本發(fā)明屬于制漿造紙領(lǐng)域，涉及制漿造紙中的測量方法，特別涉及一種利用clsm評價高得率漿纖維間結(jié)合面積的方法。

背景技術(shù)：

高得率制漿工藝以其較低的纖維成本和環(huán)境污染負荷等優(yōu)勢逐漸受到關(guān)注，發(fā)展非常迅速。漂白化學(xué)熱磨機械漿(bctmp)、堿性過氧化氫機械漿(apmp)和溫和預(yù)處理加盤磨化學(xué)處理的堿性過氧化氫機械漿(p-rcapmp)在國際上被統(tǒng)稱為高得率漿(high-yieldpulp，簡稱hyp)。近年來，高品質(zhì)的高得率漿由于其獨特性能，被用以取代部分闊葉木硫酸鹽漿，在多種高附加值紙種中得以應(yīng)用。與相應(yīng)的漂白化學(xué)漿相比，高得率漿具有較高的松厚度、不透明度和光散射系數(shù)，但是其結(jié)合強度較差的缺點嚴重限制了它在高附加值產(chǎn)品中的應(yīng)用比例和應(yīng)用范圍的進一步擴大。

在制漿造紙領(lǐng)域中，紙和紙板的物理強度是評價紙產(chǎn)品使用性能的關(guān)鍵參數(shù)，其中抗張強度是紙產(chǎn)品最常用的物理強度指標。纖維自身強度、纖維間的結(jié)合強度以及纖維在紙頁中的分布和排列是抗張強度的三個決定因素。改善纖維間的結(jié)合性能是目前提高紙頁強度的一種有效方式。目前，纖維間的結(jié)合性能主要包括纖維間的結(jié)合面積和纖維間的結(jié)合力兩個方面。因此，對于纖維結(jié)合性能的評價成為制漿造紙工作者急需完成的工作之一，而纖維間結(jié)合面積的評價和檢測也顯得尤為重要。

因此，針對紙漿纖維間結(jié)合面積的評價問題，近幾年米國內(nèi)外制漿造紙界的科研人員積極開展評價和檢測纖維間結(jié)合面積的研究工作，并在以下的文獻中公開介紹紙漿纖維間結(jié)合面積的評價方法：

1、ingmanson等人發(fā)表在《tappijournal》雜志1959年第42卷1期第83-93頁“factorscontributingtothestrengthofasheetofpaper.ii.relativebondedarea”的文章中主要根據(jù)kubelka-munk理論，建立了一種利用光散射系數(shù)測定纖維間相對結(jié)合面積(rba)的方法。他們采用控制壓榨壓力的方法獲得一系列具有不同抗張強度和相應(yīng)光散射系數(shù)的漿張，并用外推法得到纖維完全未發(fā)生結(jié)合時漿張的光散射系數(shù)(so)，最后根據(jù)理論公式計算出纖維間的相對結(jié)合面積。

2、thomson在其博士學(xué)位論文“probingthenatureofcellulosicfibreinterfaceswithfluorescenceresonanceenergytransfer”中分別用兩種特殊的染料(一種能夠提供熒光成分，另一種則能夠接受熒光成分)對纖維進行染色，當兩根被染色的纖維接觸后即可在熒光顯微鏡下觀察到纖維間的結(jié)合部位。從而確定纖維間的結(jié)合區(qū)域，最后計算出了纖維間的結(jié)合面積。

3、page發(fā)表在《papertechnology》雜志1960年第1卷4期第407-411頁“fibre-to-fibrebondspart1-amethodfortheirdirectobservation”的文章中首次提出了一種利用偏振光顯微鏡技術(shù)直接檢測化學(xué)漿纖維間結(jié)合面積的方法。該方法的基本原理為：試樣在垂直的偏振光照射下，纖維間結(jié)合面呈現(xiàn)出相對較暗的區(qū)域，而未結(jié)合的部分則為較明亮的區(qū)域。可通過計算較暗區(qū)域的面積表征纖維間的結(jié)合面積。

