本發(fā)明屬于納米材料制備與納米技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到金納米棒的合成和一種自組裝金納米棒sers免疫基底的制備方法。

背景技術(shù)：

自表面增強拉曼散射(sers)現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來，sers光譜技術(shù)就因其高靈敏度和無損檢測的優(yōu)勢而被廣泛關(guān)注，并得到快速發(fā)展。利用化學(xué)或者物理方法合成貴金屬納米粒子，并制備成具有sers增強能力的活性基底，則利用sers光譜技術(shù)就可以對位于sers活性基底表面的分析物進行高靈敏度的指紋譜檢測。因此，制備極大sers增強能力的高性能sers活性基底，應(yīng)用于生物傳感、醫(yī)學(xué)成像、癌癥治療、藥物傳輸?shù)壬镝t(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。

一般地，對貴金屬納米粒子組成的sers活性基底的性能要求主要關(guān)注它能否提供穩(wěn)定的、靈敏的、可重復(fù)的sers信號。我們知道，sers活性基底的性能與其形貌密切相關(guān)，也與制備過程密切相關(guān)。目前，利用貴金屬納米粒子制備sers基底的常用方法包括以下三種：第一種是將化學(xué)合成制備的貴金屬納米粒子溶膠直接滴加在基片(如硅片或玻璃等)上自然形成sers基底；第二種是利用化學(xué)方法修飾貴金屬納米粒子和基片的表面，在靜電力作用下金屬納米粒子固定在基片表面形成sers基底；第三種是利用物理刻蝕或電化學(xué)沉積等方法，制備具有貴金屬納米粒子陣列結(jié)構(gòu)的sers基底。實際上，上述制備sers基底的方法也存在不足。例如，第一種方法相對簡單，但通常制備的sers基底上的貴金屬納米粒子分布不均，導(dǎo)致sers信號的重復(fù)性較差；第二種方法得到的sers基底具有較強的sers信號，但穩(wěn)定性不夠好；第三種方法制備的sers基底可得到強的sers信號，并且穩(wěn)定性和重復(fù)性好，但制作工藝復(fù)雜，成本較高。

由上可見，采用化學(xué)方法合成特殊形貌的貴金屬納米粒子，并在一定的物理條件下實現(xiàn)特定貴金屬納米粒子自組裝結(jié)構(gòu)的sers基底的可控制備，將是一種低成本和簡單高效的方法。我們根據(jù)金納米棒特有的各向異性、獨特的表面等離子體共振特性、良好的穩(wěn)定性和生物相容性等特點，將金納米棒溶膠通過溶劑蒸發(fā)法沉積到親水處理過的硅片上形成金納米棒連續(xù)排列的自組裝結(jié)構(gòu)，從而得到適合用作高性能sers活性基底的納米制備材料。例如現(xiàn)有技術(shù)中申請?zhí)枮?01310015549.3的專利公開的免疫活性基底的制備方法，雖然方法制備過程簡單，但是所制備的金納米粒子組裝結(jié)構(gòu)規(guī)模小，容易受咖啡圈效應(yīng)影響，應(yīng)用范圍受到限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種自組裝金納米棒sers免疫基底及其制備方法，所述的免疫基底上金納米棒為連續(xù)排列的自組裝結(jié)構(gòu)，并使所述的免疫基底產(chǎn)生的sers信號具有強度高和穩(wěn)定的特點。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供的一種自組裝金納米棒sers免疫基底所需的材料包括單面拋光的硅片、固定在所述單面拋光硅片的拋光面上的金納米棒和鏈接在所述金納米棒表面的抗體。

所述的單面拋光的硅片可以采用單晶硅硅片或多晶硅硅片。

固定在所述單面拋光硅片的拋光面上的金納米棒的側(cè)面長度的優(yōu)選范圍為60～80nm。

固定在所述單面拋光硅片的拋光面上的金納米棒的橫向直徑的優(yōu)選范圍為20～30nm。

固定在所述單面拋光硅片的拋光面上的金納米棒的質(zhì)量濃度的優(yōu)選范圍為0.10～0.60g/l。

所述的鏈接在所述金納米棒表面的抗體的質(zhì)量濃度的優(yōu)選范圍為1～3mg/ml。

在所述單面拋光硅片的拋光面上的金納米棒連續(xù)排列成自組裝結(jié)構(gòu)，所述的自組裝結(jié)構(gòu)包括金納米棒橫向排列的自組裝結(jié)構(gòu)和金納米棒縱向排列的自組裝結(jié)構(gòu)；所述的橫向排列的自組裝結(jié)構(gòu)由所述的金納米棒的側(cè)面固定在硅片的拋光面上且相鄰金納米棒的側(cè)面相連形成的肩并肩自組裝結(jié)構(gòu)；所述的縱向排列的自組裝結(jié)構(gòu)由所述的金納米棒的端面固定在硅片的拋光面上且相鄰金納米棒的側(cè)面相連形成的豎直排列自組裝結(jié)構(gòu)。

