchi，T.等，Biochem J.303(1994)591-598)和衰老(Lopez-Bermejo，A.等，Endocrinology 141(2000)4072-4080)。

從患有不同疾病包括心臟病、腎病、炎性疾病(Scios Inc.的US6,709,855)和血管移植疾病(US 2006/0,003,338)的患者中測(cè)得了IGFBP-7mRNA的差異表達(dá)。

多個(gè)不同的試驗(yàn)已經(jīng)闡述并應(yīng)用于測(cè)試IGFBP-7的激素結(jié)合特性。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性親合交聯(lián)試驗(yàn)可分析低親合力的IGF結(jié)合。重組人類(lèi)mac25蛋白特異性結(jié)合IGF-I和-II(Oh，Y.等，J.Biol.Chem.271(1996)30322-20325；Kim，H.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci USA94(1997)12981-12986.)。IGFBP活性也可通過(guò)用Western配體印跡法測(cè)量該蛋白結(jié)合放射性標(biāo)記的IGF的能力而檢測(cè)。

最近進(jìn)行了循環(huán)IGFBP-7的免疫學(xué)測(cè)定。這種低水平的被測(cè)物在隨機(jī)的人類(lèi)血清中被檢出并且已經(jīng)看到血清水平升高與胰島素抗性相關(guān)聯(lián)(Lopez-Bermejo，A.等，J.Clinical Endocrinology and Metabolism88(2003)3401-3408，Lopez-Bermejo，A.等，Diabetes 55(2006)2333-2339)。

一些專(zhuān)利申請(qǐng)涉及IGFBPs作為用于大范圍的各種疾病的診斷劑、預(yù)防劑和治療劑的潛在效用。

US2003/0186308公開(kāi)了一種叫做前列腺環(huán)素-刺激因子-2的人類(lèi)多肽(PSF-2；＝IGFBP-7)以及它檢測(cè)病理狀況的可選診斷應(yīng)用。

WO 2003/54004推測(cè)IGFBP-7可能用于大量疾病的診斷。主張它可能被應(yīng)用于診斷細(xì)胞增生性失調(diào)、自身免疫性/炎癥性失調(diào)、心臟血管病、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、發(fā)育失調(diào)、代謝紊亂、生殖障礙、感染、生長(zhǎng)失調(diào)如生長(zhǎng)激素缺乏、肢端肥大癥、IUGR、巨體、腫瘤生成以及癌癥(例如乳腺癌)、糖尿病及其并發(fā)癥(例如糖尿病腎病)、慢性腎衰竭、血管病、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化癥及再狹窄和其他病理狀況。

US2004/0072238涉及差異表達(dá)或突變的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的檢測(cè)以診斷：伴隨異常細(xì)胞生長(zhǎng)的疾病、伴隨血管病的疾病、伴隨異常骨代謝的疾病、伴隨胰島素樣生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)激素功能紊亂的疾病、伴隨平滑肌細(xì)胞異常分化或生長(zhǎng)的疾病、伴隨骨骼肌細(xì)胞異常分化或生長(zhǎng)的疾病、伴隨胃酸分泌異常的疾病和炎性疾病。在據(jù)稱(chēng)包含在伴隨如前所述的一種或其他種病癥的疾病之一中的進(jìn)一步的列表中，幾乎任何醫(yī)學(xué)相關(guān)狀況都被提及。

WO 2004/042000描述超過(guò)150種分泌性蛋白質(zhì)在多種醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的治療應(yīng)用。提到的序列之一就是IGFBP-7序列。

WO 1994/029448描述了PGI2生產(chǎn)促進(jìn)蛋白(PGI2刺激因子)在治療一些疾病，如溶血性尿毒癥綜合征、血栓性血小板減少性紫癜、末梢栓塞、心臟缺血、腦缺血、動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗塞、高脂血癥、糖尿病、心力衰竭、心絞痛、缺血性心臟病、充血性心臟病、脈絡(luò)膜循環(huán)障礙、支氣管疾病、胃潰瘍和妊娠驚厥的用途，這些治療是以血小板聚集抑制活性、平滑肌弛緩活性和胃分泌為基礎(chǔ)。

優(yōu)選地，標(biāo)識(shí)物IGFBP-7是通過(guò)使用特異結(jié)合試劑從液體樣品中特異性測(cè)定的。

特異結(jié)合試劑是例如IGFBP-7受體，結(jié)合IGFBP-7的凝集素或IGFBP-7的抗體。特異結(jié)合試劑對(duì)其相應(yīng)的靶分子具有至少10⁷l/mol的親合力。特異結(jié)合試劑優(yōu)選對(duì)靶分子具有10⁸l/mol或更優(yōu)選10⁹l/mol的親合力。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)“特定”用于表示存在于樣品中的其他生物分子不能與IGFBP-7特異結(jié)合試劑有明顯的結(jié)合。優(yōu)選地，與非靶分子的生物分子結(jié)合程度分別產(chǎn)生的結(jié)合親合力僅僅為與靶分子的親合力的10％或更小，更優(yōu)選地僅5％或更小。優(yōu)選的特異結(jié)合試劑應(yīng)具有上述親合力以及特異性的最低的標(biāo)準(zhǔn)。

特異結(jié)合試劑優(yōu)選是與IGFBP-7反應(yīng)的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”指多克隆抗體、單克隆抗體、這些抗體的抗原結(jié)合片段、單鏈抗體以及包括抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的遺傳構(gòu)建物。

任何保留上述特異結(jié)合試劑標(biāo)準(zhǔn)的抗體片段都能被使用。抗體可通過(guò)目前工藝水平步驟所生產(chǎn)，例如，如Tijssen描述(Tijssen，P.，酶聯(lián)免疫分析的實(shí)踐和理論(Practice and theory of enzyme immunoassays)，Elsevier Science Publishers B.V.，阿姆斯特丹(1990)，全書(shū)，特別是43-78頁(yè))。此外，技術(shù)人員非常了解基于可用于抗體特異性分離的免疫吸附劑的方法。通過(guò)這些方法，多克隆抗體的質(zhì)量以及由此它們?cè)诿庖邷y(cè)定中的性能可被增強(qiáng)(Tijssen，P.，上文，108-115頁(yè))。

對(duì)于在該本發(fā)明中公開(kāi)的成果，可以使用從山羊獲得的多克隆抗體。然而，很清楚，從不同的物種，例如大鼠、兔子或豚鼠中獲得的多克隆抗體以及單克隆抗體也可以使用。因?yàn)閱慰寺】贵w能以恒定性能按需要的數(shù)量生產(chǎn)，它們是臨床常規(guī)的分析的開(kāi)發(fā)中的理想工具。

在根據(jù)本發(fā)明的方法，產(chǎn)生并使用抗IGFBP-7單克隆抗體分別代表其他的優(yōu)選實(shí)施方式。

從天然來(lái)源純化IGFBP-7并不容易。IGFBP-7的重組生產(chǎn)是獲得更高數(shù)量IGFBP-7的可選方法。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用真核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)生產(chǎn)IGFBP-7。桿狀病毒表達(dá)、在酵母中表達(dá)以及在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)都是真核表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，IGFBP-7的表達(dá)是在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)的。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子有CHO細(xì)胞、HEK細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞等等。在進(jìn)一步的優(yōu)選的實(shí)施方式中，用重組生產(chǎn)的IGFBP-7作為抗原以生產(chǎn)抗IGFBP-7的多克隆或單克隆抗體。利用上述的重組生產(chǎn)的IGFBP-7，通過(guò)在IGFBP-7免疫吸附劑上進(jìn)行免疫吸附而純化多克隆抗體也是優(yōu)選的。

現(xiàn)在技術(shù)人員應(yīng)理解，IGFBP-7已經(jīng)鑒定為在評(píng)估HF中有用的標(biāo)識(shí)物，可用替代方法獲得與本發(fā)明成果相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。例如，可使用產(chǎn)生抗體的替代策略。這些策略包括使用合成或重組肽等等，這些肽代表IGFBP-7的臨床相關(guān)的表位以用于免疫。可選地，可以使用DNA免疫，又稱(chēng)做DNA疫苗接種。

對(duì)于測(cè)量，將從個(gè)體中獲得的液體樣品和IGFBP-7的特異結(jié)合試劑在適合形成結(jié)合試劑IGFBP-7-復(fù)合物的條件下孵育。這些情況無(wú)須特別指定，因?yàn)榧幢銢](méi)有任何創(chuàng)造性勞動(dòng)技術(shù)人員也可以很容易地鑒定這些適當(dāng)?shù)姆跤龡l件。測(cè)定結(jié)合試劑IGFBP-7-復(fù)合物的數(shù)量并用于HF的評(píng)估。技術(shù)人員應(yīng)理解，有許多的方法可測(cè)定特異結(jié)合試劑IGFBP-7-復(fù)合物的數(shù)量，這些方法在相關(guān)的教科書(shū)中有詳細(xì)地描述(參見(jiàn)，例如，Tijssen P.，上文，或Diamandis，E.P.and Christopoulos，T.K.(eds.)，Immunoassay，Academic Press，Boston(1996))。

優(yōu)選地，使用三明治檢驗(yàn)形式檢測(cè)IGFBP-7。在這種檢驗(yàn)中，用第一特異結(jié)合試劑從一側(cè)捕獲IGFBP-7，并使用帶有能直接或間接檢測(cè)標(biāo)記的第二特異結(jié)合試劑作用于另一側(cè)。優(yōu)選地，在定性(有或無(wú)IGFBP-7)或定量(確定IGFBP-7的量)的免疫測(cè)定中，使用抗IGFBP-7的抗體。

如在實(shí)施例部分詳細(xì)描述的，兩種小鼠模型已經(jīng)用于鑒定通過(guò)先進(jìn)的蛋白組方法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟組織中發(fā)現(xiàn)的多肽。然而這些模型得到了至少部分矛盾的數(shù)據(jù)，當(dāng)然多肽的組織數(shù)據(jù)并不能代表這些多肽在循環(huán)中的有或無(wú)。在模型中被發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的標(biāo)識(shí)物可能不能在第二種模型中差異表達(dá)，或者甚至在進(jìn)一步的模型中顯示出矛盾的數(shù)據(jù)。即使蛋白可以在組織中差異表達(dá)，但如果從體液中測(cè)定，大多數(shù)情況下這種蛋白沒(méi)有任何診斷性關(guān)聯(lián)，因?yàn)樗赡懿槐会尫胖裂h(huán)中，可能變成片段或者被修飾，例如從細(xì)胞或者組織釋放時(shí)，可能在循環(huán)系統(tǒng)中不穩(wěn)定，可能在循環(huán)系統(tǒng)中不能被檢測(cè)，可能對(duì)于特定的疾病不特異，等等。