4、kappel等人發(fā)表在《nordicpulpandpaperresearchjournal》雜志2009年第24卷2期第199-205頁“anovelmethordforthedeterminationofbondedareaofindividualfiber-fiberbonds”和2010年第25卷1期第65-70頁“revisitingpolarizedlightmicroscopyforfiber-fiberbondareameasurement-parti：theoreticalfundamentals”，以及2010年第25卷1期第71-75頁“revisitingpolarizedlightmicroscopyforfiber-fiberbondareameasurement-partii：provingthe applicability”的三篇文章分別利用超薄切片技術(shù)、纖維染色技術(shù)和圖像分析技術(shù)探討了纖維間結(jié)合面積的幾種影響因素，并重新闡述了偏振光光學(xué)顯微技術(shù)檢測纖維間結(jié)合面積的基礎(chǔ)理論。

5、張紅杰等人發(fā)表在《bioresources》雜志2014年第9卷4期第6019-6027頁“comparisonofinterfiberbondingabilityofdifferentpoplarp-rcalkalineperoxidemechanicaipulp(apmp)fiberfractions”的文章中首次結(jié)合page抗張強度理論方程和以kubelka-munk理論為基礎(chǔ)的光散射系數(shù)法計算出高得率漿纖維間的相對結(jié)合面積(rba)。

6、張紅杰等人發(fā)表在《中國造紙》雜志2014年第33卷8期第66-70頁“clsm技術(shù)在纖維表面形態(tài)和紙張結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用”一文綜述了共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)的工作原理，重點討論了clsm在纖維表面分析、纖維形變研究以及紙張結(jié)構(gòu)觀察中的應(yīng)用。

上述文獻介紹大都僅限于對紙漿纖維間結(jié)合面積的直接和間接檢測，而且都是針對化學(xué)漿纖維展開討論。紙漿纖維結(jié)合面積的檢測方法雖然在理論上日趨成熟，但是存在以下不足之處：

1)、第1，2，3和4組文獻都僅限于對化學(xué)漿纖維間結(jié)合面積的實驗室研究，側(cè)重于對化學(xué)漿結(jié)合性能的相關(guān)基礎(chǔ)理論進行研究，沒有針對高得率漿纖維(高得率漿纖維的性能與化學(xué)漿纖維差異非常顯著，例如：纖維形態(tài)、表面形貌、形變性能等)探討在實驗室檢測其纖維間結(jié)合面積的可行性與準確性，更沒有結(jié)合所用檢測儀器和操作參數(shù)介紹該檢測方法在具體實際操作時可能出現(xiàn)的問題及其解決辦法。

2)、第1和5組文獻主要介紹紙漿纖維間相對結(jié)合面積rba的實驗室檢測方法，并未檢測紙漿纖維之間的實際結(jié)合面積；第2，3和4組文獻介紹的雖然是利用熒光顯微鏡、偏振光顯微鏡以及超薄切片技術(shù)檢測纖維間的實際結(jié)合面積，但主要側(cè)重于從理論上探討化學(xué)漿纖維間實際結(jié)合區(qū)域的判定方法，沒有針對高得率漿纖維展開討論。

3)、高得率漿纖維在纖維形態(tài)、表面形貌以及形變性能方面與化學(xué)漿纖維存在著顯著差異，致使其纖維間的結(jié)合性能不如化學(xué)漿纖維。纖維間的實際結(jié)合面積是紙漿纖維結(jié)合性能的主要評價指標之一，纖維間的結(jié)合面積與纖維的形態(tài)尺寸、形變性能(如柔韌性、抗壓潰性)以及纖維的表面形貌密切相關(guān)。高得率漿纖維和化學(xué)漿纖維相比，其纖維存在明顯的多分散性：高得率漿中含有較多的短纖維以及一定含量的細小纖維，而長纖維含量較少；制漿過程中化學(xué)處理與機械磨漿程度的不均勻造成纖維的表面形貌和形變性能存在差異。這些差異會造成針對化學(xué)法紙漿纖維探討得出的纖維間結(jié)合面積檢測方法對于高得率漿纖維是不適用的。前面的六組文獻都沒有結(jié)合高得率漿纖維進行專門探討其纖維間實際結(jié)合面積的檢測方法。

