本發(fā)明屬于腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS方法)檢測(cè)腸道組織樣本亞油酸含量，以及用于結(jié)直腸癌的診斷試劑盒。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，其致死率在全球居第四位。雖然內(nèi)鏡檢查有助于結(jié)直腸癌的確診，但受制于經(jīng)濟(jì)條件和患者的依從性，應(yīng)用范圍有限。目前，癌胚抗原(CEA)常用于卵巢癌和消化道腫瘤的早期篩查，但其檢測(cè)靈敏性和特異性有待提高。結(jié)腸直腸癌的診斷對(duì)于提高患者的生存率具有重要意義。

必需脂肪酸因?yàn)樵隗w內(nèi)不能合成，必須依賴于食物提供，主要包括亞油酸和亞麻酸等多元不飽和脂肪酸。亞油酸與類脂代謝有關(guān)，尤其對(duì)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝起著重要的作用。膽固醇在體內(nèi)必須和脂肪酸結(jié)合才可以被轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。當(dāng)體內(nèi)缺乏必需脂肪酸時(shí)，膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝發(fā)生異常，進(jìn)而堆積以致含量增加。亞油酸與膽固醇結(jié)合生成水溶性物質(zhì)，降低血清膽固醇水平，保護(hù)心腦血管。亞油酸是不飽和脂肪酸，是細(xì)胞膜的組成成分，參與線粒體及細(xì)胞膜磷脂的合成。亞油酸代謝產(chǎn)物是血栓素A2(TXA2)，具有促進(jìn)血小板聚集和促進(jìn)動(dòng)脈內(nèi)膜增生功能。同時(shí)，亞油酸是生物抗氧劑，具有抗老化和增加機(jī)體免疫力作用。

近期研究顯示，代謝通路的變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。特別是，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的亞油酸代謝通路發(fā)生了變化。明確細(xì)胞內(nèi)亞油酸代謝模式有助于腫瘤的早期診斷和發(fā)生發(fā)展進(jìn)程評(píng)價(jià)。因此，通過檢測(cè)腸息肉、腺瘤等活檢組織中的亞油酸代謝通路變化和代謝靶點(diǎn)，有助于對(duì)患者進(jìn)行早期確診和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

目前，亞油酸的檢測(cè)方法主要是GC-MS。通常將亞油酸衍生為易揮發(fā)的甲酯，經(jīng)過GC分離，然后進(jìn)行MS檢測(cè)。但在衍生過程中的水解、氧化或者異構(gòu)化等問題，極易造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)較GC-MS有以下優(yōu)點(diǎn)，LC條件溫和，適合像亞油酸這樣的極性低、低揮發(fā)性且熱敏感的化合物，可避免衍生過程中的異構(gòu)和氧化。但時(shí)，LC-MS/MS的衍生方法過于繁瑣和耗時(shí)。因此，建立簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的亞油酸檢測(cè)方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)組織亞油酸含量的方法及結(jié)直腸癌診斷試劑盒。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)組織亞油酸含量的方法，包括以下步驟：

1)將50～110mg組織樣本在液氮中研磨成粉，將研磨得到的組織粉末用含有0.1％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的冰甲醇均質(zhì)后進(jìn)行離心，取離心得到的上清液；

2)向15～20μL上清液中加入亞油酸同位素內(nèi)標(biāo)，放置25～35min后離心，將離心得到的上清液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笥?0～60μL正丁醇于60～65℃衍生處理20～30min，然后氮?dú)獯蹈?，?00～150μL流動(dòng)相重新分散溶解，得到待上樣檢測(cè)樣品；

3)對(duì)待上樣檢測(cè)樣品利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，得到組織樣本中亞油酸的含量。

所述組織樣本由腸道活檢得到。

所述冰甲醇是指0～4℃預(yù)冷的甲醇(色譜級(jí))。

所述液相色譜的工作條件包括：流動(dòng)相是將0.6～1mL 50％的乙酸水溶液與1000mL乙腈水溶液混合而制成的，所述乙腈水溶液中乙腈與水的體積比為(7～8):(2～3)；流動(dòng)相采用梯度流速，且初始流速為240μL/min；進(jìn)樣量為18～25μL。

所述質(zhì)譜的工作條件包括：離子源溫度為350～370℃；每次轉(zhuǎn)變駐留時(shí)間為200～220ms；霧化氣為0.3MPa，輔助氣為0.4MPa，氣簾氣為0.25MPa；分析模式為母離子掃描，目標(biāo)物亞油酸的母離子掃描范圍為350～500m/z，子離子為85.1m/z。

