本發(fā)明涉及圓二色光譜法檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種基于圓二色光譜技術(shù)的物質(zhì)含量的測定方法。

背景技術(shù)：

計量是實現(xiàn)單位統(tǒng)一、量值準(zhǔn)確可靠的活動，研究建立高準(zhǔn)確度的測量方法是計量學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。含量(濃度)描述了單位質(zhì)量或體積中被測對象的數(shù)量，是化學(xué)與生物計量中的基本量值，為了實現(xiàn)含量(濃度)的準(zhǔn)確測定，化學(xué)與生物計量中廣泛采用同位素稀釋質(zhì)譜的方法作為計量方法。同位素稀釋質(zhì)譜方法是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，它以被測對象的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)添加到樣品中，由于同位素內(nèi)標(biāo)與待測化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)接近，因此在充分混勻以后同位素內(nèi)標(biāo)可以實時校正整個分析過程中的系統(tǒng)誤差與隨機誤差，實現(xiàn)高準(zhǔn)確度的測量。當(dāng)添加同位素內(nèi)標(biāo)以后，由于同位素標(biāo)記物與待測目標(biāo)化合物理化性質(zhì)接近，因此在前處理過程中兩者的反應(yīng)效率、損失率等都是一致的；在高效液相色譜分離過程中，同位素內(nèi)標(biāo)與待測目標(biāo)化合物始終在一起，任意時刻施加到待測目標(biāo)化合物上的擾動也同等程度的施加到同位素內(nèi)標(biāo)上，因此校正了分離過程中的隨機誤差與系統(tǒng)誤差；在離子化的過程中，待測目標(biāo)化合物與同位素標(biāo)記物具有相同的離子化效率，兩者被同等效率的離子化并進(jìn)入到質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測，最后在質(zhì)譜的不同質(zhì)荷比通道被檢測。最后根據(jù)待測目標(biāo)化合物和同位素標(biāo)記物的比例及稱量的質(zhì)量進(jìn)行計算。由于添加同位素內(nèi)標(biāo)后整個分析過程中各種影響因素均無法改變兩者的比例，因此可以消除掉整個分析過程中的系統(tǒng)誤差與隨機誤差，得到高準(zhǔn)確度的定量結(jié)果。這使得同位素稀釋質(zhì)譜法也成為化學(xué)與生物計量中常用的計量基準(zhǔn)方法之一。

圓二色光譜是對手性分子進(jìn)行測定的光譜技術(shù)，手性廣泛的存在于自然界中，是一種重要的對稱特點。手性分子具有光化學(xué)活性能使偏振光振動平面旋轉(zhuǎn)，而對于R和L兩種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象稱為圓二色性(circular dichroism，CD)。針對這種現(xiàn)象，吸收程度的不同與波長的關(guān)系稱圓二色光譜。對于一對D和L構(gòu)型的手性異構(gòu)體，當(dāng)它們含量(濃度)相等時，單一D或L型的圓二色光譜呈現(xiàn)出大小相等、方向相反的特點；當(dāng)一對對映體等量混合以后，則不再有圓二色光譜信號，稱為消旋體。

為了進(jìn)一步發(fā)展化學(xué)與生物計量方法體系，迫切需要建立新的高準(zhǔn)確度計量方法滿足生化及生物對象準(zhǔn)確定量的需求，因此本發(fā)明基于圓二色光譜技術(shù)建立了一種新型的手性化合物含量(濃度)準(zhǔn)確測定方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法。

一種基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，包括如下步驟：

(1)確定樣品中的待測手性目標(biāo)化合物；

(2)配制光學(xué)對映體儲備液；

(3)配制手性目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液；

(4)配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

(5)待測樣品的處理；

(6)選擇流動相和色譜柱；

(7)采用高效液相色譜-圓二色光譜聯(lián)用裝置依次對配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品進(jìn)行檢測，記錄圓二色光譜信號強度；

(8)根據(jù)公式計算待測樣品中的目標(biāo)手性化合物的含量。

本發(fā)明所述的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，其中，所述步驟(1)中：當(dāng)樣品為液體樣品時，稱取m g樣品；當(dāng)樣品為固體樣品時，稱取m g樣品，溶解于n g溶劑中，形成待測樣品。

本發(fā)明所述的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，其中，所述步驟(2)具體包括：取適量的待測手性目標(biāo)化合物的光學(xué)對映體，溶解在溶劑中，形成光學(xué)對映體的儲備液，其含量記為cD₀。

本發(fā)明所述的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，其中，所述待測手性目標(biāo)化合物的光學(xué)對映體為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者經(jīng)過表征的試劑；所述光學(xué)對映體中不含有待測手性目標(biāo)化合物，或者手性目標(biāo)化合物的含量在指定的控制限量內(nèi)。