因此，對于目前在全球發(fā)展迅猛的高得率漿，亟待開發(fā)一種快速便捷且準確的纖維間結(jié)合面積的檢測方法，進而評價高得率漿纖維的結(jié)合性能，以期解決或減小高得率漿在多種高附加值紙種中應(yīng)用時存在的諸多問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種利用clsm評價高得率漿纖維間結(jié)合面積的方法，本方法首先對高得率漿纖維原料進行分級處現(xiàn)，隨后選用合適類型的熒光染料對高得率漿纖維進行染色處理，借助特殊的放大鏡和解剖針等設(shè)備將染色后的纖維搭建成纖維結(jié)合模型并制作成臨時玻片，在避光條件下用clsm掃描制作好的纖維結(jié)合模型獲取其一系列的光學(xué)切片圖像，從中選取能夠清晰地呈現(xiàn)纖維發(fā)生實際結(jié)合區(qū)域輪廓的圖片，借助相關(guān)圖像處理軟件對纖維間的實際結(jié)合區(qū)域進行標記和計算，最終計算出高得率漿各級分纖維之間的實際結(jié)合面積。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種利用clsm評價高得率漿纖維間結(jié)合面積的方法，步驟為：

(1)將商品高得率漿在去離子水中浸泡，浸泡后的高得率漿進行消潛處理，消潛完成后對高得率漿進行解離處理，鮑爾篩分儀對經(jīng)解離處理后的高得率漿進行分級處理，并收集篩分獲得的四個級分的高得率漿纖維，均衡水分后測定固含量，備用；

(2)取適量某級分高得率漿纖維在去離子水中浸泡一周，用一定濃度的熒光染料溶液染色，并洗去浮色，備用；

(3)在放大鏡下利用解剖針在載玻片上將熒光染色后的纖維搭建纖維結(jié)合模型，蓋上蓋玻片并封片；

(4)使用共聚焦激光掃描顯微鏡clsm對搭建好的纖維結(jié)合模型進行觀察和光學(xué)切片，獲取纖維結(jié)合模型中兩根纖維結(jié)合區(qū)域的焦平面圖片；

(5)根據(jù)所獲得纖維結(jié)合區(qū)域的焦平面圖片利用圖形軟件計算纖維結(jié)合模型中纖維間的結(jié)合面積。

進一步地，所述熒光染料為吖啶橙，其濃度為5×10^-5～6×10^-5mol/l。

進一步地，所述的染色方法為：稱取絕干量為0.2g的濕漿，放入用錫箔紙包裹的50ml玻璃瓶中，向玻璃瓶中加入40ml熒光染料溶液，加入適量玻璃珠后蓋上橡膠塞均勻搖晃30min，靜置，待纖維沉淀后用醫(yī)用注射器移走上層清液，加去離子水依照上述步驟清洗三次，第二次和第三次的搖晃時間為5min，最后加去離子水蓋塞備用。

進一步地，制備好的纖維結(jié)合模型與用共聚焦激光掃描顯微鏡clsm觀察時間間隔小于15min。

進一步地，封片時采用封片劑封片，所述封片劑為快速風(fēng)干型。

進一步地，所述高得率漿在水中浸泡的條件為：每60g絕干漿量添加1l去離子水。

進一步地，所述消潛時條件為漿濃2～5％，溫度80～90℃，攪拌時間20～30min。

進一步地，所述使用共聚焦激光掃描顯微鏡clsm對搭建好的纖維結(jié)合模型進行觀察的步驟為：(1)按照儀器說明書要求開啟共聚焦激光掃描顯微鏡clsm，選擇波長為488nm的激光作為激發(fā)光源；(2)先利用4倍倍物鏡尋找并鎖定纖維結(jié)合模型，然后逐級使用高倍物鏡觀察纖維結(jié)合模型，最終切換至40倍物鏡，調(diào)節(jié)焦平面尋找纖維結(jié)合模型中兩根纖維結(jié)合區(qū)域的量佳焦平面，最后設(shè)置對纖維結(jié)合模型進行光學(xué)切片的相關(guān)參數(shù)；(3)保存數(shù)據(jù)，利用圖形處理軟件標注纖維結(jié)合模型中兩根纖維間的結(jié)合區(qū)域輪廓并計算結(jié)合面積。

進一步地，設(shè)置對纖維結(jié)合模型進行光學(xué)切片的相關(guān)參數(shù)時，應(yīng)以纖維結(jié)合區(qū)域最佳焦平面為基準設(shè)置clsm掃描并進行光學(xué)切片的最高和最低位置，并設(shè)置合適的掃描步驟和相應(yīng)跨度。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：