一種結(jié)直腸癌診斷試劑盒，該試劑盒包括用于提取組織液的試劑以及用于制備液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法所需樣品的預(yù)處理試劑和流動(dòng)相(即上述流動(dòng)相)，所述用于提取組織液的試劑包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚以及甲醇，所述預(yù)處理試劑包括亞油酸同位素內(nèi)標(biāo)以及衍生試劑正丁醇。

所述試劑盒還包括用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)組織樣本中FADS1、FADS2、ELOVL2或ELOVL5基因表達(dá)量的對(duì)應(yīng)引物對(duì)P1、P2、P3或P4。

所述引物對(duì)P1為：

上游引物FADS1F：5`-GTCCGCTTCTTCCTCACTTATG-3`

下游引物FADS1R：5`-GCTTTCCAGGAACCTGACTATG-3`；

所述引物對(duì)P2為：

上游引物FADS2F：5`-CATGACCATGATCGTCCATAAGA-3`

下游引物FADS2R：5`-GATGCCGTAGAAAGGGATGTAG-3`；

所述引物對(duì)P3為：

上游引物ELOVL2F：5`-CCCTTCGGTTGTCTCATCTTC-3`

下游引物ELOVL2R：5`-CAGGTGGCTCTTGCATATCTT-3`；

所述引物對(duì)P4為：

上游引物ELOVL5F：5`-TCCCTCTTGGTTGGTTGTATTT-3`

下游引物ELOVL5R：5`-CCTTCAGGTGGTCTTTCCTTC-3`。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明所述方法通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析對(duì)組織樣本中的亞油酸含量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)，分析樣品的前處理簡(jiǎn)單有效，可用于對(duì)腸道活檢物，例如癌組織或正常組織的亞油酸含量分析，為比較疑似結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織的亞油酸含量差異提供了便利的途徑，為結(jié)直腸癌的診治以及后期的營(yíng)養(yǎng)學(xué)支持提供重要參考。

本發(fā)明所述試劑盒，可以用于對(duì)疑似結(jié)直腸癌患者的活檢樣本亞油酸含量變化以及相關(guān)代謝通路中基因的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，從而達(dá)到快速、準(zhǔn)確、可靠診斷結(jié)直腸癌的目的。

附圖說明

圖1為10對(duì)結(jié)直腸癌組織(Tumor)和癌旁對(duì)照(Normal)的代謝數(shù)據(jù)集通過主成分分析(Principal Component Analysis)分析方法進(jìn)行分類的結(jié)果。

圖2為對(duì)代謝數(shù)據(jù)集利用隨機(jī)森林方法進(jìn)行分析的結(jié)果。

圖3為亞油酸代謝通路變化示意圖。

圖4為基因芯片結(jié)果層次聚類圖。

圖5為Real-time PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和癌旁對(duì)照中FADS1、FADS2、ELOVL2以及ELOVL5基因的表達(dá)差異。

圖6為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果圖，其中方框所指特征鋒為亞油酸。

圖7為亞油酸(LA(Linoleate 18:2))在結(jié)直腸癌組織以及癌旁對(duì)照中的點(diǎn)線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

(1)對(duì)結(jié)直腸癌組織以及相應(yīng)的癌旁對(duì)照進(jìn)行代謝組學(xué)分析，篩選出合適的代謝生物標(biāo)記物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)亞油酸含量在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中降低。(2)對(duì)結(jié)直腸癌組織以及相應(yīng)的癌旁對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本分析，確定此代謝物(亞油酸)的相關(guān)酶的表達(dá)發(fā)生改變，進(jìn)一步對(duì)代謝物(亞油酸)相關(guān)酶的表達(dá)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證?；蛐酒Y(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織和癌旁對(duì)照相比FADS、FADS2、ELOVL2和ELOVL5表達(dá)上調(diào)，亞油酸代謝增加，結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)亞油酸含量降低。Real-time PCR結(jié)果顯示FADS1、FADS2、ELOVL2和ELOVL5的表達(dá)增加，與基因芯片結(jié)果重合。FADS1、FADS2、ELOVL2和ELOVL5為亞油酸代謝調(diào)控提供了新的靶點(diǎn)，以此為依據(jù)，可用以設(shè)計(jì)和開發(fā)直接針對(duì)靶點(diǎn)治療結(jié)直腸癌的新藥。以下為具體舉例說明。