所述的鏈接是抗體與所述的金納米棒的表面以價鍵的形式實現(xiàn)的結(jié)合。

本發(fā)明提供的所述的自組裝金納米棒sers免疫基底的制備方法，包括以下步驟：

1)將0.45～0.55mmol/l的氯金酸溶液、0.15～0.25mol/l的十六烷基三甲基溴化銨溶液、0.005～0.02mol/l硼氫化鈉溶液和去離子水按照體積比為10～15：10～15：5.0～6.0：1混合，靜置，得到金種溶液；

2)將0.0768mol/l十六烷基三甲基溴化銨和0.0162mol/l油酸鈉溶液按照體積比為1：1混合至完全溶解，得到混合液；再向所述的混合液中依次加入4mmol/l硝酸銀溶液，1mmol/l氯金酸溶液，體積濃度37％的鹽酸溶液和10mmol/l抗壞血酸溶液，得到成長液；在所述的混合液中加入的4mmol/l硝酸銀溶液，1mmol/l氯金酸溶液，37％的鹽酸溶液和10mmol/l抗壞血酸溶液的體積比為50～80：1：5～8：2～4；

3)將所述步驟1)得到的金種溶液與所述步驟2)得到的成長液按照體積比為1：2500混合，靜置，得到溶膠；將所述溶膠離心1～2次后，將沉積在離心管底部的溶膠復(fù)溶并進行超聲處理，得到分散的金納米棒溶液；

4)將單面拋光的硅片經(jīng)親水處理和干燥后得到預(yù)處理的硅片；

5)將所述步驟3)得到的金納米棒溶液滴加到所述步驟4)得到的硅片的拋光面上，在所述的金納米棒溶液滴加到所述的硅片的拋光面上時，將所述的硅片相對于水平面保持傾斜角度為35～45°；對滴加有所述的金納米棒溶液的硅片在10～50℃條件下干燥處理，得到固定在所述的硅片的拋光面上的金納米棒；所述金納米棒連續(xù)排列成自組裝結(jié)構(gòu)；

6)將所述的抗體溶液滴加到所述步驟5)中得到的所述的金納米棒上，靜置，用磷酸鹽緩沖液清洗硅片，對清洗后的硅片在35～38℃條件下干燥處理，所述的抗體被鏈接到所述的金納米棒表面；

7)向所述步驟6)中鏈接有所述抗體的金納米棒上滴加牛血清白蛋白溶液，靜置約4h后，用磷酸鹽緩沖液緩清洗，經(jīng)干燥處理，即得到自組裝金納米棒sers免疫基底。

所述步驟1)～3)與步驟4)之間沒有時間順序的限制。

所述步驟3)中優(yōu)選的離心轉(zhuǎn)速的范圍為5000～6000rpm；所述步驟3)中優(yōu)選的離心時間的范圍為15～25min。

所述步驟5)中滴加到單位面積的所述硅片的拋光面上的金納米棒溶液體積的優(yōu)選范圍為0.8～2μl/cm²。

所述步驟6)中滴加的抗體溶液的質(zhì)量濃度的優(yōu)選范圍為1～3mg/ml；所述滴加到單位面積的所述固定有金納米棒的硅片拋光面上的抗體溶液體積的優(yōu)選范圍為1～4μl/cm²；

所述步驟7)中所述牛血清白蛋白溶液的質(zhì)量濃度的優(yōu)選范圍為5～20mg/ml；所述滴加到單位面積的硅片拋光面上的牛血清白蛋白溶液體積的優(yōu)選范圍為1～4μl/cm²。

綜上所述，本發(fā)明提供的自組裝金納米棒sers免疫基底的制備方法，通過用雙表面活性劑法制備尺寸均一的金納米棒，所述的金納米棒被滴加到親水處理過的硅片的拋光面上形成可控的自組裝結(jié)構(gòu)，滴加時硅片與水平面傾斜一定角度克服了咖啡圈效應(yīng)的影響，保證了所述的金納米棒在所述硅片的拋光面上連續(xù)排列形成自組裝結(jié)構(gòu)，形成的自組裝結(jié)構(gòu)極大地增強了sers信號強度，在極大地提高檢測靈敏度的同時也極大地提高了檢測的可靠性。本發(fā)明提供的自組裝金納米棒sers免疫基底的制備方法，工藝簡單、成本低廉、耗時小、產(chǎn)率高，易于推廣，便于應(yīng)用。

附圖說明

圖1為實施例1得到的金納米棒肩并肩自組裝結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡照片；

圖2為實施例2得到的金納米棒豎直排列自組裝結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡照片；

圖3為實施例3得到的金納米棒連續(xù)排列的多層自組裝結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡照片；

圖4是實施例4得到的金納米棒連續(xù)排列的單層自組裝結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡照片；

圖5為實施例5中在實施例1～4制備的金納米棒自組裝結(jié)構(gòu)上鏈接的拉曼標記分子4mba的sers光譜圖；

圖6為實施例6中由實施例2的金納米棒自組裝結(jié)構(gòu)制備的免疫基底檢測不同濃度的前列腺特異性抗原(psa)對應(yīng)的sers光譜圖；

圖7為實施例6中由實施例2的金納米棒自組裝結(jié)構(gòu)制備的免疫基底檢測固定濃度psa抗原時，在基底上不同檢測點采集的1078cm^-1的sers峰強度柱狀圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供的一種自組裝金納米棒sers免疫基底所需的材料包括單面拋光的硅片、固定在所述單面拋光硅片的拋光面上的金納米棒和吸附在所述金納米棒表面的抗體。