1、本發(fā)明以共聚焦激光掃描顯微鏡clsm為主要儀器構(gòu)建了一種評價高得率漿纖維間實際結(jié)合面積的方法，本方法無需將高得率漿制備成手抄片、也無需對手抄片進行超薄切片，該方法操作簡單，易于實現(xiàn)，可適用于所有類型高得率漿纖維的結(jié)合面積評價，適應(yīng)性好。

2、本發(fā)明以對高得率漿進行篩分分級處理并對同一級分纖維搭建纖維結(jié)合模型，檢測纖維結(jié)合模型中纖維間的實際結(jié)合面積，該方法可有效避免高得率漿纖維多分散性對于纖維間實際結(jié)合面積檢測過程及結(jié)構(gòu)造成的干擾。

3、本發(fā)明利用共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)可對纖維等半透明樣品快速無損傷的進行連續(xù)光學(xué)切片的優(yōu)勢，用于確定熒光染色后纖維結(jié)合模型中纖維間的結(jié)合區(qū)域，具有較高的精確性。

附圖說明

圖1是一種楊木p-rcapmp高得率漿纖維結(jié)合模型的clsm數(shù)據(jù)三維重組圖。

圖2是圖1所述高得率漿纖維結(jié)合模型在clsm視野下的三向光學(xué)切片圖。

圖3是圖1所述高得率漿纖維結(jié)合模型在clsm觀測時得到的一系列沿z軸光學(xué)切片得到的焦平面圖像。

圖4和圖5分別是從clsm對楊木p-rcapmpr30和p30/r50級分紙漿纖維結(jié)合模型進行光學(xué)切片時得到的最接近纖維結(jié)合區(qū)域處的焦平面圖像，圖中已對纖維間結(jié)合區(qū)域進行標記并計算面積。

具體實施方式

下面根據(jù)發(fā)明內(nèi)容進一步闡述本發(fā)明的具體實施方式。

一種利用clsm評價高得率漿纖維間結(jié)合面積的方法，所選用的高得率漿纖維原料、化學(xué)藥品和纖維原料處理方法以及具體的clsm檢測參數(shù)分別描述如下：

一、高得率漿纖維原料處理

具體高得率漿處理的步驟為；首先將商品高得率漿在去離子水中浸泡，浸泡后的紙漿進行消潛處理，消潛完成后的紙漿用標準纖維解離機進行解離處理；用篩分儀對經(jīng)解離處理后的紙漿進行分級處理，并收集篩分獲得的四個級分的紙漿纖維；均衡水分后測定固含量，備用。

本發(fā)明所述的高得率漿是指得率在65％以上的半化學(xué)漿(scp)、化學(xué)機械漿(cmp)、木片磨木漿(rmp)、熱磨機械漿(tmp)、化學(xué)熱磨機械漿(ctmp)、磨石磨木漿(sgw)、壓力磨石磨木漿(pgw)等所有造紙用漿。

本發(fā)明所述的消潛處理是為了消除纖維在機械磨漿的劇烈作用下形成的扭曲變形狀態(tài)。

所述的消潛處理的條件為漿濃2～5％，溫度80～90℃，攪拌時間20～30min，進一步優(yōu)選為漿濃4％，溫度85℃，攪拌時間30min。

本發(fā)明所述的鮑爾篩分儀的篩分級數(shù)為4級，本發(fā)明中選擇的四個篩網(wǎng)為30、50、100和200日。

二、高得率漿纖維的熒光染色和纖維結(jié)合模型的搭建

取適量上述篩分獲得的r30級分紙漿纖維在去離子水中浸泡一周：用適宜濃度的熒光染料溶液染色，并洗去浮色，備用，在放大鏡下利用解剖針在載玻片上將熒光染色后的纖維快速搭建成纖維結(jié)合模型，制備好的纖維結(jié)合模型用臨時玻片避光放置，并在制備完成15min以內(nèi)使用共聚焦激光掃描顯微鏡clsm觀察。