本發(fā)明所述的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，其中，所述步驟(3)具體包括：取適量的手性目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將其溶解在合適的溶劑中，形成手性目標(biāo)化合物的儲備液，其含量記為cL₀。

本發(fā)明所述的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，其中，所述手性目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不含有待測手性目標(biāo)化合物的光學(xué)對映體，或者手性目標(biāo)化合物的光學(xué)對映體的含量在指定的控制限量內(nèi)。

本發(fā)明所述的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，其中，所述步驟(4)具體包括：采用單點法、括號法或者標(biāo)準(zhǔn)曲線法對手性目標(biāo)化合物的含量進(jìn)行測定。

本發(fā)明所述的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，其中，所述步驟(4)中，當(dāng)采用單點法測定時，只需配制一個標(biāo)準(zhǔn)溶液，該標(biāo)準(zhǔn)溶液由手性目標(biāo)化合物儲備液、光學(xué)對映體儲備液及緩沖溶液配制而成；標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中手性目標(biāo)化合物的含量與待測樣品中手性目標(biāo)化合物的含量接近；

當(dāng)采用括號法測定時，需要配制高標(biāo)溶液和低標(biāo)溶液各一個，其中高標(biāo)溶液中手性目標(biāo)化合物的含量略高于待測樣品中手性目標(biāo)化合物的含量，低標(biāo)溶液中手性目標(biāo)化合物的含量略低于待測樣品中手性目標(biāo)化合物的含量，光學(xué)對映體的含量在各個標(biāo)準(zhǔn)溶液中保持一致；

當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定時，需要配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，這些標(biāo)準(zhǔn)溶液中光學(xué)對映體的含量基本保持一致，手性目標(biāo)化合物的含量形成一個梯度范圍，該范圍覆蓋待測樣品中的手性目標(biāo)化合物的含量。

本發(fā)明所述的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，其中，所述步驟(5)具體包括：稱取適量的待測樣品，在其中添加一定量的光學(xué)對映體；充分混勻后，根據(jù)實際需要可進(jìn)行樣品前處理操作；

所述樣品前處理操作包括衍生化。

本發(fā)明所述的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法，其中，所述步驟(6)具體包括：應(yīng)避免使用手性色譜柱和含有手性添加劑的流動相，以防止待測目標(biāo)化合物和其光學(xué)對映體在分析過程中分離開；

通過對色譜分離條件的優(yōu)化，確保待測目標(biāo)化合物與樣品中的其它組分基線分離。

本發(fā)明的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，其突出效果在于：

(1)本發(fā)明建立的方法則是利用了對映體的圓二色光譜性質(zhì)，采用待測手性目標(biāo)化合物的光學(xué)對映體作為內(nèi)標(biāo)，而不是同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行分析，因此本發(fā)明建立的方法也是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法。由于光學(xué)對映體與待測目標(biāo)化合物僅光學(xué)性質(zhì)不同，在非手性環(huán)境中具有相同的理化性質(zhì)，因此在樣品中添加光學(xué)對映體作為內(nèi)標(biāo)后，在樣品前處理過程中兩者的反應(yīng)效率、損失率等都是相同的，從而起到與同位素稀釋質(zhì)譜同樣的效果，能夠?qū)崟r校正樣品前處理過程中的系統(tǒng)誤差與隨機誤差；在色譜分離過程中，在非手性色譜柱及非手性流動相的情況下，待測目標(biāo)化合物與其光學(xué)對映體始終在一起，任意一個時刻施加到待測目標(biāo)化合物上的擾動被同等程度的施加到光學(xué)對映體上，從而起到與同位素內(nèi)標(biāo)相同的作用，能夠?qū)崟r校正分離過程中的系統(tǒng)誤差與隨機誤差；在檢測過程中，不采用質(zhì)譜檢測器而是采用圓二色光譜檢測器，由于避免了離子化的環(huán)節(jié)，同時也避免使用離子光學(xué)系統(tǒng)，而是純光學(xué)系統(tǒng)，因此進(jìn)一步減少了隨機誤差與系統(tǒng)誤差。

(2)高效液相色譜-圓二色光譜聯(lián)用方法采用單點法、括號法或者標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定樣品中目標(biāo)化合物的含量(濃度)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與待測樣品中目標(biāo)化合物的濃度盡可能接近，從而最大可能的降低分析過程中的系統(tǒng)誤差與隨機誤差，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確。因此，本發(fā)明通過光學(xué)對映體的使用可以實時校正樣品前處理、分離、檢測中的各項系統(tǒng)誤差與隨機誤差，從而獲得高準(zhǔn)確度的測量結(jié)果，具有基準(zhǔn)方法的性質(zhì)。