1、篩選出結(jié)直腸癌組織中含量顯著變化的代謝物。

1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

收集10對(duì)結(jié)直腸癌組織(Tumor)樣本以及相應(yīng)的癌旁對(duì)照(Normal)，將-70℃凍存的組織樣本送往上海烈冰科技有限公司，對(duì)樣本進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)。

樣本于2014年3月采集自陜西省西安市西京醫(yī)院。

1.2數(shù)據(jù)的初步處理

總共有347個(gè)代謝物在腫瘤組織中檢測(cè)出來，首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以及數(shù)據(jù)缺失處理，結(jié)果顯示代謝物在腫瘤組織和正常組織間可以很好的區(qū)分。

1.3配對(duì)t檢驗(yàn)方法

進(jìn)一步通過配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)代謝物進(jìn)行分析，其中腫瘤組織中有95個(gè)代謝物含量顯著增加，而25個(gè)代謝物含量顯著降低；并且其中22個(gè)代謝物含量極顯著增加，而12個(gè)代謝物含量極顯著降低。

1.4主成分分析方法

通過主成分分析(Principal Component Analysis)分析方法對(duì)10對(duì)腫瘤組織和正常對(duì)照(癌旁對(duì)照)的代謝數(shù)據(jù)集進(jìn)行分類。所有樣本都在三維空間中進(jìn)行了分類，除1例腫瘤組織外，結(jié)果顯示，依據(jù)代謝物主要成分含量差異，可以很好的將腫瘤組織與正常組織進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果如圖1。

1.5隨機(jī)森林方法

對(duì)代謝數(shù)據(jù)集進(jìn)行隨機(jī)深林分析，結(jié)果顯示亞油酸(LA)含量顯著下降。同時(shí)亞油酸通路中γ亞油酸也下降，但因?yàn)闄z測(cè)過程中γ亞油酸和亞麻酸無法區(qū)分，因此不作為結(jié)直腸癌代謝檢測(cè)的靶標(biāo)分子，結(jié)果如圖2。

從圖3中可以明顯的看出腫瘤組織的亞油酸代謝通路與正常組織的代謝通路不同。

2、亞油酸含量的降低關(guān)聯(lián)代謝通路中調(diào)控關(guān)鍵酶基因表達(dá)的變化。

2.1收集10對(duì)結(jié)直腸癌組織(Tumor)樣本以及相應(yīng)的癌旁對(duì)照(Normal)，將-70℃凍存的組織和樣本送往上海烈冰科技有限公司，對(duì)樣本進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)。從圖4可以看出，對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行的層次聚類分析，發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸通路基因表達(dá)上調(diào)。

2.2qPCR對(duì)基因芯片中含量變化的驗(yàn)證。

2.2.1FADS1、FADS2、ELOVL2以及ELOVL5基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

FADS1F：5`-GTCCGCTTCTTCCTCACTTATG-3`(SEQ.ID.NO.1)

FADS1R：5`-GCTTTCCAGGAACCTGACTATG-3`(SEQ.ID.NO.2)

FADS2F：5`-CATGACCATGATCGTCCATAAGA-3`(SEQ.ID.NO.3)

FADS2R：5`-GATGCCGTAGAAAGGGATGTAG-3`(SEQ.ID.NO.4)

ELOVL5F：5`-TCCCTCTTGGTTGGTTGTATTT-3`(SEQ.ID.NO.5)

ELOVL5R：5`-CCTTCAGGTGGTCTTTCCTTC-3`(SEQ.ID.NO.6)

ELOVL2F：5`-CCCTTCGGTTGTCTCATCTTC-3`(SEQ.ID.NO.7)

ELOVL2R：5`-CAGGTGGCTCTTGCATATCTT-3`(SEQ.ID.NO.8)

2.2.2RNA提取

1)先將腫瘤組織以及癌旁對(duì)照的纖維組織、脂肪組織清除干凈，加入到研磨器中，在研磨器中磨碎后，吸取100μL的組織液加入到EP管中。

2)經(jīng)第一步處理后的樣品，每個(gè)樣品加500μL預(yù)冷的Trizol，用加樣槍反復(fù)吹打，并放置冰上5min，使細(xì)胞充分裂解。