本發(fā)明中所述的熒光染料為吖啶橙，全稱為3，6-(二甲胺基)吖啶鹽酸鹽，分子式為c17h19n3·hcl·zncl，簡稱ao，分子量438.12g/mol。染色時采用的熒光染料溶液濃度為4×10^-5～6×10^-5mol/l，優(yōu)選為5×10^-5mol/l，溶劑為去離子水，熒光染料溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，且應(yīng)存放在棕色容量瓶中。

本發(fā)明中所述的染色方法為；稱取絕干量為0.2g的濕漿，放入用錫箔紙包裹的50ml玻璃瓶中，向玻璃瓶中加入40ml熒光染料溶液，加入適量玻璃珠后蓋上橡膠塞均勻搖晃30min：靜置，待纖維沉淀后用醫(yī)用注射器移走上層清液：加去離子水依照上述步驟，其中搖晃時間改為5min，共清洗三次，最后一次無需移走上層清液。

本發(fā)明中搭建纖維結(jié)合模型過程中需保持纖維處于濕潤狀態(tài)，纖維結(jié)合模型搭建完成后迅速蓋上蓋玻片并用封片劑封片，防止結(jié)合模型被破壞，所用封片劑為快速風(fēng)干型。

三、共聚焦激光掃描顯微鏡對纖維結(jié)合模型進行觀測

使用共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)對搭建好的纖維結(jié)合模型進行觀察和光學(xué)切片，獲取纖維結(jié)合模型中兩根纖維結(jié)合區(qū)域的焦平面圖片。

clsm觀察纖維結(jié)合模型時步驟及參數(shù)設(shè)置如下：

操作步驟：

(1)按照儀器說明書要求開啟共聚焦激光掃描顯微鏡clsm，選擇波長為488nm的激光作為激發(fā)光源；

(2)先利用低倍物鏡(4倍)尋找并鎖定纖維結(jié)合模型，然后逐級使用高倍物鏡觀察纖維結(jié)合模型(最終切換至40倍物鏡)，調(diào)節(jié)焦平面尋找纖維結(jié)合模型中兩根纖維結(jié)合區(qū)域的最佳焦平面，最后設(shè)置對纖維結(jié)合模型進行光學(xué)切片的相關(guān)參數(shù)；

(3)保存數(shù)據(jù)，利用圖形處理軟件標注纖維結(jié)合模型中兩根纖維間的結(jié)合區(qū)域輪廓并計算結(jié)合面積。

四、高得率漿纖維間實際結(jié)合面積計算

從獲得的焦平面圖像中篩選出最接近與結(jié)合模型中兩根呈十字交叉狀的纖維相互接觸區(qū)域的焦平面圖像，利用clsm配套的專業(yè)圖形處理軟件lsmimagebrowser對選中用于計算實際結(jié)合面積的焦平面圖像進行標記并計算紙漿纖維結(jié)合模型中纖維間的實際結(jié)合面積。

實施例1

取某工廠生產(chǎn)的楊木p-rcapmp漿60g絕干量在1l去離子水中浸泡4h；浸泡后的紙漿進行消潛處理，消潛條件為漿濃5％，溫度90℃，攪拌時間30min消潛完成后的紙漿用標準纖維解離機進行解離處理，用鮑爾篩分儀，使用30、50、100和200日的篩網(wǎng)對經(jīng)解離處理后的紙漿進行分級處理，并收集篩分獲得的四個級分的紙漿纖維；均衡水分后測定固含量，備用；

取適量上述篩分獲得的r30級分楊木p-rcapmp紙漿纖維在去離子水中浸泡一周；用5×10^-5mol/l的吖啶橙溶液染色，具體染色方法為：稱絕干量為0.2g的濕漿，放入用錫箔紙包裹的50ml玻璃瓶中，向玻璃瓶中加入40ml熒光染料溶液，加入適量玻璃珠后蓋上橡膠塞均勻搖晃30min；靜置，待纖維沉淀后用醫(yī)用注射器移走上層清液；加去離子水依照上述步驟，其中搖晃時間改為5min，清洗三次，最后一次無需移走上層清液。在放大鏡下利用解剖針在載玻片上將熒光染色后的纖維快速搭建成纖維結(jié)合模型纖維結(jié)合模型搭建完成后迅速蓋上蓋玻片并用封片劑封片，防止結(jié)合模型被破壞，所用封片劑為快速風(fēng)干型。制備好的纖維結(jié)合模型臨時玻片避光放置，并在制備完成15min以內(nèi)使用共聚焦激光掃描顯微鏡clsm觀察。