令人驚訝地，本發(fā)明的發(fā)明人能在體液樣品中檢測(cè)蛋白IGFBP-7。更意外地是，他們能證明在這種獲自個(gè)體的液體樣品中IGFBP-7的存在可以與HF相關(guān)。使用標(biāo)識(shí)物IGFBP-7評(píng)估HF無(wú)需組織和活檢樣品。測(cè)量蛋白IGFBP-7的水平在HF領(lǐng)域被認(rèn)為是十分優(yōu)越的。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，依據(jù)本發(fā)明的方法是以血清作為液體樣品材料進(jìn)行的。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，按照本發(fā)明的方法是以血漿作為液體樣品材料進(jìn)行的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，按照本發(fā)明的方法是以全血作為液體樣品材料進(jìn)行的。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及蛋白IGFBP-7作為標(biāo)識(shí)物分子從獲自個(gè)體的液體樣品來(lái)評(píng)價(jià)心力衰竭的用途。

用于診斷的理想情況應(yīng)是其中單一事件或者過(guò)程導(dǎo)致相應(yīng)疾病的情況，例如傳染病。在其他所有的病例中正確的診斷是很難的，尤其是該疾病的病原學(xué)沒(méi)有像HF病那樣被充分認(rèn)識(shí)。技術(shù)人員應(yīng)理解，在HF領(lǐng)域，針對(duì)某一診斷問(wèn)題，沒(méi)有生化標(biāo)識(shí)物在診斷上有100％特異性并同時(shí)具有100％敏感性。生化標(biāo)識(shí)物更合適用以某種可能性或者預(yù)測(cè)值來(lái)評(píng)估潛在的診斷問(wèn)題。技術(shù)人員十分熟悉對(duì)于評(píng)價(jià)診斷問(wèn)題時(shí)用來(lái)計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)性或者可能性的常規(guī)數(shù)學(xué)/統(tǒng)計(jì)方法。在常規(guī)臨床實(shí)踐中，在醫(yī)師診斷、治療和處置潛在疾病時(shí)通常會(huì)同時(shí)考察各種的臨診癥狀和生物標(biāo)志物。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于評(píng)估HF的方法是通過(guò)測(cè)量IGFBP-7和一種或更多種其他的標(biāo)識(shí)物的濃度并通過(guò)在HF的評(píng)估中利用IGFBP-7和一種或更多種其他的標(biāo)識(shí)物的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

在評(píng)估HF中，標(biāo)識(shí)物IGFBP-7將會(huì)以下面的一個(gè)或更多個(gè)方面輔助醫(yī)師：評(píng)估個(gè)體患心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)或者評(píng)估患有心力衰竭的患者，例如鑒定心力衰竭的階段；區(qū)分急性和慢性心力衰竭；判斷疾病進(jìn)程的風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)選擇適當(dāng)治療提供指導(dǎo)；監(jiān)測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)；監(jiān)測(cè)病程，即隨訪(fǎng)HF患者。

篩選(評(píng)估個(gè)體是否有發(fā)展心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn))

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種評(píng)估個(gè)體是否有發(fā)展心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，包括步驟：測(cè)量樣品中標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的濃度，任選地測(cè)量樣品中一種或更多種心力衰竭的其他標(biāo)識(shí)物的濃度，通過(guò)將該IGFBP-7濃度和任選地對(duì)所述任選的一種或更多種其他標(biāo)識(shí)物測(cè)量的濃度與該標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物濃度的參考值比較來(lái)評(píng)價(jià)所述個(gè)體發(fā)展為心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明意義上的篩選涉及關(guān)于個(gè)體發(fā)展心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)的無(wú)偏見(jiàn)的評(píng)估。而這種篩選在理論上可以對(duì)任何樣品進(jìn)行，在臨床實(shí)踐中這種篩選通常會(huì)給予具有以某種方式發(fā)展心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。按以上討論的，這種個(gè)體可以無(wú)臨床癥狀，即他們沒(méi)有HF的體征或者癥狀。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，將對(duì)具有發(fā)展心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體進(jìn)行HF篩選，例如屬于按ACC/AHA實(shí)踐指南定義的階段A或者B。

如上述，心力衰竭是發(fā)達(dá)國(guó)家中流行性最高、花費(fèi)最多和對(duì)生命成脅最嚴(yán)重的疾病之一。因?yàn)樗母吡餍行院蜔o(wú)癥狀期長(zhǎng)，為了干預(yù)并如果可能的話(huà)阻斷該病程，對(duì)于個(gè)體發(fā)展HF風(fēng)險(xiǎn)的鑒定將變得極其重要。只有進(jìn)行足夠早期的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，才可能阻止HF病程從無(wú)癥狀期進(jìn)入有癥狀期。

心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估是通過(guò)數(shù)學(xué)/統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行的，技術(shù)人員對(duì)該方法對(duì)該方法有充分地認(rèn)識(shí)和理解。優(yōu)選地，個(gè)體患心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)是以相對(duì)值表示的并按所謂的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)性(＝RR)來(lái)給出。為了計(jì)算這種心力衰竭的RR，將IGFBP-7的個(gè)體數(shù)值與在參考群體中確定的數(shù)值進(jìn)行對(duì)比，對(duì)照群體優(yōu)選為不發(fā)生心力衰竭的健康個(gè)體。此外優(yōu)選對(duì)這種心力衰竭RR的評(píng)估基于在研究期內(nèi)，優(yōu)選一年或者也可優(yōu)選兩年之內(nèi)發(fā)展心力衰竭的個(gè)體群和在相同研究期內(nèi)未發(fā)展心力衰竭的個(gè)體群。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及標(biāo)識(shí)物IGFBP-7來(lái)篩選心力衰竭的用途。如技術(shù)人員熟知，術(shù)語(yǔ)“用作標(biāo)識(shí)物”表示標(biāo)識(shí)物分子的濃度可以通過(guò)適當(dāng)手段進(jìn)行量化而且測(cè)出的這種標(biāo)識(shí)物的值將用于指示，即標(biāo)示，疾病或者臨床狀況的有或無(wú)。用于定量的適當(dāng)手段例如是特異結(jié)合試劑，如抗體。

優(yōu)選地，HF篩選將實(shí)施于懷疑在未來(lái)出現(xiàn)心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體上。在該意義上，具有未來(lái)心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的患者是已診斷有高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化疾病、糖尿病、肥胖和代謝綜合征的患者。優(yōu)選地，對(duì)患有高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化疾病、糖尿病和/或代謝綜合征的個(gè)體進(jìn)行未來(lái)心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

還優(yōu)選的是，標(biāo)識(shí)物IGFBP-7對(duì)處于按照ACC/AHA實(shí)踐指南定義的階段B中的個(gè)體，即呈現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)改變但沒(méi)有顯示心力衰竭癥狀的個(gè)體評(píng)估未來(lái)心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的用途。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及IGFBP-7作為HF標(biāo)識(shí)物組合的一種標(biāo)識(shí)物用于HF篩選目的的用途。

在篩選設(shè)置中，IGFBP-7的水平升高是個(gè)體發(fā)展心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)升高的陽(yáng)性指示。

患者的分級(jí)

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種輔助對(duì)心力衰竭患者分級(jí)的體外方法，包括步驟：a)測(cè)量樣品中標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的濃度，b、)任選地測(cè)量樣品中一種或更多種心力衰竭的其他標(biāo)識(shí)物的濃度，并通過(guò)將在步驟(a)中確定的濃度和任選地步驟(b)中確定的濃度與該標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物濃度的參考值進(jìn)行比較來(lái)對(duì)心力衰竭進(jìn)行分級(jí)。優(yōu)選地標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的水平用作在分級(jí)中輔助將受試個(gè)體分入個(gè)體組，這些組為臨床“正?！?即，按照ACA/ACC分類(lèi)在階段A的個(gè)體)，具有結(jié)構(gòu)心臟病但無(wú)癥狀的患者(按照ACA/ACC分類(lèi)的階段B)和心力衰竭患者組(即，按照ACA/ACC分類(lèi)處于階段C或階段D的患者)。

區(qū)別急性心臟事件和慢性心臟病

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及輔助鑒別診斷急性心臟事件和慢性心臟病的體外方法，包括步驟：測(cè)量樣品中標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的濃度，任選地測(cè)量樣品中一種或更多種心力衰竭的其他標(biāo)識(shí)物的濃度，并通過(guò)將步驟(a)確定的濃度和任選地步驟(b)中確定的濃度與這個(gè)標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物濃度的參考值進(jìn)行比較以確立對(duì)急性心臟事件和慢性心臟病的鑒別診斷。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉“急性心臟事件”和“慢性心臟病”的意思。

優(yōu)選地，“急性心臟事件”涉及心臟的急性狀況、疾病或機(jī)能紊亂，特別指急性心力衰竭，例如，心肌梗死(MI)或心律失常。根據(jù)MI的程度，可能后續(xù)LVD和CHF。

優(yōu)選地，“慢性心臟病”是心臟功能的減弱，例如，由于心臟缺血、冠狀動(dòng)脈病或前期的特別小型的心肌梗死(也許后續(xù)發(fā)生進(jìn)行性L(fǎng)VD)造成。也可能由于炎性疾病、心臟瓣膜缺陷(例如二尖瓣缺陷)、擴(kuò)張型心肌病(dilatative cardiomyopathy)、肥厚型心肌病、心臟節(jié)奏缺陷(心律失常)和慢性阻塞性肺病造成。因此，慢性心臟病顯然也可以包括患有過(guò)急性冠狀綜合征，例如MI的患者，但他們當(dāng)前沒(méi)有患有急性心臟事件。

區(qū)分急性心臟事件和慢性心臟病十分重要，因?yàn)榧毙孕呐K事件和慢性心臟病可能要求相當(dāng)不同的治療方案。例如對(duì)于存在急性心肌梗塞的患者早期再灌注治療可能極度重要。而對(duì)慢性心力衰竭的患者進(jìn)行再灌注治療最多是對(duì)這個(gè)患者無(wú)害或僅僅是幾乎無(wú)害。

按照本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，標(biāo)識(shí)物IGFBP-7用于鑒別診斷急性和慢性心力衰竭。

評(píng)估疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種評(píng)估HF患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，包括步驟：在樣品中測(cè)量標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的濃度，任選地測(cè)量樣品中一種或更多種心力衰竭的其他標(biāo)識(shí)物的濃度，通過(guò)將該IGFBP-7濃度和任選地對(duì)所述任選的一種或更多種其他的標(biāo)識(shí)物確定的濃度與該標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物的濃度的參考值比較來(lái)確定所述個(gè)體疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。