本發(fā)明中，所述單面拋光的硅片的尺寸沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的硅片尺寸即可；所述單面拋光的硅片的制備方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的單面拋光的硅片的制備方法即可。本發(fā)明實施例中，所述單面拋光的硅片的來源購自常州天合光能有限公司。

本發(fā)明中，所述的固定在所述單面拋光硅片的拋光面上的金納米棒的質(zhì)量濃度的優(yōu)選為0.10～0.60g/l，更為優(yōu)選為0.25～0.45g/l。

本發(fā)明中，所述的固定在所述單面拋光硅片的拋光面上的金納米棒連續(xù)排列成自組裝結(jié)構(gòu)，所述的自組裝結(jié)構(gòu)包括金納米棒橫向排列的自組裝結(jié)構(gòu)和金納米棒縱向排列的自組裝結(jié)構(gòu)；所述的橫向排列的自組裝結(jié)構(gòu)由所述的金納米棒的側(cè)面固定在硅片的拋光面上且相鄰金納米棒的側(cè)面相連形成的肩并肩自組裝結(jié)構(gòu)；所述的縱向排列的自組裝結(jié)構(gòu)由所述的金納米棒的端面固定在硅片的拋光面上且相鄰金納米棒的側(cè)面相連形成的豎直排列自組裝結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明中，所述金納米棒的側(cè)面長度的優(yōu)選范圍為60～80nm，更為優(yōu)選的范圍為70～75nm；所述金納米棒的橫向直徑的優(yōu)選范圍為20～30nm，更為優(yōu)選的范圍為22～27nm，最優(yōu)化的橫向直徑為25nm。

本發(fā)明中，所述吸附在所述金納米棒表面的抗體的質(zhì)量濃度的優(yōu)選范圍為1～3mg/ml，更為優(yōu)選的范圍為1.5～2.5mg/ml，最優(yōu)化的質(zhì)量濃度為2.0mg/ml。所述抗體的種類包括前列腺特異性抗原抗體(anti-psa)、甲胎蛋白抗體(anti-afp)或糖類抗原抗體(anti-ca19-9)等抗體。

本發(fā)明提供所述的自組裝金納米棒sers免疫基底的制備方法，包括以下步驟：

1)將0.45～0.55mmol/l的氯金酸溶液，0.15～0.25mol/l的十六烷基三甲基溴化銨溶液，0.005～0.02硼氫化鈉溶液和去離子水按照體積比為10～15：10～15：5.0～6.0：1混合，靜置，得到金種溶液；

2)將0.0768mol/l和0.0162mol/l油酸鈉溶液按照體積比為1：1混合至完全溶解，向混合液依次加入4mmol/l硝酸銀溶液，1mmol/l氯金酸溶液，體積濃度37％的鹽酸溶液和10mmol/l抗壞血酸溶液，得到成長液；所述混合液依次加入的4mmol/l硝酸銀溶液，1mmol/l氯金酸溶液，37％的鹽酸溶液和10mmol/l抗壞血酸溶液的體積比為50～80：1：5～8：2～4；

3)將所述步驟1)得到的金種溶液與所述步驟2)得到的成長液按照體積比為1:1混合，靜置，將靜置后的溶膠離心1～2次，離心后將沉積在離心管底部的溶膠用去離子水復(fù)溶進行超聲處理，得到分散的金納米棒溶液；

4)將單面拋光的硅片親水處理，干燥，得到預(yù)處理的硅片；

5)將所述步驟3)得到的金納米棒溶液滴加到所述步驟4)得到的硅片的拋光面上，對滴加有金納米棒溶液的硅片10～50℃干燥處理；所述滴加時將硅片傾斜角度為35～45°；

6)將抗體溶液滴加到所述步驟5)中固定有金納米棒的硅片拋光面上，靜置后，清洗硅片，對清洗后的硅片在35～38℃條件下干燥處理，得到固定有金納米棒鏈接抗體的硅片；

7)向所述步驟6)中固定有金納米棒鏈接抗體的硅片拋光面上滴加封閉溶液，靜置后清洗，對清洗后的硅片干燥處理，得到自組裝結(jié)構(gòu)的金納米棒sers免疫基底；

所述步驟1)～3)與步驟4)之間沒有時間順序的限制。

在本發(fā)明所述步驟1)中，所述氯金酸溶液的最優(yōu)化的摩爾濃度為0.50mmol/l；所述十六烷基三甲基溴化銨溶液的最優(yōu)化的摩爾濃度為0.20mol/l；所述硼氫化鈉溶液的最優(yōu)化的摩爾濃度為0.01mol/l。