(3)傳統(tǒng)的高效液相色譜-圓二色光譜聯(lián)用方法主要用于手性化合物的拆分、對映體過量率的測定，不是將其中一個異構(gòu)體作為內(nèi)標(biāo)提升目標(biāo)物定量的準(zhǔn)確性，與本發(fā)明提出的手性異構(gòu)稀釋-高效液相色譜圓二色光譜聯(lián)用技術(shù)有所區(qū)別。在結(jié)果計算上，傳統(tǒng)的高效液相色譜-圓二色光譜聯(lián)用方法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法、通過g因子等測定并計算對映體的過量率；而本發(fā)明中的方法采用單點法、括號法以及標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定并計算最終結(jié)果，進(jìn)一步提高了測量結(jié)果的準(zhǔn)確度。

(3)本發(fā)明建立的方法既可實現(xiàn)絕對定量，又可實現(xiàn)相對定量。當(dāng)采用的光學(xué)對映體為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，則可直接使用光學(xué)對映體作為標(biāo)準(zhǔn)對待測目標(biāo)化合物進(jìn)行定量，構(gòu)成絕對定量方法；當(dāng)采用的光學(xué)對映體不是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)而待測目標(biāo)化合物是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，則可通過待測目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定量，構(gòu)成相對定量方法，這在傳統(tǒng)的有機物同位素稀釋質(zhì)譜以及傳統(tǒng)的高效液相色譜-圓二色光譜聯(lián)用中是不存在的。

(4)由于使用了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為測量的標(biāo)準(zhǔn)，因此采用本方法測定的結(jié)果可溯源到上一級的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)上，視上一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)情況的不同，結(jié)果可最終溯源到SI單位或國際公認(rèn)定義。

(5)本方法的提出克服了在化學(xué)和生物計量領(lǐng)域長期使用同位素稀釋一種方法的局限性和風(fēng)險，通過不同方法的相互驗證可以進(jìn)一步降低測量結(jié)果的不確定度，保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確、有效及可溯源。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量的測定方法作進(jìn)一步說明。

具體實施方式

實施例1

一種基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量(濃度)準(zhǔn)確測定方法，包括如下步驟：

(1)確定樣品中的待測手性目標(biāo)化合物：

當(dāng)樣品為液體樣品時，稱取m g樣品；當(dāng)樣品為固體樣品時，稱取m g樣品，溶解于n g的合適溶劑中，形成待測樣品。

(2)配制光學(xué)對映體儲備液：

取適量的待測手性目標(biāo)化合物的光學(xué)對映體，溶解在合適的溶劑中，形成光學(xué)對映體的儲備液，其含量(濃度)記為c_D0。

其中，待測手性目標(biāo)化合物的光學(xué)對映體為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者經(jīng)過表征的試劑；所述光學(xué)對映體中不含有待測手性目標(biāo)化合物，或者手性目標(biāo)化合物的含量在指定的控制限量內(nèi)。

(3)配制手性目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液：

取適量的手性目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將其溶解在合適的溶劑中，形成手性目標(biāo)化合物的儲備液，其含量(濃度)記為c_L0。

其中，手性目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不含有待測手性目標(biāo)化合物的光學(xué)對映體，或者手性目標(biāo)化合物的光學(xué)對映體的含量在指定的控制限量內(nèi)。

(4)配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：

可采用單點法、括號法或者標(biāo)準(zhǔn)曲線法對手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)進(jìn)行測定。

采用單點法測定時，只需要配制一個標(biāo)準(zhǔn)溶液，該標(biāo)準(zhǔn)溶液由手性目標(biāo)化合物儲備液、光學(xué)對映體儲備液及緩沖溶液配制而成。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)與待測樣品中手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)接近。

采用括號法測定時，需要配制高標(biāo)溶液和低標(biāo)溶液各一個，其中高標(biāo)溶液中手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)略高于待測樣品中手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)，低標(biāo)溶液中手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)略低于待測樣品中手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)，光學(xué)對映體的含量(濃度)在各個標(biāo)準(zhǔn)溶液中保持一致。

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定時，需要配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，這些標(biāo)準(zhǔn)溶液中光學(xué)對映體的含量(濃度)基本保持一致，手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)形成一個梯度范圍，該范圍能夠覆蓋住待測樣品中的手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)。