目前很難評(píng)估或甚至預(yù)言一種合理的可能性，即診斷有HF的患者是否具有一種或多或少的穩(wěn)定狀態(tài)，或是否疾病將會(huì)發(fā)展，以及患者的健康狀態(tài)是否最終可能惡化。心力衰竭的嚴(yán)重性和進(jìn)展在臨床上通常通過(guò)評(píng)估臨床癥狀或使用成像技術(shù)，如超聲波心動(dòng)描記術(shù)鑒定有害變化而確定的。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，心力衰竭的惡化是通過(guò)監(jiān)測(cè)左側(cè)心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)來(lái)確定。LVEF的5％或更多的惡化被認(rèn)為是疾病進(jìn)展。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明因此涉及標(biāo)識(shí)物IGFBP-7來(lái)評(píng)估患有HF患者的疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的用途。在患有HF的患者的疾病進(jìn)展評(píng)估中，IGFBP-7水平的升高指示疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)升高。

指導(dǎo)選擇適當(dāng)?shù)腍F治療方法

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及輔助選擇適當(dāng)?shù)腍F療法的體外方法，包括步驟：在樣品中測(cè)量標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的濃度，任選地測(cè)量樣品中一種或更多種心力衰竭的其他標(biāo)識(shí)物的濃度，并通過(guò)將該IGFBP-7濃度和任選地對(duì)所述任選的一種或更多種其他的標(biāo)識(shí)物測(cè)定的濃度與該標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物的濃度的參考值比較來(lái)選擇適當(dāng)?shù)寞煼ā?/p>

人們期望標(biāo)識(shí)物IGFBP-7能輔助醫(yī)師從手邊各種治療心力衰竭的方案中選擇最適當(dāng)?shù)闹委煼桨浮Ｒ虼艘粋€(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式涉及了標(biāo)識(shí)物IGFBP-7在選擇治療患HF患者的方案中的用途。

監(jiān)測(cè)患者對(duì)治療方法的反應(yīng)

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種監(jiān)測(cè)患者對(duì)HF治療方法的反應(yīng)的體外方法，包括步驟：a)在樣品中測(cè)量標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的濃度，b)任選地測(cè)量樣品中一種或更多種心力衰竭的其他標(biāo)識(shí)物的濃度，并通過(guò)將步驟(a)中確定的IGFBP-7濃度和任選地步驟(b)中確定的濃度與該標(biāo)識(shí)物或這些標(biāo)識(shí)物的濃度的參考值比較來(lái)監(jiān)測(cè)患者對(duì)HF治療方法的反應(yīng)。

可選擇地，上述用于監(jiān)測(cè)患者對(duì)療法反應(yīng)的方法可以通過(guò)確定治療前后IGFBP-7和任選所述一種或更多種其他標(biāo)識(shí)物的標(biāo)識(shí)物水平并對(duì)治療前后的標(biāo)識(shí)物水平加以比較來(lái)實(shí)施。

心力衰竭的診斷是臨床確定的。根據(jù)本發(fā)明，如果患者到達(dá)按ACC/AHA實(shí)踐指南定義的階段C或D的標(biāo)準(zhǔn)，HF被認(rèn)為是臨床確定的。依據(jù)該指南，階段C指患者具有結(jié)構(gòu)性心臟病并有心力衰竭的較早或當(dāng)前癥狀。階段D的患者是具有難治性心力衰竭的患者，需要專(zhuān)門(mén)的干預(yù)。

進(jìn)一步如上所示，測(cè)定的NT-proBNP值與心力衰竭的嚴(yán)重性高度相關(guān)。然而，BNP和NT-proBNP在監(jiān)測(cè)患者對(duì)治療方法的反應(yīng)上并不理想，參考如Beck-da-Silva，L.等，Congest.Heart Fail.11(2005)248-253，quiz 254-255。

標(biāo)識(shí)物IGFBP-7看起來(lái)適合于監(jiān)測(cè)患者對(duì)治療方法的反應(yīng)。本發(fā)明因此也涉及IGFBP-7監(jiān)測(cè)患者對(duì)治療方法的反應(yīng)的用途。在該診斷領(lǐng)域，標(biāo)識(shí)物IGFBP-7還可以用于確定在治療之前的基線(xiàn)值并測(cè)定在治療之后的一個(gè)或幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IGFBP-7。在隨訪(fǎng)的HF患者中IGFBP-7的水平升高是HF的治療有效的陽(yáng)性指示。

標(biāo)識(shí)物組合

各生化標(biāo)識(shí)物可以被單獨(dú)測(cè)定，或者在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，也可以用基于芯片或基于珠的陣列技術(shù)同時(shí)測(cè)定。然后用每個(gè)標(biāo)識(shí)物的單獨(dú)截止獨(dú)立解釋該生物標(biāo)識(shí)物的濃度或?qū)⑺鼈兘M合起來(lái)解釋?zhuān)此鼈冃纬蓸?biāo)識(shí)物組合。

技術(shù)人員將理解將標(biāo)識(shí)物水平關(guān)聯(lián)于某種可能性或風(fēng)險(xiǎn)的步驟可以用不同的方法進(jìn)行并完成。優(yōu)選地，標(biāo)識(shí)物IGFBP-7和一種或更多種其他的標(biāo)識(shí)物的測(cè)定值用數(shù)學(xué)的方法進(jìn)行組合并且該組合值與潛在診斷問(wèn)題關(guān)聯(lián)。標(biāo)識(shí)物的值可以用任何目前適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)法與IGFBP-7的測(cè)量數(shù)據(jù)組合起來(lái)。

優(yōu)選地，應(yīng)用于標(biāo)識(shí)物組合的數(shù)學(xué)算法是邏輯函數(shù)。應(yīng)用這種數(shù)學(xué)算法或這種邏輯函數(shù)的結(jié)果優(yōu)選是單一值。依賴(lài)于潛在診斷問(wèn)題上，該值可以很容易地與如個(gè)體患心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)或在評(píng)估HF患者中有益的其他計(jì)劃診斷應(yīng)用相互關(guān)聯(lián)。在一個(gè)優(yōu)選的方式中該邏輯函數(shù)按以下步驟獲得：a)將個(gè)體分成組，例如正常、具有心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體、具有急性或慢性心力衰竭患者等組，b)用單變量分析法鑒定這些組之間有顯著相異的標(biāo)識(shí)物，c)邏輯回歸分析以評(píng)估在評(píng)估這些不同各組中有用的標(biāo)識(shí)物獨(dú)立差異值，d)構(gòu)建邏輯函數(shù)來(lái)組合獨(dú)立差異值。在這類(lèi)分析中標(biāo)識(shí)物不再是獨(dú)立的而代表標(biāo)識(shí)物組合。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于組合IGFBP-7值和另外至少一個(gè)標(biāo)識(shí)物值的邏輯函數(shù)通過(guò)以下方法獲得a)將個(gè)體分別地分入正常組和心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體組，b)確定IGFBP-7的值和另外至少一個(gè)標(biāo)識(shí)物的值，c)進(jìn)行邏輯回歸分析，和d)構(gòu)建邏輯函數(shù)來(lái)組合IGFBP-7的值和另外至少一個(gè)標(biāo)識(shí)物的值。

用于將標(biāo)識(shí)物組合與疾病關(guān)聯(lián)的邏輯函數(shù)優(yōu)選使用算法，這種算法通過(guò)統(tǒng)計(jì)方法的應(yīng)用而開(kāi)發(fā)得到。適當(dāng)統(tǒng)計(jì)方法例如判別分析(DA)(即線(xiàn)性、二次方程、正規(guī)化(regularized)-DA)，核方法(即SVM)，非參數(shù)法(即k-最近-相鄰分級(jí)法)，PLS(偏最小二乘法)，基于樹(shù)狀法(即邏輯回歸，CART，隨機(jī)森林法，Boosting/Bagging法)，廣義線(xiàn)性模型(即，邏輯回歸)，基于主分量的方法(即，SIMCA)，廣義加性模型，基于模糊邏輯的方法，基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的方法。技術(shù)人員選擇適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明的標(biāo)識(shí)物組合并藉此獲得適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)算法應(yīng)沒(méi)有什么問(wèn)題。優(yōu)選地，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)方法來(lái)獲得用于評(píng)估心力衰竭的數(shù)學(xué)算法，該統(tǒng)計(jì)方法選自于DA(即線(xiàn)性-，二次方程-，正規(guī)化的判別分析)，核方法(即SVM)，非參數(shù)法(即，k-最近-相鄰分級(jí)法)，PLS(偏最小二乘法)，基于樹(shù)狀法(即邏輯回歸，CART，隨機(jī)森林法，Boosting方法)，或廣義線(xiàn)性模型(即邏輯回歸)。涉及這些統(tǒng)計(jì)方法的細(xì)節(jié)可在以下的參考資料中找到：Ruczinski，I.等，J.of Computational and Graphical Statistics 12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the American Statistical Association 84(1989)165-175；Hastie，T.等，the Elements of Statistical Learning，Springer Verlag(2001)；Breiman，L.等，Classification and regression trees，Wadsworth International Group，California(1984)；Breiman，L.，Machine Learning45(2001)5-32；Pepe，M.S.，the Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction，Oxford Statistical Science Series，28，Oxford University Press(2003)；和Duda，R.O.等，Pattern Classification，John Wiley&Sons，Inc，Inc.，2nd ed.(2001)。

發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是將優(yōu)化多變量截止用于生物標(biāo)志物的潛在組合并區(qū)分狀態(tài)A和狀態(tài)B，例如，分別區(qū)分正常和具有心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，對(duì)治療有反應(yīng)的HF患者和治療失敗，患有急性心力衰竭的患者和患有慢性心力衰竭的HF患者，顯示出疾病進(jìn)展的HF患者和未顯示疾病進(jìn)展的患者。

在受試者工作曲線(xiàn)(receiver operator curve)以下的面積(＝AUC)能指示診斷程序的有效性或正確性。診斷方法的正確性最好是由它的受試者工作特征(receiver-operating characteristics)(ROC)來(lái)進(jìn)行描述(特別見(jiàn)Zweig，M.H.，和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC圖是從連續(xù)改變所有觀測(cè)數(shù)據(jù)的判定閾中全部敏感性/特異性配對(duì)結(jié)果的繪圖。