在本發(fā)明所述步驟1)中，所述的靜置時間的優(yōu)選范圍為2～6h，最優(yōu)化的靜置時間為4h。

在本發(fā)明所述步驟1)中，所述氯金酸溶液、十六烷基三甲基溴化銨溶液、硼氫化鈉溶液和去離子水的最優(yōu)化的體積比為12.5：12：5.5：1。

在本發(fā)明所述的步驟2)和步驟3)中，所述的溶液的混合方式?jīng)]有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的混合溶液的技術(shù)方案即可。

在本發(fā)明所述的步驟3)中，所述離心轉(zhuǎn)速的優(yōu)選范圍為5000～6000rpm，更為優(yōu)選的范圍為5500rpm；所述離心時間的優(yōu)選范圍為15～25min，最優(yōu)化的離心時間為20min。

在本發(fā)明所述的步驟3)中，所述的靜置時間的優(yōu)選范圍為10～12h，最優(yōu)化的靜置時間為11h。

在本發(fā)明所述的步驟3)中，所述的溶膠復(fù)溶的溶劑是去離子水，去離子水的電導(dǎo)率是18.2mω·cm。

在本發(fā)明所述的步驟3)中，所述超聲清洗功率的優(yōu)選范圍為100～150w，最優(yōu)化的超聲清洗功率為120w；所述超聲清洗時間的優(yōu)選范圍為15～30min，最優(yōu)化的超聲清洗時間為20min。

在本發(fā)明所述的步驟4)中，將單面拋光的硅片親水處理，干燥，得到預(yù)處理的硅片。所述硅片親水處理的方法優(yōu)選包括以下步驟：

ⅰ、將單面拋光的硅片置于酸性溶液進行超聲清洗；

ⅱ、將超聲清洗后的硅片用去離子水沖洗；

ⅲ、將去離子水沖洗后的硅片置于堿性清洗液進行超聲清洗，超聲清洗后的硅片用去離子水沖洗；

ⅳ、將所述步驟ⅲ沖洗后的硅片用酸性清洗液超聲清洗，最后用去離子水沖洗，得到親水處理的硅片。

本發(fā)明所述硅片親水處理的步驟ⅰ中，所述酸性溶液包括體積濃度為50％的h2so4溶液和體積濃度為20％的h2o2溶液。

本發(fā)明所述硅片親水處理的步驟ⅲ中，所述堿性清洗液包括體積濃度為10％的nh4oh和體積濃度為20％的h2o2的水溶液。

本發(fā)明所述硅片親水處理的步驟ⅳ中，所述酸性清洗液包括體積濃度為20％的h2o2和體積濃度為10％的hcl的水溶液。

本發(fā)明所述硅片親水處理的步驟中，所述超聲清洗過程采用的超聲清洗功率的優(yōu)選范圍為100～150w，最優(yōu)化的超聲清洗功率為120w；所述超聲清洗時間的優(yōu)選范圍為15～30min，最優(yōu)化的超聲清洗時間為20min。

在本發(fā)明所述的步驟4)中，所述的硅片干燥溫度的優(yōu)選范圍為35～38℃，最優(yōu)化的干燥溫度為37℃；所述的硅片干燥時間的優(yōu)選范圍為10～14h，最優(yōu)化的干燥時間為12h。

在本發(fā)明所述的步驟5)中，所述金納米棒溶液滴加到所述硅片的拋光面上單位面積的體積的優(yōu)選范圍為0.8～2μl/cm²，更為優(yōu)選的范圍為1.2～1.8μl/cm²，最優(yōu)化的體積為1.5μl/cm²。

在本發(fā)明所述的步驟5)中，所述滴加有金納米棒溶液的硅片的干燥溫度的優(yōu)選范圍為10～20℃，最優(yōu)化的干燥溫度為15℃。所述滴加有金納米棒溶液的硅片的干燥時間的優(yōu)選范圍為2～6h，最優(yōu)化的干燥時間為4h。

在本發(fā)明所述的步驟5)中，所述滴加時傾斜硅片的最優(yōu)化傾斜角度為40°。

在本發(fā)明所述的步驟6)中，所述抗體溶液的質(zhì)量濃度的優(yōu)選范圍為1～3mg/ml，更為優(yōu)選的范圍為1.5～2.5mg/ml，最優(yōu)化的質(zhì)量濃度為2mg/ml。所述抗體溶液滴加到所述固定有金納米棒的硅片拋光面上的單位面積的體積的優(yōu)選范圍為1～4μl/cm²，最優(yōu)化的體積為3μl/cm²。所述抗體溶液為一種抗體溶液或多種抗體的混合溶液。所述抗體的種類沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員研究的抗體即可。

在本發(fā)明所述的步驟6)中，所述靜置的溫度的優(yōu)選范圍為2～8℃，更為優(yōu)選范圍為3～5℃，最優(yōu)化的溫度為4℃。所述靜置的時間優(yōu)選范圍為10～12h，最優(yōu)化的時間為11h。

在本發(fā)明所述的步驟6)中，所述的清洗劑為含有0.05％tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液。所述含有0.05％tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液的ph值的優(yōu)選范圍為7.5～8.0，最優(yōu)化的ph為7.6。所述三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗后的硅片再用去離子水進行沖洗。