使用共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)對搭建好的纖維結(jié)合模型進行觀察和光學(xué)切片，獲取纖維結(jié)合模型中兩根纖維結(jié)合區(qū)域的焦平面圖片。

clsm觀察纖維結(jié)合模型時步驟及參數(shù)設(shè)置如下：

(1)按照儀器說明書要求開啟共聚焦激光掃描顯微鏡clsm，選擇波長為488nm的激光作為激發(fā)光源；

(2)先利用低倍物鏡(4倍)尋找并鎖定纖維結(jié)合模型，然后逐級使用高倍物鏡觀察纖維結(jié)合模型(最終切換至40倍物鏡)，調(diào)節(jié)焦平面尋找纖維結(jié)合模型中兩根纖維結(jié)合區(qū)域的最佳焦平面，最后設(shè)置對纖維結(jié)合模型進行光學(xué)切片的相關(guān)參數(shù)；

(3)保存數(shù)據(jù)，利用圖形處理軟件標注纖維結(jié)合模型中兩根纖維間的結(jié)合區(qū)域輪廓并計算結(jié)合面積。

參數(shù)設(shè)定范圍和注意事項：

(1)設(shè)置對纖維結(jié)合模型進行光學(xué)切片的相關(guān)參數(shù)時，應(yīng)以纖維結(jié)合區(qū)域最佳焦平面為基準設(shè)置clsm掃描并進行光學(xué)切片的最高和最低位置，并設(shè)置合適的掃描步驟和相應(yīng)跨度；

(2)本實施例中，設(shè)置的掃描跨度為0.76μm，根據(jù)樣品厚度及已設(shè)定的掃描跨度確定掃描步驟為33次，最終可得到33張間隔為0.76μm的r30級分楊木p-rcapmp紙漿纖維結(jié)合模型的光學(xué)切片焦平面圖像。

(3)clsm的操作環(huán)境為黑暗環(huán)境，開始掃描要關(guān)閉室內(nèi)光源，直至掃描結(jié)束；掃描過程中調(diào)節(jié)位 置等操作盡量快速完成，以減少熒光淬滅造成的樣品損壞。

從上述獲得的33張間隔為0.76μm的r30級分楊木p-rcapmp紙漿纖維結(jié)合模型的光學(xué)切片(焦平面圖像)中篩選出最接近與結(jié)合模型中兩根呈十字交叉狀的纖維相互接觸區(qū)域的焦平面圖像，本實施例中第18張?zhí)幑鈱W(xué)切片(z軸坐標為12.91μm)的焦平面圖像最能清晰反應(yīng)兩根纖維間的實際結(jié)合區(qū)域，因此這張焦平面圖片被選中并用于標記和計算纖維間實際結(jié)合區(qū)域及其面積。

利用clsm配套的專業(yè)圖形處理軟件(lsmimagebrowser)對選中用于計算實際結(jié)合面積的焦平面圖像進行標記并計算所用r30級分楊木p-rcapmp紙漿纖維結(jié)合模型中纖維間的實際結(jié)合面積。

實施例2

取某工廠生產(chǎn)的楊木p-rcapmp漿60g絕干量在1l去離子水中浸泡4h；浸泡后的紙漿進行消潛處理，消潛條件為漿濃2％，溫度80℃，攪拌時間20min消潛完成后的紙漿用標準纖維解離機進行解離處理，用鮑爾篩分儀，使用30、50、100和200目的篩網(wǎng)對經(jīng)解離處理后的紙漿進行分級處理，并收集篩分獲得的四個級分的紙漿纖維；均衡水分后測定固含量，備用：；