以單點法計算為例，配制單標(biāo)時稱取了m_sL g手性目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液，稱取了m_sD g光學(xué)對映體儲備液，稱取了m₀g緩沖溶液，充分混合后，單標(biāo)中手性目標(biāo)化合物的濃度可以通過公式1計算，光學(xué)對映體的濃度可以通過公式2計算。

公式1

公式2

(5)待測樣品的處理：

稱取適量的待測樣品，在其中添加一定量的光學(xué)對映體；充分混勻后，根據(jù)實際需要，進(jìn)行衍生化等樣品前處理操作。

以溶液樣品為例，稱取了m g樣品，在其中加入了m_D g光學(xué)對映體儲備液，充分混勻后待測樣品中光學(xué)對映體的含量(濃度)可以通過公式3計算：

公式3

(6)選擇流動相和色譜柱：

應(yīng)避免使用手性色譜柱和含有手性添加劑的流動相，以防止待測目標(biāo)化合物和其光學(xué)對映體在分析過程中分離開。通過對色譜分離條件的優(yōu)化，確保待測目標(biāo)化合物與樣品中的其它組分基線分離。

(7)采用高效液相色譜-圓二色光譜聯(lián)用裝置依次對配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品進(jìn)行檢測，記錄圓二色光譜信號強度。

以單點法測定為例，單標(biāo)和樣品的圓二色光譜信號強度分別為I_s和I。

(8)根據(jù)公式計算待測樣品中的目標(biāo)手性化合物的含量(濃度)：

以單點法測定為例，根據(jù)公式4計算樣品中的目標(biāo)手性化合物的含量(濃度)：

公式4

實施例2

采用實施例1中的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量測定方法對溶液中的人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)進(jìn)行測定。其中，采用單點法對手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)進(jìn)行測定。

1、取待測人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)溶液m＝0.139345g；

2、取D型苯丙氨酸固體11.37mg并用超純水分三次稀釋濃度c_D0＝0.037793mg/g；

3、取L型苯丙氨酸固體20.51mg并用超純水分三次稀釋濃度為c_L0＝0.009114mg/g；

4、將分別取步驟2、3中所制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液m_sL＝0.69926g，m_sD＝0.69694g，計算得

5、取步驟2中配置的D型苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.101138g加入到步驟1中待測FABP溶液中旋干水解并復(fù)溶至0.099489g，計算得再取復(fù)溶后的樣品溶液0.041121g溶于0.041033g超純水中，計算得

6、經(jīng)優(yōu)化，確定如下色譜條件：色譜柱UPLC HSS T3 1.8μm(2.1×100mm)，流動相A：MilliQ純水；B乙腈，A:B＝95:5，限壓300bar，流速0.2ml/min，紫外檢測波長216.5nm，圓二色光譜檢測波長216.5nm，進(jìn)樣量10μL。分別利用建立的LC-CD方法對步驟4、5所得的標(biāo)準(zhǔn)溶液與FABP樣品溶液進(jìn)行測定，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)溶液圓二色峰面積I_s＝-0.66911mdeg·min，檢測樣品圓二色峰面積I＝-0.679269mdeg·min，后根據(jù)公式4計算得

7、根據(jù)FABP樣品兩次溶解過程，計算得

實施例3

采用實施例1中的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量測定方法對溶液中的人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)進(jìn)行測定。其中，采用括號法對手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)進(jìn)行測定。

1、取待測人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)溶液m＝0.139983g；

2、取D型苯丙氨酸固體11.37mg并用超純水分三次稀釋濃度c_D0＝0.04966mg/g；

3、取L型苯丙氨酸固體20.51mg并用超純水分三次稀釋低濃度為c_L1＝0.00719mg/g；高濃度為c_L2＝0.01090mg/g；

4、將分別取步驟2、3中所制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中低濃度m_sL1＝0.60026g，m_sD1＝0.59994g，計算得高濃度m_sL2＝0.60306g，m_sD2＝0.60624g，計算得

5、取步驟2中配置的D型苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.100393g加入到步驟1中待測FABP溶液中旋干水解并復(fù)溶至0.099527g，計算得再取復(fù)溶后的樣品溶液0.079565g溶于0.079770g超純水中，計算得

6、經(jīng)優(yōu)化，確定如下色譜條件：色譜柱UPLC HSS T3 1.8μm(2.1×100mm)，流動相A：MilliQ純水；B乙腈，A:B＝95:5，限壓300bar，流速0.2ml/min，紫外檢測波長216.5nm，圓二色光譜檢測波長216.5nm，進(jìn)樣量10μL。分別利用建立的LC-CD方法對步驟4所得的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液圓二色峰面積I_s1＝-0.769559mdeg·min，高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液圓二色峰面積I_s2＝-0.647996mdeg·min，后利用高低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液建立c_sL-c_sD—I_s標(biāo)準(zhǔn)曲線，y＝68.68x+0.6878；