實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的臨床效果取決于它診斷的準(zhǔn)確性，或正確將受試者分級(jí)入臨床相關(guān)亞群的能力。診斷準(zhǔn)確性衡量該測(cè)定正確區(qū)別研究的受試者兩種不同狀況的能力。這些狀況例如健康和疾病或疾病進(jìn)展對(duì)沒(méi)有疾病進(jìn)展。

在每個(gè)病例中，ROC曲線(xiàn)圖通過(guò)在判定閾全范圍中繪制敏感性對(duì)1-特異性的曲線(xiàn)來(lái)描述了兩種分布之間的重疊。y軸是敏感性，或真陽(yáng)性分?jǐn)?shù)[按(真陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果數(shù)量)/(真陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果數(shù)量+假陰性測(cè)定結(jié)果數(shù)量)確定]。這也表示為疾病或狀況存在的陽(yáng)性。它僅是通過(guò)受影響亞群計(jì)算得到。X軸是假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)，或1-特異性[按(假陽(yáng)性結(jié)果數(shù)量)/(真陰性結(jié)果數(shù)量+假陽(yáng)性結(jié)果數(shù)量)確定]。它是特異性的指標(biāo)，完全由未受影響亞群計(jì)算得到。因?yàn)檎婕訇?yáng)性分?jǐn)?shù)完全分開(kāi)計(jì)算，通過(guò)使用來(lái)自?xún)煞N不同亞群的試驗(yàn)結(jié)果，ROC曲線(xiàn)圖與樣品中的疾病流行性無(wú)關(guān)。在ROC曲線(xiàn)圖中的每個(gè)點(diǎn)表示敏感性/1-特異性配對(duì)，其對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定的判斷閾。辨別力很好的測(cè)定(在兩種結(jié)果分布上沒(méi)有重疊)具有的ROC曲線(xiàn)圖穿過(guò)左上角，真陽(yáng)性分?jǐn)?shù)為1.0或100％(非常好的敏感性)，假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)是0(非常好的特異性)。對(duì)于一個(gè)無(wú)辨別力的測(cè)定(對(duì)兩組的結(jié)果分布相同)來(lái)說(shuō)理論曲線(xiàn)圖是一條從左下角到右上角的45°對(duì)角線(xiàn)。大多數(shù)曲線(xiàn)在這兩種極端之間。(如果ROC曲線(xiàn)圖完全落在45°對(duì)角線(xiàn)下，這種情況很容易補(bǔ)救，即通過(guò)顛倒“陽(yáng)性”標(biāo)準(zhǔn)，從“大于”到“小于”或反之亦然。)定性地，曲線(xiàn)圖越接近左上角，測(cè)定的總精度越高。

量化實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)診斷準(zhǔn)確性的一個(gè)方便的目標(biāo)是通過(guò)單一數(shù)字來(lái)表示它的效果。最常用的總體量度是ROC曲線(xiàn)下的面積(AUC)。按照慣例，該面積總≥0.5(如果不是這樣，可以顛倒判定規(guī)則來(lái)使它如此)。數(shù)值介于1.0(兩組的測(cè)試值非常好地分開(kāi))和0.5(在測(cè)試值上兩組無(wú)明顯的分布差異)之間。該面積不僅僅依賴(lài)曲線(xiàn)圖的特定部分如最接近對(duì)角線(xiàn)的點(diǎn)或在90％特異性處的敏感性，而是整個(gè)曲線(xiàn)圖。這是一個(gè)定量的、描述性的表達(dá)式，表示ROC曲線(xiàn)圖接近完美(面積＝1.0)的程度。

總的檢驗(yàn)敏感性依賴(lài)于特異性，該特異性對(duì)于實(shí)踐此處公開(kāi)的方法是需要的。在某些優(yōu)選的設(shè)定中，75％的特異性可能足夠并且統(tǒng)計(jì)方法和結(jié)果算法可以基于該特異性的需求。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，應(yīng)用于評(píng)估個(gè)體心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的方法是基于80％、85％或優(yōu)選90％或95％的特異性。

正如以上討論的，標(biāo)識(shí)物IGFBP-7有助于評(píng)估個(gè)體發(fā)展心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)以及進(jìn)一步地在體外診斷評(píng)估患有心力衰竭患者。因此一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式是IGFBP-7作為評(píng)估心力衰竭的標(biāo)識(shí)物分子的用途。

使用包括IGFBP-7和一種或更多種其他的HF標(biāo)識(shí)物的標(biāo)識(shí)物組合來(lái)評(píng)估HF患者或評(píng)估個(gè)體患HF風(fēng)險(xiǎn)代表了本發(fā)明的一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式。在這種標(biāo)識(shí)物組合中，一種或更多種其他的標(biāo)識(shí)物優(yōu)選地選自利尿鈉肽標(biāo)識(shí)物、心臟肌鈣蛋白標(biāo)識(shí)物和炎癥標(biāo)識(shí)物。

可與IGFBP-7測(cè)量組合的一種或更多種優(yōu)選的其他HF標(biāo)識(shí)物優(yōu)選選自利尿鈉肽標(biāo)識(shí)物、心臟肌鈣蛋白標(biāo)識(shí)物和炎癥標(biāo)識(shí)物。這些優(yōu)選的其他標(biāo)識(shí)物的測(cè)量?jī)?yōu)選地與IGFBP-7的測(cè)量組合或者形成包括IGFBP-7在內(nèi)的HF標(biāo)識(shí)物組合的一部分，它們?cè)谝韵聝?nèi)容中會(huì)有更詳細(xì)地討論。

利尿鈉肽標(biāo)識(shí)物.

在本發(fā)明意義上，利尿鈉肽標(biāo)識(shí)物可以是從心房利尿鈉肽(ANP)家族中挑選出來(lái)的標(biāo)識(shí)物，也可以是從腦利尿鈉肽(BNP)家族中挑選出來(lái)的標(biāo)識(shí)物。

無(wú)論是在心房利尿鈉肽家族還是在腦利尿鈉肽家族中的多肽標(biāo)識(shí)物都是源自于相應(yīng)活性激素的前形式原(preproforms)。

按照本發(fā)明優(yōu)選的利尿鈉肽標(biāo)識(shí)物是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP和可用免疫法檢測(cè)的其生理片段。技術(shù)人員很容易理解，可用免疫法檢測(cè)的片段必須包括至少一個(gè)表位以允許特異性檢測(cè)這種生理片段。生理片段是天然存在于個(gè)體循環(huán)的片段。

在兩種利尿鈉肽家族中的標(biāo)識(shí)物代表相應(yīng)激素原的片段，分別即proANP和proBNP。因?yàn)閷?duì)于兩個(gè)家族的考慮是相似的，僅對(duì)BNP標(biāo)識(shí)物家族作一些詳細(xì)描述。BNP家族的激素原，即proBNP，由108個(gè)氨基酸組成。proBNP被剪切成為32個(gè)C末端氨基酸(77-108)，其代表有生物活性的激素BNP，和叫做N未端proBNP(或NT-proBNP)的N未端氨基酸1-76。BNP、N未端proBNP(1-76)以及進(jìn)一步的分解產(chǎn)物(Hunt，P.J.，等，Biochem.Biophys Res.Com.214(1995)1175-1183)在血液中循環(huán)。完整的前體分子(proBNP1-108)是否也存在于血漿現(xiàn)在還不完全明確。不過(guò)可以闡述為proBNP(1-108)在血漿中的低釋放量是可檢測(cè)的，但由于在其N(xiāo)未端的迅速局部降解，一些氨基酸是缺失的(Hunt，P.J.，等，Peptides 18(1997)1475-1481)。現(xiàn)在普遍接受例如對(duì)于NT-proBNP，該分子殘存于氨基酸10至50之間的中心部分代表生理上更穩(wěn)定的部分。包括NT-proBNP的這個(gè)中心部分的NT-proBNP分子能從體液中被可靠地測(cè)定。關(guān)于基于免疫法檢測(cè)該NT-proBNP分子中心部分的方法在WO00/45176中有詳細(xì)的公開(kāi)，讀者可以參考此處了解細(xì)節(jié)。僅測(cè)定NT-proBNP的某一亞組份可能更為優(yōu)越，對(duì)此提出了術(shù)語(yǔ)“天然NT-proBNP”。關(guān)于NT-proBNP亞組份的詳細(xì)公開(kāi)可以在WO2004/099253中找到。技術(shù)人員將在那里找到所有必需的指導(dǎo)。優(yōu)選地，測(cè)定的NT-proBNP是或?qū)?yīng)于使用來(lái)自德國(guó)Roche Diagnostics的 NT-proBNP 測(cè)定劑測(cè)定的NT-proBNP。

應(yīng)用NT-proBNP進(jìn)行預(yù)分析是有效的，這樣可使樣品轉(zhuǎn)移至中心實(shí)驗(yàn)室變得容易(Muelle，T.，等，Clin.Chem.Lab.Med.42(2004)942-944)。血樣可以在室溫下存儲(chǔ)幾天或可郵寄或運(yùn)輸而沒(méi)有回收率的損失。相反，將BNP儲(chǔ)存在室溫下或4℃48小時(shí)可能造成至少20％的濃度損失(Mueller，T.，等，上文；Wu，A.H.等，Clin.Chem.50(2004)867-873)。

腦源的利尿鈉肽家族(尤其是BNP和NT-proBNP)已經(jīng)在對(duì)某些群體進(jìn)行HF篩選時(shí)進(jìn)行了徹底的研究。這些標(biāo)識(shí)物，尤其是NT-proBNP的發(fā)現(xiàn)是相當(dāng)鼓舞人心的。NT-proBNP的值甚至在無(wú)癥狀“患者”中升高，這種升高的值明確地表明了“心臟問(wèn)題”(Gremmler，B.等，Exp.Clin.Cardiol.8(2003)91-94)。這些作者證明了升高的NT-proBNP顯示了“心-腎不適”的存在并應(yīng)該迅速安排進(jìn)一步檢查。與其他的組的研究人員相一致，Gremmler等也發(fā)現(xiàn)了NT-proBNP濃度異常對(duì)于排除群體中的HF和排除氣喘受試者中的左心室功能紊亂(＝LVD)是準(zhǔn)確的診斷性試驗(yàn)。陰性BNP或NT-proBNP值在排除HF或LVD時(shí)的作用被其他組研究人員確證，參考如McDonagh，T.A.等，Eur.J.Heart Fail.6(2004)269-273；以及Gustafsson，F(xiàn).等，J.Card.Fail.11，Suppl.5(2005)S15-20。