3)轉(zhuǎn)移至經(jīng)DEPC水處理過的1.5mL EP管，加200μL氯仿，充分震蕩混勻，靜置5min使其分層。

4)4℃ 12000rpm離心15min，用200μL加樣槍吸取上層水樣400μL左右至新的1.5mL EP管中。

5)加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫靜置10min。

6)4℃ 12000rpm離心15min，棄上清。

7)加100％乙醇1mL，充分洗滌后再重復(fù)步驟(6)，可見底部有白色沉淀析出，即總RNA。

8)倒扣EP管于吸水濾紙上，靜置5min后，用20μL DEPC水溶解。

9)RNA定量：取4μL從步驟8獲得的RNA溶解于196μL ddH2O中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其A260和A280值，即可知道所提取總RNA的純度和濃度。

2.2.3反轉(zhuǎn)錄

取0.5μg總RNA，使用TaKaRa公司的Prime Script RT reagent kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系(20μL)為：5×buffer 4μL、補(bǔ)去離子水至20μL。反應(yīng)條件為：37℃ 15min；85℃5s，4℃ 10min。

2.2.4實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)

采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq試劑進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本做三個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系為20μL：2×buffer 10μL、上下游引物各1μL、cDNA模板2μL、ROX 0.4μL、補(bǔ)去離子水至20μL。在ABI 7500熒光定量PCR儀上按下列條件擴(kuò)增：95℃預(yù)變性10s，然后95℃ 10s，60℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)定在每個(gè)循環(huán)的變性期結(jié)束后，程序記錄上一循環(huán)最后10％時(shí)間的平均熒光值，以表示在該循環(huán)結(jié)束時(shí)的PCR產(chǎn)物的量。反應(yīng)完成后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和修正。在調(diào)整基線循環(huán)和計(jì)算閾值后，采用^2-ΔΔCt法比較FADS2和ELOV5的相對(duì)表達(dá)量，儀器自動(dòng)根據(jù)得出的Ct值計(jì)算得出代表相對(duì)表達(dá)量的值。參見圖5，結(jié)果提示結(jié)直腸癌組織中FADS1、FADS2、ELOVL2以及ELOVL5基因表達(dá)上調(diào)。

3、LC-MS/MS方法快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中亞油酸含量變化

3.1主要試劑：

3.2主要儀器：

3.3溶液的配制：

亞油酸同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存液配制：取凍干粉一支，加入1mL甲醇混合使溶解，濃度15.2μmol/L，純度99.7％。

亞油酸同位素內(nèi)標(biāo)使用液配制：取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存液用甲醇稀釋100倍(1個(gè)月內(nèi)用完)，濃度0.152μmol/L。

流動(dòng)相的配制：加0.6mL的體積分?jǐn)?shù)50％的乙酸水溶液到1000mL的乙腈水溶液中(乙腈：水＝80％：20％)，混合均勻并超聲脫氣以備用。

洗針液的配制：在1000mL的玻璃瓶中分別加入250mL的乙腈、250mL的異丙醇和250mL的去離子水，混合均勻后室溫條件下貯存以備用。

3.4組織樣本的前處理(以結(jié)直腸癌組織為例)：

準(zhǔn)確稱量100mg結(jié)直腸癌組織于1.5mL離心管中，液氮研磨成粉，加到1.5mL含0.1％(體積分?jǐn)?shù))BHT的冰甲醇中，研磨組織樣品直至完全均質(zhì)，5000rpm離心，取上清100μL，-20℃冰箱保存待測(cè)。

3.5樣本預(yù)處理：

取15μL(每孔)準(zhǔn)備好的腫瘤組織液(即步驟3.4得到的上清液)，置于96孔過濾板中，每孔加入50μL亞油酸同位素內(nèi)標(biāo)使用液，室溫放置25min，然后離心至96孔聚丙烯微孔板，65℃氮?dú)饧訜岽蹈桑偌尤?0μL正丁醇(74.12g/mol)，Teflon膜覆蓋(防止揮發(fā))，置65℃恒溫箱內(nèi)25min，隨后65℃氮?dú)饧訜岽蹈桑偌尤?00μL流動(dòng)相，鋁膜覆蓋(防止揮發(fā)，同時(shí)，方便采樣針穿入)，即可上樣檢測(cè)。