7、利用建立的LC-CD方法對步驟5所得的FABP樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果圓二色峰面積I＝-0.700440mdeg·min，后計算得

8、根據(jù)FABP樣品兩次溶解過程，計算得

實施例4

采用實施例1中的基于圓二色光譜技術(shù)的手性分子含量測定方法對溶液中的人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)進(jìn)行測定。其中，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對手性目標(biāo)化合物的含量(濃度)進(jìn)行測定。

1、取待測人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)溶液m＝0.139033g；

2、取D型苯丙氨酸固體11.37mg并用超純水分三次稀釋濃度c_D0＝0.04966mg/g；

3、取L型苯丙氨酸固體20.51mg并用超純水分三次稀釋低濃度為c_L1＝0.00719mg/g；中間濃度為c_L2＝0.00907mg/g；高濃度為c_L3＝0.01090mg/g；

4、將分別取步驟2、3中所制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中低濃度m_sL1＝0.60026g，m_sD1＝0.59994g，計算得中間濃度m_sL2＝0.60065g，m_sD2＝0.60315g，計算得高濃度m_sL3＝0.60306g，m_sD3＝0.60624g，計算得

5、取步驟2中配置的D型苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.100281g加入到步驟1中待測FABP溶液中旋干水解并復(fù)溶至0.099440g，計算得再取復(fù)溶后的樣品溶液0.096920g溶于0.098886g超純水中，計算得

6、經(jīng)優(yōu)化，確定如下色譜條件：色譜柱UPLC HSS T3 1.8μm(2.1×100mm)，流動相A：MilliQ純水；B乙腈，A:B＝95:5，限壓300bar，流速0.2ml/min，紫外檢測波長216.5nm，圓二色光譜檢測波長216.5nm，進(jìn)樣量10μL。分別利用建立的LC-CD方法對步驟4所得的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液圓二色峰面積I_s1＝-0.769559mdeg·min，中間濃度I_s2＝-0.743316mdeg·min，高濃度I_s3＝-0.647996mdeg·min，后利用低中高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液建立c_sL-c_sD—I_s標(biāo)準(zhǔn)曲線，y＝68.894x+0.681；

7、利用建立的LC-CD方法對步驟5所得的FABP樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果圓二色峰面積I＝-0.70173mdeg·min，后計算得

8、根據(jù)FABP樣品兩次溶解過程，計算得

為突出本發(fā)明實施例的突出效果，進(jìn)行以下對比例試驗：

對比例1

采用同位素稀釋質(zhì)譜方法對溶液中人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)濃度進(jìn)行測定。

1、將與實施例2中相同的FABP樣品溶液用純水稀釋10倍，稱量FABP樣品溶液0.02486g，加入純水0.25713g，則樣品的稀釋比例為11.34倍；

2、取稀釋后的FABP溶液20μL與等體積的濃度0.6μg/g的同位素標(biāo)記苯丙氨酸混合，分別記錄稱量的FABP溶液質(zhì)量和同位素標(biāo)記苯丙氨酸溶液的質(zhì)量，混勻后用氮氣吹干。然后加入200μL的6mol/L的鹽酸，通氮氣2min以除去氧氣后封管，在110℃的烘箱中水解48hrs。取出平衡至室溫后用氮氣將鹽酸吹干，然后加入100μL 0.01mol/L的鹽酸，復(fù)溶過濾后進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜分析；

3、以國家苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，測定樣品中苯丙氨酸的含量為0.5985μg/g。因此樣品中的對應(yīng)的FABP濃度為0.5985/165.19/6×14000＝8.454μg/g，因此未稀釋前樣品中FABP的濃度為8.454×11.34/1000＝0.0959mg/g。

以上對比例和實施例進(jìn)行試驗結(jié)果對比，得出以下結(jié)論：

(1)手性異構(gòu)稀釋圓二色光譜方法與傳統(tǒng)的同位素稀釋質(zhì)譜方法均能滿足對溶液中蛋白質(zhì)含量的測定；

(2)手性異構(gòu)稀釋圓二色光譜方法與傳統(tǒng)的同位素稀釋質(zhì)譜方法對同樣樣品測量結(jié)果之間的差異僅為1.2％，均在在兩個方法的不確定度的范圍內(nèi)，兩種測量方法結(jié)果一致；

(3)手性異構(gòu)稀釋圓二色光譜方法采用手性對映體作為內(nèi)標(biāo)，成本上比同位素內(nèi)標(biāo)價格更為低廉，因此方法的分析成本更低。

以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。