BNP主要在心室中產(chǎn)生(雖然不是唯一)并在壁壓力升高時(shí)釋放。因此，BNP釋放的升高主要反映了心室功能紊亂或發(fā)生于心房但影響心室的功能紊亂，例如，通過(guò)流入量減少或血容量過(guò)載。與BNP相反，ANP主要從心房產(chǎn)生并釋放。因此ANP的水平可能主要反映心房的功能。

ANP和BNP是活性激素，與他們的相應(yīng)非活性對(duì)應(yīng)物NT-proANP和NT-proBNP相比具有較短的半衰期。BNP在血液中被代謝，而NT-proBNP則作為完整的分子在血液中循環(huán)并通過(guò)腎臟除去。NT-proBNP的體內(nèi)半衰期比BNP長(zhǎng)120分鐘，BNP的體內(nèi)半衰期為20分鐘(Smith，M.W.等，J.Endocrinol.167(2000)239-246)。

因此取決于時(shí)間過(guò)程或感興趣的性質(zhì)，活性的或非活性形式的利尿鈉肽的測(cè)量都可能是有益的。

在個(gè)體心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估中，測(cè)定的IGFBP-7值優(yōu)選與NT-proANP和/或NT-proBNP的值相組合。優(yōu)選地，NT-proBNP的值與IGFBP-7的值相組合。類(lèi)似的考慮應(yīng)用于選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒?、鑒別疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)并監(jiān)測(cè)疾病的過(guò)程。

在IGFBP-7用于評(píng)估患者對(duì)治療方法的反應(yīng)的情況下，優(yōu)選地將其與ANP或BNP的測(cè)量組合起來(lái)。

在IGFBP-7用來(lái)區(qū)分急性和慢性心力衰竭的情況下，優(yōu)選的標(biāo)識(shí)物組合包含IGFBP-7、ANP或proANP和BNP或proBNP。

心臟肌鈣蛋白標(biāo)識(shí)物

術(shù)語(yǔ)心臟肌鈣蛋白涉及心臟肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T的同種型。按上述說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)標(biāo)識(shí)物也涉及標(biāo)識(shí)物分子的生理變異體，如生理片段或復(fù)合體。對(duì)于心臟肌鈣蛋白標(biāo)識(shí)物，它們的生理學(xué)存在的復(fù)合體已知是診斷相關(guān)的并因此明確包含在內(nèi)。

肌鈣蛋白T具有約37.000Da的分子量。發(fā)現(xiàn)于心臟組織的肌鈣蛋白T同種型(cTnT)與骨骼肌TnT有充分的區(qū)別，以至于可以生產(chǎn)抗體來(lái)判別這兩種TnT同種型。TnT被認(rèn)為是急性心肌損傷的標(biāo)識(shí)物；參見(jiàn)Katus，H.A.等J.Mol.Cell.Cardiol.21(1989)1349-1353；Hamm，C.W.等，N.Engl.J.Med.327(1992)146-150；Ohman，E.M.，等，N.Engl.J.Med.335(1996)1333-1341；Christenson，R.H.，等Clin.Chem.44(1998)494-501；和EP 0394819。

肌鈣蛋白I(TnI)是肌鈣蛋白復(fù)合物的抑制元件，為25kDa，發(fā)現(xiàn)于肌肉組織。TnI在沒(méi)有Ca2+時(shí)結(jié)合肌動(dòng)蛋白，抑制肌動(dòng)球蛋白的三磷酸腺苷酶活性。發(fā)現(xiàn)于心臟組織的TnI同種型(cTnI)與骨骼肌TnI有40％的差異，可以用免疫法判別兩種同種型。cTnI的正常血漿濃度小于0.1ng/ml(4pM)。cTnI在心臟細(xì)胞死亡后釋放進(jìn)入血流；因此在有急性心肌梗塞的患者血漿中cTnI濃度升高(Benamer，H.等Am.J.Cardiol.82(1998)845-850)。

肌鈣蛋白I和T獨(dú)特的心臟同種型讓它們可以通過(guò)免疫法與其他的骨骼肌肌鈣蛋白加以區(qū)別。因此肌鈣蛋白I和T由損傷心肌釋放進(jìn)入血液可以特異性地與心臟組織損傷相關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)在技術(shù)人員也知道心臟肌鈣蛋白可能從循環(huán)中檢出，可能是游離態(tài)也可能是復(fù)合物的一部分(參考如US 6,333,397,US 6,376,206和US 6,174,686)。

在評(píng)估個(gè)體患心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)以及評(píng)估已患心力衰竭患者的時(shí)候，測(cè)定的IGFBP-7值優(yōu)選地與肌鈣蛋白T和/或肌鈣蛋白I心臟同種型的值相結(jié)合。與標(biāo)識(shí)物IGFBP-7組合使用的優(yōu)選的心臟肌鈣蛋白是心臟肌鈣蛋白T。

炎癥標(biāo)識(shí)物

技術(shù)人員對(duì)術(shù)語(yǔ)炎癥標(biāo)識(shí)物是熟悉的。優(yōu)選的炎癥標(biāo)識(shí)物是白介素-6，C-反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A和S100蛋白。

白介素-6(IL-6)是一種21kDa的分泌性蛋白質(zhì)，它具有多種生物活性，可分為參與紅細(xì)胞生成作用的活性和參與活化先天免疫反應(yīng)的活性。IL-6是急性期反應(yīng)物并刺激多種蛋白，包括粘著分子的合成。它的主要功能是介導(dǎo)急性期肝臟蛋白的生產(chǎn)，細(xì)胞因子IL-1和TNF-α誘導(dǎo)它的合成。IL-6通常是由巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。IL-6的正常血清濃度小于5pg/ml。

C-反應(yīng)蛋白(CRP)是一種同型五聚體(homopentameric)Ca²⁺-結(jié)合急性期蛋白，具有參與宿主防御的21kDa亞基。CRP的合成可被IL-6誘導(dǎo)以及IL-1間接誘導(dǎo)，因?yàn)镮L-1可以觸發(fā)肝血竇的庫(kù)柏法(kupffer)細(xì)胞的IL-6的合成。在90％的健康群體中CRP的正常血漿濃度小于3μg/ml(30nM)，在99％的健康個(gè)體中小于10μg/ml(100nM)。例如血漿的CRP濃度可以通過(guò)血清淀粉樣蛋白A(＝SAA)來(lái)測(cè)定，血清淀粉樣蛋白A是一種11.7kDa的低分子量急性期蛋白。它主要是在肝響應(yīng)于IL-1、IL-6或TNF-α刺激時(shí)合成，并參與調(diào)控T細(xì)胞依賴(lài)的免疫反應(yīng)。在急性事件中，SAA的濃度增加最高達(dá)1000倍以到達(dá)1毫克/毫升。它可以用來(lái)監(jiān)測(cè)在如囊性纖維化、腎移植排斥、外傷或感染的疾病中的炎癥。在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的某些病例中被用于替代CRP，但是SAA仍然沒(méi)有被廣泛認(rèn)可。

S100蛋白形成不斷擴(kuò)大的Ca²⁺-結(jié)合蛋白家族，該家族現(xiàn)在已有超過(guò)20個(gè)的成員。S100蛋白的生理性相關(guān)結(jié)構(gòu)是一種同源二聚體，但有些也可以互相形成異源二聚體，例如，S100A8和S100A9。其細(xì)胞內(nèi)功能包括蛋白質(zhì)磷酸化、酶活性或涉及細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的調(diào)控。因?yàn)槟承㏒100蛋白也可以從細(xì)胞中釋放，其胞外功能現(xiàn)在也已有描述，例如，神經(jīng)元存活、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡以及炎性過(guò)程的調(diào)控。S100A8、S100A9、異源二聚體S100A8/A9以及S100A12已經(jīng)在炎癥中發(fā)現(xiàn)，S100A8對(duì)慢性炎癥應(yīng)答，而S100A9、S100A8/A9和S100A12在急性炎癥中增多。S100A8、S100A9、S100A8/A9和S100A12已發(fā)現(xiàn)與有炎性成分的不同疾病有關(guān)聯(lián)，包括某些癌癥、腎同種異體移植(allocraft)排異、結(jié)腸炎，最重要的是與RA有關(guān)聯(lián)(Burmeister，G.和Gallacchi，G.，Inflammopharmacology 3(1995)221-230；Foell，D.等，Rheumathology 42(2003)1383-1389)。用于評(píng)估個(gè)體患HF風(fēng)險(xiǎn)或患有HF患者的最優(yōu)選S100標(biāo)識(shí)物，例如按照本發(fā)明使用的標(biāo)識(shí)物組合，是S100A8、S100A9、S100A8/A9異源二聚體和S100A12。

sE-選擇蛋白(可溶的內(nèi)皮性白細(xì)胞粘著分子-1，ELAM-1)是一種115kDa的I型跨膜糖蛋白，只在內(nèi)皮細(xì)胞上并僅受炎性細(xì)胞因子(IL-1β，TNF-α)或內(nèi)毒素活化后表達(dá)。細(xì)胞表面的E-選擇蛋白是一種白細(xì)胞轉(zhuǎn)動(dòng)附著至內(nèi)皮的媒介，該過(guò)程是白細(xì)胞在炎癥位點(diǎn)外滲(extravasion)的必需步驟，由此該蛋白在局部炎性反應(yīng)中具有重要的作用。在健康個(gè)體的血液中有發(fā)現(xiàn)可溶性E-選擇蛋白，這可能是由于表面表達(dá)的分子被蛋白酶剪切后生成的。已有報(bào)道在許多病理狀況下血清中sE-選擇蛋白的水平升高(Gearing，A.J.和Hemingway，I.，Ann.N.Y.Acad.Sci.667(1992)324-331)。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中本發(fā)明涉及IGFBP-7作為HF的標(biāo)識(shí)物分子，與一種或更多種HF標(biāo)識(shí)物分子組合用以從個(gè)體獲得的液體樣品中評(píng)估HF的用途。

按以上說(shuō)明，在按照本發(fā)明的優(yōu)選方法中，IGFBP-7的測(cè)定值至少與至少另一種標(biāo)識(shí)物的值組合，這種標(biāo)識(shí)物選自利尿鈉肽標(biāo)識(shí)物、心臟肌鈣蛋白標(biāo)識(shí)物和炎癥標(biāo)識(shí)物。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及IGFBP-7和NT-proBNP的標(biāo)識(shí)物組合來(lái)評(píng)估心力衰竭的用途。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及IGFBP-7和肌鈣蛋白T的標(biāo)識(shí)物組合來(lái)評(píng)估心力衰竭的用途。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及IGFBP-7和CRP的標(biāo)識(shí)物組合來(lái)評(píng)估心力衰竭的用途。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包括標(biāo)識(shí)物IGFBP-7、肌鈣蛋白T、NT-proBNP和CRP的標(biāo)識(shí)物組合。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于在體外用生化標(biāo)識(shí)物來(lái)評(píng)估HF的方法的標(biāo)識(shí)物組，所述方法包括測(cè)量在樣品中IGFBP-7和一種或更多種其他的HF標(biāo)識(shí)物的濃度，并使用確定的濃度來(lái)評(píng)估HF。