取適量上述篩分獲得的p30/r50級分楊木p-rcapmp紙漿纖維在去離子水中浸泡一周：用6×10⁵mol/l的吖啶橙溶液染色，具體染色方法為：稱絕干量為0.2g的濕漿，放入用錫箔紙包裹的50ml玻璃瓶中，向玻璃瓶中加入40ml熒光染料溶液，加入適量玻璃珠后蓋上橡膠塞均勻搖晃30min；靜置，待纖維沉淀后用醫(yī)用注射器移走上層清液：加去離子水依照上述步驟，其中搖晃時間改為5min，清洗三次，最后一次無需移走上層清液。在放大鏡下利用解剖針在載玻片上將熒光染色后的纖維快速搭建成纖維結(jié)合模型，纖維結(jié)合模型搭建完成后迅速蓋上蓋玻片并用封片劑封片，防止結(jié)合模型被破壞，所用封片劑為快速風(fēng)干型。制備好的纖維結(jié)合模型臨時玻片避光放置，并在制備完成15min以內(nèi)使用共聚焦激光掃描顯微鏡clsm觀察。

使用共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)對搭建好的纖維結(jié)合模型進行觀察和光學(xué)切片，獲取纖維結(jié)合模型中兩根纖維結(jié)合區(qū)域的焦平面圖片。

clsm觀察纖維結(jié)合模型時步驟及參數(shù)設(shè)置如下：

操作步驟：

(1)按照儀器說明書要求開啟共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)，選擇波長為488nm的激光作為激發(fā)光源；

(2)先利用低倍物鏡(4倍)尋找并鎖定纖維結(jié)合模型，然后逐級使用高倍物鏡觀察纖維結(jié)合模型(最終切換至40倍物鏡)，調(diào)節(jié)焦平面尋找纖維結(jié)合模型中兩根纖維結(jié)合區(qū)域的最佳焦平面，最后設(shè)置對纖維結(jié)合模型進行光學(xué)切片的相關(guān)參數(shù)；

(3)保存數(shù)據(jù)，利用圖形處理軟件標注纖維結(jié)合模型中兩根纖維間的結(jié)合區(qū)域輪廓并計算結(jié)合面積。

參數(shù)設(shè)定范圍和注意事項：

(1)設(shè)置對纖維結(jié)合模型進行光學(xué)切片的相關(guān)參數(shù)時，應(yīng)以纖維結(jié)合區(qū)域最佳焦平面為基準設(shè)置clsm掃描并進行光學(xué)切片的最高和最低位置，并設(shè)置合適的掃描步驟和相應(yīng)跨度；

(2)本實施例中，設(shè)置的掃描跨度為0.76μm，根據(jù)樣晶厚度及已設(shè)定的掃描跨度確定掃描步驟為25次，最終可得到25張間隔為0.76μm的p30/r50級分楊木p-rcapmp紙漿纖維結(jié)合模型的光學(xué)切片(焦平面圖像)，如附圖3所示。

(3)clsm的操作環(huán)境為黑暗環(huán)境，開始掃描要關(guān)閉室內(nèi)光源，直至掃描結(jié)束；掃描過程中調(diào)節(jié)位置等操作盡量快速完成，以減少熒光淬滅造成的樣品損壞。

四、高得率漿纖維間實際結(jié)合面積計算

從上述獲得的25張間隔為0.76μm的p30/r50級分楊木p-rcapmp紙漿纖維結(jié)合模型的光學(xué)切片(焦平面圖像)中篩選出最接近與結(jié)合模型中兩根呈十字交叉狀的纖維相互接觸區(qū)域的焦平面圖像，本實施例中第12張光學(xué)切片(z軸坐標為8.35μm處)的焦平面圖像最能清晰反應(yīng)兩根纖維間的實際結(jié)合區(qū)域，因此這張焦平面圖片被選中并用于標記和計算纖維間實際結(jié)合區(qū)域及其面積。

利用clsm配套的專業(yè)圖形處理軟件(lsmimagebrowser)對選中用于計算實際結(jié)合面積的焦平面圖像進行標記并計算所用p30/r50級分楊木p-rcapmp紙漿纖維結(jié)合模型中纖維間的實際結(jié)合面積。

因此，就計算出了楊木p-rcapmp紙漿中r30和p30/r50級分制備的纖維結(jié)合模型中兩根纖維間的實際結(jié)合面積分別為115.2μm2和189.57μm2。

由此可見，本發(fā)明中的利用clsm評價高得率漿纖維間結(jié)合面積的方法具有快捷簡便且精確度較高等優(yōu)點，是一種實際生產(chǎn)可以接受的、經(jīng)濟可行的新型高得率漿纖維結(jié)合面積檢測方法。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。