3.6LC-MS/MS分析條件：

LC參數(shù)：初始流速：240μL/min，四元泵設(shè)置梯度流速見表1，進(jìn)樣量：18μL。

表1.流動(dòng)相流速

MS/MS參數(shù)：離子源溫度(Probe temperature)350℃，每次轉(zhuǎn)變駐留時(shí)間(Dwell time per transition)200ms，霧化氣(Nebulizer GAS 1)0.3MPa，輔助氣(Heater gas GAS 2)0.4MPa，氣簾氣(Curtain gas)0.25MPa，離子源電壓(Ion spray voltage)：5500V，分析模式(Mode of analysis)：母離子掃描(Precursor Ion Scanning)，目標(biāo)物亞油酸，母離子(Q1)480.6，子離子(Q3)85.1。

3.7數(shù)據(jù)處理：

由Chem View軟件(美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計(jì)算，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，根據(jù)代謝物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)豐度比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行計(jì)算，得出樣品中亞油酸的濃度。

3.8檢測(cè)方法驗(yàn)證：

方法學(xué)認(rèn)證樣本：采用美國(guó)Cambridge Isotope Labs公司提供的加入已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的樣品進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)本編號(hào)分別為061-064，包括四個(gè)濃度等級(jí)，分別為：基質(zhì)、低加標(biāo)濃度、中加標(biāo)濃度、高加標(biāo)濃度。

3.8.1方法準(zhǔn)確性測(cè)定結(jié)果：所測(cè)得結(jié)果均在檢測(cè)結(jié)果95％可信區(qū)間內(nèi)。

3.8.2方法精確性測(cè)定：采用在1天內(nèi)1次測(cè)定5個(gè)樣本，計(jì)算這5個(gè)樣本中亞油酸的變異系數(shù)作為批內(nèi)變異；每天1次測(cè)定5個(gè)樣本，連續(xù)5天，計(jì)算這5天的亞油酸的變異系數(shù)作為批間變異，用變異系數(shù)(CV)表示精確性，CV(％)＝100*均值/標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果顯示變異系數(shù)均小于5％。

3.8.3提取回收率：不同濃度水平的回收率在95.8％～98.2％范圍內(nèi)，總回收率為97.2％。

如圖6，通過LC-MS/MS的方法快速對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤樣本進(jìn)行亞油酸含量檢測(cè)，比傳統(tǒng)的GC-MS的方法簡(jiǎn)便快捷，檢測(cè)限更低，分析時(shí)間更短。

如圖7所示，經(jīng)檢測(cè)，腫瘤組織亞油酸含量顯著降低。

總之，本發(fā)明首先對(duì)腫瘤組織代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，主成分分析，以及隨機(jī)深林分析，均發(fā)現(xiàn)亞油酸顯著降低，并且代謝組學(xué)結(jié)果提示結(jié)直腸癌組織中亞油酸代謝通路不同于其他組織，代謝通路中如代謝物24:4以及24:5不表達(dá)，并且在進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)過程中會(huì)也會(huì)通過20:2而不僅僅是GLA。因此推測(cè)亞油酸代謝通路與結(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)亞油酸通路的代謝酶進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果提示亞油酸通路中FADS1，F(xiàn)ADS2，ELOVL2以及ELOVL5的基因表達(dá)都增加，說明腫瘤細(xì)胞內(nèi)亞油酸代謝旺盛，亞油酸進(jìn)入細(xì)胞后很快的會(huì)被代謝，因此腫瘤組織中亞油酸含量降低，提示亞油酸可能是結(jié)直腸癌基因組學(xué)中一個(gè)重要的靶標(biāo)。

以上通過組學(xué)的方法篩選亞油酸作為結(jié)直腸癌病人的一個(gè)BIOMARK，那么如何推廣，在醫(yī)院中如何檢測(cè)呢？首先可以將取來的活檢組織進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)快速的確定活檢組織中亞油酸的含量，接著可提取RNA進(jìn)行FADS1、FADS2、ELOVL2和ELOVL5的表達(dá)分析。通過對(duì)結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織亞油酸含量變化以及相關(guān)代謝通路中基因的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，為結(jié)直腸癌的診治，以及后期的營(yíng)養(yǎng)學(xué)支持提供重要參考。

核苷酸序列表

<110> 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)

<120> 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)組織亞油酸含量的方法及結(jié)直腸癌診斷試劑盒

<160> 8

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtccgcttct tcctcactta tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gctttccagg aacctgacta tg 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

catgaccatg atcgtccata aga 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gatgccgtag aaagggatgt ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tccctcttgg ttggttgtat tt 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ccttcaggtg gtctttcctt c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cccttcggtt gtctcatctt c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

caggtggctc ttgcatatct t 21