根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)識(shí)物組，優(yōu)選地用蛋白陣列技術(shù)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。陣列是可尋址的個(gè)體標(biāo)識(shí)物集合。這些標(biāo)識(shí)物可以在空間上被尋址，如包含于微量滴定板中或印在平面表面的陣列，其中每個(gè)標(biāo)識(shí)物存在于不同的X和Y軸坐標(biāo)。可選擇地，標(biāo)識(shí)物也可根據(jù)標(biāo)簽、珠、納米?；蛭锢硇再|(zhì)來(lái)尋址。微陣列可按照普通技術(shù)人員已熟知的方法(參見(jiàn)如US 5,807,522；Robinson，W.H.等，Nat.Med.8(2002)295-301；Robinson，W.H.等，Arthritis Rheum.46(2002)885-893)制備。在此使用的陣列指任何具有多種可尋址標(biāo)識(shí)物的免疫學(xué)測(cè)定。在一種實(shí)施方式中，可尋址標(biāo)識(shí)物是抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可尋址元件是自身抗體。微陣列是小型化形式的陣列。在此使用的抗原指任何可以特異性結(jié)合于抗體的分子。術(shù)語(yǔ)自身抗體在該領(lǐng)域已有明確的定義。

在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及蛋白陣列，其包括標(biāo)識(shí)物IGFBP-7和任選地包括一種或更多種HF的其他標(biāo)識(shí)物。

在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及蛋白陣列，其包括標(biāo)識(shí)物IGFBP-7和NT-proBNP。

在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及蛋白陣列，其包括標(biāo)識(shí)物IGFBP-7和肌鈣蛋白T。

在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及蛋白陣列，其包括標(biāo)識(shí)物IGFBP-7和CRP。

在一種進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包括標(biāo)識(shí)物IGFBP-7、肌鈣蛋白T、NT-proBNP和CRP的蛋白陣列。

在一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及試劑盒，其包括特異性測(cè)定IGFBP-7需要的試劑。優(yōu)選的另一種試劑盒包括特異性測(cè)定IGFBP-7需要的試劑和測(cè)定一種或更多種其他心力衰竭標(biāo)識(shí)物需要的試劑，這些標(biāo)識(shí)物在HF標(biāo)識(shí)物組合中一起使用。

以下提供的實(shí)施例、序列表和附圖用于輔助了解本發(fā)明，其真實(shí)范圍在附加的權(quán)利要求中闡述。需要理解，在未偏離本發(fā)明精神前提下所述的步驟可以被修改。

附圖說(shuō)明

圖1

野生型和R9C小鼠的表型分析。(A)野生型小鼠(n＝79)和R9C小鼠(n＝44)在24周后的生存曲線(xiàn)。(B)用超聲波心動(dòng)描記術(shù)進(jìn)行的心臟縮短評(píng)估(＝縮短分?jǐn)?shù))。早在8周齡R9C轉(zhuǎn)基因動(dòng)物出現(xiàn)了明顯的功能損害。

圖2

野生型和AB小鼠的超聲心動(dòng)圖和血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)。(A)術(shù)后2、4和8周最高壓強(qiáng)的變化(mmHg)。(B)術(shù)后2、4和8周左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)變化的百分?jǐn)?shù)。(封閉圓表示來(lái)源于假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)，開(kāi)口圓表示來(lái)源于具主動(dòng)脈綁扎(aortic binding)(AB)的小鼠的數(shù)據(jù))。

圖3

分別從R9C和對(duì)照小鼠心臟組織獲得的Western印跡數(shù)據(jù)。比起從健康的小鼠(＝+/+)獲得的組織樣品，患有心力衰竭的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(R9C)的組織樣品中可觀察到IGFBP-7的明顯過(guò)量表達(dá)。染色條帶下面的數(shù)字表示由質(zhì)譜記錄數(shù)值確定的相對(duì)表達(dá)水平。

圖4

分別從10例HF和對(duì)照樣品中測(cè)得的IGFBP-7。

分別對(duì)標(biāo)記的來(lái)源于心力衰竭患者(HF＝菱形)的樣品和健康對(duì)照(正常人血清＝NHS＝正方形)給出在IGFBP-7檢驗(yàn)中的光密度(ODs)。

圖5

分別從來(lái)自于臨床常規(guī)和擴(kuò)展對(duì)照組的HF樣品中檢出的IGFB-7值。分別對(duì)標(biāo)記的來(lái)源于心力衰竭患者(HF)的樣品和來(lái)自健康的對(duì)照(正常人血清＝NHS)的樣品中測(cè)出的IGFBP-7給出計(jì)算濃度。盒須圖(box-and-whisker-blots)顯示了較低和較高的四分位值(盒(boxes))以及最高和最低的值(須(whiskers))。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

心力衰竭的小鼠模型

1.1R9C小鼠模型

已報(bào)道一種遺傳的人類(lèi)擴(kuò)張型心肌病源于人受磷蛋白(PLN)基因(PLN-R9C)中的精氨酸9轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?Schmitt，J.P.等，Science299(2003)1410-1413)。擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病一般開(kāi)始于患病患者的青春期階段，隨后在心臟功能上漸進(jìn)性惡化以導(dǎo)致危險(xiǎn)和死亡。該突變的轉(zhuǎn)基因小鼠模型顯示出與患病患者類(lèi)似的心臟表型，存在擴(kuò)張型心肌病、降低的心臟收縮力和早產(chǎn)兒死亡(Schmitt等，2003，上文)。

我們繪制了轉(zhuǎn)基因小鼠的存活曲線(xiàn)。PLN-R9C小鼠平均存活僅～20周，只有少于15％的能存活超過(guò)24周(圖1A)。在PLN-R9C系中，最早有記錄的死亡在12周齡被觀察到，而僅一只野生型對(duì)照鼠在24周內(nèi)死亡。先于最早有記錄的死亡，八周被選作為疾病的‘早期’階段的代表時(shí)間點(diǎn)，而16周被選為中點(diǎn)，介于8至24周之間(經(jīng)典DCM)。一份詳細(xì)的分離的心臟的病理學(xué)分析顯示了PLN-R9C小鼠甚至在8周齡時(shí)心室和心房擴(kuò)大的證據(jù)。分離心肌的交叉部分(獲自于野生型和PLN-R9C小鼠)在蘇木素和伊紅染色之后也顯示了左心室擴(kuò)張或心室壁變薄的證據(jù)，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中8周開(kāi)始，隨年齡增長(zhǎng)擴(kuò)張進(jìn)程延續(xù)。

對(duì)8、16和24周齡的雄性小鼠用超聲波心動(dòng)描記術(shù)進(jìn)行心臟功能測(cè)定(匯總于表1中)。前后壁厚度的超聲波心動(dòng)描記術(shù)測(cè)定結(jié)果顯示R9C小鼠在8周時(shí)具有顯著的擴(kuò)張，且在小鼠生存期內(nèi)持續(xù)惡化。收縮性，用心臟縮短來(lái)評(píng)估(圖1B)，也是在8周時(shí)出現(xiàn)輕的但顯著的減低，而更顯著的減低在16周時(shí)變得明顯。雌性小鼠分析結(jié)果顯示與雄性相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未展示)。

表1：野生型和R9C雄性小鼠在8、16和24周時(shí)的超聲心動(dòng)圖和血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表1中的值是平均值±SEM。在表1中使用的符號(hào)：HR＝心率；AW，PW＝前壁和后壁的厚度(左心室)；LVEDD，LVESD分別表示左心室舒張和收縮末期尺寸；FS＝縮短分?jǐn)?shù)＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD x100％；ETC＝對(duì)于HR校正的射血時(shí)間；VCFC＝對(duì)HR校正的周期縮短速度＝FS/ETC；PAVC＝對(duì)HR校正的主動(dòng)脈速度頂點(diǎn)；E-波＝早期-充盈傳播(transmitral)舒張期波；LVESP，LVEDP＝左心室收縮和舒張末期壓；+dP/dtmax＝左心室壓的最大正一階導(dǎo)數(shù)；-dP/dtmax＝左心室壓的最大負(fù)一階導(dǎo)數(shù)；AVA＝主動(dòng)脈速度增速(PAVe/加速時(shí)間)；相對(duì)WT*P＜0.05。

1.2主動(dòng)脈綁扎(AB)小鼠模型

在小鼠模型中由主動(dòng)脈綁扎(AB)造成壓力過(guò)載而誘導(dǎo)心臟肥大。

通過(guò)外科手術(shù)在C57BL小鼠實(shí)施壓力過(guò)載。升主動(dòng)脈縮窄(coarction)(稱(chēng)為主動(dòng)脈綁扎)誘導(dǎo)心臟肥大以及心肌生長(zhǎng)，特別是在左心室，這些是作為主動(dòng)脈縮窄的一種初級(jí)反應(yīng)。在這種小鼠模型的后期階段中心臟會(huì)變得肥大并最終膨脹。該模型可以很好地表征并已證明可以高度重現(xiàn)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)該模型有10-15％或更低的低死亡率。在縮窄之后，該動(dòng)物模型可用于評(píng)價(jià)響應(yīng)血液動(dòng)力學(xué)應(yīng)力的左心室肥大和心力衰竭的發(fā)展進(jìn)程。

簡(jiǎn)言之，用氯胺酮(90mg/kg)和甲苯噻嗪(Rompun)(10mg/kg)混合麻醉C57BL小鼠并使用25號(hào)針結(jié)扎主動(dòng)脈。假(sham)手術(shù)小鼠經(jīng)歷相同的手術(shù)步驟，只是不用針扎緊。

實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)

為了檢驗(yàn)肥大反應(yīng)，綁扎的動(dòng)物和假手術(shù)對(duì)照在干預(yù)后一、二、四和八周處死。通過(guò)超聲心動(dòng)圖分析以評(píng)估心臟功能和肥大發(fā)展，并通過(guò)組織學(xué)檢查處死后加以確認(rèn)。表2展示了不同的時(shí)間點(diǎn)用超聲波心動(dòng)描記術(shù)評(píng)價(jià)的心臟功能的總覽。技術(shù)人員熟知表2中給出的詳細(xì)超聲心動(dòng)圖參數(shù)并能在例如Asahi，M.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)9199-9204以及Oudit，G.Y.等，Nat.Med.9(2003)1187-1194文獻(xiàn)中找到。