在本發(fā)明所述的步驟6)中，所述干燥溫度的優(yōu)選范圍為35～38℃，最優(yōu)化的溫度為37℃。

在本發(fā)明所述的步驟7)中，所述封閉溶液為牛血清白蛋白溶液。所述牛血清白蛋白溶液的質(zhì)量濃度的優(yōu)選范圍為5～20mg/ml，最優(yōu)化的質(zhì)量濃度為10mg/ml。滴加到單位面積的所述固定有金納米棒的硅片拋光面上的牛血清白蛋白溶液體積的優(yōu)選范圍為1～4μl/cm²。

在本發(fā)明所述的步驟7)中，所述牛血清白蛋白溶液滴加到固定有金納米棒的硅片拋光面上后的靜置溫度的優(yōu)選范圍為20～27℃，最優(yōu)化的溫度為25℃。所述靜置的時間的優(yōu)選范圍為2～4h，最優(yōu)化的時間為3h。

在本發(fā)明所述的步驟7)中，所述的清洗溶液為含有0.05％tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液。所述含有0.05％tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液的ph值的優(yōu)選范圍為7.5～8.0，最優(yōu)化的ph為7.6。所述三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗后的硅片再用去離子水進行沖洗。

在本發(fā)明所述的步驟7)中，所述干燥溫度的優(yōu)選范圍為35～38℃，最優(yōu)化的溫度為37℃。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種自組裝金納米棒sers免疫基底及其制備方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

實施例1

制備單分散的均勻金納米棒溶液，具體過程為：a1、在室溫下將5ml0.50mm的氯金酸溶液和5ml0.20m的十六烷基三甲基溴化銨溶液攪勻，迅速向其中加入冰凍的0.6ml0.01m硼氫化鈉溶液，并加入0.4ml去離子水，得到金種溶液，在室溫下靜置至少2h待用；a2、將2.5ml0.0768m十六烷基三甲基溴化銨和2.5ml0.0162m油酸鈉溶液混合至完全溶解，向其中加入180μl4mm硝酸銀溶液，靜置15min，再向其中加入2.5ml1mm氯金酸溶液，攪拌15min后，即溶液變成無色后，加入21μl37％的鹽酸溶液，接著再加入12μl10mm抗壞血酸溶液，得到成長液；a3、將8μl由a1步驟制備的金種溶液加入到由a2步驟制備的成長液中，在室溫下靜置12h，最后得到金納米棒溶膠。制備得到的金納米棒溶液注入離心管，然后對金納米棒溶液進行離心清洗，接著在離心清洗結(jié)束后去除上清液，保留沉淀在離心管底部的金納米棒溶膠并加入去離子水，離心多次，超聲處理，得到單分散的均勻金納米棒的懸浮溶液；在此，對金納米棒溶液進行離心清洗的轉(zhuǎn)速為6000r/min，離心時間是20min，往沉淀在離心管底部的金納米棒溶膠中加入的去離子水是40ml，離心次數(shù)是2次。進行超聲處理的處理時間為25min。

制備自組裝的金納米棒基底，具體過程為：取一塊邊長為5mm的正方形的單面拋光的硅片，然后采用硅片清洗工藝對硅片進行清洗，清洗流程為：首先將硅片用酸性液超聲清洗，然后用去離子水沖洗，再用堿性清洗液超聲清洗，再經(jīng)去離子水沖洗后用酸性清洗液超聲清洗，最后用去離子水沖洗；所述酸性液為體積濃度為50％的h2so4溶液和體積濃度為20％的h2o2溶液；所述堿性清洗液包括體積濃度為10％的nh4oh，體積濃度為20％的h2o2的水溶液；所述酸性清洗液包括體積濃度為20％的h2o2，體積濃度為10％的hcl的水溶液。對清洗干凈的硅片進行干燥處理以備用，將由質(zhì)量濃度0.60g/l的金納米棒溶液40μl滴加到處理過的硅片的拋光面上，并保持硅片與水平面傾斜40°，然后保持在10℃的恒溫箱中進行干燥處理，即制得了自組裝金納米棒基底。

由本實施例制備的基底上的金納米棒呈肩并肩排列的自組裝結(jié)構(gòu)，如圖1所示。在圖1中，沉積在硅片上的金納米棒的大小均一，其單個金納米棒的大小為：縱向長75±5nm，橫向直徑是25±2nm。