除了功能參數(shù)以外，對(duì)取自于2、4和8周的AB小鼠和對(duì)照小鼠心臟組織進(jìn)行蘇木紫/伊紅(HE)染色的組織學(xué)分析。組織學(xué)證實(shí)了在AB小鼠中預(yù)期的壞死和重塑過(guò)程，而在假手術(shù)小鼠的心臟組織中未顯示任何顯著的變化。在手術(shù)之后二周，結(jié)扎小鼠的心室顯示出明顯的左心室肥大，四周后進(jìn)一步發(fā)展，并在術(shù)后八周變得十分類(lèi)似于擴(kuò)張型心肌病的終末期。

實(shí)施例2

樣品制備和質(zhì)譜分析

心臟勻漿以及細(xì)胞器分離

分離心臟，除去心房，將心室用刀片小心切碎并用冰冷卻的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)徹底沖洗以除去剩余血液。使用較松的手持玻璃勻漿器在10ml裂解緩沖液(250mM蔗糖，50mM Tris-HCl，pH 7.6，1mMMgCl2，1mM DDT(二硫蘇糖醇)和1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中勻漿組織30秒。所有后續(xù)步驟都在4℃下操作。裂解液用臺(tái)式離心機(jī)在800×g下離心15分鐘；上清液作為胞質(zhì)溶膠、線(xiàn)粒體和微粒體組分的來(lái)源。包含細(xì)胞核的沉淀塊用8ml裂解緩沖液稀釋并加到4ml0.9M蔗糖緩沖液(0.9M蔗糖，50mM Tris-HCl pH 7.6，1mM MgCl2，1mM DDT和1mM PMSF)上層，4℃ 1000×g離心20min。得到的沉淀再懸浮于8ml 2M蔗糖緩沖液(2M蔗糖，50mM Tris-HCl pH 7.4，5mM MgCl2，1mM DTT和1mM PMSF)，加到4ml的2M蔗糖緩沖液上層并在150,000×g下超速離心1h(Beckman SW 40.1轉(zhuǎn)子)而沉淀。細(xì)胞核作為沉淀回收。在4℃ 7500×g下再離心20分鐘從上清液中分離線(xiàn)粒體；獲得的沉淀用裂解緩沖液洗滌兩次。將除去線(xiàn)粒體的細(xì)胞質(zhì)用Beckman SW 41轉(zhuǎn)子在100,000×g超速離心1h沉淀微粒體。上清液為胞質(zhì)溶膠部分(＝cyto)。

提取細(xì)胞器

用低滲裂解緩沖液(10mM HEPES，pH 7.9，1mM DTT，1mM PMSF)在冰上孵育線(xiàn)粒體30分鐘，抽提可溶的線(xiàn)粒體蛋白。使用超聲法短暫地處理懸浮物，在13,000×g離心30min除去碎片。上清液作為“mito 1”組分。獲得的不溶的沉淀用膜去污劑抽提緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.8，0.4M NaCl，15％甘油，1mM DTT，1mM PMSF，1.5％Triton-X-100)再懸浮并溫和振搖30分鐘后在13,000×g離心30分鐘；上清液作為“mito 2”組分。

通過(guò)將微粒體在膜去污劑抽提緩沖液中再懸浮來(lái)抽提膜相關(guān)蛋白。溫和振動(dòng)懸浮物孵育1h并在13,000×g離心30min除去不溶碎片。上清液作為“micro”組分。

細(xì)胞器提取物的消化和MudPIT分析

從每個(gè)組分中取大約含100μg總蛋白的整分試樣(通過(guò)Bradford測(cè)定法確定)用5倍體積的冰冷丙酮在大約20℃沉淀過(guò)液，然后在13,000×g離心15min。蛋白沉淀在小體積的8M脲、50mM Tris-HCl、pH 8.5、1mM DTT的溶液中37℃溶解1h，接著用5mM碘乙酰胺在37℃避光處理1h進(jìn)行羧酰氨基甲基化。用相等體積的100mM、pH 8.5的碳酸氫銨稀釋樣品至4M脲，并用1∶150比例的內(nèi)蛋白酶Lys-C(Roche Diagnostics，Laval，奎北克，加拿大)在37℃消化過(guò)夜。第二天，用相等體積的50mM、pH8.5的碳酸氫銨稀釋樣品至2M脲，補(bǔ)加CaCl2至終濃度1mM，并用Poroszyme胰蛋白酶珠(應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)，Streetsville，Ontario，加拿大)在30℃轉(zhuǎn)動(dòng)孵育過(guò)夜。產(chǎn)生的肽混合物用SPEC-Plus PT C18管(Ansys Diagnostics，Lake Forest，加拿大)按廠家說(shuō)明進(jìn)行固相抽提然后存儲(chǔ)于-80℃以備后期使用。如所述，設(shè)定了一個(gè)全自動(dòng)、需時(shí)20h 12個(gè)步驟的多循環(huán)MudPIT程序(Kislinger，T.等，Mol.Cell Proteom.2(2003)96-106)。簡(jiǎn)短而言，HPLC四元泵與LCQ DECA XP離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan，San Jose，CA)連接。將一支100μM內(nèi)徑的熔融石英毛細(xì)管微型柱(Polymicro Technologies，Phoenix，AZ)用P-2000激光拉伸器(Sutter Instruments，Novato，CA)拉成極細(xì)的尖頭并填入8cm的5μM Zorbax Eclipse XDB-C18樹(shù)脂(Agilent Technologies，Mississauga，Ontario，加拿大)，再填入6cm的5μM Partisphere強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Whatman，Clifton，NJ)。將單個(gè)樣品用高壓容器手動(dòng)加在分離柱上。層析溶劑的條件嚴(yán)格按Kislinger，T.等，Mol.Cell Proteom.2(2003)96-106所述。

蛋白質(zhì)的鑒定和驗(yàn)證

用SEQUEST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索算法將肽串聯(lián)質(zhì)譜與在局部-維持最小冗余FASTA格式的小鼠和人類(lèi)蛋白序列(來(lái)自于Swiss-Prot/TrEMBL和IPI數(shù)據(jù)庫(kù))數(shù)據(jù)庫(kù)中的多肽序列匹配。為了統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估實(shí)驗(yàn)性假發(fā)現(xiàn)率以控制并且因此最小化假陽(yáng)性鑒定，將全部光譜都對(duì)無(wú)論正常(正向的)和倒置(翻轉(zhuǎn)的)的氨基酸方向的蛋白序列進(jìn)行搜索(Kislinger，T.等Mol.Cell Proteom.2(2003)96-106)。然后應(yīng)用STATQUEST濾除算法至所有假定的搜索結(jié)果以獲得對(duì)于每個(gè)候選鑒定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)可靠性測(cè)定(置信度得分)(截止p值≤.15，相當(dāng)于85％或更大可能性的是正確匹配)。高置信度匹配被解析成為一種使用基于Perl腳本的內(nèi)部SQL型數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)被設(shè)計(jì)成可容納對(duì)與給定蛋白匹配的多種肽的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果和光譜信息(掃描首(scan headers))，以及關(guān)于樣品名、實(shí)驗(yàn)編號(hào)、MudPIT步驟、細(xì)胞器源、氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、帶電性和置信水平的信息。只有那些具有預(yù)計(jì)置信度95％或更高的p值以及至少二種光譜都一起檢出的蛋白才能保留以進(jìn)行進(jìn)一步分析。

實(shí)施例3

模型系統(tǒng)中獲得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)。

3.1用于生成R9C小鼠模型差異表達(dá)p值的統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)于137個(gè)不同實(shí)驗(yàn)過(guò)程的每一個(gè)，用實(shí)施例2所述的方法獲得的原始數(shù)據(jù)由每種都有光譜計(jì)數(shù)的6190個(gè)蛋白組成，所有光譜都與該蛋白相關(guān)。原始數(shù)據(jù)，6190個(gè)蛋白亞組，都進(jìn)行了國(guó)際通用的規(guī)范化，首先將在每個(gè)過(guò)程中的數(shù)據(jù)根據(jù)他們的光譜計(jì)數(shù)分進(jìn)數(shù)目相同的組中，對(duì)于我們的分析設(shè)置成100。然后對(duì)每組(1-100)進(jìn)行LOESS(Cleveland，W.S.和Devlin，S.J.，Journal of The American Statistical Association 83(1988)596-610)，對(duì)于具有類(lèi)似光譜計(jì)數(shù)的一組基因調(diào)整在光譜計(jì)數(shù)中的差異。

基于原始數(shù)據(jù)我們構(gòu)建了兩個(gè)線(xiàn)性模型，第一個(gè)模型使用對(duì)照/疾病，時(shí)間(8周，16周，末期)以及位置(cyto、micro、mitoI、mitoII)作為因子并使用下式描述：

過(guò)程計(jì)數(shù)＝β0+β1時(shí)間+β2時(shí)間²+β3位置+β4對(duì)照 (1)

第二個(gè)模型僅使用時(shí)間(8周，16周，末期)和位置(cyto、micro、mitoI、mitoII)作為因子并用下式描述：

過(guò)程計(jì)數(shù)＝β0+β1時(shí)間+β2時(shí)間²+β3位置 (2)

其中βO為截距，β1、β2、β3和β4為可變時(shí)間、時(shí)間平方、位置和對(duì)照/疾病的斜率估計(jì)值。

用Anova對(duì)這兩個(gè)模型比較，解消假設(shè)為兩模型之間無(wú)差異。而低的p值顯示無(wú)充足的證據(jù)說(shuō)這兩個(gè)模型是相同的。額外的信息顯示狀態(tài)(即，對(duì)照/疾病)似乎是該模型的重要部分。為了提取在我們的對(duì)照和疾病模型之間相對(duì)蛋白豐度上有重大變化的蛋白，我們的6190個(gè)蛋白列表根據(jù)他們計(jì)算的p值進(jìn)行分級(jí)。這樣產(chǎn)生了一組593個(gè)具有p值＜0.05的蛋白。

為了從上述模型中解釋多重假設(shè)檢驗(yàn)，p值用假發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正法進(jìn)行校正，特別是Benjamini-Hochberg FDR校正法(Benjamini，Y.和Hochberg，Y.，Journal of the Royal Statistical Society B.57(1995)289-300)。這樣產(chǎn)生了一組40個(gè)具有對(duì)于R9C小鼠模型校正p值＜0.05的蛋白