實施例2

制備單分散的均勻金納米棒溶液，具體過程為：a1、在室溫下將5ml0.45mm的氯金酸溶液和5ml0.25m的十六烷基三甲基溴化銨溶液攪勻，迅速向其中加入冰凍的0.6ml0.005m硼氫化鈉溶液，并加入0.4ml去離子水，得到金種溶液，在室溫下靜置至少2h待用；a2、將2.5ml0.0768m十六烷基三甲基溴化銨和2.5ml0.0162m油酸鈉溶液混合至完全溶解，向其中加入180μl4mm硝酸銀溶液，靜置15min，再向其中加入2.5ml1mm氯金酸溶液，攪拌15min后，即溶液變成無色后，加入21μl37％的鹽酸溶液，接著再加入12μl10mm抗壞血酸溶液，得到成長液；a3、將8μl由a1步驟制備的金種溶液加入到由a2步驟制備的成長液中，在室溫下靜置12h，最后得到金納米棒溶膠。制備得到的金納米棒溶液注入離心管，然后對金納米棒溶液進行離心清洗，接著在離心清洗結(jié)束后去除上清液，保留沉淀在離心管底部的金納米棒溶膠并加入去離子水，離心多次，超聲處理，得到單分散的均勻金納米棒的懸浮溶液；在此，對金納米棒溶液進行離心清洗的轉(zhuǎn)速為6000r/min，離心時間是20min，往沉淀在離心管底部的金納米棒溶膠中加入的去離子水是40ml，離心次數(shù)是2次。進行超聲處理的處理時間為25min。

制備自組裝的金納米棒基底，具體過程為：取一塊邊長為5mm的正方形的單面拋光的硅片，然后采用硅片清洗工藝對硅片進行清洗，清洗流程為：首先將硅片用酸性液超聲清洗，然后用去離子水沖洗，再用堿性清洗液超聲清洗，再經(jīng)去離子水沖洗后用酸性清洗液超聲清洗，最后用去離子水沖洗；所述酸性液為體積濃度為50％的h2so4溶液和體積濃度為20％的h2o2溶液；所述堿性清洗液包括體積濃度為10％的nh4oh，體積濃度為20％的h2o2的水溶液；所述酸性清洗液包括體積濃度為20％的h2o2，體積濃度為10％的hcl的水溶液。對清洗干凈的硅片進行干燥處理以備用，將由質(zhì)量濃度0.45g/l的金納米棒溶液50μl滴加到處理過的硅片的拋光面上，并且硅片與水平面傾斜45°，然后保持在15℃的恒溫箱中進行干燥處理，即制得自組裝金納米棒基底。

由本實施例制備的基底上的金納米棒呈豎直排列的自組裝結(jié)構(gòu)，如圖2所示。在圖2中，沉積在硅片上的金納米棒的大小均一，其單個金納米棒的大小為：縱向長70±5nm，橫向直徑是27±2nm。

實施例3

制備單分散的均勻金納米棒溶液，具體過程為：a1、在室溫下將5ml0.55mm的氯金酸溶液和5ml0.15m的十六烷基三甲基溴化銨溶液攪勻，迅速向其中加入冰凍的0.6ml0.02m硼氫化鈉溶液，并加入0.4ml去離子水，得到金種溶液，在室溫下靜置至少2h待用；a2、將2.5ml0.0768m十六烷基三甲基溴化銨和2.5ml0.0162m油酸鈉溶液混合至完全溶解，向其中加入180μl4mm硝酸銀溶液，靜置15min，再向其中加入2.5ml1mm氯金酸溶液，攪拌15min后，即溶液變成無色后，加入21μl37％的鹽酸溶液，接著再加入12μl10mm抗壞血酸溶液，得到成長液；a3、將8μl由a1步驟制備的金種溶液加入到由a2步驟制備的成長液中，在室溫下靜置12h，最后得到金納米棒溶膠。制備得到的金納米棒溶液注入離心管，然后對金納米棒溶液進行離心清洗，接著在離心清洗結(jié)束后去除上清液，保留沉淀在離心管底部的金納米棒溶膠并加入去離子水，離心多次，超聲處理，得到單分散的均勻金納米棒的懸浮溶液；在此，對金納米棒溶液進行離心清洗的轉(zhuǎn)速為6000r/min，離心時間是20min，往沉淀在離心管底部的金納米棒溶膠中加入的去離子水是50ml，離心次數(shù)是3次。進行超聲處理的處理時間為25min。

制備自組裝的金納米棒基底，具體過程為：取一塊邊長為5mm的正方形的單面拋光的硅片，然后采用硅片清洗工藝對硅片進行清洗，清洗流程為：首先將硅片用酸性液超聲清洗，然后用去離子水沖洗，再用堿性清洗液超聲清洗，再經(jīng)去離子水沖洗后用酸性清洗液超聲清洗，最后用去離子水沖洗；所述酸性液為體積濃度為50％的h2so4溶液和體積濃度為20％的h2o2溶液；所述堿性清洗液包括體積濃度為10％的nh4oh，體積濃度為20％的h2o2的水溶液；所述酸性清洗液包括體積濃度為20％的h2o2，體積濃度為10％的hcl的水溶液。對清洗干凈的硅片進行干燥處理以備用，將由質(zhì)量濃度0.25g/l的金納米棒溶液50μl滴加到處理過的硅片的拋光面上，并且硅片與水平面傾斜38°，然后，硅片保持在40℃的恒溫箱中進行干燥處理，即制得自組裝金納米棒基底。

由本實施例制備的基底上的金納米棒呈連續(xù)排列的多層自組裝結(jié)構(gòu)，如圖3所示。在圖3中，沉積在硅片上的金納米棒的大小均一，其單個金納米棒的大小為：縱向長72±5nm，橫向直徑是25±2nm。

實施例4

制備單分散的均勻金納米棒溶液，具體過程為：a1、在室溫下將5ml0.50mm的氯金酸溶液和5ml0.20m的十六烷基三甲基溴化銨溶液攪勻，迅速向其中加入冰凍的0.6ml0.01m硼氫化鈉溶液，并加入0.4ml去離子水，得到金種溶液，在室溫下靜置至少2h待用；a2、將2.5ml0.0768m十六烷基三甲基溴化銨和2.5ml0.0162m油酸鈉溶液混合至完全溶解，向其中加入180μl4mm硝酸銀溶液，靜置15min，再向其中加入2.5ml1mm氯金酸溶液，攪拌15min后，即溶液變成無色后，加入21μl37％的鹽酸溶液，接著再加入12μl10mm抗壞血酸溶液，得到成長液；a3、將8μl由步驟a1制備的金種溶液加入到由a2步驟制備的成長液中，在室溫下靜置12h，最后得到金納米棒溶膠。制備得到的金納米棒溶液注入離心管，然后對金納米棒溶液進行離心清洗，接著在離心清洗結(jié)束后去除上清液，往沉淀在離心管底部的金納米棒溶膠加入10ml去離子水中，離心多次，超聲處理，得到單分散的均勻金納米棒的懸浮溶液；在此，對金納米棒溶液進行離心清洗的轉(zhuǎn)速為6000r/min，離心時間是20min，往沉淀在離心管底部的金納米棒溶膠中加入的去離子水是10ml，離心次數(shù)是2次。進行超聲處理的處理時間為25min。

制備自組裝的金納米棒基底，具體過程為：取一塊邊長為5mm的正方形的單面拋光的硅片，然后采用硅片清洗工藝對硅片進行清洗，清洗流程為：首先將硅片用酸性液超聲清洗，然后用去離子水沖洗，再用堿性清洗液超聲清洗，再經(jīng)去離子水沖洗后用酸性清洗液超聲清洗，最后用去離子水沖洗；所述酸性液為體積濃度為50％的h2so4溶液和體積濃度為20％的h2o2溶液；所述堿性清洗液包括體積濃度為10％的nh4oh，體積濃度為20％的h2o2的水溶液；所述酸性清洗液包括體積濃度為20％的h2o2，體積濃度為10％的hcl的水溶液。對清洗干凈的硅片進行干燥處理以備用，將由質(zhì)量濃度0.10g/l的金納米棒溶液50μl滴加硅片的拋光面上，并且硅片與水平面傾斜38°，然后，硅片保持在50℃的恒溫箱中進行干燥處理，即制得自組裝金納米棒基底。

由本實施例制備的基底上的金納米棒呈連續(xù)排列的單層自組裝結(jié)構(gòu)，如圖4所示。在圖4中，沉積在硅片上的金納米棒的大小均一，其單個金納米棒的大小為：縱向長70±5nm，橫向直徑是30±2nm。

實施例5

本實施例給出一種將上述實施例所制備的自組裝金納米棒基底鏈接拉曼標記分子并檢測其sers光譜的實施過程。以實施例1制備的自組裝金納米棒基底為例，具體步驟如下：

1)對巰基苯甲酸(4mba)作為拉曼標記分子，制備濃度為10mm的對巰基苯甲酸溶液(4mba)溶液。

2)將實施例1制備的自組裝金納米棒基底浸泡在4mba溶液中4h，用去離子水清洗未鏈接4mba標記分子的基底，清洗2～3次后，在37℃恒溫箱中保持12h干燥。

3)測量由所述的步驟2)制備的自組裝金納米棒基底鏈接的4mba標記分子的sers光譜。檢測時，使激光器發(fā)射的激光經(jīng)聚焦后垂直照射于組裝基底上，照射的激光經(jīng)標記分子的基底反射后由拉曼光譜儀接收，拉曼光譜儀記錄的4mba標記分子的特征sers光譜如圖5中曲線1所示。采集sers光譜的積分時間為1～10s，照射激光的功率為49.55mw，激光波長為785nm。

按照上述同樣步驟，測量由本發(fā)明的實施例2、實施例3和實施例4制備得到的自組裝金納米棒基底的sers光譜，結(jié)果分別如圖5中曲線2、曲線3和曲線4所示。

由圖5可見，不同自組裝金納米棒基底鏈接相同濃度的4mba拉曼標記分子后對應(yīng)的4mba的sers光譜的特征峰強度的大小有明顯不同。所以，自組裝金納米棒基底的sers特性依賴于金納米棒在硅片拋光面上的不同的排列方式，而當金納米棒在硅片拋光面上自組裝形成豎直排列時，由實施例2制備的自組裝金納米棒基底得到的4mba的特征拉曼信號最強。