3.2用于產(chǎn)生主動(dòng)脈綁扎小鼠模型差異表達(dá)p值的統(tǒng)計(jì)方法。

從主動(dòng)脈綁扎小鼠模型的68個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，鑒定了3152個(gè)具有光譜計(jì)數(shù)的蛋白。如上所述應(yīng)用于R9C小鼠模型的相同數(shù)據(jù)分析法被用于主動(dòng)脈綁扎小鼠模型的數(shù)據(jù)集。

實(shí)施例4

用Western印跡法檢測(cè)標(biāo)識(shí)物IGFBP-7

從R9C小鼠心臟組織樣品得到粗組織裂解液。簡(jiǎn)言之，切碎心臟組織，在杜恩斯勻漿器中碾碎并于8000g離心30min以除去細(xì)胞核和細(xì)胞碎片。上清液用于Western印跡法。

使用德國(guó)Karlsruhe的Invitrogen的試劑和設(shè)備進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡。對(duì)于每個(gè)測(cè)試的組織樣品，10μg的胞質(zhì)組分用還原性(Invitrogen)SDS樣品緩沖液稀釋并在95℃加熱10min。樣品在MES緩沖系統(tǒng)中用4-12％凝膠(Tris-甘氨酸)進(jìn)行電泳。將凝膠分離的蛋白混合物用Invitrogen XCell II^TM印跡模塊(Invitrogen))和轉(zhuǎn)移緩沖系統(tǒng)印跡至硝酸纖維素膜上。將膜在PBS/0.05％Tween-20洗滌3次并用封閉緩沖液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)封閉2小時(shí)。將一抗，肌鈣網(wǎng)蛋白的兔多克隆抗體(PA1-903，Affinity Bioreagents(ABR)，Golden公司)用封閉緩沖液按1∶500稀釋并與膜孵育1小時(shí)。將膜在PBS/0.05％Tween-20中洗滌6次。特異性結(jié)合的IGFBP-7的第一抗體用POD綴合的的抗大鼠IgG多克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，用封閉緩沖液稀釋至10mU/ml。孵育1h后，將膜在PBS/0.05％Tween-20中洗滌6次。為了檢測(cè)已結(jié)合的POD綴合的抗兔抗體，將膜用Lumi-Light^PLUSWestem印跡底物(貨號(hào)-2015196，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國(guó))孵育并對(duì)放射自顯影膜曝光。

圖3展示了典型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在匹配的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)比來(lái)源于健康小鼠的組織樣品，來(lái)源于患有心力衰竭的R9C實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織樣品中可以看到IGFBP-7的強(qiáng)過(guò)量表達(dá)。

實(shí)施例5

5.1用ELISA檢測(cè)人血清和血漿樣品中的IGFBP-7

為了在人血清或血漿中檢測(cè)IGFBP-7，開(kāi)發(fā)了一種三明治式ELISA實(shí)驗(yàn)。為捕獲并檢測(cè)抗原，一種來(lái)自于R&DSystems(產(chǎn)品號(hào)：AF1334)的抗IGFBP-7多克隆抗體的整分試樣分別與生物素和地高辛綴合。

將覆蓋有抗生物素蛋白鏈菌素的96孔微量滴定板與100μl的1μg/ml生物素?；目?IGFBP-7多克隆抗體的1xPBS溶液孵育60分鐘。之后用1xPBS+0.02％Tween-20洗滌平板三次，用PBS+1％BSA(牛血清白蛋白)封閉，然后再用1xPBS+0.02％Tween-20洗滌三次。分別用連續(xù)稀釋的重組IGFBP-7作為標(biāo)準(zhǔn)抗原或用來(lái)自于患者或?qū)φ諅€(gè)體的稀釋血清或血漿樣品(1∶50)孵育孔1.5小時(shí)。結(jié)合IGFBP-7之后，平板用1x PBS+0.02％Tween-20洗滌三次。為了特異性檢測(cè)結(jié)合的IGFBP-7，孔用100μl的1μg/ml的地高辛化抗IGFBP-7多克隆抗體的1xPBS+1％BSA溶液孵育60min。其后洗滌平板三次以除去未結(jié)合的抗體。下一步，用75mU/ml抗地高辛-POD綴合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國(guó)，貨號(hào)1633716)的1xPBS+1％BSA溶液孵育孔60分鐘。然后，平板用相同的緩沖液洗滌六次。為了檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合體，用100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國(guó)，貨號(hào)11685767)孵育孔并于15分鐘之后用ELISA讀數(shù)器在405和492nm處測(cè)定光密度(OD)。

5.2.分別在來(lái)源于患心力衰竭患者和明顯健康供者的樣品中進(jìn)行IGFBP7ELISA測(cè)定。

為了建立和優(yōu)化IGFBP-7的ELISA測(cè)定，測(cè)定獲自于不同的患有心力衰竭患者的10份血清樣品(HF樣品)和從正常健康供者獲得10份血清(NHS)。之后按5.1中描述進(jìn)行分析程序，以下結(jié)果(見(jiàn)表3)由這些樣品獲得：

表3：IGFBP7ELISA結(jié)果(檢測(cè)顯影樣品)

從圖4中可以明顯看到，與從對(duì)照個(gè)體獲得的樣品相比，從患HF患者獲得的血清中IGFBP-7的水平平均要高很多。

5.3.分別用患HF的患者和取自于臨床常規(guī)并明顯健康的供體的血清進(jìn)行IGFBP7的ELISA檢測(cè)。

為了進(jìn)一步的評(píng)價(jià)在常規(guī)臨床條件下IGFBP-7檢驗(yàn)的應(yīng)用，研究了來(lái)自于HF患者(n＝45)和來(lái)自于35位明顯健康的對(duì)照組患者的血清組。按之前所述，血清用1xPBS+1％BSA按1∶50進(jìn)行稀釋。表4顯示了這些擴(kuò)展組的結(jié)果。

表4：IGFBP7ELISA檢測(cè)結(jié)果(具有來(lái)自于臨床常規(guī)的HF樣品的擴(kuò)展組)

概括于表4中的數(shù)據(jù)已用于計(jì)算如圖5所示的盒式圖(box-blots)。圖5顯示，與來(lái)源于明顯健康的對(duì)照個(gè)體的血清相比，在來(lái)源于心力衰竭患者的血清中測(cè)出的IGFBP-7平均值有很大差異。

實(shí)施例6

評(píng)估心力衰竭的包括標(biāo)識(shí)物IGFBP-7的標(biāo)識(shí)物組合

實(shí)施例6.1NT-proBNP和IGFBP-7的標(biāo)識(shí)物組合

評(píng)價(jià)NT-proBNP和IGFBP-7標(biāo)識(shí)物組合用于分別區(qū)分處于階段B和階段C及D的患者。通過(guò)分析從明確鑒定的個(gè)體組，即50個(gè)按照ACA/ACC的HF分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)處于階段B的個(gè)體和50個(gè)患有HF并按照ACA/ACC的HF分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)處于階段C的患者，獲得的個(gè)體液體樣品來(lái)評(píng)估診斷的準(zhǔn)確性。在獲自于每個(gè)這些個(gè)體的血清樣品中，用一種已商品化的測(cè)定劑(Roche Diagnostics，NT-proBNP測(cè)定劑(對(duì)于系統(tǒng)免疫測(cè)定分析劑貨號(hào)03121640160))測(cè)定的NT-proBNP，和如上所述測(cè)定的IGFBP-7被量化。按照Z(yǔ)weig，M.H.和Campbell，G.上文的方法進(jìn)行ROC-分析。通過(guò)正規(guī)化的判別分析(Friedman，J.H.，Regularized Discriminant Analysis，Journal of The American Statistical Association 84(1989)165-175)來(lái)計(jì)算對(duì)于IGFBP-7與已確立的標(biāo)識(shí)物NT-proBNP的組合區(qū)別階段C患者與階段B個(gè)體的判別能力。

實(shí)施例6.2肌鈣蛋白T和IGFBP-7的標(biāo)識(shí)物組合

評(píng)價(jià)肌鈣蛋白T和IGFBP-7標(biāo)識(shí)物組合用于區(qū)分患有急性心臟事件和患有慢性心臟病的患者。通過(guò)分析從明確鑒定的個(gè)體組，即50個(gè)診斷為患急性心臟事件的個(gè)體和50個(gè)診斷為患慢性心臟病的患者，獲得的個(gè)體液體樣品來(lái)評(píng)估診斷的準(zhǔn)確性。在獲自于每個(gè)這些個(gè)體的血清樣品中，用一種已商品化的測(cè)定劑(Roche Diagnostics，肌鈣蛋白T測(cè)定劑(對(duì)于系統(tǒng)免疫測(cè)定分析劑貨號(hào)2017644))測(cè)定的肌鈣蛋白T和如上所述測(cè)定的IGFBP-7被量化。按照Z(yǔ)weig，M.H.和Campbell，G.上文進(jìn)行ROC-分析。通過(guò)正規(guī)化的判別分析(Ffiedman，J.H.，J.of The American Statistical Association 84(1989)165-175)來(lái)計(jì)算對(duì)于IGFBP-7與已確立的標(biāo)識(shí)物NT-proBNP的組合區(qū)別階段C患者和階段B個(gè)體的判別能力。

實(shí)施例6.3NT-proBNP和CRP的標(biāo)識(shí)物組合

評(píng)價(jià)C-反應(yīng)蛋白和IGFBP-7標(biāo)識(shí)物組合用于區(qū)分診斷為患有心肌病的患者和未患任何混雜的心臟病的對(duì)照。通過(guò)分析從明確鑒定的個(gè)體組，即50個(gè)具有心肌病的個(gè)體和50個(gè)健康對(duì)照個(gè)體，獲得的個(gè)體液體樣品來(lái)評(píng)估診斷的準(zhǔn)確性。在獲自于每個(gè)這些個(gè)體的血清中，用一種已商品化的測(cè)定劑(Roche Diagnostics，CRP-測(cè)定劑(Tina-quant C反應(yīng)蛋白(latex)高敏感性的測(cè)定劑-Roche貨號(hào)11972855216)測(cè)定的C反應(yīng)性蛋白和如上所述測(cè)定的IGFBP-7被量化。按照Z(yǔ)weig，M.H.和Campbell，G.上文的方法進(jìn)行ROC-分析。通過(guò)正規(guī)化的判別分析(Friedman，J.H.，J.of The American Statistical Association84(1989)165-175)計(jì)算IGFBP-7與已確立的標(biāo)識(shí)物NT-proBNP的組合區(qū)別階段C患者和階段B個(gè)體的判別能力。

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