實施例6

本實施例給出制備一種自組裝金納米棒sers免疫基底的實施過程。以實施例2制備的自組裝金納米棒基底為例，具體步驟如下：

1)將用于進行psa抗原檢測的anti-psa抗體溶液滴加到經(jīng)處理的實施例2制備的自組裝金納米棒基底，并在溫度為2～8℃的條件下靜置10～12h，之后依次用0.05％tween20三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水沖洗硅片，以去除未吸附到金納米棒上的anti-psa抗體，最后對吸附有anti-psa抗體的自組裝金納米棒基底進行干燥處理，滴加與anti-psa抗體溶液相同體積的牛血清白蛋白溶液，在25℃下反應(yīng)2～4h，之后用含有0.05％tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對硅片進行沖洗，以去除未吸附到金納米棒上的牛血清白蛋白，再對硅片進行干燥處理，所述的干燥是在37℃恒溫箱中保持12h，制備得到具有特異性選擇功能的sers免疫基底。

2)從濃度為0fg/ml、2.1fg/ml、210fg/ml、21pg/ml和2.1ng/ml的待測psa抗原溶液樣品中分別取20μl滴加到由步驟1)制備的5個自組裝金納米棒sers免疫基底上，在溫度為30～38℃的條件下反應(yīng)2h；用含有0.05％tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對sers免疫基底進行沖洗，再對sers免疫基底進行干燥處理，得到5個對應(yīng)不同psa抗原濃度的sers免疫基底。

3)按照現(xiàn)有技術(shù)，如申請?zhí)枮?01310015549.3的專利公開的金納米球溶膠的制備方法，制備直徑大小為20nm的金納米球溶膠。在濃度為10mm的對巰基苯甲酸溶液(4mba)溶液中取10μl滴加到1ml的所述的金納米球溶膠中，充分混合并靜置4～6h后，制備得到修飾有4mba的20nm的金納米球探針溶液。在室溫條件下放置12h后，進行離心處理，以11000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min，之后去除離心管中的上層清液，再將沉積物溶于1ml的磷酸鹽緩沖溶液(pbs)中。在緩慢攪拌的情況下，向經(jīng)步驟c處理后得到的溶液中，加入20μl且濃度為2mg/ml的anti-psa抗體溶液，在4℃恒溫下反應(yīng)1.5h，再離心處理，以11000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min，以去除未吸附在金納米粒子表面的anti-psa抗體，之后去除離心管中的上層清液，再在超聲波振蕩環(huán)境下，將離心管中的沉積物溶于1ml的磷酸鹽緩沖溶液中。在此，加入的抗體溶液的量可以控制在15～30μl范圍內(nèi)，濃度可控制在1～3mg/ml范圍內(nèi)；磷酸鹽緩沖溶液的ph值可以為7.0；磷酸鹽緩沖溶液的量可控制在1～3ml范圍內(nèi)。由此，制備得到金納米球免疫探針溶液。

4)將用于進行psa抗原檢測的anti-psa抗體溶液滴加到經(jīng)處理的實施例2制備的自組裝金納米棒基底，并在溫度為2～8℃的條件下靜置10～12h，之后依次用0.05％tween20三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水沖洗硅片，以去除未吸附到金納米棒上的anti-psa抗體，最后對吸附有anti-psa抗體的自組裝金納米棒基底進行干燥處理，滴加與anti-psa抗體溶液相同體積的牛血清白蛋白溶液，在室溫下反應(yīng)2～4h，之后用含有0.05％tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對硅片進行沖洗，以去除未吸附到金納米棒上的牛血清白蛋白，再對硅片進行干燥處理，所述的干燥是在37℃恒溫箱中保持12h，制備得到具有特異性選擇功能的sers免疫基底。

5)從步驟4)制備的免疫探針液中分別取20μl滴加到步驟2)制備的鏈接有待測抗原的5個sers免疫基底上，在溫度為4℃的恒溫條件下反應(yīng)1.5～3h，使所滴加的待測psa抗原溶液中的抗原與sers免疫基底上的anti-psa抗體以及免疫探針中的anti-psa抗體發(fā)生免疫復(fù)合反應(yīng)。之后，用含有0.05％tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液和去離子水對每個sers免疫基底進行沖洗，再對所有sers免疫基底進行干燥處理，在37℃恒溫箱中保持12h的干燥，即得到5個“三明治”結(jié)構(gòu)的檢測樣品。

6)利用拉曼光譜儀對步驟4)處理后得到的5個“三明治”結(jié)構(gòu)的檢測樣品進行sers光譜測量，檢測免疫探針中拉曼標記物的特征指紋譜。由本實施例得到的5個樣品的sers光譜如圖6所示。

從圖6中可以看出，在psa抗原溶液濃度低至2.1fg/ml時，在拉曼位移1078cm^-1處仍然有明顯的sers信號。所以，由實施例2制備得到的自組裝金納米棒sers免疫基底進行psa抗原濃度檢測，具有高靈敏度。

為驗證本實施例中采用的自組裝金納米棒sers免疫基底結(jié)構(gòu)的重現(xiàn)性、和信號的穩(wěn)定性，對于psa抗原濃度為2.1ng/ml的樣品進行多次檢測，如圖7所示，在基底上25個不同檢測點采集1078cm^-1的sers峰強度大小，從圖中可以看出該基底重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較好。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。